Изобретение относится к биотехнологии и касается фармакологической субстанции на основе мембранотропных гомеостатических тканеспецифических биорегуляторов, выделенных из различных тканей и биологических жидкостей животных и может найти применение в фармацевтической промышленности и медицине.
Изобретение направлено на идентификацию состава и структуры ранее недостаточно полно изученной такой биологически активной субстанции, как мембранотропные гомеостатические тканеспецифические биорегуляторы (МГТБ), обнаруженной в различных тканях и биологических жидкостях животных.
Изобретение позволяет расширить существующие представления о биологически активных веществах природного происхождения.
Биологически активную субстанцию МГТБ экстрагируют из животных тканей в физиологическом растворе при низких температурах. В качестве сырья можно использовать также биологические жидкости (молоко, желчь) и коммерческий препарат сыворотки крови крупного рогатого скота. Далее очистку МГТБ и ее отдельных компонентов можно проводить несколькими способами, применяя методы препаративной белковой химии - высаливание белков, хроматография белков и пептидов, электрофорез в ПААГ, изоэлектрофокусирование (ИЭФ) и др. В изобретении представлены несколько способов выделения и очистки субстанции МГТБ, которые не влияют на ее состав, структуру и биологическую активность. Например, представлен способ, состоящей из получения тканевого экстракта, высаливания примесных белков в насыщенном растворе сернокислого аммония, получения фракции супернатанта и последующего разделения ее методом ИЭФ в градиенте сахарозы в интервале рН 3,5-10,0. Собирали и изучали фракции кислых белков, которые собирали в интервале рН 1,5-3,0,
В процессе очистки присутствие фармакологической субстанции МГТБ и ее отдельных фракций определяли с помощью оригинального адгезиометрического метода, в основе которого лежит оценка ее мембранотропной активности - влияния на вязкоупругие свойства плазматической мембраны (ПМ) клеток млекопитающих в условиях in vitro. Учитывая тот факт, что субстанция МГТБ проявляет биологическое действие в низких концентрациях, проводят исследование дозовой зависимости ее активности в диапазоне концентрации, соответствующему 10-3 - 10-19 мг белка в мл. Концентрационную линейку растворов субстанции МГТБ получают путем последовательного 10-ти кратного разбавления исходного раствора с установленной концентрацией, которую определяют стандартными методами.
Ранее на различных экспериментальных моделях в условиях in vitro и in vivo было показано, что субстанция МГТБ в отношении патологически измененных тканей проявляет репаративно-регенеративную активность, которая характеризуется наличием органотканевой, но отсутствием видовой специфичности, в связи с чем может быть использована для приготовления фармакологических средств
Например, в опубликованных монографиях [1] - [4] (Константиновский и др. 2012; Ямскова и др. 2009; 2010; 2012) было показано, что фракции, полученные из экстрактов различных тканей глаза, а также сыворотки крови быка, в низких дозах активируют процессы восстановления и репарации у млекопитающих на модели экспериментальной раны роговицы глаза in vivo. Биорегулятор, выделенный из роговицы глаза быка, оказывал выраженное протективное действие на состояние этой ткани при культивировании роговицы глаза позвоночных животных in vitro за счет способности дополнительно активировать клеточные источники регенерации. Биорегулятор, выделенный из сыворотки крови, стимулировал ранозаживление роговицы у кролика в эксперименте in vivo, а также у человека при посттравматической рецидивирующей эрозии и ожоге роговицы. Биорегулятор, выделенный из пигментного эпителия глаза быка, способствовал стабилизации дифференцировки клеток пигментного эпителия и поддержанию жизнеспособности биполярных и мюллеровских клеток сетчаткив условиях органотипического культивирования тканей глаза in vitro.
Из RU 2725491 02.07.2020 известна субстанция для получения лекарственных средств, способствующая созреванию сперматозоидов млекопитающих и проявляющая биологическую активность при разведении в водном фармацевтически приемлемом, носителе и/или разбавителе до концентрации по белку от 10-8 до 10-15 мг / мл, включающая пептиды с молекулярными массами 1000-6000 Да, и бычий сывороточный альбумин с молекулярной массой 65712 Да и аминокислотной последовательностью, которая имеет 100%-ную гомологию с N-концевой последовательностью зрелой молекулы бычьего сывороточного альбумина, при соотношении по массе пептиды: белок как 1:1-7, выделенная из семенников быков ИЭФ-фракций, разделенных и собранных методом изоэлектрофокусирования в интервале рН<3,0 с использованием обращено-фазовой ВЭЖХ.
В частности, из RU 2701566 30.09.2019 известна фармакологическая композиция, обладающая протекторным действием на состояние тканей заднего отдела глаза -склеральную оболочку, сетчатку, пигментный эпителий, хороид. Данная субстанция содержит белок-пептидный комплекс, образованный при смешении белка с молекулярной массой в диапазоне от 66000 до 68000 Да, относящегося к семейству альбуминов сыворотки крови, и пептидов с молекулярными массами от 1000 до 6000 Да, а также липиды, углеводы и ионы кальция, и представляет собой водный раствор БПК в концентрации 10-7-10-17 мг/мл. БПК получен экстракцией ткани склеральной оболочки глаза позвоночных животных, и последующего разделения полученного тканевого экстракта методами изоэлектрофокусирования в градиенте сахарозы или/и обращенно-фазовой ВЭЖХ.
Известное изобретение обеспечивает поддержание в ткани склеры адгезии между отдельными тканями глаза, а также адгезионных межклеточных взаимодействий в пределах отдельных тканей, целостности и сохранения пространственной организации коллагеновых волокон, увеличению жизнеспособности фибробластов склеры, сохранению статуса их клеточной пролиферации и дифференцировки.
Изобретение позволяет получить высокоочищенный препарат, предназначенный в качестве субстанции для фармакологического (лекарственного) средства для профилактики и лечения глазных заболеваний, связанных с заявленными нарушениями.
Согласно вышеуказанному известному изобретению (RU 2701566 30.09.2019) способ выделения и очистки ВПК заключается в том, что из свежеэнуклеированных глаз быка или другого позвоночного животного выделяют макулярную область ретинального ПЭ, промывают ее в физиологическом растворе, выдерживают ткань ПЭ в водно-солевом растворе, центрифугируют тканевой экстракт, собирают надосадочную жидкость, осаждают белки в 100%-ном растворе сульфата аммония, центрифугированием собирают фракцию, флотирующую при 100000 g - 105000 g, диализуют до полного удаления ионов аммония, разделяют высокоэффективной жидкостной хроматографией в градиенте ацетонитрила в 0,1%-ной трифторуксусной кислоте при рН 2,2-3,0, температуре 22-25°C в течение 30-60 минут, собирают фракции гидрофильных пептидов и белка - представителя семейства альбуминов сыворотки крови, из которых удаляют ацетонитрил и смешивают в присутствии 10-3 М CaCl2 в эквимолекулярных количествах.
Таким образом, в этих работах было показано, что в экстрактах различных тканей животных, получаемых водно-солевой экстракцией тканей при пониженной температуре, присутствуют биологически активные вещества, локализованные внеклеточно, которые имеют сложное строение - они содержат белки, пептиды, углеводы, которые тканеспецифично влияют на адгезию, миграцию, дифференцировку, пролиферацию клеток, вызывают увеличение их жизнеспособности в условиях культивирования in vitro. Биологически активные вещества, содержащиеся в данных экстрактах тканей животных, активируют процессы восстановления и репарации в патологически измененных тканях за счет дополнительной активации клеточных источников регенерации в организме.
Существенным недостатком всех этих известных технических решений является отсутствие данных о составе, структуре и механизме действия биологически активных веществ, содержащихся в фармакологической субстанции МГТБ и проявляющих тканеспецифическую репаративно-регенеративную активность, вызывая восстановление патологически измененных тканей без образования соединительнотканного рубца. Данные проведенных исследований указывали на новый механизм регенерации, который включался в результате способности биологически активных веществ, входящих в состав изучаемой субстанции, вызывать восстановление структуры и функции поврежденных тканей без образования соединительнотканного рубца (механизм фиброза). Поэтому выяснение вопросов, связанных с определением состава, структуры и механизма действия биологически активных веществ представлялось исключительно актуальным, поскольку полученные в этом аспекте результаты способствовали бы наиболее эффективному применению фармакологической субстанции МГТБ в качестве основы для разработки новых лекарственных средств.
В заявленном изобретении удалось идентифицировать состав, структуру, определить физико-химические свойства и механизм биологического действия субстанции МГТБ, выделенной из различных тканей и биологических жидкостей животных, В данном изобретении представлены результаты исследований, которые показывают, что основу субстанции МГТБ, выделенной из различных тканей и биологических жидкостей животных, составляют белок-пептидные комплексы (БПК), которые, в свою очередь, состоят из пептидов с молекулярными массами от 1000 Да до 10000 Да, являющихся продуктами протеолиза известных изученных белков (ферментов, адгезивных и мембранных белков), которые взаимодействуют с белками мультисемейства альбуминов сыворотки крови, модулирующими активность данных пептидов. На присутствии в комплексе МГТБ ионов кальция (10-3 М CaCl2 указывают сведения в примерах 11, 32, в которых приводятся КД-спектры МГТБ, выделенного из сыворотки крови, после воздействия ЭДТА и других физико-химических факторов. В этом исследовании было продемонстрировано, что конформация данного МГТБ наиболее нарушалась после обработки Са-хелатирующим агентом (ЭДТА): в случае воздействия температуры 100°С или гуанидинхлорида (дезагрегирующий агент) подобного нарушения конформации БПК не было обнаружено (фиг. 13-15).
Кроме того, было установлено (18), что методом равновесного микродиализа было показано, что субстанция МГТБ обладает высокой Са2+-связывающей активностью (Кд=10-4-10-6 мг/мл).
Изучение физико-химических свойств субстанции МГТБ показало, что в ее водно-солевых растворах присутствуют наноразмерные частицы, проявляющие тенденцию в дальнейшему укрупнению. Взаимодействия с липидами, наличие инозитол-содержащей гликозидной структуры в составе МГТБ, ее наноразмерное состояние исключительно важны для проявления биологического действия субстанции - именно посредством такого механизма осуществляется связь внеклеточной структуры МГТБ с плазматической мембраной клеток и поддержание ее стабильной конформации, обусловливающей биологическое действие данной субстанции.
Сопоставляя эти данные с результатами исследования субстанции МГТБ - ее состава, структуры, физико-химических свойств, биологического действия [2] (Ямскова и др., 2009) можно заключить, что она участвует в межклеточной адгезии и процессах клеточной регуляторной трансдукции за счет своей способности изменять свойства ПМК.
По сути, БПК, входящие в состав субстанции МГТБ, представляют собой ранее обнаруженные «тканевые формы» сывороточного альбумина, функция который оставалась до сих пор малоизученной исследованной [5](Peters, 1996). Согласно полученным по изобретению результатам, эти «тканевые формы» сывороточного альбумина образуются в результате транспорта определенных его изоформ через гистогематические барьеры организма, их проникновения в межклеточные пространства тканей и взаимодействия по кальций-зависимому механизму с постоянным для каждой ткани набором пептидов. Пептиды являются продуктами постоянно протекающего протеолиза различных белков. Образовавшиеся БПК, представляющие основу субстанции МГТБ, далее способны к взаимодействию с ПМ клеток через связывание с макромолекулярную систему инозитол-содержащего гликозидного якоря.
