НАНОЧАСТИЦА И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ГЛАЗНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ИЛИ РАКА Российский патент 2023 года по МПК A61K9/51 A61K39/395 A61K47/42 A61P27/02 A61P35/00 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к наноразмерным системам доставки лекарственных препаратов, более конкретно - к наночастицам, содержащим матрицу альбумина и моноклональные антитела, для применения для лечения рака и глазных заболеваний.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Моноклональные антитела представляют собой интересную группу гликопротеинов для применения в различных областях терапии, таких как лечение рака, аутоиммунных и хронических воспалительных заболеваний и лечение отторжения трансплантата. В настоящее время регулирующими органами (FDA и ЕМЕА) утверждено 30 моноклональных антител.

Одним из этих моноклональных антител является бевацизумаб, иммуноглобулин G (immunoglobulin G, IgG), который воздействует на VEGF-A (фактор роста эндотелия сосудов) и включает четыре основные изоформы VEGF. Он был утвержден Управлением по контролю за качеством лекарственных средств и пищевых продуктов США (FDA) в 2004 году для применения в качестве терапии первой линии метастатического колоректального рака, а впоследствии также утвержден для лечения других видов рака, таких как немелкоклеточный рак легкого или метастатический рак молочной железы. Недавно бевацизумаб начали применять для лечения глазных заболеваний, в том числе неоваскуляризации роговицы или сетчатки, диабетической ретинопатии и возрастной макулярной дегенерации.

Местное нанесение на поверхность глаза является распространенным способом применения лекарственных препаратов. Тем не менее, защитные механизмы (слезотечение, слезоотделение и слезоотведение) снижают биодоступность лекарственного препарата за счет быстрого удаления композиции. В последние несколько лет было установлено, что интравитреальная инъекция бевацизумаба является очень эффективным вариантом лечения при влажной форме возрастной макулярной дегенерации, пролиферативной диабетической ретинопатии и неоваскуляризации хориоидеи. Краткосрочные результаты показывают, что интравитреальный бевацизумаб хорошо переносится и связан с улучшением остроты зрения, снижением толщины сетчатки и ангиографическим истечением у большинства пациентов. Тем не менее, для достижения и поддержания улучшения остроты зрения требуются многократные инъекции и визиты последующего наблюдения. Это влечет за собой высокий риск осложнений, таких как эндофтальмит, а также повторяющаяся боль, ощущение тревоги и дискомфорт, связанные с введением игл в глаза. Кроме того, период полувыведения бевацизумаба при интравитреальном введении составляет всего около 3 суток.

В случае лечения рака текущие стратегии лечения, как правило, связаны с инвазивными процессами, включающими применение катетеров для химиотерапии для сокращения размеров опухоли перед ее хирургическим удалением. Программы исследований по улучшению эффективности терапии рака привели к существенному улучшению выживаемости пациентов, тем не менее, проблемы, связанные с токсичными побочными действиями и низким качеством жизни пациентов, остаются актуальными.

Таким образом, требуется разработка эффективного способа доставки лекарственного препарата, который сделает доставку бевацизумаба, а также других моноклональных антител менее инвазивной и более длительной для лечения рака и глазных заболеваний.

В этом отношении наночастицы представляют собой подходящий наполнитель для введения лекарственных препаратов и дают многообещающие результаты в области офтальмологии, а также терапии рака. Для подготовки таких наноразмерных систем доставки можно использовать широкий ряд материалов. Например, моноклональные антитела бевацизумаб были включены в наночастицы ПЛГК для лечения возрастной макулярной дегенерации [Нао et al., American Association of Pharmaceutical Scientists (AASP) Annual Meeting and Exposition, Los Angeles, California, November 2009; Li, F. et al., The Open Ophthalmology Journal, 2012, 6, 54-58], а также для лечения неоваскуляризации сетчатки и хориоидеи [Pan CK et al., J. Ocul. Pharmacol. Ther., 2011, 27(3), 219-224; Varshochian, R. et al., European Journal of Pharmaceutical Sciences, 2013, 50, 341-352].

Тем не менее, натуральные биополимеры являются более предпочтительными, чем синтетические материалы. В данном отношении для получения наночастиц для доставки лекарственных препаратов человеческий сывороточный альбумин широко применяется в связи с тем фактом, что они являются биосовместимыми, биоразлагаемыми, нетоксичными и неиммуногенными. Наночастицы альбумина привлекли значительное внимание в связи с их высокой способностью к связыванию различных лекарственных препаратов и хорошей переносимостью без серьезных побочных действий.

В последние годы предложено большое число различных физико-химических процессов для получения наночастиц альбумина, включая тепловое гелеобразование, эмульгирование и десольватацию (коацервацию). В любом случае процедуры на основе десольватации представляются наиболее популярными благодаря их простоте и воспроизводимости. Тем не менее, недавно полученные наночастицы являются нестабильными и требуют выполнения дополнительного этапа физической, химической или ферментативной стабилизации для продления периода полувыведения в водной среде и/или предотвращения образования макроагрегатов белка.

В целом одной из самых популярных стратегий стабилизации наночастиц альбумина является сшивка альбумина. В публикации Elzoghby et al. [Journal of Controlled Release, 2012, 157, 168-182] используются различные способы получения наночастиц альбумина и их применения в качестве активных систем доставки лекарственных препаратов. Особое внимание уделяется вопросу нестабильности наночастиц в водной среде, для решения которого предусматривается их сшивка с использованием глутаральдегида - химического сшивающего агента, широко известного в данной области техники. В публикации Lohcharoenkal W. et al. [BioMed Research International, 2014] также рассматривается нестабильность наночастиц альбумина при их растворении или коагуляции для образования отдельной фазы, если они находятся в несшитом состоянии. В публикации Llabot et al. [19th International Symposium on Microencapsulation, 2013] описаны наночастицы альбумина, сшитые с полимером Gantrez, который обволакивает бевацизумаб, а также их применение при васкуляризации роговицы.

Таким образом, сшивка стабилизирует наночастицы альбумина и снижает ферментативное расщепление, а также доставку активного ингредиента из наночастицы.

Тем не менее, несмотря на высокую эффективность глутаральдегида в стабилизации наночастиц, его применение сомнительно, главным образом в связи с токсичностью, которая препятствует применению для доставки in vivo. Таким образом, важное значение имеет максимально полное удаление сшивающего агента. Кроме того, глутаральдегид может отрицательно влиять на стабильность биомакромолекул, в частности белковые лекарственные препараты, антитела и пептиды в наночастицах, поскольку он вступает в реакцию с функциональными группами в составе макромолекул (такими как остатки первичных аминов), вызывая значительную потерю их активности.

Для устранения этого важного недостатка были предложены различные стратегии для укрепления или стабилизации только что образовавшихся наночастиц альбумина без необходимости использования токсичных реактивов. Помимо прочего, стабилизация наночастиц может быть достигнута путем тепловой обработки, высокого гидродинамического давления или ферментативной сшивки с генипином или трансглутаминазой.

Для стабилизации наночастиц альбумина также использовалось поверхностное покрытие. Например, для покрытия наночастиц бычьего сывороточного альбумина использовались катионные полимеры, такие как полилизин или полиэтелинимин, для улучшения их стабильности [Wang et al., Pharm. Res., 2008, 25(12), 2896-2909],

В публикации WO 2013/042125 описано получение сшитых глутаральдегидом наносфер бычьего сывороточного альбумина, включающих бевацизумаб и последующее обволакивание указанных наносфер слоем ионной ПЛГК.

В публикации WO 2011/053803 также описаны наночастицы с полимерной оболочкой, обволакивающей лекарственное средство, такое как бевацизумаб, для лечения глазных заболеваний.

С учетом всего вышеуказанного требуются соответствующие системы доставки, обеспечивающие сохранение целостности и активности моноклональных антител и контролирующие их высвобождение из наночастиц.

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что включение моноклональных антител, таких как бевацизумаб, в матрицу альбумина обеспечивает получение наночастиц с высокой стабильностью в водном растворе, и неожиданно установили, что указанные наночастицы не требуют сшивки или стабилизации другими способами, таким образом обеспечивая сохранение трехмерной структуры и биологической активности антител после доставки. Напротив, как указано в экспериментальной части ниже, применение глутаральдегида (наиболее распространенного сшивающего агента, используемого в предшествующем уровне техники для стабилизации наночастиц альбумина) инактивирует антитела, таким образом делая неосуществимым использование сшитых наночастиц для включения активных ингредиентов данного типа.

Авторы также провели испытания несшитых наночастиц, покрытых неионными полимерами, такими как фталат гидроксипропилметилцеллюлозы (hydroxypropyl methyl cellulose phthalate, HPMC-P) и полиэтиленгликоль 35000 (polyethylenglycol 35,000, PEG35), а также Eudagrit® S-100, и установили, что целостность антител также сохраняется.

Кроме того, в соответствии с описанным ниже методом наночастицы альбумина, связанные с моноклональными антителами, можно получить в виде сухого порошка, готового к диспергированию и разведению путем простого добавления воды или водного раствора.

Кроме того, наночастицы изобретения обеспечивают возможность пролонгированного высвобождения моноклональных антител и представляют собой систему доставки лекарственных препаратов, представляющих большой интерес для применения in vivo в соответствии с данными по биологической активности, полученными в животной модели неоваскуляризации роговицы.

Кроме того, анализы биораспределения, выполненные с использованием наночастиц альбумина, покрытых неионными полимерами, указывают на то, что они способны концентрироваться в опухолевых тканях, что делает их очень многообещающими системами наночастиц для высвобождения моноклональных антител в пораженные ткани.

Эксперименты in vivo показали, что наночастицы изобретения способны высвобождать моноклональные антитела в опухолевую ткань в связи с присутствием сниженной концентрации указанных антител в сыворотке по сравнению с введением тех же моноклональных антител в водном растворе. Кроме того, достигается значительное сокращение объема опухоли.

Таким образом, первый аспект настоящего изобретения относится к наночастице для применения в медицине, в котором указанная наночастица содержит твердое ядро, указанное твердое ядро, содержащее несшитую матрицу альбумина и моноклональные антитела, и в котором моноклональные антитела распределены по объему матрицы альбумина, указанное твердое ядро необязательно покрыто неионным полимером.

Второй аспект изобретения относится к фармацевтической композиции, содержащей:

множество наночастиц, указанные наночастицы, содержащие твердое ядро, указанное твердое ядро, содержащее несшитую матрицу альбумина и моноклональные антитела, в которой моноклональные антитела распределены по объему матрицы альбумина, указанное твердое ядро необязательно покрыто неионным полимером;

вспомогательное вещество, фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель.

В другом аспекте изобретение относится к указанной фармацевтической композиции изобретения для применения в медицине.

Другой аспект изобретения включает наночастицу для применения в лечении глазных заболеваний, в котором указанная наночастица содержит твердое ядро, указанное твердое ядро, содержащее несшитую матрицу альбумина и моноклональные антитела, и в котором моноклональные антитела распределены по объему матрицы альбумина, указанное твердое ядро необязательно покрыто неионным полимером.

Еще один аспект изобретения включает наночастицу для применения в лечении рака, в котором указанная наночастица содержит твердое ядро, указанное твердое ядро, содержащее несшитую матрицу альбумина и моноклональные антитела, и в котором моноклональные антитела распределены по объему матрицы альбумина, указанное твердое ядро необязательно покрыто неионным полимером.

И наконец, еще один аспект изобретения относится к наночастице, содержащей твердое ядро, указанное твердое ядро, содержащее несшитую матрицу альбумина и моноклональные антитела, в которой моноклональные антитела распределены по объему матрицы альбумина, указанное твердое ядро покрыто неионным полимером.

Ниже приведен полный объем притязаний по настоящему изобретению.

Согласно настоящему изобретению заявлено применение наночастицы для лечения глазных заболеваний или рака, включающей твердое ядро, содержащее несшитую матрицу альбумина и моноклональные антитела, распределенные по объему матрицы альбумина, при этом указанное твердое ядро необязательно покрыто неионным полимером.

Согласно одному из вариантов изобретения указанное твердое ядро может иметь покрытие, а в составе наночастицы отсутствуют любые другие полимерные покрытия, кроме неионного полимера.

Согласно одному из вариантов изобретения весовое отношение моноклональные антитела / альбумин составляет от 0,01 до 0,5.

Согласно одному из вариантов изобретения весовое отношение неионный полимер / альбумин составляет от 0,02 до 5 по массе.

Согласно одному из вариантов изобретения альбумин представляет собой человеческий сывороточный альбумин или бычий сывороточный альбумин.

Согласно одному из вариантов изобретения моноклональные антитела выбраны из бевацизумаба, ранибизумаба, трастузумаба, цетуксимаба и ритуксимаба.

Согласно одному из вариантов изобретения неионный полимер представляет собой водорастворимую целлюлозу, выбранную из гидроксиэтилцеллюлозы, гидрокси-н-пропилцеллюлозы, гидрокси-н-бутилцеллюлозы, гидроксипропилметилцеллюлозы, фталата

гидроксипропилметилцеллюлозы и этилгидроксиэтилцеллюлозы; крахмала; декстрана; поливинилпирролидона, полиэфира, выбранного из соединений под торговой маркой Eudagrit, или полиалкиленгликоля.

Согласно одному из вариантов изобретения указанная наночастица получена способом, содержащим:

a) получение водного раствора альбумина и моноклональных антител;

b) титрование водного раствора, полученного на этапе а), до рН от 4 до 5;

c) добавление десольватирующего средства к водному раствору, полученному на этапе Ь), с получением наночастиц альбумина / моноклональных антител;

d) дополнительно инкубацию наночастиц альбумина/моноклональных антител, полученных на этапе с), с неионным полимером; и дополнительно

e) сушку наночастиц путем вакуумной сушки, сушки распылением или сублимационной сушки.

Согласно одному из вариантов изобретения глазное заболевание выбрано из макулярной дегенерации, неоваскуляризации или ангиогенеза роговицы, неоваскуляризации или ангиогенеза радужки, неоваскуляризации или ангиогенеза сетчатки, диабетической пролиферативной ретинопатии, недиабетической пролиферативной ретинопатии, глаукомы, инфекционного конъюнктивита, аллергического конъюнктивита, язвенного кератита, неязвенного кератита, эписклерита, склерита, диабетической ретинопатии, увеита, эндофтальмита, инфекционных процессов и воспалительных процессов.

Согласно одному из вариантов изобретения рак представляет собой рак молочной железы, рак легких, рак поджелудочной железы, множественную миелому, почечно-клеточную карциному, рак предстательной железы, меланому, рак толстой кишки, колоректальный рак, рак почки, рак шейки матки, рак яичников, рак печени, почек и ЖКТ, рак мочевого пузыря или плоскоклеточный рак.

Согласно настоящему изобретению также заявлена наночастица, включающая твердое ядро, содержащее несшитую матрицу альбумина и моноклональные антитела, распределенные по объему матрицы альбумина, при этом указанное твердое ядро покрыто неионным полимером.

Согласно настоящему изобретению также заявлена фармацевтическая композиция, включающая:

- группу наночастиц, содержащих твердое ядро, включающее несшитую матрицу альбумина и моноклональные антитела, распределенные по объему матрицы альбумина, при этом указанное твердое ядро необязательно покрыто неионным полимером;

- вспомогательное вещество, фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель.