Возможно, именно такие взаимодействия БПК лежат в основе «самосборки» субстанции МГТБ в межклеточном пространстве. В пользу этого предположения свидетельствует уникальная способность молекулы сывороточного альбумина связывать обширный круг лигандов, осуществляя транспорт огромного количества различных веществ в организме. В основе такой важнейшей функции альбумина лежит структурная подвижность его молекулы [5].
В отличие от указанных выше изобретений, представленные в настоящем изобретении субстанции МГТБ животного происхождения, являются идентифицированными БПК, строение и структура которых изучены: в их состав входит постоянный для каждой ткани набор биологически активных пептидов с установленными значениями молекулярных масс, а также белки, модулирующие активность этих пептидов, структура которых была идентифицирована с помощью с помощью метода PMF (peptide mass fingerprinting) в базе данных NCBI.
Выделение заявляемых в качестве изобретения субстанций для фармакологических препаратов из тканей животного происхождения осуществляется путем экстракции небольших фрагментов свежеполученной ткани животных в физиологическом растворе при низкой температуре. При этом исключается гомогенизация ткани, ферментативная обработка и другие воздействия, вызывающие нарушение целостности клеток. Основным фактором, определяющим переход во внешнюю среду (экстрагирующий раствор) биорегуляторов группы МГТБ, которые составляют основу заявленных субстанций, является температура экстрагирующего раствора +4°С-0°С. При этой температуре происходит фазовый переход бислоя ПМК, в результате которого связанная с ним (например, через «мембранные якоря») надмолекулярная структура БПК, входящих в состав МГТБ, изменяет взаимодействие с ПМК и переходит в экстрагирующий раствор. Присутствие ионов кальция в экстрагирующем растворе не оказывает влияния на процесс выделения МГТБ.
Из биологических жидкостей (например,желчь) субстанцию МГТБ получают, вначале подвергая ее фракционированию, например, путем высаливания примесных белков при добавлении солей или органических растворителей с последующим применением традиционных методов (биологической химии) белковой химии - изоэлектрофокусирования, хроматографии и др.
Технической задачей настоящего изобретения является получение фармакологической субстанции наноразмерных мембранотропных гомеостатических тканеспецифических биорегуляторов МГТБ с повышенной биологической активностью, обусловленной определенным (идентифицированным) составом компонентов, входящих в ранее неизученные структуру и организацию фармакологической субстанции МГТБ, а также изученного механизма ее функционирования в живых организмах, что позволяет наиболее результативно применить полученные результаты для профилактики и лечения распространенных заболеваний, патологий тканей различных органов.
Техническим результатом заявленного изобретения в соответствии с поставленной технической задачей является расширение арсенала средств для создания фармакологических препаратов природного происхождения, основу которых составляют ранее не достаточно изученные биологически-активные (белок-пептидные) комплексы, содержащиеся в различных тканях и биологических жидкостях животных.
Поставленная техническая задача и технический результат достигаются заявленной в качестве изобретения фармакологической субстанцией мембранотропных гомеостатических тканеспецифических биорегуляторов МГТБ, обладающая, в виде их растворов в фармацевтически приемлемом носителе и/или разбавителе, способностью к поддержанию, стимулированию и восстановлению функции тканей органов после развития в них различных патологических процессов, выделенная из различных тканей и биологических жидкостей животных, выбранных из группы, включающей сыворотку крови, ткани печени, легкого, кишечника, поджелудочной железы, предстательной железы, молочной железы, желчи, содержащая в качестве активно-действующей основы белок-пептидные комплексы, которые состоят из белков мультисемейства сывороточных альбуминов и биологически активных пептидов с молекулярными массами 1000Да-10000Да, являющихся продуктами протеолиза ряда белков, а также ионы кальция Са+2, липиды, углеводы, такие как остатки маннозы, галактозы, глюкозы, N-ацетилглюкозамина, глюкозамина, N-ацетилгалактозамина, которые образуют инозитол-содержащую гликозидную структуру, обеспечивающую ее связь с плазматической мембраной клетки.
Заявленная в качестве изобретения фармакологическая субстанция мембранотропных гомеостатических тканеспецифических биорегуляторов МГТБ предназначена для приготовления на ее основе лекарственного средства для профилактики и лечения распространенных заболеваний человека и животных в виде растворов в диапазоне концентраций от 10-17 до 10-5 мг белка/мл при разведении в фармацевтически приемлемом носителе и/или разбавителе, и присутствующая в виде наноразмерных частиц 50-200 нм.
Заявленная фармакологическая субстанция мембранотропных гомеостатических тканеспецифических биорегуляторов МГТБ тканеспецифично, но не видоспецифично, способствует поддержанию и восстановлению функции тканей при развитии различных патологических процессов.
Итак, технический результат достигается заявленным изобретением, которое способствует разработке основных критериев в использовании ранее не достаточно полно изученной субстанции МГТБ для создания на ее основе новых фармакологических средств, предназначенных для профилактики и лечения распространенных заболеваний животных и человека. Полученный технический результат будет способствовать наиболее эффективному применению в качестве основы для разработки новых лекарственных средств на основе субстанции МГТБ, выделенной из тканей или биологических жидкостей животных, содержащих биологически активные пептиды с молекулярными массами 1000 Да - 10000 Да, белки мультисемейства сывороточного альбумина, а также ионы кальция, липиды, инозитол-содержащую гликозидную структуру, которая при разведении в фармацевтически приемлемом носителе и/или разбавителе в низких концентрациях от 10-17 до 10-5 мг/мл оказывает биологическое действие, которое характеризует наличием органотканевой (но не видовой) специфичности.
Ниже приводится краткое описание общего способа получения заявленной в качестве предполагаемого изобретения фармакологической субстанции МГТБ, основу которой составляют белок-пептидные комплексы, выделенные из тканей и биологических жидкостей различных позвоночных животных.
Фармакологическую субстанцию МГТБ, выделенную из тканей или биологических жидкостей животных, получают на основе высокоочищенных фракций тканевых экстрактов, разделенных и собранных методами изоэлектрофокусирования, электрофореза и обращенно-фазовой ВЭЖХ. Состав, строение и гомогенность данных фракций изучены с привлечением современных методов биохимии, биоорганической химии, а биологическое действие - с помощью методов биофизики, клеточной биологии и медицинской биотехнологии.
Установлено, например, что для субстанции МГТБ, выделенной из тканей и биологических жидкостей быка - это изоформы сывороточного альбумина gi|1351907; gi|367460260; gi|74267962, в базе данных SwissProt, которые отличаются друг от друга составом аминокислот только в четырех положениях полипептидной цепи: 116, 214, 429 и 579. Аналогично было установлено и показано, что в состав белок-пептидных комплексов, представляющих собой основу субстанции МГТБ, выделенной из различных тканей крысы Wistar, входят также три изоформы сывороточного альбумина крысы - gi| 158138568; gi|55628; gi| 124028612, отличающиеся друг от друга тремя заменами аминокислот полипептидной цепи, соответственно, в положениях 262, 317 и 431. Установленные замены аминокислот в первичной последовательности сывороточного альбумина, выделенных из тканей быка и крысы, расположены во втором и третьем доменах его молекулы. Такая корреляция замены аминокислот в первичной последовательности альбуминов может объяснить их способность, как белков-модуляторов, различным образом изменять активность пептидов, входящих в состав белок-пептидных комплексов.
Было установлено и показано также, что в фармакологической субстанции МГТБ белково-пептидные комплексы взаимодействуют с липидами, ионами кальция, которые стабилизируют их конформацию и в том числе, определяют их.
Фармакологическую субстанцию МГТБ, выделенную из различных тканей и биологических жидкостей животных, используют, например, в виде питьевого раствора в низкой концентрации, что исключает развитие побочных негативных реакций со стороны как отдельных тканей органов ЖКТ, так и со стороны организма в целом. Раствор применяется перорально в течение 2-6 месяцев.
Для определения углеводного состава изучаемой ИЭФ-фракции ее предварительно лиофилизуют.Далее проводят гидролиз 1 мг лиофилизата в 2 мл 4 М трифторуксусной кислоты в стеклянной ампуле с тефлоновой крышкой в течение 3 часов при 110°С, по истечении времени реакции трифторуксусную кислоту удаляют на роторном испарителе. Модификацию моносахаридов - получение 3-метил-1-фенил-2-пиразолин-5-он-(РМР)-производных углеводов проводят по методу [S. Honda, Е. Akao, S. Suzuki, М. Okuda, К. KakehiJ. Nakamura, Anal. Biochem. 180 (1989) 351]. Гидролизованный образец растворяют в 0,5 мл 0,3 М NaOH, к раствору добавляют 0,5 мл 0.5 М раствора РМР в метаноле и инкубируют 2 часа при 70°С. После нейтрализации 0,3 М HCl избыток РМР удаляют экстракцией хлороформом, водную фазу упаривают досуха. Хроматографический анализ РМР-производных проводят на колонне Kromasil С18 (250×4.6 мм) элюцией 0,1 М CH3COONH4, рН 5,6 в 20% ацетонитриле, детекцию проводят при 245 нм. В результате проведенного анализа было установлено, что ИЭФ-фракция содержит углеводы (остатки маннозы, галактозы, глюкозы, N-ацетилглюкозамина, глюкозамина, N-ацетилгалактозамина), которые образуют инозитол-содержащую гликозидную структуру (в частности, 22,5% глюкозы, 22,6% глюкозамина, 20,2% маннозы, 11,6% галактозы, 8,5% ксилозы, 7,4% фукозы, 6,5% N - ацетилглюкозамина).
Полученные данные указывают на присутствие в МГТБ (содержащим БПК), выделенном из биологической жидкости и тканей животных, ряда гликанов, которые определяют, с одной стороны, его взаимодействие с плазматической мембраной клетки, с другой - тканеспецифический характер его биологического действия.
Для определения липидов в составе ИЭФ-фракции применяют метод газовой хроматомасс-спектрометрии, предварительно получают их дериваты - соответствующие триметилсилиловые и метиловые эфиры. Для получения триметилсилиловых эфиров ВЭЖХ-фракции с временем удерживания 53 мин была обработана силирующим реагентом - N,O-бис(триметилсилил)ацетамидом при 60°С. Для получения метиловых эфиров многокомпонентную пробу обрабатывали метилирующим реагентом -тетраметиламмонийгидроксидом (25%-ный раствор в метаноле). Пиролиз промежуточно образующихся тетраметиламмониевых солей с образованием соответствующих метиловых эфиров проходит непосредственно в колонке при хроматографировании анализируемой фракции. Определение компонентного состава изучаемой фракции проводят на газовом хроматографе Agilent 7890 (США) на колонке НР-5 (США) (50 м×320 мкм×1,05 мкм) оснащенным масс-спектрометрическим детектором 5975С с квадрупольным масс-анализатором. Анализ проводят при температурной программе хроматографирования: изотерма 2 мин при 40°С; нагрев до 250°С со скоростью 5°С/ мин; изотерма 15 мин при 250°С; нагрев до 320°С со скоростью 25°С/мин; изотерма 5 мин при 320°С. Температура интерфейса 280°С. Газ носитель - гелий, скорость потока 1 мл/мин. Хроматограмма фракции по полному ионному току. Условия массспектрометрического детектирования: энергия ионизирующих электронов 70 эВ; регистрация масс-спектров в положительных ионах в диапазоне (m/z) от 20 до 450 со скоростью 2,5 скан/сек. Программное обеспечение - chemStation Е02.00. Идентификацию компонентного состава (качественный анализ) проводят по библиотеке полных массспектров и соответствующим значениям хроматографических линейных индексов удерживания (Ilin). В результате было установлено, что ИЭФ-фракция содержит компоненты, которые являются составляющими глицеридов, фосфолипидов, гликолипидов, а также насыщенные жирные кислоты (С6:0,С8:0, С9:0, С10:0, С12:0, С14:0, С15:0, С16:0. С17:0, С18:0) и моноеновую жирную кислоту (С 16.1).
Изобретение иллюстрируется нижеприведенными примерами, 18 фигурами (18 ил.) и 8 таблицами, которые не ограничивают объем его притязаний.
Ниже представлено краткое описание прилагаемых фигур (фиг. 1-18) и таблиц (табл.1-8).
Фиг. 1. Изоэлектрофокусирование супернатантов тканевых экстрактов, выделенных из:
А - печени крысы; Б - легкого крысы; В - тонкого кишечника крысы; Г - желчи быка. По ординате 1- значения рН; по ординате 2- D280; по абсциссе - номера фракций.
Фиг. 2. Влияние на вязкоупругие свойства плазматической мембраны клеток печени мыши при множественной органном культивировании in vitro, ряда подфракций (А-Г), собранных в области значений рН менее 3,0 после изоэлектрофокусирования супернатанта тканевого экстракта: А - печени крыс; Б - легкого крыс; В - желчи быка; Г - тонкого кишечника крыс. По ординате - величина эффекта Эа (%); по абсциссе -показатель степени десятикратного разбавления.
К - контроль; столбцы - воздействие ИЭФ-фракции в разбавлении 10х, где х - показатель степени десятикратного разбавления изучаемого препарата, (р<0.05).
Фиг. 3. Влияние на вязкоупругие свойства плазматической мембраны клеток печени мыши при множественном органном культивировании in vitro, ряда подфракций (А-Г), собранных в области значений рН 8,5-9,5 после изоэлектрофокусирования супернатанта тканевого экстракта: А - печени крыс; Б - легкого крыс; В - желчи быка; Г - тонкого кишечника крыс. По ординате - величина эффекта Эа (%); по абсциссе - показатель степени десятикратного разбавления.
К - контроль; столбцы - воздействие ИЭФ-фракции в разбавлении 10х, где х - показатель степени десятикратного разбавления изучаемого препарата, (р<0.05).
Фиг. 4. Влияние на вязкоупругие свойства плазматической мембраны клеток печени мыши при множественной органном культивировании in vitro, ряда подфракций (А-Г), собранных в области значений в интервале рН 4,5-5,1 после изоэлектрофокусирования супернатанта тканевого экстракта: А - печени крыс; Б - легкого крыс; В - тонкого кишечника крыс; Г - желчи быка. По ординате - величина эффекта Эа (%); по абсциссе - показатель степени десятикратного разбавления.
К - контроль; столбцы - воздействие ИЭФ-фракции в разбавлении 10х, где х - показатель степени десятикратного разбавления изучаемого препарата, (р<0.05).
Фиг. 5. Мембранотропное действие фракции субстанции МГТБ, выделенной печени крысы, собранной в интервале рН 6,7-7,2 (метод биотестирования, р<0.05). А - диализ против воды; Б - диализ против физ. раствора.
По ординате - величина эффекта Эа (%);
по абсциссе - показатель степени десятикратного разбавления.
к - контроль; столбцы - воздействие супернатанта в разбавлении 10х, где х - показатель степени десятикратного разбавления изучаемого препарата с исходной концентрацией 0,02 мг/мл.
Фиг. 6. Изоэлектрофокусирование супернатантов тканевых экстрактов, выделенных из: А - сердца быка; Б - сыворотки крови быка.
По ординате 1- значения рН; по ординате 2- D280; по абсциссе - номера фракций.
Фиг. 7. Изоэлектрофокусирование супернатантов тканевого экстракта предстательной железы быка (А) и тканевого экстракта молочной железы коровы (Б), по абсциссе-номера фракций,; по ординате 1 - значения оптической плотности соответствующих фракций при 280 нм., по ординате 2 - значения рН.
Фиг. 8. Мембранотропная активность фракции, собранной в области значений рН менее 3,0 после изоэлектрофокусирования супернатанта тканевого экстракта предстательной железы быка (А) и супернатанта тканевого экстракта молочной железы коровы (Б). По ординате - величина эффекта Эа (%); по абсциссе - показатель степени десятикратного разбавления.
К - контроль; столбцы - воздействие ИЭФ-фракции в разбавлении 10х, где х - показатель степени десятикратного разбавления изучаемого препарата, (р<0.05)
Показано, что данные МГТБ изменяют вязкоупругие свойства ткани печени мыши in vitro, причем имеет место полимодальная дозовая зависимость биологического действия МГТБ.
Фиг. 9. Разделение фракций белково-пептидных комплексов, входящих в состав МГТБ, полученных после изоэлектрофокусирования супернатантов тканевых экстрактов и желчи, в 12%-ном ПААГ с добавлением додецилсульфата натрия.
Окраска Кумасси G250.
а) М - маркеры, с 1 по 4 фракции кислых МГТБ, выделенных соответственно, из печени; легкого; тонкого кишечника и желчи, б) М - маркеры, с 1 по 4 фракции основных МГТБ, выделенных, соответственно, из печени; легкого; тонкого кишечника и желчи.
Фиг. 10. Масс-спектр липидной фракции, полученной экстракцией кислой подфракций МГТБ, выделенной из сыворотки крови быка.
Фиг. 11. Распределение частиц МГТБ в водных растворах по гидродинамическому радиусу (метод лазерного динамического светорассеяния). А - кислый белково-пептидный комплекс, входящий в состав МГТБ, выделенного из печени крыс; Б - кислый белково-пептидный комплекс, входящий в состав МГТБ, выделенного из легкого крыс; В - кислый белково-пептидный комплекс, входящий в состав МГТБ, выделенного из тонкого кишечника крыс; Г - кислый белково-пептидный комплекс, входящий в состав МГТБ, выделенного из желчи быка.
Фиг. 12. Определение наноразмерных частиц в ВЭЖХ-фракциях МГТБ, полученных из печени крыс (А), легкого (Б), желчи быка (В), методом АСМ.
Фиг. 13. КД - спектры МГТБ, выделенного из сыворотки крови быка, после нагревания до 100°С в течение 30 мин. По ординате - значение эллептичности при 222 нм; по абсциссе - значение температуры раствора МГТБ. Сплошная линия - кислая фракция МГТБ; крупная пунктирная линия - подфракция МГТБ, собранная в интервале рН 4,5-5,1; мелкая пунктирная линия подфракция основных МГТБ.
Фиг. 14. КД - спектры МГТБ, выделенного из сыворотки крови быка, после воздействия гуанидинхлорида 14 часов, 21-23°С. По ординате - значение эллептичности при 222 нм; по абсциссе - значения концентраций гуанидинхлорида в ммоль/л. Сплошная линия - кислая фракция МГТБ; крупная пунктирная линия - подфракция МГТБ, собранная в интервале рН 4,5-5,1; мелкая пунктирная линия - подфракция основных МГТБ.
Фиг. 15. КД - спектры МГТБ, выделенного из сыворотки крови быка, после воздействии ЭДТА. По ординате - значение эллептичности при 222 нм; по абсциссе -значения показателя десятичной степени 10х моль/л ЭДТА. Сплошная линия - кислая фракция МГТБ; крупная пунктирная линия - подфракция МГТБ, собранная в интервале рН 4,5-5,1; мелкая пунктирная линия - подфракция основных МГТБ.
Фиг. 16. Спектр 1Н ЯМР субстанции МГТБ, выделенной из предстательной железы быка (А), молочной железы коровы (Б), сигнал инозитола (В).
Фиг. 17. Изоэлектрофокусирование супернатанта тканевого экстракта поджелудочной железы быка, по абсциссе номера фракций; по ординате 1 - значения оптической плотности соответствующих фракций при 280 нм, по ординате 2- значения рН.
Фиг. 18. Мембранотропная активность фракции, собранной в области значений рН менее 3,0 после изоэлектрофокусирования супернатанта тканевого экстракта поджелудочной (А) и щитовидной (Б) желез быка. По ординате - величина эффекта Эа (%); по абсциссе - показатель степени десятикратного разбавления.
В таблице 1 приведена характеристики ИЭФ - фракций супернатанта печени* с указанием интервала разбавления фракции, в котором проявляется мембранотропная активность (*данные приводятся для тканевого экстракта, полученного из 230 г влажного веса ткани).
В таблице 2 приведена мембранотропная активность кислых и основных ИЭФ-фракций МГТБ, выделенных из экстрактов различных тканей крысы и желчи быка. В таблице 3 приведены данные сравнительных исследований тканевой специфичности фракций МГТБ, выделенных из печени и легкого, собранных в области рН 4,5-5,1.
В таблице 4 приведены данные о влиянии МГТБ, выделенных из различных тканей и желчи животных на адгезию энтероцитов in vitro.
В таблице 5 приведены сведения об изменении размера частиц желчи быка при воздействии МГТБ, выделенных из желчи, сыворотки крови и печени млекопитающих in vitro.
В таблице 6 приведены сведения об исследованиях вторичной структуры кислых МГТБ Показано, что вторичная структура БПК, входящих в состав МГТБ, описывается, в основном, в терминах β-структур (приблизительно 70%) и статистического клубка (около 30%). Такое состояние вторичной структуры БПК биорегуляторов данной группы является их характерным свойством.
В таблице 7 приведены сведения о влиянии МГТБ, выделенного из поджелудочной железы быка, на экспериментальный диабет у крыс in vivo.
В таблице 8 приведены сведения о противовирусном действии препаратов МГТБ, выделенных из тимуса, сыворотки крови, тонкого кишечника млекопитающих, в отношении инфекции, вызванной высокопатогенным вариантом вируса гриппа птиц.
A/H5N1 в культурах эмбриональных клеток почек свиньи in vitro.
Таким образом, представленные данные на фиг. 1-18 и в таблицах 1-8 наглядно демонстрируют влияние МГТБ на вязкоупругие свойства плазматической мембраны клеток печени, на адгезию энтероцитов in vitro и т.д., тканевую специфичность МГТБ, противовирусное действие препаратов МГТБ, что в целом свидетельствует о способности заявленной субстанции МГТБ и препаратов на ее основе к поддержанию (стимулированию) и восстановлению функции тканей органов после развития в них различных патологических процессов.