Согласно одному из вариантов изобретения указанное твердое ядро имеет покрытие, при этом оно покрыто неионновым полимером.

Согласно одному из вариантов изобретения композиция является глазной или противораковой фармацевтической композицией.

Согласно одному из вариантов изобретения наночастицы находятся в виде сухого порошка.

Согласно одному из вариантов изобретения вспомогательное вещество, фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель подходит для перорального, местного или парентерального введения.

Согласно одному из вариантов изобретения альбумин представляет собой человеческий сывороточный альбумин или бычий сывороточный альбумин.

Согласно одному из вариантов изобретения моноклональные антитела выбраны из бевацизумаба, ранибизумаба, трастузумаба, цетуксимаба и ритуксимаба.

Согласно одному из вариантов изобретения неионный полимер представляет собой водорастворимую целлюлозу, выбранную из гидроксиэтилцеллюлозы, гидрокси-н-пропилцеллюлозы, гидрокси-н-бутилцеллюлозы, гидроксипропилметилцеллюлозы, фталата гидроксипропилметилцеллюлозы и этилгидроксиэтилцеллюлозы; крахмала; декстрана; поливинилпирролидона, полиэфира, выбранного из соединений под торговой маркой Eudagrit, или полиалкиленгликоля.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фигура 1. Влияние отношения бевацизумаб / альбумин на полезную нагрузку полученных наночастиц. Наночастицы были получены после инкубации моноклональных антител и белка в течение 10 минут. Данные выражены в виде среднего значения ± СО (n=3).

Фигура 2. Фотография ПЭМ наночастиц альбумина, наполненных бевацизумабом (bevacizurnab-loaded nanoparticles, B-NP).

Фигура 3. А) ИК-спектр с Фурье-преобразованием человеческого сывороточного альбумина (human serum albumin, HSA), глутаральдегида (glutaraldehyde, GLU), механической смеси HSA и глутаральдегида (glutaraldehyde, HSA-GLU) и наночастиц, сшитых с глутаральдегидом (nanoparticles cross-linked with glutaraldehyde, NP-GLU). В) ИК-спектр с Фурье-преобразованием человеческого сывороточного альбумина (HSA), бевацизумаба (bevacizumab, BEVA), механической смеси HSA и бевацизумаба (HSA-BEVA) и наночастиц, наполненных бевацизумабом (B-NP).

Фигура 4. Рентгеновские спектры бевацизумаба (BEVA), наночастиц, наполненных бевацизумабом (B-NP), и человеческого сывороточного альбумина (HSA).

Фигура 5. Термограммы ДТА: А) нативного человеческого сывороточного альбумина (HSA) и бевацизумаба (BEVA); В) механической смеси (РМ) человеческого сывороточного альбумина (HSA), бевацизумаба (BEVA) и наночастиц альбумина, наполненных бевацизумабом (B-NP); С) нативного человеческого сывороточного альбумина (HSA) и глутаральдегидом (GLU); D) механической смеси (РМ) человеческого сывороточного альбумина (HSA), глутаральдегида (GLU) и наночастиц альбумина, сшитых с глутаральдегидом (NP-GLU).

Фигура 6. Динамика изменения среднего размера пустых наночастиц, сшитых с глутаральдегидом (NP-GLU), и наночастиц, наполненных бевацизумабом (B-NP), после их диспергирования в водном растворе при рН 7,4. Данные выражены в виде среднего значения ± СО (n=3).

Фигура 7. Профиль высвобождения бевацизумаба из наночастиц человеческого сывороточного альбумина после инкубации в PBS (рН 7,4). Данные выражены в виде среднего значения ± СО (n=3).

Фигура 8. Микрофотография ПЭМ наночастиц альбумина, наполненных бевацизумабом, пегилированных PEG35 (B-NP-PEG35).

Фигура 9. Профиль высвобождения бевацизумаба из наночастиц альбумина после инкубации в PBS (рН 7,4) наночастиц, наполненных бевацизумабом (B-NP); наночастиц, наполненных бевацизумабом и покрытых PEG35 (B-NP-PEG35); (…) наночастиц, наполненных бевацизумабом и покрытых Eudagrit® S-100 (B-NP-S-100); наночастиц, наполненных бевацизумабом и покрытых НРМС-Р (B-NP-HPMC-P). Данные выражены в виде среднего значения ± СО (n=3).

Фигура 10. Автоматизированный электрофорез наночастиц на микрофлюидном чипе (L - маркер длин; 1 - пустые наночастицы, покрытые PEG35 (NP-PEG35); 2 - наночастицы альбумина, наполненные бевацизумабом (B-NP); 3 - наночастицы альбумина, наполненные бевацизумабом и покрытые PEG35 (B-NP-PEG35); 4 - человеческий сывороточный альбумин (HSA); 5 - бевацизумаб).

Фигура 11. Сравнение изображений ОФЭКТ-КТ in vivo 99mTc-меченых В-NP (верхний ряд) и 99mTc-меченых B-NP-PEG35 (нижний ряд) после введения в глаз крысам Вистар. Изображения в каждом ряду соответствуют тем же животным, исследованным во временных точках, указанных на фигуре. Активность исчезает через 4-8 ч. после введения в глаз, тогда как в B-NP-PEG35 она сохраняется в глазу как минимум 8 ч.

Фигура 12. Кривая активность - время для динамики количества радиоактивности в различных областях после введения в глаз наночастиц 99mTc-B-NP. Исследуемые объемные области (volumes of interest, VOI) были получены для зон, обозначенных на графиках, и средних количеств, полученных для каждой VOI, данные приведены с поправкой на затухание и нанесены на график.

Фигура 13. Сравнение изображений ОФЭКТ-КТ in vivo 99mTc-меченых В-NP (верхний ряд) и 99mTc-меченых B-NP-PEG35 (нижний ряд) после внутривенного введения крысам Вистар. Изображения в каждом ряду соответствуют тем же животным, исследованным во временных точках, указанных на фигуре.

Фигура 14. Схематическое представление плана-графика, на котором показано прижигание роговицы в 0 ч. (0-е сутки) и первое лечение через 24 ч. (1-е сутки).

Фигура 15. Фотографии роговиц животных, получавших лечение: (А) физиологическим раствором [контроль (-)]; (В) Авастином® (4 мг/мл бевацизумаба); (С) наночастицами альбумина, наполненными бевацизумабом (В-NP); (D) наночастицами альбумина, наполненными бевацизумабом и покрытыми PEG 35,000 (B-NP-PEG35); (Е): раствором человеческого сывороточного альбумина (HSA); (F): Эйлеа® (EYLEA); (G): дексаметазоном (DEXA).

Фигура 16. Площадь очага поражения в процентах площади роговицы, пораженной ожогом. Статистически значимые различия между очагами поражения в различных группах не выявлены. Данные выражены в виде среднего значения ± СО (n=9).

Фигура 17. Площадь инвазии (invasion area, IA), доля площади роговицы с присутствием сосудов. Данные выражены в виде среднего значения ± СО (n=9).

* р<0,01 - результаты дисперсионного анализа с использованием критерия Тьюки значимо отличаются от контроля (-).

** р<0,01 - результаты дисперсионного анализа с использованием критерия Тьюки значимо отличаются от BEVA.

*** р<0,005 - результаты дисперсионного анализа с использованием критерия Тьюки значимо отличаются от B-NP.

Фигура 18. Площадь неоваскуляризации, нормализованная по очагу поражения. Данные выражены в виде среднего значениям ± СО (n=9).

* р<0,01 - результаты дисперсионного анализа с использованием критерия Тьюки значимо отличаются от контроля (-).

** р<0,005 - результаты дисперсионного анализа с использованием критерия Тьюки значимо отличаются от BEVA.

Фигура 19. Микрофотографии срезов нормальной и неоваскуляризованной роговицы, для лечения которой применяли бевацизумаб (е - эпителиальный слой; s - строма; ас - передняя камера; v - стромальные микрососуды). А) Микрофотография нормальной роговицы крыс, на которой показан интактный эпителий (е), строма, содержащая правильные параллельные коллагеновые пластинки с уплощенными кератоцитами между ними; В) Микрофотография роговицы крысы из группы, получавшей лечение наночастицами альбумина, наполненными бевацизумабом (B-NP). Толщина роговицы находится в пределах нормы, интактный эпителий и немного нечеткая и рыхлая строма с небольшой инфильтрацией. С) Микрофотография роговицы крысы из группы, получавшей лечение наночастицами альбумина, наполненными бевацизумабом и покрытыми PEG35 (B-NP-PEG35). Нормальный эпителий, многочисленные стромальные микрососуды (v). Толщина роговицы в пределах нормы; D и Е): микрофотографии роговицы крыс из группы, получавшей лечение бевацизумабом. Сохраняющий структуру и гипертрофированный эпителий, который отделяется от стромы. Утолщение стромы с многочисленными и беспорядочно расположенными фибробластами (*); F) Микрофотография роговицы крысы из группы, получавшей лечение физиологическим раствором. Серьезные изменения роговицы, центральная эрозия и увеличение толщины. Выраженный фиброз с большими беспорядочно расположенными фибробластами, умеренной воспалительной инфильтрацией и неоваскуляризацией (v). Образование кисты (с) из клеток эпителия, что демонстрирует попытку ненормального восстановления. Масштаб - 200 мкм, т.е. 100-кратное увеличение.

Фигура 20. Отношения опухоль / нормальная ткань для опухолей ноги и шеи у животных, получавших лечение наночастицами альбумина, покрытыми PEG35 (NP-PEG35). Значения соответствуют среднему значению для трех животных, полученному через 1 час (синие столбики) и 4 часа (красные столбики) после внутривенного (в/в) введения наночастиц, меченых радиоактивным изотопом.

Фигура 21. Объем опухоли (мм 3). Данные выражены в виде среднего значения ± СО (n≥6).

* р<0,05 - результаты дисперсионного анализа с использованием критерия Тьюки значимо отличаются от физиологического раствора.

** р<0,01 - результаты дисперсионного анализа с использованием критерия Тьюки значимо отличаются от физиологического раствора.

Фигура 22. Зависимость концентрации бевацизумаба в сыворотке (мкг/мэ) от времени (сутки).

ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Как указано выше, первый аспект настоящего изобретения относится к наночастице для применения в медицине, в котором указанная наночастица содержит твердое ядро, указанное твердое ядро, содержащее несшитую матрицу альбумина и моноклональные антитела, и в котором моноклональные антитела распределены по объему матрицы альбумина, указанное твердое ядро необязательно покрыто неионным полимером.

В частном варианте осуществления, настоящее изобретение относится к наночастице для применения в медицине, в котором указанная наночастица содержит твердое ядро, указанное твердое ядро, состоящее из несшитой матрицы альбумина и моноклональных антител, и в котором моноклональные антитела распределены по объему матрицы альбумина, указанное твердое ядро необязательно покрыто неионным полимером.

В еще одном частном варианте, осуществления настоящее изобретение относится к наночастице для применения в медицине, в котором указанная наночастица состоит из твердого ядра, указанное твердое ядро, содержащее несшитую матрицу альбумина и моноклональные антитела, и в котором моноклональные антитела распределены по объему матрицы альбумина, указанное твердое ядро необязательно покрыто неионным полимером.

В еще одном частном варианте осуществления, настоящее изобретение относится к наночастице для применения в медицине, в котором указанная наночастица состоит из твердого ядра, указанное твердое ядро, состоящее из несшитой матрицы альбумина и моноклональных антител, и в котором моноклональные антитела распределены по объему матрицы альбумина, указанное твердое ядро необязательно покрыто неионным полимером.

Используемый здесь термин «наночастица» относится к коллоидной системе, имеющей сферическую или квазисферическую форму и средний размер меньше 1 мкм. В конкретном варианте осуществления наночастица имеет средний размер в диапазоне от 100 до 900 нм, более предпочтительно от 150 до 800 нм, еще более предпочтительно от 200 до 500 нм и наиболее предпочтительно от 200 до 400 нм.

Под «средним размером» понимается средний диаметр популяции наночастиц, перемещающихся вместе в водной среде. Средний размер этих систем можно измерить стандартными способами, известными специалистам в данной области техники и описанными, например, в экспериментальной части ниже.

В контексте настоящего изобретения термин «наночастица» относится к наносфере или наносфере с покрытием.

Под «наносферой» понимается твердая несшитая матрица альбумина или сплошной материал альбумина, в котором по объему указаннойой матрицы распределены моноклональные антитела, так что выраженная структура ядро/оболочка отсутствует.

Под «наносферой с покрытием» понимается наносфера согласно определению выше, в которой твердая несшитая матрица альбумина покрыта неионным полимером.

Соответственно, наночастицы изобретения не содержат любые другие полимерные покрытия, кроме неионных полимеров.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, наночастица представляет собой наночастицу, в которой при нанесенном на твердое ядро покрытии в составе наночастицы отсутствуют любые другие полимерные покрытия, кроме неионных полимеров. Несмотря на то что для наночастиц изобретения не требуется полимерное покрытие, авторы изобретения установили, что при отсутствии в составе наночастицы любых других полимерных покрытий, кроме неионных полимеров, указанные частицы демонстрируют полезный эффект по сравнению с теми же частицами при использовании ионного покрытия. Например, когда наночастицы изобретения покрыты ионным полимером, частицы демонстрируют очень быстрый профиль высвобождения антител (взрывное высвобождение).

Так что когда используемые в изобретении наночастицы не покрыты неионным полимером, указанные наночастицы следует рассматривать как наносферы согласно приведенному выше определению, тогда как когда используемые в изобретении наночастицы покрыты неионным полимером, указанные наночастицы следует рассматривать как наносферы с покрытием согласно приведенному выше определению.

В отличие от наночастиц, используемых в предшествующем уровне техники, в котором матрица альбумина является сшитой или стабилизированной другими способами, наночастицы, используемые в изобретении, характеризуются наличием твердого ядра из несшитой матрицы альбумина, под которой понимается организационная структура или конфигурация, обусловленная местными взаимодействиями между альбумином и моноклональными антителами. Таким образом, в объеме настоящего изобретения наночастицы образуют твердые матричные системы.

В связи с этим термин «твердое ядро» относится к твердой несшитой структуре матричного типа, в которой альбумин образует непрерывную структуру, в которой моноклональные антитела распределены, предпочтительно равномерно распределены, по всему объему матрицы.

Так что твердое ядро наночастиц, используемых в изобретении, не имеет дифференцированных внешней и внутренней структур, в связи с чем моноклональные антитела распределены, более предпочтительно равномерно распределены, по всему объему матрицы альбумина, а не заключены или ограничены в ее центральной полости.

В частном варианте осуществления изобретения, наночастица, используемая в изобретении, представляет собой наносферу согласно приведенному выше определению. Более конкретно, в указанных наночастицах твердое ядро не покрыто неионным полимером. Как описано по всему тексту настоящего документа, а также показано на примерах, наночастицы изобретения являются стабильными и не требуют заключения в оболочку. В контексте настоящего изобретения, термин «стабильный» относится к повышению уровня стабильности частиц таким образом, что частицы можно использовать в медицине без распада материала. Таким образом, в конкретном варианте осуществления наночастица настоящего изобретения представляет собой стабильную наночастицу с дополнительным полимерным покрытием или без покрытия.