Ниже представлены примеры, иллюстрирующие изобретение, но не ограничивающие его.
Пример 1. Способ получения субстанции МГТБ из ткани печени быка
Получение тканевого экстракта печени быка
Свежевыделенную печень быка промывали несколько раз в холодном физ. р-ре до полного удаления крови, нарезали на небольшие фрагменты массой 2-5 г, еще раз промывали физ. р-ром и помещали на 2-3 ч в физ. р-р при 0°С-+4°С. Затем образовавшийся экстракт сливали, центрифугировали при 2500g 30 мин, при +4°С. Полученный экстракт печени далее фракционировали для получения субстанции МГТБ или же замораживали и сохраняли при -80°С- -90°С.
Получение БПК из экстракта ткани печени быка
К охлажденному раствору тканевого экстракта печени постепенно добавляют сернокислый аммоний при постоянном перемешивании до образования насыщенного раствора соли (на 1000 мл экстракта добавляли 780 г соли). Суспензию белков оставляют на 7 суток при температуре +4°С, после чего центрифугируют при 12000g в течение 30 минут. Собирают фракцию супернатанта и осадка. Фракцию супернатанта диализуют против дистиллированной воды до удаления сульфата аммония в соотношении объемов 1:100 с пятикратной сменой воды. Присутствие в растворе ионов аммония определяют реакцией с реактивом Несслера. Фракцию супернатанта концентрируют в роторном вакуумном испарителе при температуре ниже 40°С, диализуют против дистиллированной воды до удаления сульфата аммония и разделяют методом изоэлектрофокусирования (ИЭФ) в градиенте плотности сахарозы на колонке LKB-440 («LKB», Швеция), используя амфолины диапазона рН 3,5 - 10,0 (Serva, Германия) (Остерман, 1983). Для разделения готовят следующие растворы: тяжелый электродный раствор - 60% сахарозы в 1%-ный р-р Н3РО4; легкий электродный раствор - 0,1%-ный NaOH; тяжелый градиентный раствор - 75 г. сахарозы, 100 мл супернатанта, доводят до 200 мл дистиллированной водой; легкий градиентный раствор - 15 г. сахарозы, до 200 мл дистиллированной воды. В колонку наслаивают растворы в следующем порядке: тяжелый электродный раствор, тяжелый и легкий градиентные растворы, которые подают из градиентного смесителя, и затем легкий электродный раствор. ИЭФ проводят при +4°С в течение 96 часов при напряжении 500-1500 В. Собирают фракции объемом 10 мл.
Детекцию белков осуществляют на спектрофотометре при 280 нм, для каждой фракции определяют значение рН с помощью рН-метра. Согласно полученной картине разделения (фиг. 1) собирают фракцию в интервале значений рН<3,0, которую далее диализуют против дистиллированной воды до удаления сахарозы в соотношении объемов 1:100 с пятикратной сменой воды. Данную фракцию анализируют методом масс-спектрометрии на времяпролетном масс-анализаторе UltraFlex 2 (Bruker Daltonic, Германия) с использованием в качестве матрицы α-циано-4-гидроксикоричной кислоты, обнаруживают ряд пептидов с молекулярными массами в диапазоне 1000 Да - 10000 Да (2112, 2170, 2866, 2940, 3009, 3151, 5026, 5237 Да).
Проводят электрофорез в 15%-ном полиакриламидном геле в денатурирующих условиях ИЭФ-фракции, собранной в интервале значений рН<3,0. Из геля вырезают полосу, соответствующую молекулярной массе приблизительно 66000 Да. Проведенный триптический гидролиз белка в геле с последующим масс-спектрометрическим исследованием продуктов гидролиза показал, что выделенный белок представляет собой белок семейства альбуминов млекопитающих под номером gi|367460260 в базе данных SwissProt.
Таким образом, ИЭФ-фракция, собранная в интервале значений рН<3,0, содержит белок gi|367460260 - представитель мультисемейства альбуминов сыворотки крови быка со значением pI в области рН 3,90-4,00, а также смесь небольших пептидов с молекулярными массами от 1000 до 10000 Да, а также ионы кальция, липиды, углеводы, в частности, остатки маннозы, галактозы, глюкозы, N-ацетилглюкозамина, глюкозамина, N-ацетилгалактозамина, которые образуют инозитол-содержащую гликозидную структуру, обеспечивающую ее связь с плазматической мембраной клетки.
Аналогично выделяют субстанцию по изобретению из других органов животных и биологических жидкостей.
Пример 2. Способ получения субстанции МГТБ из ткани печени крысы
Получение тканевого экстракта печени крысы
Эксперимент проводили на крысах Wistar, 220-250 г., обоего пола. Животных декапитировали под эфирным наркозом, перфузировали печень через портальную вену физ. р-ром в течение 1-3 минут для полного удаления крови. Железу вырезали, нарезали на фрагменты, массой 2-4 г., которые промывают несколько раз в свежем физ. растворе и помещают на 2-3 ч в физ. р-р при 0°С-+4°С. Затем образовавшийся экстракт сливают, центрифугируют при 2500g в течение 30 мин. Полученный экстракт печени далее фракционировали для получения БПК или же замораживали и сохраняли при -90°С. Получение субстанции МГТБ из экстракта ткани печени крысы
К охлажденному раствору тканевого экстракта печени постепенно добавляют сернокислый аммоний при постоянном перемешивании до образования насыщенного раствора соли (на 1000 мл экстракта добавляли 780 г соли). Суспензию белков оставляют на 7 суток при температуре +4°С, после чего центрифугируют при 12000g в течение 30 минут. Собирают фракцию супернатанта и осадка. Фракцию супернатанта диализуют против дистиллированной воды до удаления сульфата аммония в соотношении объемов 1:100 с пятикратной сменой воды. Присутствие в растворе ионов аммония определяют реакцией с реактивом Несслера. Фракцию супернатанта концентрируют в роторном вакуумном испарителе при температуре ниже 40°С, диализуют против дистиллированной воды до удаления сульфата аммония и разделяют методом изоэлектрофокусирования (ИЭФ) в градиенте плотности сахарозы на колонке LKB-440 («LKB», Швеция), используя амфолины диапазона рН 3,5 - 10,0 (Serva, Германия) (Остерман, 1983). Для разделения готовят следующие растворы: тяжелый электродный раствор - 60% сахарозы в 1%-ный р-р Н3РО4; легкий электродный раствор - 0,1%-ный NaOH; тяжелый градиентный раствор - 75 г сахарозы, 100 мл супернатанта, доводят до 200 мл дистиллированной водой; легкий градиентный раствор - 15 г. сахарозы, до 200 мл дистиллированной воды. В колонку наслаивают растворы в следующем порядке: тяжелый электродный раствор, тяжелый и легкий градиентные растворы, которые подают из градиентного смесителя, и затем легкий электродный раствор. ИЭФ проводят при +4°С в течение 96 часов при напряжении 500-1500 В. Собирают фракции объемом 10 мл. Детекцию белков осуществляют на спектрофотометре при 280 нм, для каждой фракции определяют значение рН с помощью рН-метра. Согласно полученной картине разделения собирают фракцию в интервале значений рН<3,0, которую далее диализуют против дистиллированной воды до удаления сахарозы в соотношении объемов 1:100 с пятикратной сменой воды. Данную фракцию анализируют методом масс-спектрометрии на времяпролетном масс-анализаторе UltraFlex 2 (Bruker Daltonic, Германия) с использованием в качестве матрицы α-циано-4-гидроксикоричной кислоты, обнаруживают ряд пептидов с молекулярными массами в диапазоне 1000 Да - 10000 Да (3649, 5025 Да).
Проводят электрофорез в 15%-ном полиакриламидном геле в денатурирующих условиях ИЭФ-фракции, собранной в интервале значений рН<3,0. Из геля вырезают полосу, соответствующую молекулярной массе приблизительно 66000 Да. Проведенный триптический гидролиз белка в геле с последующим масс-спектрометрическим исследованием продуктов гидролиза показал, что выделенный белок представляет собой белок семейства альбуминов млекопитающих под номером gi|55628 в базе данных SwissProt.
Таким образом, ИЭФ-фракция, собранная в интервале значений рН<3,0, содержит белок gi|55628 - представитель мультисемейства альбуминов сыворотки крови крысы со значением pI в области рН 3,90-4,00, а также смесь небольших пептидов с молекулярными массами от 1000 до 10000 Да, а также ионы кальция, липиды, углеводы (остатки маннозы, галактозы, глюкозы, N-ацетилглюкозамина, глюкозамина, N-ацетилгалактозамина), которые образуют инозитол-содержащую гликозидную структуру, обеспечивающую ее связь с плазматической мембраной клетки.
Пример 3. Способ получения субстанции МГТБ из печени рыб
Печень получают от рыб вида налим, отряда трескообразных, или из карпа из отряда карпообразных путем вырезания железы после декапитации рыб, многократного промывания ткани в физ. р-ре, разрезания на фрагменты с массой 2-4 г, еще тщательного многократного промывания ткани в физ. р-ре, и последующей экстракции ткани в физ. р-ре при 0°С-+4°С. Образовавшийся экстракт печени рыбы сливали, центрифугировали при 2500g в течение 30 мин. Полученный тканевой экстракт далее фракционировали для получения БПК или же замораживали и сохраняли при -90°С.
К охлажденному раствору тканевого экстракта постепенно добавляют сернокислый аммоний при постоянном перемешивании до образования насыщенного раствора соли (на 100 мл экстракта добавляют 78 г соли). Суспензию белков оставляют на 7 суток при температуре +4°С, после чего центрифугируют при 12000g в течение 30 минут. Собирают фракцию супернатанта и осадка. Фракцию супернатанта диализуют против дистиллированной воды до удаления сульфата аммония в соотношении объемов 1:100 с пятикратной сменой воды. Присутствие в растворе ионов аммония определяют реакцией с реактивом Несслера. Супернатант концентрируют в роторном вакуумном испарителе при температуре ниже 40°С. Фракцию супернатанта экстракта печени рыбы разделяют с помощью метода изоэлектрофокусирования (ИЭФ) в градиенте плотности сахарозы на колонке LKB-440 («LKB», Швеция), используя амфолины диапазона рН 3,5 - 10,0 (Serva, Германия) (Остерман, 1983). Для разделения готовят следующие растворы: тяжелый электродный раствор - 60% сахарозы в 1%-ный р-р Н3РО4; легкий электродный раствор -0,1%-ный NaOH; тяжелый градиентный раствор - 75 г. сахарозы, 100 мл супернатанта, доводят до 200 мл дистиллированной водой; легкий градиентный раствор - 15 г. сахарозы, до 200 мл дистиллированной воды. В колонку наслаивают растворы в следующем порядке: тяжелый электродный раствор, тяжелый и легкий градиентные растворы, которые подают из градиентного смесителя, и затем легкий электродный раствор. ИЭФ проводят при +4°С в течение 96 часов при напряжении 500-1500 В. Собирают фракции объемом 10 мл. Детекцию белков осуществляют на спектрофотометре при 280 нм, для каждой фракции определяют значение рН с помощью рН-метра. Согласно полученной картине разделения собирают фракцию в интервале значений рН<3,0, которую далее диализуют против дистиллированной воды до удаления сахарозы в соотношении объемов 1:100 с пятикратной сменой воды. Данную фракцию анализируют методом масс-спектрометрии на времяпролетном масс-анализаторе UltraFlex 2 (Bruker Daltonic, Германия) с использованием в качестве матрицы а-циано-4-гидроксикоричной кислоты, обнаруживают ряд пептидов с молекулярными массами в диапазоне 1000 Да - 10000 Да. Методом изоэлектрофокусирования в градиенте сахарозы обнаруживают белок, представляющий собой сывороточный альбумин со значением pI в области рН 4,4-5,0, который согласно исследованию методом электрофореза в ПААГ имеет молекулярную массу 65000-67000 Да.
Таким образом, ИЭФ-фракция, собранная в интервале рН>3,0 представляет собой БПК, состоящий из белка - представителя мультисемейства альбуминов сыворотки крови рыб имеет значение pI в области рН 4,4-5,0, с молекулярной массой около 65000-67000 Да и смеси пептидов с молекулярными массами от 1000 до 10000 Да, а также ионы кальция, липиды, углеводы (остатки маннозы, галактозы, глюкозы, N-ацетилглюкозамина, глюкозамина, N-ацетилгалактозамина), которые образуют инозитол-содержащую гликозидную структуру, обеспечивающую ее связь с плазматической мембраной клетки.
Пример 4. Способ получения субстанции МГТБ из ткани печени кур
Печень получают от птиц белых пород, например, Леггорн, самки 7-9 месяцев, путем вырезания железы, многократного промывания ткани в физ. р-ре, разрезания на фрагменты с массой 2-4 г, еще тщательного многократного промывания ткани в физ. р-ре, и последующей экстракции ткани в физ. р-ре при 0°С-+4°С. Образовавшийся экстракт печени сливали, центрифугировали при 2500g в течение 30 мин. Полученный тканевой экстракт далее фракционировали для получения БПК или же замораживали и сохраняли при -90°С.
К охлажденному раствору тканевого экстракта постепенно добавляют сернокислый аммоний при постоянном перемешивании до образования насыщенного раствора соли (на 100 мл экстракта добавляли 78 г соли). Суспензию белков оставляют на 7 суток при температуре +4°С, после чего центрифугируют при 12000g в течение 30 минут. Собирают фракцию супернатанта и осадка. Фракцию супернатанта диализуют против дистиллированной воды до удаления сульфата аммония в соотношении объемов 1:100 с пятикратной сменой воды. Присутствие в растворе ионов аммония определяют реакцией с реактивом Несслера. Супернатант концентрируют в роторном вакуумном испарителе при температуре ниже 40°С. Фракцию супернатанта тканевого экстракта разделяют с помощью метода изоэлектрофокусирования (ИЭФ) в градиенте плотности сахарозы на колонке LKB-440 («LKB», Швеция), используя амфолины диапазона рН 3,5 - 10,0 (Serva, Германия) (Остерман, 1983). Для разделения готовят следующие растворы: тяжелый электродный раствор - 60% сахарозы в 1%-ный р-р Н3РО4; легкий электродный раствор -0,1%-ный NaOH; тяжелый градиентный раствор - 75 г. сахарозы, 100 мл супернатанта, доводят до 200 мл дистиллированной водой; легкий градиентный раствор - 15 г. сахарозы, до 200 мл дистиллированной воды. В колонку наслаивают растворы в следующем порядке: тяжелый электродный раствор, тяжелый и легкий градиентные растворы, которые подают из градиентного смесителя, и затем легкий электродный раствор. ИЭФ проводят при +4°С в течение 96 часов при напряжении 500-1500 В. Собирают фракции объемом 10 мл. Детекцию белков осуществляют на спектрофотометре при 280 нм, для каждой фракции определяют значение рН с помощью рН-метра. Согласно полученной картине разделения собирают фракцию в интервале значений рН<3,0, которую далее диализуют против дистиллированной воды до удаления сахарозы в соотношении объемов 1:100 с пятикратной сменой воды. Данную фракцию анализируют методом масс-спектрометрии на времяпролетном масс-анализаторе UltraFlex 2 (Bruker Daltonic, Германия) с использованием в качестве матрицы α-циано-4-гидроксикоричной кислоты, обнаруживают ряд пептидов с молекулярными массами в диапазоне 1000 Да - 10000 Да. Методом изоэлектрофокусирования в градиенте сахарозы обнаруживают белок, представляющий собой сывороточный альбумин со значением pI в области рН 4,5-4,9, который согласно исследованию методом электрофореза в ПААГ имеет молекулярную массу приблизительно 66000 Да- 68000 Да.
Таким образом, ИЭФ-фракция, собранная в интервале рН>3,0 представляет собой БПК, состоящий из белка - представителя мультисемейства альбуминов сыворотки крови курицы имеет значение pI в области рН 4,5-5,1 с молекулярной массой около 66000 Да-68000 Да и смеси пептидов с молекулярными массами от 1000 до 10000 Да, а также ионы кальция, липиды, углеводы - остатки маннозы, галактозы, глюкозы, N-ацетилглюкозамина, глюкозамина, N-ацетилгалактозамина, которые образуют инозитол-содержащую гликозидную структуру, обеспечивающую ее связь с плазматической мембраной клетки.
Пример 5. Способ получения субстанции МГТБ из ткани легкого быка
Получение тканевого экстракта легкого быка
Легкое быка промывали несколько раз в холодном физ. р-ре до полного удаления крови, нарезали на небольшие фрагменты массой 1-2 г, еще раз промывали физ. р-ром и помещали на 2-3 ч в физ. р-р при 0°С-+4°с. Затем образовавшийся экстракт сливали, центрифугировали при 2500g в течение 30 мин. Полученный экстракт легкого далее фракционировали для получения МГТБ или же замораживали и сохраняли при -90°С.
Получение МГТБ из экстракта ткани легкого быка
К охлажденному раствору тканевого экстракта легкого постепенно добавляют сернокислый аммоний при постоянном перемешивании до образования насыщенного раствора соли (на 100 мл добавляли 78 г соли). Суспензию белков оставляют на 7 суток при температуре +4°С, после чего центрифугируют при 12000g в течение 30 минут. Собирают фракцию супернатанта и осадка. Фракцию супернатанта диализуют против дистиллированной воды до удаления сульфата аммония в соотношении объемов 1:100 с пятикратной сменой воды. Присутствие в растворе ионов аммония определяют реакцией с реактивом Несслера. Фракцию супернатанта концентрируют в роторном вакуумном испарителе при температуре ниже 40°С. Фракцию супернатанта диализовали против дистиллированной воды до удаления сульфата аммония и разделяют с помощью метода изоэлектрофокусирования (ИЭФ) в градиенте плотности сахарозы на колонке LKB-440 («LKB», Швеция), используя амфолины диапазона рН 3,5 - 10,0 (Serva, Германия) (Остерман, 1983). Для разделения готовят следующие растворы: тяжелый электродный раствор - 60% сахарозы в 1%-ный р-р Н3РО4; легкий электродный раствор - 0,1%-ный NaOH; тяжелый градиентный раствор - 75 г. сахарозы, 100 мл супернатанта, доводят до 200 мл дистиллированной водой; легкий градиентный раствор - 15 г. сахарозы, до 200 мл дистиллированной воды. В колонку наслаивают растворы в следующем порядке: тяжелый электродный раствор, тяжелый и легкий градиентные растворы, которые подают из градиентного смесителя, и затем легкий электродный раствор. ИЭФ проводят при +4°С в течение 96 часов при напряжении 500-1500 В. Собирают фракции объемом 10 мл. Детекцию белков осуществляют на спектрофотометре при 280 нм, для каждой фракции определяют значение рН с помощью рН-метра. Согласно полученной картине разделения (фиг. 1) собирают фракцию в интервале значений рН<3,0, которую далее диализуют против дистиллированной воды до удаления сахарозы в соотношении объемов 1:100 с пятикратной сменой воды. Данную фракцию анализируют методом масс-спектрометрии на времяпролетном масс-анализаторе UltraFlex 2 (Bruker Daltonic, Германия) с использованием в качестве матрицы α-циано-4-гидроксикоричной кислоты, обнаруживают ряд пептидов с молекулярными массами в диапазоне 1000 Да - 10000 Да.
Проводили электрофорез в 15%-ном полиакриламидном геле в денатурирующих условиях ИЭФ-фракции, собранной в интервале значений рН<3,0. Из геля вырезали полосу, соответствующую молекулярной массе приблизительно 66000 Да. Проведенный триптический гидролиз белка в геле с последующим масс-спектрометрическим исследованием продуктов гидролиза показал, что выделенный белок представляет собой белок семейства альбуминов млекопитающих под номером gi
|367460260 в базе данных SwissProt.
Таким образом, ИЭФ-фракция, собранная в интервале значений рН<3,0 содержит белок gi|367460260 - представитель мультисемейства альбуминов сыворотки крови быка со значением pI в области рН 3,90-4,00, а также смесь небольших пептидов с молекулярными массами от 1000 до 10000 Да, а также ионы кальция, липиды, углеводы - остатки маннозы, галактозы, глюкозы, N-ацетилглюкозамина, глюкозамина, N-ацетилгалактозамина, которые образуют инозитол-содержащую гликозидную структуру, обеспечивающую ее связь с плазматической мембраной клетки.
Пример 6. Способ получения субстанции МГТБ из ткани легкого крысы
Получение тканевого экстракта легкого крысы
Свежевыделенное легкое крысы промывали несколько раз в холодном физ. р-ре до полного удаления крови, нарезали на небольшие фрагменты массой 1 -2 г, еще раз промывали физ. раствором и помещали на 2-3 ч в физ. раствор при 0°С-+4°с. Затем образовавшийся экстракт сливали, центрифугировали при 2500g в течение 30 мин. Полученный экстракт ткани легкого далее фракционировали для получения МГТБ или же замораживали и сохраняли при -90°С.
Получение МГТБ из экстракта ткани легкого крысы
К охлажденному раствору тканевого экстракта легкого постепенно добавляют сернокислый аммоний при постоянном перемешивании до образования насыщенного раствора соли (на 100 мл добавляли 78 г соли). Суспензию белков оставляют на 7 суток при температуре +4°С, после чего центрифугируют при 12000g в течение 30 минут. Собирают фракцию супернатанта и осадка. Фракцию супернатанта диализуют против дистиллированной воды до удаления сульфата аммония в соотношении объемов 1:100 с пятикратной сменой воды. Присутствие в растворе ионов аммония определяют реакцией с реактивом Несслера. Фракцию супернатанта концентрируют в роторном вакуумном испарителе при температуре ниже 40°С. Фракцию супернатанта диализовали против дистиллированной воды до удаления сульфата аммония и разделяют с помощью метода изоэлектрофокусирования (ИЭФ) в градиенте плотности сахарозы на колонке LKB-440 («LKB», Швеция), используя амфолины диапазона рН 3,5 - 10,0 (Serva, Германия) (Остерман, 1983). Для разделения готовят следующие растворы: тяжелый электродный раствор - 60% сахарозы в 1%-ный р-р Н3РО4; легкий электродный раствор - 0,1%-ный NaOH; тяжелый градиентный раствор - 75 г. сахарозы, 100 мл супернатанта, доводят до 200 мл дистиллированной водой; легкий градиентный раствор - 15 г. сахарозы, до 200 мл дистиллированной воды. В колонку наслаивают растворы в следующем порядке: тяжелый электродный раствор, тяжелый и легкий градиентные растворы, которые подают из градиентного смесителя, и затем легкий электродный раствор. ИЭФ проводят при +4°С в течение 96 часов при напряжении 500-1500 В. Собирают фракции объемом 10 мл.