В еще одном частном варианте осуществления изобретения, наночастица, используемая в изобретении, представляет собой наносферу с покрытием согласно приведенному выше определению, т.е. содержит или состоит из твердого ядра из твердой матрицы альбумина или сплошного материала альбумина, в которой по всем объему указанной матрицы распределены моноклональные антитела и в которой твердое ядро покрыто неионным полимером.

Дополнительный аспект изобретения относится к наночастице, содержащей твердое ядро, указанное твердое ядро, содержащее несшитую матрицу альбумина и моноклональные антитела, в которой моноклональные антитела распределены по объему матрицы альбумина, указанное твердое ядро покрыто неионным полимером.

Более конкретно, изобретение также относится к наночастице, содержащей твердое ядро, указанное твердое ядро, состоящее из несшитой матрицы альбумина и моноклональных антител, в которой моноклональные антитела распределены по объему матрицы альбумина, указанное твердое ядро покрыто неионным полимером.

Также, в частности, изобретение относится к наночастице, состоящей из твердого ядра, указаннойого твердого ядра, содержащего несшитую матрицу альбумина и моноклональные антитела, в которой моноклональные антитела распределены по объему матрицы альбумина, указанное твердое ядро покрыто неионным полимером.

Еще более конкретно, изобретение также относится к наночастице, состоящей из твердого ядра, указаннойого твердого ядра, состоящего из несшитой матрицы альбумина и моноклональных антител, в которой моноклональные антитела распределены по объему матрицы альбумина, указанное твердое ядро покрыто неионным полимером.

Альбумин.

Используемый здесь термин «альбумин» относится к семейству глобулярных отрицательно заряженных белков, наиболее распространенными из которых являются сывороточные альбумины. Все белки семейства альбуминов являются водорастворимыми, умеренно растворимыми в концентрированных растворах солей и подверженными тепловой денатурации. Альбумины широко распространены в плазме крови и отличаются от других белков крови тем, что они не гликозилируются.

Общая структура альбумина характеризуется несколькими длинными спиралями, позволяющими им сохранять относительно статическую форму, которая очень важна для регулирования артериального давления.

В конкретном варианте осуществления альбумин представляет собой сывороточный альбумин. Сывороточный альбумин продуцируется в печени и растворяется в плазме крови, представляя собой наиболее распространенный белок у млекопитающих.

Более предпочтительно сывороточный альбумин представляет собой человеческий сывороточный альбумин (HSA) или бычий сывороточный альбумин (BSA), еще более предпочтительно сывороточный альбумин представляет собой человеческий сывороточный альбумин.

Человеческий сывороточный альбумин кодируется геном ALB, тогда как формы других млекопитающих, такие как бычий сывороточный альбумин, химически подобны.

Человеческий сывороточный альбумин имеет молекулярную массу приблизительно 65000 Да и состоит из 585 аминокислот. Последовательность аминокислот HSA содержит 17 дисульфидных мостиков, один свободный тиол (Cys34) и один триптофан (Trp214).

Моноклональные антитела.

Используемый здесь термин «моноклональные антитела» (monoclonal antibody, mAb или moAb) относится к антителам или фрагментам антител, продуцируемым одним клоном В-лимфоцитов или одной клеткой, именуемой гибридомой, которая секретирует молекулу антител всего одного типа. Моноклональные антитела получают способами, известными специалистам в данной области техники, например путем получения гибридных антителообразующих клеток за счет слияния антителообразующей клетки и миеломы или другой самопроникающей клеточной линии.

Моноклональные антитела имеют моновалентную аффинность в том отношении, что они связываются с одним эпитопом (частью антигена, которая распознается антителами). Практически для любого вещества можно получить моноклональные антитела, специфически связывающиеся с этим веществом.

Для цели настоящего изобретения моноклональные антитела, предназначенные для включения в матрицу альбумина наночастицы, должны обладать аффинностью как минимум к одной мишени в ткани глаза или раковой ткани либо должны обладать аффинностью к самой ткани. Например, мишенью может являться рецептор, связанный с заболеваниею глаз или раком, или белок, связанный с заболеваниею глаз или раком.

В частном варианте осуществления изобретения, моноклональные антитела выбраны из бевацизумаба (Авастин®), который ингибирует функцию натурального белка под названием «фактор роста эндотелия сосудов» (vascular endothelial growth factor, VEGF), который стимулирует образование новых кровеносных сосудов; ранибизумаба (Луцентис®), который обеспечивает сильное связывание с VEGF-A; трастузумаба (Герцептин®), который распознает рецептор HER-2, сверхэкспрессирующийся в солидных опухолях; цетуксимаба (Эрбитукс®), который распознает рецепторы EGFR, и ритуксимаба (Мабтера®), который распознает CD20.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, одно или несколько антител (или фрагментов антител) против VEGF выбраны для включения в матрицу альбумина, таким образом обеспечивая направленное воздействие непосредственно на фактор роста эндотелия сосудов (VEGF). Так в предпочтительном варианте осуществления моноклональные антитела выбраны из бевацизумаба и ранибизумаба, более предпочтительно представляют собой бевацизумаб.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения одно или несколько антител (или фрагментов антител) против VEGF R2 выбраны для включения в матрицу альбумина, таким образом обеспечивая направленное воздействие на клетки, такие как клетки пигментного эпителия сетчатки, экспрессирующие фактор роста эндотелия сосудов 2 (VEGF R2).

Примеры моноклональных антител против VEGF R2 включают, помимо прочего, клон моноклональных антител Avasl2al и моноклональные антитела 2С3.

Сверхэкспрессия рецептора VEGF и VEGFR2 клетками эпителия, такими как клетки пигментного эпителия сетчатки, связана, например, с возрастной макулярной дегенерацией (ВМД).

В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, моноклональные антитела представляют собой глазной препарат направленного действия, т.е. антитела, специфические к антигену, продуцируемому тканью глаза, непосредственно затрагиваемой заболеваниею глаз, или связанному с ней.

В частном варианте осуществления изобретения, весовое отношение антитела/альбумин составляет от 0,01 до 0,5, более предпочтительно от 0,01 до 0,2. По результатам наблюдений наночастицы с весовым отношением моноклональные антитела / альбумин меньше 0,01 не сохраняют стабильность с течением времени.

Неионный полимер.

Используемый здесь термин «неионный полимер» относится к гидрофильном полимеру, который в условиях получения наночастиц не обладает суммарным зарядом. Кроме того, указаннойый неионный полимер должен быть биоразлагаемым, т.е. разлагающимся при применении in vivo, а также биосовместимым, т.е. по существу не токсичным или не оказывающим вредного воздействия на живые ткани или живые системы, с которыми он вступает в контакт.

Примерами подходящих неионных полимеров для использования в настоящем изобретении являются поливиниловый спирт; поливинилпирролидон; полиаллиловый спирт; поливинилметиловый эфир; поливинилацеталь; полиалкиленовый спирт; полисахарид, необязательно замещенный по меньшей мере одной алкильной группой, гидроксиалкильной группой, алкоксиалкильной группой или комбинацией двух или более таких групп; сложные полиэфиры; полиамиды, полиуретаны и полиэфиры.

Предпочтительные полисахариды включают, помимо прочего, ксантановые камеди, гуаровые камеди, крахмалы, целлюлозу, декстран и комбинацию двух или более из перечисленного.

Крахмалы включают, например, кукурузный крахмал и оксипропилированный крахмал.

Целлюлоза включает, например, алкилцеллюлозы, такие как С1-С6-алкилцеллюлозы, включая метилцеллюлозу, этилцеллюлозу и н-пропилцеллюлозу; замещенные алкилцеллюлозы, включая гидрокси-С1-С6-алкилцеллюлозы и гидрокси-С1-С6-алкил-С1-С6-алкилцеллюлозы, такие как гидроксиэтилцеллюлоза, гидрокси-н-пропилцеллюлоза, гидрокси-н-бутилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза и этилгидроксиэтилцеллюлоза.

В частном варианте осуществления изобретения, неионный полимер выбран из полисахарида, поливинилпирролидона, полиэфира и полиалкиленгликоля. Предпочтительно неионный полимер представляет собой водорастворимую целлюлозу, выбранную из гидроксиэтилцеллюлозы, гидрокси-н-пропилцеллюлозы, гидрокси-н-бутилцеллюлозы, гидроксипропилметилцеллюлозы, фталата гидроксипропилметилцеллюлозы и этилгидроксиэтилцеллюлозы; крахмал; декстран; полиэфир, выбранный из соединений под торговой маркой Eudagrit, или полиалкиленгликоль, такой как полиэтиленгликоль или полипропиленгликоль.

В еще одном частном варианте осуществления изобретения, неионный полимер выбран из гидроксипропилметилцеллюлозы, фталата гидроксипропилметилцеллюлозы, крахмала, декстрана 70, Eudagrit® NM; Eudagrit® NE, поливинилпирролидона (PVP) и полиэтиленгликоля (PEG). Полиэтиленгликоль предпочтительно представляет собой PEG-10000, PEG- 20000 или PEG-35000 в соответствии с его молекулярной массой.

Является предпочтительным, когда неионный полимер выбран из гидроксипропилметилцеллюлозы, фталата гидроксипропилметилцеллюлозы и PEG 35 000. Является предпочтительным, когда неионный полимер выбран из фталата гидроксипропилметилцеллюлозы и PEG 35 000. Еще более предпочтительно неионный полимер представляет собой PEG 35 000.

Неионный полимер используется в качестве покрытия наночастиц альбумина, сообщая им повышенную стабильность и в целом обеспечивая увеличение количества моноклональных антител, которыми может быть наполнена наночастица. Было продемонстрировано, что наличие покрытия не оказывает значимого влияния на физические свойства наночастицы. В зависимости от характера покрытия возможно лишь незначительное увеличение или уменьшение размера и дзета-потенциала.

В частном варианте осуществления изобретения, весовое отношение неионный полимер / альбумин составляет от 0,02 до 5 (в/в), более предпочтительно от 0,05 до 2 (в/в).

В еще одном частном варианте осуществления изобретения и в дополнительном варианте осуществления изобретения, наночастицы, используемые в настоящем изобретении, дополнительно содержат соединение для защиты матрицы альбумина в процессе сушки наночастиц или сушки суспензии, содержащей наночастицы, с использованием общепринятых способов, например посредством сушки распылением, далее - «защитное средство». Указанное защитное средство не входит в состав твердой матрицы наночастиц, выступая в качестве объемообразующего средства, способствующего эффективной сушке наночастиц с сохранением их структуры. В качестве защитного средства может использоваться практически любое соединение, отвечающее этим характеристикам. В конкретном варианте осуществления указанное защитное средство представляет собой сахарид.

Неограничивающие иллюстративные примеры защитных средств, которые могут быть использованы в контексте настоящего изобретения, включают лактозу, маннитол, сахарозу, мальтозу, трегалозу, мальтодекстрин, глюкозу, сорбит и т.д., а также вещества с пребиотическими характеристиками, такие как, например, олигофруктоза, пектин, инулин, олигосахариды (например, галактоолигосахариды, олигосахариды грудного молока), лактулоза, пищевые волокна и т.д., и любые их комбинации. В конкретном варианте осуществления защитное средство выбрано из лактозы, маннитола, сахарозы, мальтозы, трегалозы, мальтодекстрина, глюкозы, сорбита и их комбинаций. Предпочтительно защитное средство представляет собой сахарозу. Если наночастицы, используемые в изобретении, включают защитное средство, весовое отношение матрицы альбумина и защитного средства может изменяться в широком диапазоне; тем не менее, в конкретном варианте осуществления весовое отношение защитное средство / альбумин составляет 1: 0,1-1,5, как правило, 1: 0,5-4, предпочтительно около 1:1.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, наночастицы, используемые в изобретении, содержат по меньшей мере одно визуализирующее средство, которое обеспечивает возможность направленной доставки лекарственного препарата с визуальным контролем за счет предварительной визуализации расположения частиц до, во время и после доставки лекарственного препарата. Для связывания с поверхностью наночастиц подходит большое количество визуализирующих средств, включая, помимо прочего, флуоресцентные визуализирующие средства (такие как индоцианин зеленый, цианин 5, цианин 7, цианин 9, флуоресцеин и зеленый флуоресцентный белок), визуализирующие средства, меченые радиоактивными изотопами (такие как средства, содержащие йод-124, 99mTc), и магнитно-резонансные визуализирующие средства (такие как гадолиниевые контрастные средства).

Наночастицы, используемые в изобретении, могут доставлять моноклональные антитела в контролируемом процессе. Такой контроль способен обеспечивать доставку моноклональных антител в течение длительного периода. Например, предполагается, что доставка может осуществляться в течение периода от 1 до 30 суток. Помимо выполнения с возможностью доставки лекарственного препарата контролируемым образом, наночастицы могут быть выполнены с возможностью использования различных вариантов обнаружения и визуализации частиц до, во время и после доставки лекарственного препарата.

Наночастицы, используемые в настоящем изобретении, могут дополнительно содержать второе моноклональное антитело или лекарственный препарат для обеспечения комбинированной терапии.

Указаннойый лекарственный препарат включает, например, другие белки, такие как кальцитонин, инсулин или циклоспорин А.

Второе моноклональное антитело может быть любым из указанных выше, представляя собой, например, бевацизумаб (Авастин®), ранибизумаб (Луцентис®), трастузумаб (Герцептин®), цетуксимаб (Эрбитукс®) или ритуксимаб (Мабтера®).

Способ получения наночастиц.

Наночастицы, используемые в настоящем изобретении, могут быть получены путем осаждения белков (альбумина и моноклональных антител) в водной среде перед очисткой и сушкой.

Этот способ содержит:

a) получение водного раствора альбумина и моноклональных антител;

b) титрование водного раствора, полученного на этапе а), до рН от 4 до 5;

c) добавление десольватирующего средства к водному раствору, полученному на этапе b).

Этот способ основан на технологии десольватации, в которой водный раствор альбумина и моноклональных антител медленно десольватируют путем медленного добавления, такого как добавление по каплям, десольватирующего средства (как правило, органического растворителя, такого как этанол, ацетон или ТГФ) при постоянных условиях перемешивания, температуры и рН.

В частном варианте осуществления изобретения, альбумин, используемый при получении водного раствора на этапе а), представляет собой человеческий сывороточный альбумин или бычий сывороточный альбумин, более предпочтительно человеческий сывороточный альбумин.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, моноклональные антитела, используемые при получении водного раствора на этапе а), выбраны из бевацизумаба (Авастина®), ранибизумаба (Луцентиса®), трастузумаба (Герцептина®), цетуксимаба (Герцептина®) и ритуксимаба (Мабтеры®). Более предпочтительно моноклональные антитела представляют собой бевацизумаб или ранибизумаб, еще более предпочтительно бевацизумаб.

Раствор альбумина и моноклональных антител можно получить общепринятыми способами, известными специалистам в данной области техники, например путем добавления альбумина и моноклональных антител в водный раствор.

Альбумин и моноклональные антитела предпочтительно смешивают при комнатной температуре, т.е. при температуре от 18°С до 25°С, предпочтительно от 20°С до 22°С.

Количество альбумина, которое может быть добавлено в водный раствор, может изменяться в широком интервале значений, тем не менее, в конкретном варианте осуществления настоящего изобретения количество альбумина, добавляемое в указаннойый водный раствор, составляет от 0,1% до 10% (в/о), предпочтительно от 0,5% до 5% (в/о), еще более предпочтительно от 1% до 2% (в/о).

Аналогичным образом количество моноклональных антител, которое может быть добавлено в водный раствор, может изменяться в широком интервале значений, тем не менее, в конкретном варианте осуществления настоящего изобретения количество моноклональных антител, добавляемое в указаннойый водный раствор, составляет от 0,005% до 1% (в/о), предпочтительно от 0,01% до 0,5% (в/о), еще более предпочтительно от 0,01% до 0,4% (в/о).

В частном варианте осуществления изобретения, альбумин и моноклональные антитела добавляют в водный раствор таким образом, чтобы весовое отношение моноклональные антитела / альбумин составляло от 0,01 до 0,5, более предпочтительно от 0,01 до 0,2.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, водный раствор альбумина и моноклональные антитела подвергают гомогенизации, например посредством перемешивания.

Этап b) способа получения наночастиц включает снижение уровня рН водного раствора, содержащего альбумин и моноклональные антитела до слабокислого рН. Это обеспечивает возможность осаждения наночастиц на следующем этапе данного способа. Это может быть осуществлено путем добавления кислого компонента в водный раствор, полученный на этапе а), такого как 1М HCl.

В частном варианте осуществления изобретения, водный раствор инкубируют в течение по меньшей мере 10 минут при комнатной температуре.

На этапе с) способа получения наночастиц в водный раствор, полученный на этапе Ь), добавляют десольватирующее средство.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, добавление десольватирующего средства в водный раствор, полученный на этапе b), осуществляют при перемешивании.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления осуществления настоящего изобретения указанное десольватирующее средство представляет собой органический растворитель, выбранный из этанола и тетрагидрофурана (ТГФ), более предпочтительно этанол.

Десольватирующее средство медленно добавляют в водный раствор при перемешивании. Более предпочтительно десольватирующее средство добавляют по каплям в водный раствор альбумина и моноклональных антител при перемешивании полученной смеси.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, указанное добавление десольватирующего средства осуществляют в атмосфере инертного газа, такой как атмосфера азота.

После добавления десольватирующего средства в водный раствор альбумина и моноклональных антител при вышеуказанных условиях, т.е. при комнатной температуре и перемешивании, самопроизвольно образуются наночастицы изобретения. В частном варианте осуществления изобретения указанные наночастицы находятся в суспензии в среде, в которой они были получены.

Таким образом, способ изобретения обеспечивает возможность получения однородной дисперсии наночастиц с использованием простого процесса десольватации, обеспечивающего получение твердых наносфер со структурой матричного типа, в которых моноклональные антитела распределены во всему объему матрицы альбумина.

Таким образом, наночастицы, полученные этим способом, можно рассматривать как самособирающиеся наночастицы, которые образуются самопроизвольно вследствие местных взаимодействий между моноклональными антителами и альбумином при добавлении десольватирующего средства.

Способ получения наночастиц может содержать дополнительный этап очистки, например с использованием способов фильтрации, центрифугирования и ультрацентрифугирования.

Аналогичным образом указаннойый способ может включать дополнительный этап сушки полученных наночастиц для получения наночастиц изобретения в виде порошка. Эта форма выпуска указанных наночастиц обеспечивает их стабильность и, в частности, дополнительно полезна для их конечного применения в составе фармацевтических композиций.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, наночастицы, полученные на этапе с) или после очистки, подвергают сушке общепринятыми способами, например вакуумной сушке или предпочтительно сушке распылением или сублимационной сушке (лиофилизации) для высушивания наночастиц.

В частном варианте осуществления изобретения, этот этап сушки, в частности при выполнении с использованием сушки распылением или лиофилизации, содержит добавление к сформированным наночастицам защитного средства. Это защитное средство защищает наночастицу в процессе сушки и представляет собой, например, сахарид.

Неограничивающие иллюстративные примеры сахаридов, которые могут быть использованы в качестве защитных средств в контексте настоящего изобретения, включают лактозу, маннитол, сахарозу, мальтозу, трегалозу, мальтодекстрин, глюкозу, сорбит и т.д., а также полисахариды с пребиотическими характеристиками, такие как, например, олигофруктоза, пектин, инулин, олигосахариды (например, галактоолигосахариды, олигосахариды грудного молока), лактулоза, пищевые волокна и т.д., и их смеси. В конкретном варианте осуществления защитное средство выбрано из лактозы, маннитола, сахарозы, мальтозы, трегалозы, мальтодекстрина, глюкозы, сорбита и их комбинаций. Если наночастицы включают защитное средство, его добавляют в соответствующем количестве; при этом несмотря на то что весовое отношение матрицы наночастиц и защитного средства может изменяться в широком диапазоне, в конкретном варианте осуществления весовое отношение альбумин / защитное средство составляет 1:0,1-1,5, как правило, 1:0,5-4, предпочтительно около 1:1.

Для сушки наночастиц также может использоваться сушка распылением. Для этой цели суспензию, содержащую наночастицы и защитное средство, помещают в распылительную сушилку с контролируемыми условиями обработки (температура воздуха на входе, температура воздуха на выходе, давление воздуха, скорость подачи образца, всасывание и расход воздуха). Специалист в данной области техники может подобрать наиболее подходящие условия обработки в каждом конкретном случае.

Этот способ обеспечивает возможность получения наночастиц в виде сухого порошка, который сохраняет стабильность на протяжении длительных периодов времени при контролируемых условиях или условиях окружающей среды и может быть легко включен в различные конечные твердые и жидкие продукты.

Поскольку наночастицы получают перед добавлением защитного средства, оно не образует конъюгаты или комплексы с матрицей альбумина.

В еще одном частном варианте осуществления настоящего изобретения, когда наночастицы, используемые в изобретении, покрывают неионным полимером, указанные наночастицы с покрытием могут быть получены путем инкубации наночастиц альбумина с моноклональными антителами, полученных после этапов а) - с) описанного выше способа, с неионным полимером.

В частном варианте осуществления изобретения, неионный полимер может представлять собой любой из вышеописанных. Является предпочтительным, когда указанный полимер выбран из гидроксипропилметилцеллюлозы, фталата гидроксипропилметилцеллюлозы, крахмала, декстрана 70, Eudagrit® NM, Eudagrit® NE, поливинилпирролидона и полиэтиленгликоля (PEG). Более предпочтительно неионный полимер выбран из гидроксипропилметилцеллюлозы, фталата гидроксипропилметилцеллюлозы и PEG 35000.

В частном варианте осуществления изобретения, весовое отношение неионный полимер / альбумин составляет от 0,02 до 5, более предпочтительно от 0,05 до 2.

В еще одном частном варианте осуществления изобретения, инкубации наночастиц в неионном полимере выполняют менее 1 часа, более предпочтительно менее 45 минут.

Фармацевтическая композиция.

Описанные выше наночастицы обладают способностью удерживать моноклональные антитела и защищать их в процессе обработки и хранения, а также до конечной доставки в заданную биологическую область. Таким образом, дезактивация моноклональных антител после включения в состав различных конечных продуктов (например, фармацевтических композиций или косметических композиций) полностью предотвращается или существенно снижается. Экспериментальные исследования показали, что моноклональные антитела сохраняют целостность в матрице альбумина.

Кроме того, наночастицы изобретения обеспечивают возможность пролонгированного высвобождения моноклональных антител, которые также сохраняют всю полноту биологической активности и, таким образом, представляют собой систему доставки лекарственных препаратов, представляющих большой интерес для применения in vivo в соответствии с данными по биологической активности, полученными в животной модели неоваскуляризации роговицы. Проведенные эксперименты in vivo показали, что наночастицы альбумина с моноклональными антитела обеспечивают значительное снижение площади глаза с васкуляризацией роговицы по сравнению с введением тех же моноклональных антител в свободной форме.

Кроме того, анализы биораспределения, выполненные с использованием наночастиц изобретения, указывают на то, что они способны концентрироваться в опухолевых тканях, что делает их очень многообещающими системами наночастиц для высвобождения моноклональных антител в пораженные раковые ткани.

Таким образом, в другом аспекте изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей множество наночастиц, как определено выше, в виде суспензии или сухого порошка и вспомогательное вещество, фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель.

Характеристики наночастиц уже определены выше и включены в настоящий документ посредством ссылки.

В частном варианте осуществления изобретения, наночастицы, содержащиеся в фармацевтической композиции изобретения, находятся в виде сухого порошка.

Несмотря на возможность использования любых способов введения фармацевтической композиции в контексте настоящего изобретения, предпочтительно фармацевтическая композиция вводится человеку или животному перорально, местно или парентерально, более предпочтительно путем внутривенного введения, внутриартериального введения, внутрилегочного введения, внутриглазного введения, внутримышечного введения, внутрикожного или подкожного введения, перорального введения или ингаляции.

Более предпочтительно фармацевтическая композиция содержит наполнитель или носитель, приемлемый для перорального, местного или парентерального введения.

В зависимости от конкретного способа введения фармацевтическая композиция может быть приготовлена в виде таблеток, драже, капсул, пакетов-саше, гранул, порошков, суспензий, эмульсий, безводных или гидратированных композиций для наружного применения и растворов.

Фармацевтически приемлемые носители или наполнители хорошо известны специалистам в данной области техники и общедоступны. Предпочтительно фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель является химически инертным к активной композиции и каждому из ее компонентов и не связан с отрицательными побочными действиями или токсичностью при условиях применения.

В некоторых частных вариантах осуществления настоящего изобретения, фармацевтическая композиция выполнена с возможностью использования в качестве системы доставки для транспортировки лекарственного препарата при пероральном, местном, парентеральном или внутривенном введении в систему кровообращения пациента.

Композиции, подходящие для перорального введения, включают жидкие растворы, такие как эффективное количество наночастиц или содержащей их композиции, растворенных в разбавителях, таких как вода или физиологический раствор: капсулы, пакеты-саше, таблетки, пастилки, каждая из которых содержит предварительно заданное количество наночастиц, порошки, суспензии в соответствующей жидкости и эмульсии.

Композиции для местного применения включают водные офтальмологические растворы или суспензии, офтальмологическую мазь, глазной имплантат или любую другую композицию, способную доставлять наночастицы на наружную поверхность глаза. Предпочтительно композиция для местного применения представляет собой офтальмологический раствор или суспензию, содержащую наночастицы для применения в качестве жидких капель. Любая из вышеуказанных композиций может включать подходящий растворитель, консерванты и другое фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, широко применяемое в офтальмологических композициях.

Парентеральные композиции, как правило, содержат от 0,5% до 25% по массе наночастиц в растворе. Указанные композиции могут быть приготовлены в виде однодозовых или многодозовых герметичных контейнеров, таких как ампулы и флаконы, и могут храниться в сублимированном (лиофилизированном) состоянии, требуя добавления стерильного жидкого носителя, например воды для инъекций, только непосредственно перед применением.

Заболевания, подлежащие лечению.

Как указано выше, было продемонстрировано, что наночастицы альбумина и моноклональных антител являются очень многообещающей системой доставки лекарственных препаратов для лечения глазных заболеваний и рака.

Таким образом, еще один аспект настоящего изобретения относится к наночастицам или определенной выше композиции для лечения глазных заболеваний.

В частном варианте осуществления данного аспекта изобретения, наночастица содержит твердое ядро, указанное твердое ядро, содержащее несшитую матрицу альбумина и моноклональные антитела, в которой моноклональные антитела распределены по объему матрицы альбумина, указанное твердое ядро не покрыто полимером. Более конкретно, указанное твердое ядро не покрыто неионным полимером.

В еще одном частном варианте варианте осуществления данного аспекта изобретения, наночастица содержит твердое ядро, указанное твердое ядро, состоящее из несшитой матрицы альбумина и моноклональных антител, в которой моноклональные антитела распределены по объему матрицы альбумина, указанное твердое ядро не покрыто полимером. Более конкретно, указанное твердое ядро не покрыто неионным полимером.

В еще одном частном варианте осуществления данного аспекта изобретения, наночастица содержит твердое ядро, указанное твердое ядро состоит из несшитой матрицы альбумина и моноклональных антител, в которой моноклональные антитела распределены по объему матрицы альбумина, указанное твердое ядро не покрыто полимером. Более конкретно, указанное твердое ядро не покрыто неионным полимером.

В еще одном частном варианте осуществления данного аспекта изобретения, наночастица содержит твердое ядро, указанное твердое ядро, состоящее из несшитой матрицы альбумина и моноклональных антител, в которой моноклональные антитела распределены по объему матрицы альбумина, указанное твердое ядро не покрыто полимером. Более конкретно, указанное твердое ядро не покрыто неионным полимером.

В другом аспекте настоящего изобретения, оно также относится к способу лечения заболевания глаз, указанный способ содержит введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, наночастиц или композиции, содержащей наночастицы, как описано выше.

В еще одном аспекте настоящее изобретение также относится к применению наночастиц или композиции, содержащей наночастицы, как описано выше, для получения лекарственного препарата для лечения глазных заболеваний.

Указанную композицию можно вводить пациенту перорально, местно или путем внутриглазной инъекции. В предпочтительном варианте осуществления композицию вводят местно, например путем нанесения на слизистую оболочку глаза или интравитреальной инъекции.

Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения при введении наночастиц для лечения заболевания глаз указанные наночастицы вводят в составе местной или инъекционной фармацевтической композиции, такой как описана выше.

В еще одном частном варианте осуществления изобретения, заболевание глаз, подлежащая лечению, выбрана из макулярной дегенерации, неоваскуляризации или ангиогенеза роговицы, неоваскуляризации или ангиогенеза радужки, неоваскуляризации или ангиогенеза сетчатки, диабетической пролиферативной ретинопатии, недиабетической пролиферативной ретинопатии, глаукомы, инфекционного конъюнктивита, аллергического конъюнктивита, язвенного кератита, неязвенного кератита, эписклерита, склерита, диабетической ретинопатии, увеита, эндофтальмита, инфекционных процессов и воспалительных процессов.

Еще один аспект настоящего изобретения относится к наночастицам или определенной выше композиции для лечения рака.

В частном варианте осуществления данного аспекта настоящего изобретения, наночастица содержит твердое ядро, указанное твердое ядро, содержащее несшитую матрицу альбумина и моноклональные антитела, в которой моноклональные антитела распределены по объему матрицы альбумина, указанное твердое ядро покрыто неионным полимером.

В еще одном частном варианте осуществления данного аспекта настоящего изобретения, наночастица содержит твердое ядро, указанное твердое ядро, состоящее из несшитой матрицы альбумина и моноклональных антител, в которой моноклональные антитела распределены по объему матрицы альбумина, указанное твердое ядро покрыто неионным полимером.

В еще одном частном варианте осуществления данного аспекта настоящего изобретения, наночастица содержит твердое ядро, указанное твердое ядро состоит из несшитой матрицы альбумина и моноклональных антител, в которой моноклональные антитела распределены по объему матрицы альбумина, указанное твердое ядро покрыто неионным полимером.

В еще одном частном варианте осуществления данного аспекта настоящего изобретения, наночастица содержит твердое ядро, указанное твердое ядро, состоящее из несшитой матрицы альбумина и моноклональных антител, в которой моноклональные антитела распределены по объему матрицы альбумина, указанное твердое ядро покрыто неионным полимером.

В другом аспекте настоящего изобретения, оно также относится к способу лечения рака, указанный способ содержит введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, наночастиц или композиции, содержащей наночастицы, как описано выше.