Детекцию белков осуществляют на спектрофотометре при 280 нм, для каждой фракции определяют значение рН с помощью рН-метра. Согласно полученной картине разделения собирают фракцию в интервале значений рН<3,0, которую далее диализуют против дистиллированной воды до удаления сахарозы в соотношении объемов 1:100 с/ пятикратной сменой воды. Данную фракцию анализируют методом масс-спектрометрии на времяпролетном масс-анализаторе UltraFlex 2 (Bruker Daltonic, Германия) с использованием в качестве матрицы α-циано-4-гидроксикоричной кислоты, обнаруживают ряд пептидов с молекулярными массами в диапазоне 1000 Да - 10000 Да.
Проводили электрофорез в 15%-ном полиакриламидном геле в денатурирующих условиях ИЭФ-фракции, собранной в интервале значений рН<3,0. Из геля вырезали полосу, соответствующую молекулярной массе приблизительно 65000 Да - 67000 Да. Проведенный триптический гидролиз белка в геле с последующим масс-спектрометрическим исследованием продуктов гидролиза показал, что выделенный белок представляет собой белок семейства альбуминов млекопитающих под номером gi |367460260 в базе данных SwissProt.
Таким образом, ИЭФ-фракция представляет собой БПК, состоящий из белка - члена мультисемейства альбуминов сыворотки крови крысы и смеси пептидов с молекулярными массами от 1000 до 10000 Да, а также ионы кальция, липиды, углеводы, в частности, остатки маннозы, галактозы, глюкозы, N-ацетилглюкозамина, глюкозамина, N-ацетилгалактозамина, которые образуют инозитол-содержащую гликозидную структуру, обеспечивающую ее связь с плазматической мембраной клетки.
Пример 7. Способ получения МГТБ из ткани тонкого кишечника крысы
Получение тканевого экстракта тонкого кишечника
Тонкий кишечник вырезают, помещают в физ. р-р, разрезают на фрагменты длинной около 2 см, промывают многократно внутренние поверхности кишки, используя шприц, быстро помещают в холодный физ. р-ре (+4°С - 0°С) на 2 часа, затем образовавшийся экстракт сливают, центрифугируют при 2500g в течение 30 мин. Полученный тканевой экстракт сразу же фракционируют для получения МГТБ или же замораживают и сохраняют при -90°С.
Получение МГТБ из экстракта ткани тонкого кишечника крысы
К охлажденному раствору тканевого экстракта постепенно добавляют сернокислый аммоний при постоянном перемешивании до образования насыщенного раствора соли (на 100 мл добавляли 78 г соли). Суспензию белков оставляют на 7 суток при температуре +4°С, после чего центрифугируют при 12000g в течение 30 минут. Собирают фракцию супернатанта и осадка. Фракцию супернатанта диализуют против дистиллированной воды до удаления сульфата аммония в соотношении объемов 1:100 с пятикратной сменой воды. Присутствие в растворе ионов аммония определяют реакцией с реактивом Несслера.
Фракцию супернатанта концентрируют в роторном вакуумном испарителе при температуре ниже 40°С. Фракцию супернатанта диализовали против дистиллированной воды до удаления сульфата аммония и разделяют с помощью метода изоэлектрофокусирования (ИЭФ) в градиенте плотности сахарозы на колонке LKB-440 («LKB», Швеция), используя амфолины диапазона рН 3,5 - 10,0 (Serva, Германия) (Остерман, 1983). Для разделения готовят следующие растворы: тяжелый электродный раствор - 60% сахарозы в 1%-ный р-р Н3РО4; легкий электродный раствор - 0,1%-ный NaOH; тяжелый градиентный раствор - 75 г. сахарозы, 100 мл супернатанта, доводят до 200 мл дистиллированной водой; легкий градиентный раствор - 15 г. сахарозы, до 200 мл дистиллированной воды. В колонку наслаивают растворы в следующем порядке: тяжелый электродный раствор, тяжелый и легкий градиентные растворы, которые подают из градиентного смесителя, и затем легкий электродный раствор. ИЭФ проводят при +4°С в течение 96 часов при напряжении 500-1500 В. Собирают фракции объемом 10 мл. Детекцию белков осуществляют на спектрофотометре при 280 нм, для каждой фракции определяют значение рН с помощью рН-метра. Согласно полученной картине разделения (фиг. 1) собирают фракцию в интервале значений рН<3,0, которую далее диализуют против дистиллированной воды до удаления сахарозы в соотношении объемов 1:100 с пятикратной сменой воды. Данную фракцию анализируют методом масс-спектрометрии на времяпролетном масс-анализаторе UltraFlex 2 (Bruker Daltonic, Германия) с использованием в качестве матрицы α-циано-4-гидроксикоричной кислоты, обнаруживают ряд пептидов с молекулярными массами в диапазоне 1000 Да - 10000 Да.
Проводили электрофорез в 15%-ном полиакриламидном геле в денатурирующих условиях ИЭФ-фракции, собранной в интервале значений рН<3,0. Из геля вырезали полосу, соответствующую молекулярной массе приблизительно 65000 Да - 67000 Да. На секвинаторе методом Эдмана определяли N-концевой фрагмент белка, он соответствовал N-концевому фрагменту альбумина сыворотки крови крысы.
Таким образом, ИЭФ-фракция представляет собой БПК, состоящий из белка - члена мультисемейства альбуминов сыворотки крови крысы и смеси пептидов с молекулярными массами от 1000 до 10000 Да, а также ионы кальция, липиды, углеводы -остатки маннозы, галактозы, глюкозы, N-ацетилглюкозамина, глюкозамина, N-ацетилгалактозамина, которые образуют инозитол-содержащую гликозидную структуру, обеспечивающую ее связь с плазматической мембраной клетки.
Пример 8. Получение субстанции МГТБ из желчи быка
В работе использовали препарат «Желчь медицинская консервированная», выделенный из желчного пузыря быка (1 л), приобретенный в аптеках г. Москвы.
К охлажденной желчи при перемешивании добавляют сухой сернокислый аммоний до образования насыщенного раствора соли, несколько кристалликов азида натрия и оставляют на 7 суток при температуре +4°С. Далее суспензию белков центрифугируют при 15000g в течение 30 минут. Фракцию супернатанта, представляющей собою прозрачную белую жидкость, диализуют против дистиллированной воды до удаления сульфата аммония в соотношении объемов 1:100 с пятикратной сменой воды. Присутствие в растворе ионов аммония определяют реакцией с реактивом Несслера. Фракцию супернатанта концентрируют в роторном вакуумном испарителе при температуре ниже 40°С. Фракцию супернатанта разделяют с помощью метода изоэлектрофокусирования (ИЭФ) в градиенте плотности сахарозы на колонке LKB-440 («LKB», Швеция), используя амфолины диапазона рН 3,5 - 10,0 (Serva, Германия) (Остерман, 1983). Для разделения готовят следующие растворы: тяжелый электродный раствор - 60% сахарозы в 1%-ный р-р Н3РО4; легкий электродный раствор - 0,1%-ный NaOH; тяжелый градиентный раствор - 75 г. сахарозы, 100 мл супернатанта, доводят до объема 200 мл дистиллированной водой; легкий градиентный раствор - 15 г. сахарозы, до 200 мл дистиллированной воды. В колонку наслаивают растворы в следующем порядке: тяжелый электродный раствор, тяжелый и легкий градиентные растворы, которые подают из градиентного смесителя, и затем легкий электродный раствор. ИЭФ проводят при +4°С в течение 96 часов при напряжении 500-1500 В. Собирают фракции объемом 10 мл. Детекцию белков осуществляют на спектрофотометре при 280 нм, для каждой фракции определяют значение рН с помощью рН-метра. Согласно полученной картине разделения (фиг. 1) собирают фракцию в интервале значений рН<3,0, которую далее диализуют против дистиллированной воды до удаления сахарозы в соотношении объемов 1:100 с пятикратной сменой воды. Данную фракцию анализируют методом масс-спектрометрии на времяпролетном масс-анализаторе UltraFlex 2 (Bruker Daltonic, Германия) с использованием в качестве матрицы α-циано-4-гидроксикоричной кислоты, обнаруживают ряд пептидов с молекулярными массами в диапазоне 1000 Да - 10000 Да.
Проводили электрофорезе 15%-ном ПААГ геле в денатурирующих условиях ИЭФ-фракции, собранной в интервале значений рН<3,0. Из геля вырезали полосу, соответствующую молекулярной массе приблизительно 66000 Да. Проведенный триптический гидролиз белка в геле с последующим масс-спектрометрическим исследованием продуктов гидролиза показал, что выделенный белок с молекулярной массой 66366 Да представляет собой белок семейства альбуминов млекопитающих под номером под номером gi| 1351907 в базе данных SwissProt. Методом Эдмана была установлена частичная N-концевая аминокислотная последовательность данного белка (DTHKSEIAHRFKDLGE), которая имеет 100%-ную гомологию с N-концевой последовательностью зрелой молекулы сывороточного альбумина Bos taurus.
Таким образом, ИЭФ-фракция представляет собой БПК, состоящий из белка gi| 1351907 представителя мультисемейства альбуминов сыворотки крови Bos taurus и смеси пептидов с молекулярными массами от 1000 до 10000 Да, а также ионы кальция, липиды, углеводы -остатки маннозы, галактозы, глюкозы, N-ацетилглюкозамина, глюкозамина, N-ацетилгалактозамина, которые образуют инозитол-содержащую гликозидную структуру, обеспечивающую ее связь с плазматической мембраной клетки.
Пример 9. Приготовление растворов различных концентраций белок-пептидных комплексов, входящих в состав субстанции МГТБ, выделенной из различных тканей и биологических жидкостей животных
Количественное определение белка в исследуемых фракциях осуществляли с помощью колориметрического метода с использованием бицинхонината меди при 562 нм [Smith et al., 1985].
Для этого готовили два раствора:
Раствор А - 1 г бицинхониновой кислоты, 2 г Na2CO3, 0,16 г тартрата натрия, 1 г NaOH, 0,95 г NaHCO3 в 100 мл дистиллированной воды (рН=11,25);
Раствор Б - 0.4 г CuSO4*5H2O в 10 мл дистиллированной воды.