В еще одном аспекте настоящего изобретения, оно также относится к применению наночастиц или композиции, содержащей наночастицы, как описано выше, для получения лекарственного препарата для лечения рака.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, указанную композицию вводят пациенту парентерально, например путем внутривенного, внутриартериального, внутримышечного или подкожного введения.

Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления изобретения при введении наночастиц для лечения рака указанные наночастицы вводят в составе парентеральной композиции, такой как описана выше.

В еще одном частном варианте осуществления изобретения, рак, подлежащий лечению, включает, помимо прочего, карциному, лимфому, бластому, саркому и лейкемию. Примеры рака, подлежащего лечению путем введения наночастиц, включают, например, рак молочной железы, рак легких, рак поджелудочной железы, множественную миелому, почечно-клеточную карциному, рак предстательной железы, меланому, рак толстой кишки, колоректальный рак, рак почки, рак шейки матки, рак яичников, рак печени, почек и ЖКТ, рак мочевого пузыря или плоскоклеточный рак.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, наночастицы, используемые в настоящем изобретении, или содержащие их композиции могут быть введены со второй терапевтической композицией и/или вторым лекарственным препаратом для лечения глазных заболеваний или рака.

Частота приема композиции и второй композиции или второго лекарственного препарата может быть скорректирована на протяжении курса лечения. В некоторых вариантах осуществления изобретения, первый и второй лекарственный препараты вводят одновременно, последовательно или параллельно. При отдельном введении композицию наночастиц и вторую композицию можно вводить с различной частотой или интервалами.

В качестве альтернативы наночастицы, используемые в настоящем изобретении, могут содержать второе моноклональное антитело или лекарственный препарат для обеспечения комбинированной терапии.

Указанный лекарственный препарат включает, например, другие белки, такие как кальцитонин, инсулин или циклоспорин А.

Второе моноклональное антитело может быть любым из указанных выше, представляя собой, например, бевацизумаб (Авастин®), ранибизумаб (Луцентис®), трастузумаб (Герцептин®), цетуксимаб (Эрбитукс®) или ритуксимаб (Мабтера®).

Примеры.

В приведенных ниже примерах используются следующие сокращения.

BEVA - бевацизумаб.

B-NP - наночастицы альбумина, наполненные бевацизумабом.

HSA - человеческий сывороточный альбумин.

РМ - механическая смесь.

NP-Glu - наночастицы альбумина, сшитые с глутаральдегидом.

B-NP-GLU - наночастицы альбумина, сшитые с глутаральдегидом и наполненные бевацизумабом.

NP-PEG35 - наночастицы альбумина, покрытые полиэтиленгликолем 35000.

B-NP-PEG35 - наночастицы альбумина, наполненные бевацизумабом и покрытые полиэтиленгликолем 35000.

B-NP-HPMC-P - наночастицы альбумина, наполненные бевацизумабом и покрытые фталатом гидроксипропилметилцеллюлозы.

B-NP-S100 - наночастицы альбумина, наполненные бевацизумабом и покрытые Eudagrit S-100.

Материалы.

Человеческий сывороточный альбумин или HSA (фракция V, степень чистоты 96-99%), полиэтиленгликоль 35000 (PEG35) и 25% водный раствор глутаральдегида (GLU) были получены от компании Sigma (Мадрид, Испания).

Бевацизумаб (Авастин®) был приобретен у компании Roche (Испания). Гидроксипропилметилцеллюлоза K100 LV (НРМС; ММ 164000) производства компании Ashland Chemical Hispania (Испания). Авастин® поставляется в виде концентрата для приготовления раствора для инфузий в одноразовых флаконах с номинальным содержанием 100 мг бевацизумаба во флаконе объемом 4 мл или 400 мг бевацизумаба во флаконе объемом 16 мл (концентрация 25 мг/мл). Фталат гидроксипропилметилцеллюлозы (НРМС-Р) был приобретен у компании Acros Organic (Испания). Набор для анализа белка Micro ВСА был приобретен у компании Pierce (Thermo Fisher Scientific Inc., штат Иллинойс, США). Набор для иммуноферментного анализа Shikari Q-beva, используемый для определения бевацизумаба, был приобретен у компании Matriks Biotech (Турция). Ацетон был приобретен у компании Prolabo, VWR International Ltd (Англия), а хлорид олова дигидрат и чистый спирт были приобретены у компании Рапгеас Pharma (Испания). Изофлуран был приобретен у компании Braun, а средство для безболезненного умерщвления Т-69 Intervet - у компании Schering-Plough Animal Health. Элюат пертехнетата с технецием-99 т был получен из генератора Drytec® 99Mo-99mTc, приобретенного у компании General Electric.

Для физико-химических исследований использовали следующие приборы: спектрометр Thermo / Nicolet 360FT-IR (E.S.P.Thermo Fisher Scientific, США), дифрактометр Bruker Axs D8 Advance (Германия), для термогравиметрического анализа (ТГ) и дифференциальной сканирующей колориметрии (ДСК) использовали калориметр Mettler Toledo dsc822e с роботом для отбора проб Mettler Toledo TSO 801 RO и охладителем Julabo FT900, а для элементного анализа - элементный анализатор LECO CHN-900 (штат Мичиган, США).

Для исследований с использованием радиомечения и исследований биораспределения использовали следующие приборы: ОФЭКТ-КТ Symbia, Siemens Medical Systems (Германия), калибратор активности AtomLab 500, Biodex (США), гамма-счетчик LKB Pharmacia.

Физико-химическая характеристика наночастиц (размер, дзета-потенциал и морфология).

Размер и дзета-потенциал наночастиц определяли в приборе Zeta Plus (Brookhaven Inst. Corp., США). Диаметр наночастиц определяли после диспергирования в сверхчистой воде (1/10) и измеряли при 25°С способом динамического светорассеяния под углом 90°С. Дзета-потенциал определяли следующим образом: 200 мкл образца растворяли в 2 мл раствора 1 мМ KCl с рН, приведенным к 7,4.

Морфологические характеристики наночастиц исследовали с использованием сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) под цифровым сканирующим электронным микроскопом Zeiss DSM940 (Оберкохен, Германия). Для этой цели образцы диспергировали в воде и центрифугировали при 27000 g в течение 20 минут при 4°С для удаления криопротектора. Затем микросферы помещали на стеклянные пластинки, приклеенные двусторонней клейкой лентой к металлическим стержням, и высушивали. На них напыляли слой платины с палладием толщиной 4 нм с использованием устройства для ионного напыления Cressington 208HR с планетарным/наклонным столиком, оборудованного регулятором толщины МТМ-20. СЭМ выполняли с использованием прибора LEO 1530 (LEO Electron Microscopy Inc, Торнвуд, штат Нью-Йорк, США) при напряжении 1-3 кВ и силе тока накала около 0,5 мА.

Выход.

Количество HSA, превращенное в наночастицы (выход) определяли путем подсчета HSA, образующего наночастицы, с использованием набора Micro ВСА. Коротко говоря, 10 мг наночастиц взвешивали и диспергировали в 10 мл сверхчистой воды и центрифугировали при 15000 об/мин в течение 15 минут при 4°С (Rotor 3336, Biorage Heraeus, Ханау, Германия). Затем микросферы измельчали с 1 мл 0,02 Н NaOH, и 200 мкл этого раствора переносили в 96-луночный микропланшет с дальнейшим использованием для анализа белка Micro ВСА в спектрофотометре при 562 нм.

Избирательность набора определяли с использованием контролей, содержащих другие вспомогательные вещества и препараты (глутаральдегид, PEG 35 000, НРМС или бевацизумаб), для определения возможных искажений при определении альбумина. Анализ данных выполняли с использованием следующей формулы:

где Wлиоф - количество HSA, преобразованного в наночастицы,

a Wисх - количество HSA, использованное для получения наночастиц.

Подсчет полезной нагрузки препарата в наночастицах.

Количество антител, содержащихся в наночастицах альбумина, оценивали с использованием иммуноферментного анализа (Shikari Q-BEVA). Для этой цели 10 мг наночастиц взвешивали и диспергировали в 1 мл воды. Суспензию центрифугировали в течение 10 минут при 10000 об/мин (Rotor 3336, Biofuge Heraeus, Ханау, Германия). Надосадочную жидкость удаляли. Затем наночастицы растворяли в 1 мл 0,02 Н NaOH. 200 мкл полученного раствора переносили в 96-луночный микропланшет, покрытый человеческим фактором роста эндотелия сосудов (VEGF), и выполняли специфический ИФА для бевацизумаба (процедура испытаний Q-Beva, Shikari Q-Beva, Matriks Biotek).

Каждый образец анализировали в трех повторностях и выполняли расчеты с использованием стандартных кривых в диапазоне от 0,1 до 100 мкг/мл (r2>0,993). Пределы обнаружения и количественного определения составляли 0,1 мкг/мл и 100 мкг/мл соответственно (r2>0,993).

Нагрузка бевацизумаба (DL) и эффективность включения (ЕЕ) рассчитывали по следующим формулам:

где Wвкл - количество включенного бевацизумаба,

Wобщ - общее количество использованного препарата,

a Wнч - масса наночастиц.

ИК-Фурье-спектроскопия.

Молекулярную структуру наночастиц HSA исследовали с использованием ИК-Фурье-спектроскопии. Инфракрасные спектры образцов, диспергированных в 1% образца в дисках KBr, снимали на Фурье-ИК-спектрометре NICOLET (Thermo / Nicolet 360FT-IR E.S.P. Thermo Fisher Scientific, США). Образцы сканировали в диапазоне от 4000 до 400 см-1. Условия съемки были следующими: разрешение 8,0 и 40-кратное сканирование образцов. Данные анализировали с использованием программного обеспечения OMNIC (Thermo Fisher Scientific, США).

Рентгенографические исследования.

Рентгенографические исследования выполняли для изучения распределения кристаллографических плоскостей и изменчивости степени кристалличности полимерной матрицы в различных образцах наночастиц. Для этой цели образцы в виде порошка на металлической пластинке помещали в дифрактометр (Bruker Axs D8 Advance, Германия) и измеряли в диапазоне углов до 360° при комнатной температуре. Дифрактограммы анализировали с использованием программы Diffrac.Suite.

Термический анализ.

Реакцию различных наночастиц на изменения температуры исследовали с использованием термического анализа (термогравиметрического анализа (ТГА) в сочетании с дифференциальным термическим анализом (ДТА)). Анализировали изменения поведения при термическом воздействии функциональных групп HSA во время образования наночастиц. Термические анализы проводили на анализаторе термогравиметрического и дифференциально-термического анализа TGA/sDTA 85 le Mettler Toledo. Термограммы получали путем нагрева около 5-10 мг образца в перфорированном алюминиевом тигле с частотой сканирования 10°С/мин от 25 до 250°С. Термические анализы выполняли в атмосфере неподвижного воздуха с использованием N2 (20 мл-мин-1) в качестве продувочного газа. Измерения выполняли в трех повторностях.

Элементный анализ.

Элементный анализ (С, Н, О и N) наночастиц выполняли для подтверждения связи различных стабилизирующих добавок в наночастицах HSA на элементном анализаторе LECO CHN-900 (штат Мичиган, США). Коротко говоря, 1 мг каждого образца испытывали в трех повторностях с выражением результатов в процентах (% по массе) с СО ± 0,4. Этот способ демонстрирует изменения в составе кислорода, водорода или азота альбумина (HSA) при связывании с другими компонентами (глутаральдегидом, PEG35, НРМС-Р или бевацизумабом).

Исследование высвобождения in vitro.

Исследования высвобождения in vitro наночастиц альбумина, наполненных бевацизумабом, выполняли в PBS (рН 7,4). Пробирки Эппендорфа, содержащие 10 мг каждой композиции наночастиц, диспергировали в общем объеме 1 мл PBS, помещенном в пробирки Эппендорфа, и помещали во встряхивающую баню при 37°С при постоянном перемешивании с частотой 60 циклов/мин (Unitronic 320 OR, Selecta, Мадрид, Испания). Пробирки Эппендорфа отбирали с различными временными интервалами и центрифугировали в течение 10 минут при 10000 об/мин (Rotor 3336, Biofuge Heraeus, Ханау, Германия). Надосадочные жидкости анализировали для определения содержания бевацизумаба с использованием специфического ИФА (Shikari Q-Beva, Matriks Biotek). Профили высвобождения выражали в совокупном высвобождении в процентах и наносили на график изменения по времени.

Кроме того, на основе профилей высвобождения оценивали кинетику с использованием экспоненциальной модели на основе уравнения Корсмейера - Пеппаса (ур. 4):

где Q - процентная доля высвобождения препарата в момент времени

t,

K - константа, учитывающая структурные и геометрические характеристики исследуемого устройства, n - диффузионная экспонента, которая, как правило, используется в качестве показателя механизма транспортировки препарата в лекарственной форме.

Значение n≤0,43 показывает, что высвобождение препарата происходит согласно фиковской диффузии, тогда как значение n≥0,85 указывает на то, что в высвобождении препарата преобладает механизм эрозии. Для значений 0,43<n<0,85 высвобождение обозначается как аномальное, подразумевая, что высвобождение препарата обусловлено сочетанием диффузии и эрозии [Gao Y., et al., In Vitro Release Kinetics of Antituberculosis Drugs from Nanoparticles Assessed Using a Modified Dissolution Apparatus. Biomed Research International 2013].

Пример 1. Получение наночастиц человеческого сывороточного альбумина, наполненных бевацизумабом. Влияние отношения бевацизумаб/HSA на физико-химические свойства полученных наночастиц.

Наночастицы, наполненные бевацизумабом, получали с использованием процедуры осаждения белков в водной среде перед очисткой и сушкой.

Для этой цели 100 мг HSA и переменное количество бевацизумаба (BEVA) (1-20 мг) растворяли в 5-10 мл воды для инъекций, а затем раствор титровали до рН 4,1-4,4 с использованием 1 М HCL. Смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 10 минут. Наночастицы получали путем непрерывного добавления 16 мл этанола, используемого в качестве десольватирующего средства при постоянном перемешивании (500 об/мин) при комнатной температуре. Полученные наночастицы очищали двумя различными способами - ультрацентрифугированием и ультрафильтрацией. В первом наночастицы очищали дважды путем центрифугирования при 21000 g в течение 20 минут при 4°С (Sigma 3K30, Остероде-ам-Харц, Германия) и повторного диспергирования микросфер в исходном объеме в воде. Во втором наночастицы очищали путем ультрафильтрации через полисульфоновый мембранный фильтрующий элемент с размером пор 50 кДа (Medica SPA, Италия). Затем наночастицы лиофилизировали в приборе Genesis 12EL (Virtis, штат Нью-Йорк, США) после повторного диспергирования или 5% водного раствора сахарозы. Эти композиции представляют собой наночастицы человеческого сывороточного альбумина, наполненные частицами бевацизумаба, без какой-либо дополнительной стабилизации, далее - композиции B-NP.

Для включения моноклональных антител в наночастицы определяли два ключевых параметра- отношение бевацизумаб / альбумин и время инкубации для обеих композиций перед образованием наночастиц. В сводной таблице 1 приведены основные физико-химические свойства полученных наночастиц при изменении отношения моноклональные антитела / белок. При низком отношении бевацизумаб / альбумин (например, 0,01) наночастицы не сохраняли стабильность с течением времени. Для отношений выше 0,01 полученные наночастицы сохраняли стабильность при среднем размере, близком к 300 нм, и отрицательном поверхностном заряде около -15 мВ.

Аналогичным образом расчетный выход технологического процесса составил около 80%. На фигуре 1 показано влияние отношения бевацизумаб / альбумин на содержание моноклональных антител.

В соответствии с данными результатами количество бевацизумаба, содержащегося в наночастицах, возрастало с увеличением отношения BEVA/HSA. Все эти эксперименты проводили после 10 минут инкубации между моноклональными антителами и белком. Примечательно, что при увеличении этого параметра не наблюдались значимые различия в физико-химических свойствах наночастиц.

Таблица 1. Влияние отношения бевацизумаб / альбумин на физико-химические свойства полученных наночастиц. Время инкубации между бевацизумабом и альбумином - 10 минут. Данные выражены в виде среднего значения ± СО (n=3).

Пример 2. Влияние сшивки наночастиц, наполненных бевацизумабом, с глутаральдегидом на их физико-химические свойства.

В связи с тем фактом, что наночастицы человеческого сывороточного альбумина в отсутствие бевацизумаба не сохраняли стабильность и исчезали сразу же после образования, контрольные наночастицы, наполненные бевацизумабом, были получены путем сшивки с 12,5 мкг глутаральдегида в этаноле (300 мкл), далее - композиции B-NP-GLU. Для этой цели только что образовавшиеся наночастицы, наполненные бевацизумабом, инкубировали в течение 5 минут с глутаральдегидом перед очисткой и лиофилизацией.

В сводной таблице 2 приведены основные физико-химические свойства необработанных наночастиц HSA (без дополнительных процедур стабилизации) и контрольных наночастиц, полученных путем сшивки с глутаральдегидом. Путем включения бевацизумаба в наночастицы альбумина получали стабильные наночастицы с высоким содержанием антител. Примечательно, что эффективность включения, рассчитанная как содержание активных моноклональных антител в наночастицах, была близкой к 90% при содержании бевацизумаба около 13%. При сшивке наночастиц, наполненных бевацизумабом, с глутаральдегидом, полученные наночастицы были незначительно меньше полученных без химического сшивающего агента. Тем не менее, обработка наночастиц глутаральдегидом инактивировала моноклональные антитела, и количественная оценка с использованием ИФА показала очень низкие уровни антител.

Пример 3. Характеристика наночастиц, наполненных бевацизумабом.

ПЭМ.

На фиг. 2 показана морфология наночастиц, наполненных бевацизумабом (B-NP), которые имеют сферическую форму и неровную поверхность.

ИК-Фурье-спектроскопия.

ИК-спектроскопия позволяет оценить проявление конформационньгх изменений во вторичной структуре белка. На фиг. 3 показаны ИК-Фурье-спектры наночастиц, наполненных бевацизумабом, в сравнении с отдельными спектрами моноклональных антител, белка и их механической смеси.

ИК-спектры белков демонстрируют большое количество амидных связей, которые отражают различные колебания пептидных групп. Такие сигналы: амидная полоса I в диапазоне от 1600 до 1700 см-1 (главным образом участок С=О) и амидная полоса II при 1550 см-1 (участок C-N, связанный с изгибными колебаниями N-H) - использовались в качестве подтверждения присутствия такой химической связи и ее непосредственного отношения ко вторичной структуре белка. Тем не менее, амидная полоса I более чувствительна к изменению вторичной структуры белка, чем амид II. Таким образом, изменения частоты и силы этих сигналов являются подтверждением взаимодействия с белком.

В данном случае и в связи с тем фактом, что наночастицы образованы двумя различными белками (альбумином и бевацизумабом), наблюдались небольшие изменения частоты сигнала, соответствующие пику амида I (1642 для HSA и 1645 см-1 для B-NP).

В качестве контроля также исследовали наночастицы, сшитые с глутаральдегидом. В этом случае также было обнаружено незначительное смещение частот амида I (1642-1645 см-1) вследствие взаимодействия между глутаральдегидом и альбумином.

Рентгенографические исследования.

На фиг. 4 показаны рентгеновские спектры человеческого сывороточного альбумина, бевацизумаба и наночастиц, наполненных бевацизумабом. Во всех случаях такие спектры показывают аморфную структуру.

Термический анализ.

Термические анализы были выполнены для определения реакции между функциональными группами HSA и бевацизумаба. На фиг. 5 показаны термограммы нативного альбумина (HSA) и бевацизумаба (BEVA) (А), наночастиц с бевацизумабом (B-NP) и механической смеси (P.M.) альбумина и бевацизумаба (В), нативного альбумина (HSA) и глутаральдегида (GLU) (С), наночастиц, сшитых с глутаральдегидом (NP-GLU), и механической смеси (P.M.) альбумина и глутаральдегида (D).

Термограммы показывают, что нативный альбумин обладает экзотермическим эффектом около 30°С, который соответствует обратимому переходу, и вторым тепловым эффектом, связанным с эндотермическим переходом стеклования.

Отсутствие в наночастицах экзотермического сигнала, соответствующего альбумину, может быть обусловлено сочетанием альбумина с белком (BEVA) и сшивающим агентом (глутаральдегидом). Таким образом, бевацизумаб и альбумин образуют комплекс.

Элементный анализ.

В таблице 3 приведены данные элементного анализа человеческого сывороточного альбумина, бевацизумаба, наночастиц альбумина, сшитых с глутаральдегидом, и наночастиц альбумина, наполненных бевацизумабом. Бевацизумаб демонстрирует значительно более низкое содержание углерода и азота по сравнению с человеческим сывороточным альбумином. Напротив, содержание кислорода в моноклональных антителах примерно в два раза выше, чем в альбумине. Аналогичным образом наночастицы, наполненные бевацизумабом (B-NP), демонстрировали более низкую долю азота и более высокое содержание кислорода по сравнению с нативным альбумином.

Пример 4. Стабильность наночастиц, наполненных бевацизумабом.

Стабильность наночастиц оценивали в сверхчистой воде. Образцы диспергировали в очищенной воде и хранили при комнатной температуре в течение 3 суток. Через различные интервалы времени оценивали стабильность путем измерения размера, коэффициента полидисперсности и дзета-потенциала наночастиц.

После диспергирования в воде (при рН, приведенном к 7,4) наночастицы, наполненные бевацизумабом, сохраняли стабильность на протяжении по меньшей мере 24 часов (фиг. 6). Их поведение было аналогичным наблюдаемому для пустых наночастиц, сшитых с глутаральдегидом (фиг. 6). Аналогичным образом эксперимент не влиял на коэффициент полидисперсности (КП) B-NP. Так, при t=0 КП составлял 0,19±0,01, а через 24 часа этот параметр составлял 0,16±0,03 (данные не показаны).

Пример 5. Высвобождение in vitro бевацизумаба из наночастиц.

На фиг. 7 показан профиль высвобождения in vitro бевацизумаба из наночастиц альбумина в PBS. Этот профиль характеризовался первоначальным взрывным эффектом с высвобождением около 23% включенных антител за первые 5 минут с последующим медленным контролируемым высвобождением на протяжении следующих 24 часов. В конце эксперимента было достигнуто высвобождение около 40% включенного бевацизумаба. Взрывное высвобождение может быть связано с антителами, адсорбированными на поверхности наночастиц.

Пример 6. Получение и характеристика наночастиц альбумина, наполненных бевацизумабом, с покрытием.

Включение бевацизумаба в наночастицы человеческого сывороточного альбумина, покрытые различными соединениями, было выполнено с использованием процедуры, состоящей из четырех этапов. В частности, были выбраны неионные НРМС-Р и PEG35 для оценки их способности к связыванию с наночастицами, наполненными бевацизумабом. Также использовали ионное покрытие Eudragit S-100.

Первый этап заключался в получении наночастиц в водной среде. После этого на наночастицы наносили покрытие путем простой инкубации в водной среде. Третий этап использовался для очистки полученных наночастиц, которые высушивали на заключительном этапе.

Первый этап. 100 мг HSA и переменное количество бевацизумаба (1-20 мг) растворяли в 5-10 мл воды для инъекций, а затем раствор титровали до рН 4,1-4,4 с использованием 1 М HCl. Смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 10 минут. Наночастицы получали путем непрерывного добавления 16 мл этанола, используемого в качестве десольватирующего средства при постоянном перемешивании (500 об/мин) при комнатной температуре.

Второй этап. Для нанесения покрытия на только что полученные наночастицы, наполненные бевацизумабом, добавляли одно из следующих соединений: PEG 35000, фталат гидроксиметалпропилцеллюлозы или Eudragit S-100.

В качестве контроля наночастицы, наполненные бевацизумабом, стабилизировали путем сшивки с 12,5 мкг глутаральдегида в этаноле (300 мкл) в течение 5 минут, как описано выше.

Третий этап. Полученные наночастицы подвергали очистке. Использовали две различные процедуры - ультрацентрифугирование и ультрафильтрацию. В первом наночастицы очищали дважды путем центрифугирования при 21000 g в течение 20 минут при 4°С (Sigma 3K30, Остероде-ам-Харц, Германия) и повторного диспергирования микросфер в исходном объеме в воде. Во втором наночастицы очищали путем ультрафильтрации через полисульфоновый мембранный фильтрующий элемент с размером пор 50 кДа (Medica SPA, Италия).

Четвертый этап. На завершающем этапе наночастицы лиофилизировали в приборе Genesis 12EL (Virtis, штат Нью-Йорк, США). При использовании в качестве способа очистки ультрацентрифугирования микросферы после завершающего этапа центрифугирования диспергировали в 5% водном растворе сахарозы. При использовании ультрафильтрации микросферы также повторно диспергировали в 5% водном растворе сахарозы.

В сводной таблице 4 приведены основные физико-химические свойства этих наночастиц. В целом количество содержащегося бевацизумаба было во всех случаях аналогичным и близким к 14%. Тем не менее, при инкубации наночастиц, наполненных бевацизумабом, с различными вспомогательными веществами для нанесения покрытия получали наночастицы с измененными физико-химическими свойствами. Так, наночастицы, наполненные бевацизумабом и покрытые PEG35 (B-NP-PEG35), демонстрировали средние размеры и отрицательный дзета-потенциал, аналогичный необработанным наночастицам, наполненным бевацизумабом (B-NP). Напротив, при инкубации В-NP с HPMC-P средний размер получаемых наночастиц значительно возрастал по сравнению с B-NP. При инкубации с ионным Eudragit® S-100 полученные наночастицы демонстрировали меньшие размеры и увеличенный отрицательный дзета-потенциал по сравнению с B-NP. С использованием СЭМ было установлено, что наночастицы альбумина имеют сферическую форму и гладкую поверхность.

Таблица 4. Физико-химические характеристики бевацизумаба, включенного в наночастицы альбумина с покрытием. Данные выражены в виде среднего значения ± СО (n=3). КП - коэффициент полидисперсности. Покровные вещества: S-100 (ионный Eudragit® SI00), НРМС-Р (фталат гидроксипропилметилцеллюлозы), PEG35 (полиэтиленгликоль 35000). Отношение СА / белок - отношение покровное вещество / альбумин. B-NP-GLU - наночастицы альбумина, сшитые с глутаральдегидом и наполненные бевацизумабом. B-NP - необработанные наночастицы альбумина, наполненные бевацизумабом.

Морфологическое исследование (фиг. 8) наночастиц, наполненных бевацизумабом и покрытых PEG35 (B-NP-PEG35), показывает, что они имеют сферическую форму с неровной поверхностью и однородным распределением.

Пример 7. Высвобождение in vitro бевацизумаба из наночастиц с покрытием.

На фиг. 9 показан профиль высвобождения in vitro бевацизумаба из наночастиц альбумина, покрытых двумя неионными полимерами (PEG35 и НРМС-Р) и ионным Eudragit® SI00 в PBS при рН 7,4. Для наночастиц, покрытых PEG35 (B-NP-PEG35), профиль был аналогичен наблюдаемому для необработанных наночастиц (B-NP) с тем отличием, что в конце эксперимента количество высвобожденного бевацизумаба было выше, чем для B-NP. В любом случае эти пегилированные наночастицы обладали двухфазным профилем высвобождения, характеризующимся первоначальным взрывным эффектом в течение первых 5 минут - около 22%, за которым следовал более устойчивый и медленный этап высвобождения, продолжающийся по меньшей мере 24 ч. Взрывное высвобождение составляло около 22% и может быть связано с антителами, адсорбированными на поверхности наночастиц. Двухфазный процесс без учета первых 5 минут взрывного высвобождения был приведен с использованием уравнения Корсмейера - Пеппаса к профилю диффузии (n=0,54; R2=0,994). На этапе диффузии высвобождение бевацизумаба достигало плато на уровне 48% после первых двух часов.

Для наночастиц, покрытых НРМС-Р (B-NP-HPMC-P), количество бевацизумаба, высвобождающегося в течение первых 60 минут, составляло около 40%. После этого наблюдалась постоянная скорость высвобождения оставшихся антител. Тем не менее, в данном случае скорость высвобождения бевацизумаба была выше, чем для B-NP или B-NP-PEG35. Так что через 8 ч. инкубации из наночастиц, покрытых НРМС-Р, высвобождалось около 100% содержащегося в них бевацизумаба.

В отличие от наночастиц с покрытием из неионных полимеров, наночастицы, покрытые Eudragit® S-100 (B-NP-S-100), продемонстрировали профиль немедленного высвобождения.

Пример 8. Целостность бевацизумаба после включения в наночастицы альбумина.

Для подтверждения результатов, полученных с использованием набора ИФА при количественном определении содержания бевацизумаба в наночастицах альбумина, анализировали целостность антител (бевацизумаба), включенных в различные наночастицы, с использованием системы автоматизированного электрофореза на микрофлюидном чипе Experion™ (Bio Rad, США). Образцы оценивали в невосстанавливающих условиях и в восстанавливающих условиях с использованием 2-меркаптоэтанола. Полученные данные обрабатывали с использованием программного обеспечения Experion System.

Наночастицы взвешивали и измельчали с 1 мл 0,005 Н NaOH. Концентрация различных растворов составляла около 400 нг белка/мкл (линейный динамический диапазон испытания - 5-2000 нг/мкл). В качестве контролей использовали образцы свободного белка (альбумина и бевацизумаба). Все эти образцы оценивали в полученном виде или после обработки β-меркаптоэтанолом и нагрева. Затем образцы обрабатывали в соответствии с протоколом набора для анализа Experion System Pro260 (Bio-Rad Lab., США). После загрузки образцов и контролей в чип их анализировали с использованием системы автоматизированного электрофореза Experion™ (Bio Rad, США).

Результаты получали в виде денситометрических полос на смоделированном гель-электрофоретическом изображении. Каждая полоса соответствует отдельному образцу. Программное обеспечение Experion определяет различные пики размеров и выражает их в килодальтонах (кДа) на контрольной полосе системы.

Результаты анализа показаны на фиг. 10. В дорожке 5 полоса бевацизумаба наиболее выражена в районе 150 кДа. Аналогичная полоса наблюдалась для дорожек 2 (B-NP) и 3 (B-NP-PEG35). Аналогичным образом в дорожках 1-3 также четко отображаются полосы, соответствующие альбумину (дорожка 4).

Пример 9. Исследование биораспределения наночастиц, введенных через глаза крысам Вистар.

Исследование биораспределения радиомеченых наночастиц у крыс Вистар для визуализации ОФЭКТ-КТ in vivo.