Непосредственно перед проведением опыта готовили третий раствор В, смешивая 50 мл раствора А с 1 мл раствора Б. Для определения концентрации белка к 50 мкл исследуемого раствора прибавляли 1 мл раствора В, инкубировали пробы 30 минут при 60°С, затем охлаждали до комнатной температуры. Поглощение измеряли при 562 нм. Для построения калибровочной кривой вначале готовили растворы бычьего сывороточного альбумина (БСА) в концентрациях: 5, 10, 25, 50, 75, 100, 125, 250, 500, 750, 1000 мкг/мл. К 50 мкл раствора БСА известной концентрации добавляли 1 мл раствора В, полученные пробы инкубировали, измеряли поглощение по описанной выше методике и строили калибровочную кривую согласно результатам измерений. По построенной калибровочной кривой определяли концентрацию белков в исследуемых растворах.
В качестве исходного раствора МГТБ используют ИЭФ-фракцию, собранную в области рН<3,0, выделенную из соответствующей ткани быка с концентрацией по белку 100±10 мкг/мл. Во флакон, содержащий 0,1 мл водного раствора МГТБ, добавляют 0,9 мл дистиллированной воды интенсивно встряхивают 25 раз. Отбирают 0,1 мл образовавшегося раствора в следующий флакон и добавляют 0,9 мл дистиллированной воды, встряхивают 25 раз. Данную процедуру повторяют 17 раз, получая таким образом растворы МГТБ с 10-кратным последовательным разбавлением от 1 до 19 степени. Таким образом, были получены растворы МГТБ с 10-1 по 10-19 мг/мл. В экспериментах по изучению безопасности раствора МГТБ, выделенного из сыворотки крови КРС, были исследованы растворы в концентрациях 10-5, 10-12, 10-19 мг/мл. Аналогично и в таком же диапазоне концентраций были приготовлены растворы МГТБ на 0,9%-ном растворе NaCl. Все растворы стерилизуют путем пропускания через стерильные мембранные фильтры GV с диаметром пор 0,22 мкм («МПИроге», США). В качестве терапевтической дозы исследуют раствор МГТБ в концентрации, соответствующей 10-10-10-12 мг/мл.
Пример 10. Влияние субстанции МГТБ, выделенной из экстрактов различных тканей и биологических жидкостей животных, на вязкоупругие свойства мембран клеток печени и легкого мыши при множественном кратковременном органном культивировании in vitro (мембранотропная активность)
Биотестирование фракций, получаемых на разных этапах очистки тканевых экстрактов и биологических жидкостей, проводили с помощью адгезиометрического метода, специально разработанного для идентификации субстанции МГТБ. Метод позволяет оценивать вязкоупругие свойства ткани при стандартном деформационном воздействии.
В эксперименте использовали мышей CBA/C57BI, самцы, весом 15-18 г.
После декапитации животного из печени или из легкого вырезали фрагменты весом 1,0-2,5 мг.В каждый пенициллиновый флакон опытной серии вносили 1 мл питательной среды 199 и 0,1 мл исследуемого раствора белка в соответствующей концентрации, помещали по пять фрагментов ткани печени или легкого мыши. Интервал активных концентраций для каждого из изучаемых белковых препаратов определяли, исследуя биологическое действие его растворов, полученных при последовательном разведении в 10, 100, 1000 и более раз. В флаконы контрольной серии вместо раствора исследуемого белка вносили 0,1 мл физ. раствора. Органные культуры опытной и контрольной серий инкубировали в течение 2 ч при 37°С. Далее каждый фрагмент ткани вынимали, осушали в течение 10-15 сек на фильтровальной бумаге, взвешивали и подвергали диспергированию в 0,1 мл 0,1%-ного раствора трипанового синего, приготовленного на 199 среде, в дезинтеграторе ткани с зазором 50 мкм в условиях стандартного деформационного воздействия. Полученную суспензию клеток и клеточных ядер исследовали микроскопически в камере Горяева, проводя подсчет клеточных ядер в определенном объеме камеры (0,02 мм).
Определяли параметр, отражающий влияние МГТБ на вязкоупругие свойства ткани печени или легкого по формуле:
где
Ма и Nк -количество клеточных ядер, выделившихся из 1 мг ткани печени или легкого после диспергирования, соответственно, в опытной и контрольной сериях. Статистическую обработку полученных данных проводили методом вариационной статистики с использованием критерия Стьюдента.
В каждом эксперименте на одну точку (раствор исследуемого препарата в определенной концентрации и контроле) просчитывали не менее 5 фрагментов ткани. Каждый эксперимент повторяли не менее 3-х раз.
Пример 11. Влияние полученных изофокусированием подфракций субстанции МГТБ, выделенной, соответственно, из тканевого экстракта печени и тканевого экстракта легкого, на вязкоупругие свойства мембран клеток печени при множественном органном культивировании ткани in vitro
Методом изоэлектрофокусирования в градиенте сахарозы в интервале рН 3,0-10,0 было показано, что МГТБ, содержащиеся в экстракте ткани соответствующего органа, могут образовывать несколько подфракций, белки которых различаются по заряду (табл.1). Наиболее представленной количественно и всегда присутствующей в супернатантах тканевых экстрактов является подфракция кислых белков, которую собирали после ИЭФ в области рН менее 3,0. Другие подфракций также были идентифицироваными, например, в супернатанте экстракта печени крысы были обнаружены 4 подфракций, различающихся по заряду белков МГТБ: в области рН<3.0 (кислые белки); в области рН 4.5-5.1 (слабокислые белки); в области рН 6.7-7.2; в области рН>8.0 (основные белки). Основные характеристики данных ИЭФ-фракций приведены в табл. 1, на фиг. 2-5 представлены диаграммы дозовой зависимости мембранотропного действия данных фракций, определенного на множественной органотипической культуре печени мыши in vitro. Аналогично были получены подфракций из тканевого экстракта легкого, ткани тонкого кишечника и желчи крысы и быка (фиг. 2-5).
Фракция в области рН 6.7-7.2, представляет собой минорную фракцию МГТБ, отличающуюся от фракции кислых БПК, во-первых, непостоянством присутствия в тканевых экстрактах и биологических жидкостей, во-вторых, отсутствием резистентности к воздействию различных физико-химических факторов (температура, воздействие деионизованной среды или Са2+- хелатирующих агентов). Например, было показано, что фракция белков, собранная в области рН 6,7-7,2, утрачивает мембранотропную активность после диализа против дистиллированной воды. Если же диализ данной фракции проводить против физ. раствора, содержащего ионы кальция, то ее мембранотропная активность сохраняется (фиг. 5). Данная подфракция утрачивала биологическую активность после многократной процедуры «замораживания-оттаивания», а также после пребывания при комнатной температуре, т.е. проявляла свойства, которые значительно отличали ее от других фракций МГТБ из печени. Следует отметить, что данная подфракция проявляла свойство тканевой специфичности: фракция, выделенная из печени крыс была активно только в отношении ткани печени, подфракция, выделенная из легкого крыс, была активна только в отношении ткани легкого.
Фракция, собранная в интервале рН 4.5-5.1 после проведения изоэлектрофокусирования супернатанта печени представляет собою БПК, состоящий из сывороточного альбумина и низкомолекулярных пептидов, соотношение которых при образовании комплекса отличалось от такового в БПК кислой подфракций: в подфракций интервала рН 4,5-5,1 количество сывороточного альбумина было намного больше, чем во фракции кислых БПК.
В табл. 2 представлены характеристики кислых и основных подфракций БПК, входящих в состав МГТБ, выделенных изоэлектрофокусированием из супернатантов нескольких тканевых экстрактов и биологических жидкостей. В качестве примера на фиг. 3 представлены результаты исследования мембранотропной активности данных подфракций. Следует отметить, что несмотря на различия в заряде белков МГТБ, в этих подфракциях, основными компонентами являются низкомолекулярные пептиды и сывороточный альбумин, образующими БПК. Предполагается, что различия зарядов у БПК могут обусловливать третичная и четвертичная структуры сывороточного альбумина, состав пептидов, а также липидов.
Наиболее количественно в субстанции МГТБ представлена ИЭФ-фракция, собранная в интервале значений рН<3,0. Для МГТБ, выделенной из сыворотки крови крупного рогатого скота, она содержит белок - представитель мультисемейства альбуминов сыворотки крови быка gi| 1359007, pI в области рН 3,90-4,00, а также смесь небольших пептидов с молекулярными массами от 1000 до 10000 Да, среди которых были обнаружены, а для МГТБ, выделенной 367460260 - представитель мультисемейства альбуминов сыворотки крови быка со значением белок gi| 158138568 - представитель мультисемейства альбуминов сыворотки крови крысы со значением pI в области рН 3,90-4,00, а также смесь небольших пептидов с молекулярными массами от 1000 до 10000 Да.
В табл.3. представлены данные исследования мембранотропной активности подфракций, выделенных из печени и легкого крыс, собранных в интервале рН 4,5-5,1.
Было установлено, что фракции, выделенные из тканевого экстракта печени и его супернатанта, проявляли мембранотропное действие как на клетки печени, так и на клетки легкого in vitro, т.е. характеризовались отсутствием тканевой специфичности биологического действия. Только Фракции, собранные в интервале рН 4.5-5.1, после изоэлектрофокусирования, как тканевого экстракта легкого, так и его супернатанта, были биологически неактивны.
Выводы
1. В супернатантах тканевых экстрактов печени, легкого, тонкого кишечника, а также в желчи млекопитающих, содержатся МГТБ в виде нескольких подфракций, отличающихся по заряду.
2. Все эти подфракций представляют собою БПК, образованные сывороточным альбумином и небольшими пептидами с молекулярными массами 1000 Да - 10000 Да. Фракцией, количественно представленной и всегда присутствующей в составе субстанции МГТБ, является БПК, собранный в интервале рН менее 3,0. Все остальные подфракций были менее представлены количественно, кроме того, в ряде тканевых экстрактов и биологических жидкостях они не были обнаружены. Поэтому способ получения МГТБ из соответствующей ткани позвоночных животных соответствует выделению и очистке именно фракции кислых БПК.
Пример 12. Влияние МГТБ, выделенного из ткани кишечника крыс, на адгезию энтероцитов крысы in vitro
Эксперимент проводили на крысах Wistar, обоего пола, весом 240-250 г. Под эфирным наркозом животное декапитировали, вынимали из брюшной полости тонкий кишечник. Из его середины вырезали фрагменты длиной приблизительной 80-100 мм, который с помощью стеклянной палочки выворачивали, делая внутреннюю поверхность внешней. Далее многократно очень аккуратно, не повреждая поверхности кишки промывали фрагменты в 199 среде при комнатной температуре (22-24°С), разрезали на более мелкие фрагменты длиной 20-25 мм. По 5 мелких фрагментов кишки помещали в чашку Петри, содержащую 5 мл 199 среды и 10% сыворотки крови крупного рогатого скота (контроль), в другие чашки помещали по 5 мелких фрагментов, содержащих 5 мл 199 среды и 10% сыворотки и МГТБ в концентрации 10-9 мг белка/мл. Изучали биологическое действие следующих МГТБ в виде ИЭФ-фракций, собранных в диапазоне рН менее 3,0:
1. МГТБ, выделенный из ткани тонкого кишечника крысы;
2. МГТБ, выделенный из ткани печени крысы;
3. МГТБ, выделенный из ткани легкого крысы;
4. МГТБ, выделенный из сыворотки крови быка;
5. МГТБ, выделенный из желчи быка.