Для радиомечения наночастиц использовали 99mTc путем восстановления 99mTc-пертехната хлоридом олова способом, описанным в других источниках. Если вкратце, 20 мкл раствора хлорида олова дигидрата в воде для инъекций с конечной концентрацией олова 0,02 мг/мл добавляли к 9 мг лиофилизированных наночастиц с последующим добавлением 60 мкл элюата 99mTcO4 к предварительно восстановленному олову. 4 мкл радиомеченой суспензии наночастиц (5 МБк) смешивали с 0,6 мг композиции немеченых наночастиц, полученную смесь осторожно вводили в правый глаз крысам Вистар, анестезированным изофлураном.

Офтальмологическое введение крысам Вистар для визуализации ОФЭКТ-КТ in vivo.

Животных анестезировали в течение одного часа во избежание активного удаления суспензии из глаза, затем пробуждали и снимали изображения ОФЭКТ-КТ в шести различных временных точках от 5 ч. до 17 ч. 30 мин. с момента введения наночастиц.

При визуализирующих исследованиях животных анестезировали перед каждым исследованием изофлураном и помещали в положение лежа на животе в систему ОФЭКТ-КТ Symbia Т2 Truepoint (Siemens). Изображения получали с использованием матрицы 128×128, 7 изображений/с; КТ использовали с параметрами 110 мАс и 130 кВ, 130 изображений толщиной 3 мм. Слияние изображений выполняли с использованием программного обеспечения Syngo MI Applications TrueD. Изображения обрабатывали и количественно оценивали с использованием встроенного программного комплекса. Количественные значения получали путем автоматического построения изоконтура в трех плоскостях для выбранных зон с получением исследуемых объемных областей (VOI), для которых определяли средние значения количеств.

На фиг. 11 и 12 показано биораспределение B-NP и B-NP-PEG35 после введения в глаза в виде глазных капель. Радиоактивность, связанная с наночастицами, сохранялась в глазу на протяжении по меньшей мере 4 ч. в случае B-NP и 8 ч. в случае B-NP-PEG35, хотя она медленно исчезала из места введения, перемещаясь в желудочно-кишечный тракт. Перемещение радиомеченых наночастиц через глотку животного наблюдается на крайнем верхнем слева изображении на фиг. 11. Интенсивность изображений ОФЭКТ на фиг. 11 была приведена к максимальной интенсивности каждого отдельного изображения для повышения точности оценки положения радиоактивности в организме животного.

Полуколичественная оценка радиоактивности с течением времени с поправкой на затухание показана в графическом виде на фиг. 12 для B-NP. Результаты для B-NP-PEG35 были очень схожими, но выведение указанных частиц происходило дольше, поскольку они больше времени остаются в глазу.

Пример 10. Биораспределение наночастиц после внутривенного введения самцам крыс Вистар

Для визуализирующих экспериментов по биораспределению in vivo крысам Вистар вводили меченые 99mTc наночастицы HSA, наполненные бевацизумабом (B-NP), и наночастицы HSA, наполненные бевацизумабом и покрытые PEG35 (B-NP-PEG35). Вводили внутривенно однократную дозу 5 мг бевацизумаба / кг веса тела и снимали изображения раз в два часа на протяжении до десяти часов с момента введения.

Через 1 час после внутривенного введения радиоактивность, связанная с инъекцией B-NP и B-NP-PEG35, наблюдалась в печени и почках, как показано на фиг. 13. Кроме того, следует отметить, что B-NP-PEG35 в меньшей степени поглощается печенью. B-NP и В- NP-PEG35 не накапливаются ни в каких органах.

Пример 11. Влияние наночастиц альбумина, наполненных бевацизумабом, на неоваскуляризации) роговицы.

Самцы крыс Вистар весом приблизительно 200 г были получены из компании Harlan для анализа эффективности наночастиц, наполненных бевацизумабом, в крысиной модели неоваскуляризации роговицы. Исследования были одобрены этическим комитетом организации в области исследований на животных (протокол за номером 172-14) в соответствии с европейским законодательством по экспериментам на животных.

Животных поддерживали в состоянии седации после внутрибрюшинного введения 100 мкл раствора 5 мг/кг ксилазина (Xilagesic, Calier Laboratory) и 200 мкл раствора 40 мг/кг кетамина (IMALGENE, Merial). Затем в каждый глаз крыс вводили одну каплю мидриатических глазных капель (Coliricusi Tropicamida, 10 мг/мл, Alcon). Через 5 минут роговицы крыс прижигали, прикладывая ляписный карандаш (Argepenal, Braun) к поверхности глаз на 5 секунд. И наконец, глаза промывали стерильным раствором NaCl 0,9% по объему.

Через двенадцать часов животных анестезировали изофлураном (Isovet, Испания) и разделяли на отдельные группы. В глаза животных вводили следующие лекарственные препараты в виде глазных капель: (i) 10 мкл водного раствора 4 мг/мл бевацизумаба (Авастина®) раз в 12 часов в течение 7 суток, (ii) 10 мкл водного раствора 4 мг/мл афлиберцепта (Эйлеа®) раз в 12 часов в течение 7 суток, (iii) 10 мкл водного раствора 0,1% дексаметазонфосфата (Coliriculi dexametasona®) раз в 12 часов в течение 7 суток, (iv) наночастицы альбумина, наполненные бевацизумабом (B-NP; 10 мкл суспензии, содержащей 40 мкг бевацизумаба) раз в сутки в течение одной недели, (v) наночастицы альбумина, наполненные бевацизумабом и покрытые PEG35 (B-NP-PEG35; 10 мкл суспензии, содержащей 40 мкг бевацизумаба) раз в сутки в течение 1 недели. В качестве контролей одной группе животных вводили физиологический раствор (PBS), а другой группе животных вводили человеческий сывороточный альбумин, растворенный в PBS (HSA), в количестве, аналогичном вводимому с B-NP-PEG35.

На фиг. 14 приведено схематическое представление плана-графика, на котором показано прижигание роговицы в 14 ч. (0-е сутки) и первое лечение через 24 ч. (1-е сутки).

Для расчетов получали цифровые изображения роговиц, которые анализировали с использованием программного обеспечения ImageJ (общедоступное ПО, http://rsb.info.nih.gov/ij/). Изображения анализировали в двоичном режиме с переводом в черно-белый формат. По этим изображениям определяли общую площадь роговицы, а также поверхность роговицы, пораженной ожогом нитратом серебра (очаг поражения), и рассчитывали площадь с наблюдаемым образованием новых сосудов (неоваскуляризацией роговицы) путем подсчета пикселей. По этим параметрам определяли площадь инвазии (IA) и CNV (неоваскуляризации роговицы, нормализованной по площади очага поражения):

В сводной таблице 5 приведена эффективность различных лекарственных композиций бевацизумаба в виде результата сокращения площади поверхности глаза, пораженной неоваскуляризацией, вызванной очагом поражения (фиг. 15). Во всех случаях очаг поражения в глазах животных был аналогичным, статистически значимые различия по площади очага поражения между четырьмя группами не выявлены (р>0,05; фиг. 16).

Группа животных, получавших лечение раствором бевацизумаба (BEVA), показала более низкую площадь поражения глаза неоваскуляризацией по сравнению с животными, получавшими PBS (отрицательный контроль). С другой стороны, у животных, получавших лечение наночастицами, наполненными бевацизумабом (B-NP), площадь поражения глаза неоваскуляризацией роговицы была в 2,7 раза ниже, чем у животных, получавших лечение Авастином® (BEVA) (фиг. 17 и 18). При лечении животных пегилированными наночастицами, наполненными бевацизумабом, площадь поражения неоваскуляризацией была приблизительно в 1,4 раза ниже, чем у животных, получавших лечение Авастином®. Важно отметить, что животные, получавшие лечение наночастицами, получали на 50% меньше бевацизумаба по сравнению с животными, получавшими лечение Авастином®. Еще одно важное наблюдение заключалось в том, что при выбранных условиях эксперимента ни дексаметазон, ни Эйлеа® не продемонстрировали положительного влияния на неоваскуляризацию (таблица 9, фиг. 15).

Таблица 5. Влияние композиций бевацизумаба на неоваскуляризацию роговицы, вызванную ожогом ляписным карандашом. BEVA - раствор бевацизумаба (Авастин® 4 мг/мл, две дозы в сутки в течение 7 суток); B-NP - наночастицы альбумина, наполненные бевацизумабом (4 мг/мл, одна доза в сутки в течение 7 суток); B-NP-PEG35 - наночастицы альбумина, наполненные бевацизумабом и покрытые PEG35 (4 мг/мл, одна доза в сутки в течение 7 суток); HSA - человеческий сывороточный альбумин; дексаметазон- 0,1% раствор два раза в сутки в течение 7 суток; Эйлеа - раствор афлиберцепта (Эйлеа® 4 мг/мл, две дозы в сутки в течение 7 суток); контроль - PBS. IA - площадь инвазии. CNV - площадь неоваскуляризации роговицы, нормализованная по площади очага поражения. Данные выражены в виде среднего значения ± СО, n=9.

b р < 0,05 - результаты дисперсионного анализа с использованием критерия Тьюки значимо отличаются от контроля (-)

с р <0,01 - результаты дисперсионного анализа с использованием критерия Тьюки значимо отличаются от контроля (-)

d р < 0,005 - результаты дисперсионного анализа с использованием критерия Тьюки значимо отличаются от контроля (-)

е р < 0,001 - результаты дисперсионного анализа с использованием критерия Тьюки значимо отличаются от контроля (-)

Гистология.

Для гистологического исследования глаз с неоваскуляризацией роговицы в конце лечения удаляли по два глаза из каждой группы. Поверхность глаза промывали физиологическим раствором и отделяли передний полюс от заднего. Роговицы укладывали на ровную поверхность, фиксировали 4% параформальдегидом в течение 24 ч., а затем каждый образец несколько раз промывали PBS. Роговицы сохраняли в 70% метаноле для последующих срезов и анализа.

Для анализа роговиц их включали в парафин и выполняли срезы толщиной 4 мкм от центра роговицы и зоны неоваскуляризации. Затем их окрашивали гематоксилином-эозином и анализировали с использованием оптической микроскопии. При оценке срезов оценивали интенсивность неоваскуляризации, интенсивность воспаления, фиброз, отек и среднюю толщину роговицы. Исследование выполнял исследователь с маскированием по группам лечения. Изображения снимали под микроскопом Nikon Eclipse Ci, оснащенным цифровой камерой Nikon DS-Ri 1. Изображения анализировали с использованием калиброванной системы анализа цифровых изображений Nikon NIS-elements.

Для оценки интенсивности неоваскуляризации использовали следующую шкалу: 0 - отсутствие неоваскуляризации; 1 - минимальная или близкая к отсутствующей васкуляризация; 2 - легкая васкуляризация; 3 - ограниченная или очаговая васкуляризация в субэпителиальной и престромальной областях (умеренная неоваскуляризация); 4 - очень частая или интенсивная; 5 - диффузная и интенсивная васкуляризация. Интенсивность воспаления оценивали аналогичным образом: 0 - отсутствие воспаления; 1 - минимальное или близкое к отсутствующему воспаление; 2 - очаговое воспаление, низкое количество воспалительных клеток смешанного типа, таких как лимфоциты, нейтрофильные лейкоциты и эозинофильные лейкоциты; 3 - умеренное воспаление; 4 - очень частое или интенсивное; 5 - интенсивное, диффузное воспаление, воспалительные клетки смешанного типа. Для оценки активности фибробластов использовали следующую шкалу: 0 - отсутствие активности фибробластов; 1 - минимальная или близкая к отсутствующей активность фибробластов; 2 - очаговая активность фибробластов; 3 - умеренная активность фибробластов; 4 - очень частая; 5 - диффузная и интенсивная активность фибробластов. И наконец, для классификации отека использовали следующую шкалу: 0 - отсутствие отека; 1 - минимальный или близкий к отсутствующему отек; 2 - легкий отек; 3 - умеренный отек; 4 - очень частый или интенсивный; 5 - диффузный и интенсивный отек.

На фиг. 19 показаны гистологические исследования глаз животных, включенных в исследование. Очаги поражения роговиц, для лечения которых применяли B-NP (фиг. 19В) и B-NP-PEG35 (фиг. 19С), находятся в фазе восстановления и не вызывают временное нарушение зрения, как на начальном этапе. Таким образом, повреждение является обратимым. Напротив, очаги поражения роговиц, для лечения которых применяли физиологический раствор, очень серьезно нарушают зрение и представляются необратимыми (фиг. 19F).

В сводной таблице 6 приведены гистопатологические оценки в различных группах. Роговицы, для лечения которых применяли физиологический раствор, показали толщину в 1,4 раза больше толщины роговиц, для лечения которых применяли бевацизумаб, и в 2,7 раза больше толщины роговиц, для лечения которых применяли B-NP. С другой стороны, роговицы, для лечения которых применяли Авастин® (BEVA), показали толщину в два раза больше толщины роговиц, для лечения которых применяли B-NP, и в 1,3 раза больше толщины роговиц, для лечения которых применяли B-NP-PEG35. Аналогичным образом роговицы, для лечения которых применяли B-NP, продемонстрировали улучшение симптомов с низкой степенью фиброза, низкой васкуляризацией и отсутствием отеков.

Таблица 6. Гистопатологические оценки образцов из глаз животных. Контроль - животные, получавшие лечение физиологическим раствором; BEVA - животные, получавшие лечение Авастином®; B-NP - животные, получавшие лечение наночастицами, наполненными бевацизумабом; B-NP-PEG35 - животные, получавшие лечение пегилированными наночастицами, наполненными бевацизумабом.

Пример 12. Биораспределение наночастиц после внутривенного введения опухоленесущим безтимусным мышам.

Для опытов по визуализации опухоли на мышах клетки гепатокарциномы человека (HepG2) культивировали при стандартных условиях, собирали через одну неделю после посева и суспендировали в PBS. Опухоли индуцировали у безтимусных мышей путем подкожного введения 5×105 клеток HepG2 в двух различных местах - в правую конечность и верхнюю часть спины. Рост опухоли контролировали в течение 12-15 суток, пока она не становилась четко видна, затем животных использовали для опытов с визуализацией ОФЭКТ-КТ in vivo после внутривенного введения 99mTc-меченых наночастиц HSA, покрытых PEG35 (NP-PEG35). Через 1 и 4 часа после в/в введения животных умерщвляли и иссекали обе опухоли и часть мышечной ткани контралатеральной ноги (без опухоли). Образцы использовали для подсчета на гамма-счетчике, калиброванном по 99mTc, вносили поправку на массу образца и затухание и рассчитывали отношение опухоль / нормальная ткань с использованием мышечной ткани контралатеральной ноги в качестве основы.

У опухоленесущих мышей радиоактивность, связанная с внутривенно введенными NP-PEG35, сконцентрирована в опухолях (по сравнению с нормальной тканью), как видно на фиг. 20. Такое явление представляется зависимым от времени, поскольку через 4 ч. с момента введения наночастиц количество в опухолях снизилось, хотя и оставалось высоким (отношение опухоль / нормальная ткань >6).

Пример 13. Влияние наночастиц альбумина, наполненных бевацизумабом, на мышиной модели колоректального рака.

Исследования были одобрены этическим комитетом организации в области исследований на животных (протокол за номером 107-16) в соответствии с европейским законодательством по экспериментам на животных. Для опытов у компании Harlan Sprague Dawley, Inc. были приобретены сорок два самца безтимусных мышей весом около 20 граммов и возрастом 3 недели. Мышей содержали в контролируемых условиях в соответствии с правилами организации. Корм и воду давали без ограничений.

Клетки рака толстой кишки человека (НТ-29) культивировали при стандартных условиях, собирали через неделю после посева и суспендировали в PBS. Для индукции опухоли мышей анестезировали изофлураном путем ингаляции и подкожно вводили 100 мкл суспензии, содержащей 2-3×106 опухолевых клеток НТ-29 (клеточная линия рака толстой кишки человека, чувствительная к бевацизумабу), в правый бок каждого животного. Рост опухоли контролировали в течение 12-15 суток, пока она не становилась четко видна (диаметр 0,4-0,6 см), после чего начинали лечение.

Мышей рандомизировали в шесть групп по семь особей в каждой: (i) водный раствор бевацизумаба (Авастина), (ii) наночастицы альбумина, наполненные бевацизумабом (B-NP), (iii) наночастицы альбумина, наполненные бевацизумабом и покрытые PEG35,000 (B-NP-PEG35), (iv) физиологический раствор (PBS), (v) пустые наночастицы, покрытые PEG 35000 (NP-PEG35) в количестве, аналогичном вводимому с B-NP-PEG35, (vi) водный раствор HSA, содержащий количество альбумина, аналогичное вводимому в группе, получавшей B-NP. Во всех случаях два раза в неделю внутривенно вводили 150-200 мкл препаратов, содержащих 5 мг бевацизумаба / кг веса. Контрольная группа в тех же временных точках получала внутривенное введение 0,9% физиологического раствора.

На 0-е сутки (до первого введения), 15-е сутки, 22-е сутки и 26-е сутки с момента первого введения отбирали образцы крови. Для измерения концентрации бевацизумаба в сыворотке использовали специфический иммуноферментный анализ (Shikari Q-Beva).

Объем и вес опухолей регистрировали 1-2 раза в неделю. Для опухолей (V) штангенциркулем измеряли два размера: ширину (W) и длину (L) - и выполняли расчет объема по следующей формуле (ур. 5):

На фиг. 21 показана зависимость объема опухоли от времени. В каждой группе развились опухоли одинакового размера, статистически значимые различия между объемом опухолей между шестью группами в начале опыта не выявлены (р>0,05).

На 12-е сутки группа, получавшая B-NP-PEG35, показала значимое снижение объема опухоли (р<0,05) по сравнению с остальными группами. К 14-м суткам группы, получавшие BEVA и B-NP-PEG35, показали значимое снижение объема опухоли (р<0,05) по сравнению с остальными группами. На 22-е сутки группы, не получавшие лечения, показали повышенный объем опухоли по сравнению с особями, получавшими лечение наночастицами, наполненными бевацизумабом (B-NP), бевацизумабом (BEVA) и пегилированными наночастицами, наполненными бевацизумабом (B-NP-PEG35). Следует отметить, что к концу опыта у половины животных в группе, не получавшей бевацизумаб, развились язвы в местах опухолей.

На фиг. 22 показаны уровни бевацизумаба в сыворотке. Образцы отбирали в следующие сутки: 0-е (перед введением), 15-е, 22-е и 26-е с момента первого введения. Следует отметить повышение уровней бевацизумаба в сыворотке на 22-е сутки, которые соответствуют следующим суткам после еженедельного введения. На фиг. 22 видно, что уровни бевацизумаба в сыворотке мышей, получавших несвязанный препарат, до шести раз превышают уровни у получавших наночастицы (B-NP и B-NP-PEG35).

Польза введения бевацизумаба, включенного в наночастицы, заключается в более низких уровнях бевацизумаба в сыворотке. После внутривенного введения несвязанного бевацизумаба возникает высокая концентрация в крови, что может привести к побочным действиям. Эта концентрация постепенно снижается до достижения плато. Тем не менее, после введения новой дозы концентрация бевацизумаба в крови повышается (см. фиг. 22), таким образом увеличивая вероятность побочных действий.

С другой стороны, после внутривенного введения наночастиц бевацизумаба уровни препарата в сыворотке постепенно повышаются до достижения плато. Эта концентрация в шесть раз ниже достигаемой при введении несвязанного бевацизумаба и остается постоянной. Кроме того, каждый раз при введении новой дозы пиковая концентрация бевацизумаба в крови намного ниже. Это снижает вероятность побочных действий.

Кроме того, полиэтиленгликоль образует стерический барьер на поверхности наночастиц, предотвращая опсонизацию, которая представляет собой основной механизм потери введенной дозы в течение нескольких часов после в/в введения.

ПЭТ-визуализация.

В конце опыта из групп, получавших лечение бевацизумабом, пегилированными наночастицами, наполненными бевацизумабом, и физиологическим раствором, отбирали по три мыши для визуализации 18F-ФДГ-ПЭТ. Для этого мышей не кормили на ночь, но давали пить воду без ограничений. Через сутки мышей анестезировали изофлураном 2% в 100% газообразном O2 и фиксировали в неподвижном состоянии для процедуры 18F-ФДГ-ПЭТ. За сорок минут до сканирования в хвостовую вену вводили 18F-ФДГ (10 МБк ± 2 в 80-100 мкл). ПЭТ-визуализацию выполняли на специальном томографе для мелких животных Philips Mosaic (Кливленд, штат Огайо) с разрешением 2 мм, осевым полем зрения (FOV) 11,9 см и поперечным FOV 12,8 см. Анестезированных мышей помещали в горизонтальном положении на стол ПЭТ-сканера для получения статического изображения (синограммы) в течение 15 минут. Изображения реконструировали с использованием трехмерного алгоритма RAMLA (истинная трехмерная реконструкция) с двумя итерациями и параметром релаксациии 0,024 в матрицу 128×128 с размером вокселя 1 мм и с учетом поправок на время нечувствительности, затухание, случайные совпадения и рассеяние. Для оценки поглощения 18F-ФДГ опухолью все исследования экспортировали и анализировал с использованием программного обеспечения PMOD (PMOD Technologies Ltd., Адлисвиль, Швейцария). Области исследования (regions of interest, ROI) строили на фронтальных изображениях ПЭТ для мелких животных толщиной 1 мм на последовательных срезах, включая опухоль в целом. И наконец, для каждой опухоли рассчитывали максимальное стандартизированное значение поглощения (SUV) по формуле:

В сводной таблице 7 приведены результаты ПЭТ-визуализации в различных группах. В отношении SUVmax (максимальное поглощение опухолью) самое низкое значение соответствовало группе, получавшей лечение B-NP-PEG35, тогда как самое высокое соответствовало группе, получавшей физиологический раствор.

В отношении объема самые низкие значения принадлежали группам, получавшим лечение B-NP-PEG35 и HSA. Тем не менее, особи, отобранные из группы HSA, не были представительными, поскольку они были единственными, у которых отсутствовали язвы. Самое высокое значение снова было зарегистрировано в группе, которая не получала лечения (физиологический раствор). Группа B-NP-PEG35 показала объем в три раза меньше, чем в группе физиологического раствора, и в 1,5 раза меньше, чем в группе BEVA.

И наконец, для TLG (общий гликолиз очага) было зафиксировано наименьшее значение для группы, получавшей лечение B-NP-PEG35, которое было в 1,5 раза меньше, чем в группе лечения BEVA, и до 3,5 раз меньше, чем в группе, получавшей физиологический раствор.

Пример 14. Получение наночастиц человеческого сывороточного альбумина, наполненных ранибизумабом.

Наночастицы HSA, наполненные ранибизумабом, получали с использованием той же процедуры, которая описана в примере 1 для наночастиц альбумина, наполненных бевацизумабом.

Для наночастиц, наполненных ранибизумабом, оптимальное отношение антитела / альбумин составляло 0,15. Наночастицы с ранибизумабом показали размер частиц около 210 нм при КП ниже 0,3 и дзета-потенциале - 15 мВ.

Группа изобретений относится к области медицины, а именно к офтальмологии и онкологии, и предназначена для лечения глазных и онкологических заболеваний. Для лечения глазных заболеваний или рака применяют наночастицу, включающую твердое ядро, содержащее несшитую матрицу альбумина и моноклональные антитела, распределенные по объему матрицы альбумина, при этом, когда указанное твердое ядро имеет покрытие, оно покрыто неионным полимером. В других воплощениях обеспечиваются указанная наночастица и фармацевтические композиции, содержащие группу указанных наночастиц и вспомогательное вещество, фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель. Использование группы изобретений обеспечивает эффективное лечение рака и глазных заболеваний, что достигается за счет контролируемой доставки моноклональных антител при сохранении их целостности и активности. 6 н. и 19 з.п. ф-лы, 22 ил., 7 табл., 14 пр.

1. Применение наночастицы для лечения глазных заболеваний, включающей твердое ядро, содержащее несшитую матрицу альбумина и моноклональные антитела, распределенные по объему матрицы альбумина, при этом, когда указанное твердое ядро имеет покрытие, оно покрыто неионным полимером.

2. Применение наночастицы для лечения рака, включающей твердое ядро, содержащее несшитую матрицу альбумина и моноклональные антитела, распределенные по объему матрицы альбумина, при этом, когда указанное твердое ядро имеет покрытие, оно покрыто неионным полимером.

3. Применение по п. 1 или 2, согласно которому весовое отношение моноклональные антитела/альбумин составляет от 0,01 до 0,5.

4. Применение по п. 1 или 2, согласно которому весовое отношение неионный полимер/альбумин составляет от 0,02 до 5 по массе.

5. Применение по п. 1 или 2, согласно которому альбумин представляет собой человеческий сывороточный альбумин или бычий сывороточный альбумин.

6. Применение по п. 1 или 2, согласно которому моноклональные антитела выбраны из бевацизумаба, ранибизумаба, трастузумаба, цетуксимаба и ритуксимаба.

7. Применение по п. 1 или 2, согласно которому неионный полимер представляет собой водорастворимую целлюлозу, выбранную из гидроксиэтилцеллюлозы, гидрокси-н-пропилцеллюлозы, гидрокси-н-бутилцеллюлозы, гидроксипропилметилцеллюлозы, фталата гидроксипропилметилцеллюлозы и этилгидроксиэтилцеллюлозы; крахмала; декстрана; поливинилпирролидона, полиэфира, выбранного из соединений под торговой маркой Eudagrit, или полиалкиленгликоля.

8. Применение по п. 1 или 2, согласно которому неионный полимер выбран из фталат гидроксипропилметилцеллюлозы и полиэтиленгликоля.

9. Применение по п. 1 или 2, согласно которому моноклональное антитело выбрано из бевацизумаба и трастузумаба, а неионный полимер выбран из фталат гидроксипропилметилцеллюлозы и полиэтиленгликоля.

10. Применение по п. 1 или 2, согласно которому указанная наночастица получена способом, содержащим:

a) получение водного раствора альбумина и моноклональных антител;

b) титрование водного раствора, полученного на этапе а), до рН от 4 до 5;

c) добавление десольватирующего средства к водному раствору, полученному на этапе b), с получением наночастиц альбумина/моноклональных антител;

d) дополнительно инкубацию наночастиц альбумина/моноклональных антител, полученных на этапе с), с неионным полимером и дополнительно

e) сушку наночастиц путем вакуумной сушки, сушки распылением или сублимационной сушки.

11. Применение по п. 1, согласно которому глазное заболевание выбрано из макулярной дегенерации, неоваскуляризации или ангиогенеза роговицы, неоваскуляризации или ангиогенеза радужки, неоваскуляризации или ангиогенеза сетчатки, диабетической пролиферативной ретинопатии, недиабетической пролиферативной ретинопатии, глаукомы, инфекционного конъюнктивита, аллергического конъюнктивита, язвенного кератита, неязвенного кератита, эписклерита, склерита, диабетической ретинопатии, увеита, эндофтальмита, инфекционных процессов и воспалительных процессов.

12. Применение по п. 2, согласно которому рак представляет собой рак молочной железы, рак легких, рак поджелудочной железы, множественную миелому, почечно-клеточную карциному, рак предстательной железы, меланому, рак толстой кишки, колоректальный рак, рак почки, рак шейки матки, рак яичников, рак печени, почек и ЖКТ, рак мочевого пузыря или плоскоклеточный рак.

13. Наночастица для лечения глазных заболеваний, включающая твердое ядро, содержащее несшитую матрицу альбумина и моноклональные антитела, распределенные по объему матрицы альбумина, при этом указанное твердое ядро покрыто неионным полимером.

14. Наночастица для лечения рака, включающая твердое ядро, содержащее несшитую матрицу альбумина и моноклональные антитела, распределенные по объему матрицы альбумина, при этом указанное твердое ядро покрыто неионным полимером.

15. Наночастица по п.13 или 14, в которой неионный полимер выбран из фталат гидроксипропилметилцеллюлозы и полиэтиленгликоля.

16. Наночастица по п.13 или 14, в которой моноклональное антитело выбрано из бевацизумаба и трастузумаба, а неионный полимер выбран из фталат гидроксипропилметилцеллюлозы и полиэтиленгликоля.

17. Глазная фармацевтическая композиция для лечения глазных заболеваний, включающая:

- группу наночастиц, содержащих твердое ядро, включающее несшитую матрицу альбумина и моноклональные антитела, распределенные по объему матрицы альбумина, при этом, когда указанное твердое ядро имеет покрытие, оно покрыто неионным полимером;

- вспомогательное вещество, фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель.

18. Противораковая фармацевтическая композиция для лечения рака, включающая:

- группу наночастиц, содержащих твердое ядро, включающее несшитую матрицу альбумина и моноклональные антитела, распределенные по объему матрицы альбумина, при этом, когда указанное твердое ядро имеет покрытие, оно покрыто неионным полимером;

- вспомогательное вещество, фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель.

19. Композиция по п. 17 или 18, в которой наночастицы находятся в виде сухого порошка.

20. Композиция по п. 17 или 18, в которой вспомогательное вещество, фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель подходит для перорального, местного или парентерального введения.

21. Композиция по п. 17 или 18, в которой альбумин представляет собой человеческий сывороточный альбумин или бычий сывороточный альбумин.

22. Композиция по п. 17 или 18, в которой моноклональные антитела выбраны из бевацизумаба, ранибизумаба, трастузумаба, цетуксимаба и ритуксимаба.

23. Композиция по п. 17 или 18, в которой неионный полимер представляет собой водорастворимую целлюлозу, выбранную из гидроксиэтилцеллюлозы, гидрокси-н-пропилцеллюлозы, гидрокси-н-бутилцеллюлозы, гидроксипропилметилцеллюлозы, фталата гидроксипропилметилцеллюлозы и этилгидроксиэтилцеллюлозы; крахмала; декстрана; поливинилпирролидона, полиэфира, выбранного из соединений под торговой маркой Eudagrit, или полиалкиленгликоля.

24. Композиция по 17 или 18, в которой неионный полимер выбран из фталат гидроксипропилметилцеллюлозы и полиэтиленгликоля.

25. Композиция по 17 или 18, в которой моноклональное антитело выбрано из бевацизумаба и трастузумаба, а неионный полимер выбран из фталат гидроксипропилметилцеллюлозы и полиэтиленгликоля.