Органотипические культуры кишки инкубировали в течение 15 минут при 37°С. Далее каждый фрагмент аккуратно вынимали, быстро осушали на фильтровальной бумаге, взвешивали, надевали на металлический стержень, диаметром 1,5 мм, и подвергали вращению в течение 3 мин, опуская стержень в кювету со 199 средой, содержащей 10% сыворотки крови, объемом 1 мл. Скорость вращения 100 об/мин, 22-24°С. Далее производили подсчет выделившихся энтероцитов в питательную среду с помощью камеры Горяева. Просчитывали 5 фрагментов каждой опытной серии.
Как показывают результаты в табл.4, только при воздействии МГТБ, выделенного из тонкого кишечника, энтероцитов выделялось приблизительно в 2,0 раза меньше, чем в контроле или при воздействии МГТБ, выделенных из других источников.
Выводы
В данном исследовании было показано, что МГТБ проявляют свойства адгезивных белков, которое характеризуется тканевой специфичностью.
Пример 13. Влияние субстанции МГТБ, выделенной из желчи быка, на размер частиц в желчи человека in vitro
У человека ежедневно секретируется 250-1000 мл желчи со сложным компонентным составом. Желчь, находящаяся в протоках печени (печеночная желчь) и желчь, присутствующая в пузыре (пузырная желчь) значительно различаются по составу, несмотря на то, что и та и другая представляют собой неустойчивую коллоидную систему.
Неотъемлемым компонентом желчи являются желчные кислоты (соли), в значительной мере определяющие ее физико-химические свойства. Физиологическое значение желчных кислот для организма человека определяется рядом положений: образование мицелл для транспорта водонерастворимых веществ (холестерина, витаминов А, Д, Е, К); образование с холестерином жидких кристаллов; стабилизация мембран гепатоцитов; активация панкреатической липазы; стимуляция моторики кишечника; повышение секреции ионов натрия и воды в толстой кишке.
Было показано, что только при добавлении МГТБ, выделенного из желчи, к пузырной желчи быка в условиях in vitro наблюдали статистически достоверное уменьшение среднего диаметра частиц приблизительно вдвое по сравнению с контролем (табл.5). В этом же эксперименте было также показано, что МГТБ, выделенные из сыворотки крови и печени млекопитающих, не оказывали влияния на размер частиц желчи in vitro. Таким образом, в данной экспериментальной серии удалось продемонстрировать специфическую биологическую активность МГТБ, выделенного из желчи.
Пример 14. Получение субстанции МГТБ из ткани сердца быка
Сердце получали от молодых бычков мясоперерабатывающих предприятий г. Москвы и Московской области.
Получение тканевого экстракта сердца быка
Сердце быка промывали несколько раз в холодном физ. р-ре до полного удаления крови, нарезали на небольшие фрагменты массой 1-2 г, еще раз промывали физ. р-ром и помещали на 2-3 ч в физ. р-р при 0°С-+4°С. Затем образовавшийся экстракт сливали, центрифугировали при 2500g в течение 30 мин. Полученный экстракт сердца далее фракционировали для получения МГТБ или же замораживали и сохраняли при -90°С.
Получение МГТБ из экстракта ткани сердца быка
К охлажденному раствору тканевого экстракта сердца постепенно добавляют сернокислый аммоний при постоянном перемешивании до образования насыщенного раствора соли (на 100 мл добавляли 78 г соли). Суспензию белков оставляют на 7 суток при температуре +4°С, после чего центрифугируют при 12000 g в течение 30 минут. Собирают фракцию супернатанта и осадка. Фракцию супернатанта диализуют против дистиллированной воды до удаления сульфата аммония в соотношении объемов 1:100 с пятикратной сменой воды. Присутствие в растворе ионов аммония определяют реакцией с реактивом Несслера. Фракцию супернатанта концентрируют в роторном вакуумном испарителе при температуре ниже 40°С. Фракцию супернатанта диализовали против дистиллированной воды до удаления сульфата аммония и разделяют с помощью метода изоэлектрофокусирования (ИЭФ) в градиенте плотности сахарозы на колонке LKB-440 («LKB», Швеция), используя амфолины диапазона рН 3,5 - 10,0 (Serva, Германия) (Остерман, 1983). Для разделения готовят следующие растворы: тяжелый электродный раствор - 60% сахарозы в 1%-ный р-р Н3РО4; легкий электродный раствор - 0,1%-ный NaOH; тяжелый градиентный раствор - 75 г сахарозы, 100 мл супернатанта, доводят до 200 мл дистиллированной водой; легкий градиентный раствор - 15 г сахарозы, до 200 мл дистиллированной воды. В колонку наслаивают растворы в следующем порядке: тяжелый электродный раствор, тяжелый и легкий градиентные растворы, которые подают изградиентного смесителя, и затем легкий электродный раствор. ИЭФ проводят при +4°С в течение 96 часов при напряжении 500-1500 В. Собирают фракции объемом 10 мл. Детекцию белков осуществляют на спектрофотометре при 280 нм, для каждой фракции определяют значение рН с помощью рН-метра. Согласно полученной картине разделения (фиг. 6) собирают фракцию в интервале значений рН<3,0, которую далее диализуют против дистиллированной воды до удаления сахарозы в соотношении объемов 1:100 с пятикратной сменой воды. Данную фракцию анализируют методом масс-спектрометрии на времяпролетном масс-анализаторе UltraFlex 2 (Bruker Daltonic, Германия) с использованием в качестве матрицы α-циано-4-гидроксикоричной кислоты, обнаруживают ряд пептидов с молекулярными массами в диапазоне 1000 Да - 10000 Да.
Проводили электрофорез в 15%-ном полиакриламидном геле в денатурирующих условиях ИЭФ-фракции, собранной в интервале значений рН<3,0. Из геля вырезали полосу, соответствующую молекулярной массе приблизительно 66000 Да. Проведенный триптический гидролиз белка в геле с последующим масс-спектрометрическим исследованием продуктов гидролиза показал, что выделенный белок представляет собой белок семейства альбуминов млекопитающих под номером gi| 1351907 в базе данных SwissProt.
Таким образом, ИЭФ-фракция представляет собой БПК, состоящий из белка gi| 1351907 представителя мультисемейства альбуминов сыворотки крови Bos taurus и смеси пептидов с молекулярными массами от 1000 до 10000 Да, а также ионы кальция, липиды, углеводы - остатки маннозы, галактозы, глюкозы, N-ацетилглюкозамина, глюкозамина, N-ацетилгалактозамина, которые образуют инозитол-содержащую гликозидную структуру, обеспечивающую ее связь с плазматической мембраной клетки.
Пример 15. Получение субстанции МГТБ из ткани сердца крыс
Получение тканевого экстракта сердца крысы
Свежевыделенное сердце крысы промывали несколько раз в холодном физ. р-ре до полного удаления крови, нарезали на небольшие фрагменты массой 2-3 г, еще раз промывали физ. р-ром и помещали на 2-3 ч в физ. р-р при 0°С-+4°с. Затем образовавшийся экстракт сливали, центрифугировали при 2500g в течение 30 мин. Полученный экстракт сердца далее фракционировали для получения МГТБ или же замораживали и сохраняли при -90°С.
Получение МГТБ из экстракта ткани сердца крысы
К охлажденному раствору тканевого экстракта сердца постепенно добавляют сернокислый аммоний при постоянном перемешивании до образования насыщенного раствора соли (на 100 мл добавляли 78 г соли). Суспензию белков оставляют на 7 суток при температуре +4°С, после чего центрифугируют при 12000g в течение 30 минут. Собирают фракцию супернатанта и осадка. Фракцию супернатанта диализуют против дистиллированной воды до удаления сульфата аммония в соотношении объемов 1:100 с пятикратной сменой воды. Присутствие в растворе ионов аммония определяют реакцией с реактивом Несслера. Фракцию супернатанта концентрируют в роторном вакуумном испарителе при температуре ниже 40°С. Фракцию супернатанта диализовали против дистиллированной воды до удаления сульфата аммония и разделяют с помощью метода изоэлектрофокусирования (ИЭФ) в градиенте плотности сахарозы на колонке LKB-440 («LKB», Швеция), используя амфолины диапазона рН 3,5 - 10,0 (Serva, Германия) (Остерман, 1983). Для разделения готовят следующие растворы: тяжелый электродный раствор - 60% сахарозы в 1%-ный р-р Н3РО4; легкий электродный раствор - 0,1%-ный NaOH; тяжелый градиентный раствор - 75 г сахарозы, 100 мл супернатанта, доводят до 200 мл дистиллированной водой; легкий градиентный раствор - 15 г сахарозы, до 200 мл дистиллированной воды. В колонку наслаивают растворы в следующем порядке: тяжелый электродный раствор, тяжелый и легкий градиентные растворы, которые подают из градиентного смесителя, и затем легкий электродный раствор. ИЭФ проводят при +4°С в течение 96 часов при напряжении 500-1500 В. Собирают фракции объемом 10 мл. Детекцию белков осуществляют на спектрофотометре при 280 нм, для каждой фракции определяют значение рН с помощью рН-метра. Согласно полученной картине разделения собирают фракцию в интервале значений рН<3,0, которую далее диализуют против дистиллированной воды до удаления сахарозы в соотношении объемов 1:100 с пятикратной сменой воды. Данную фракцию анализируют методом масс-спектрометрии на времяпролетном масс-анализаторе UltraFlex 2 (Bruker Daltonic, Германия) с использованием в качестве матрицы α-циано-4-гидроксикоричной кислоты, обнаруживают ряд пептидов с молекулярными массами в диапазоне 1000 Да - 10000 Да.
Проводили электрофорез в 15%-ном полиакриламидном геле в денатурирующих условиях ИЭФ-фракции, собранной в интервале значений рН<3,0. Из геля вырезали полосу, соответствующую молекулярной массе приблизительно 65000 Да - 67000 Да. Проведенный триптический гидролиз белка в геле с последующим масс-спектрометрическим исследованием продуктов гидролиза показал, что выделенный белок представляет собой белок семейства альбуминов млекопитающих под номером gi|124028612 в базе данных SwissProt.
Таким образом, ИЭФ-фракция представляет собой БПК, состоящий из белка - члена мультисемейства альбуминов сыворотки крови крысы и смеси пептидов с молекулярными массами от 1000 до 10000 Да, а также ионы кальция, липиды, углеводы - остатки маннозы, галактозы, глюкозы, N-ацетилглюкозамина, глюкозамина, N-ацетилгалактозамина, которые образуют инозитол-содержащую гликозидную структуру, обеспечивающую ее связь с плазматической мембраной клетки.
Пример 16. Способ получения субстанции МГТБ из сыворотки крови рогатого скота
Использовали коммерческий препарат сыворотки крови КРС, стерильной, инактивированной применяемый в качестве питательной добавки для культур клеток и тканей.
К охлажденному раствору сыворотки крови постепенно добавляют сернокислый аммоний при постоянном перемешивании до образования насыщенного раствора соли (на 1000 мл сыворотки добавляли 780 г соли) и оставляют на 7 суток при температуре +4°С, после чего центрифугируют при 12000g в течение 30 минут. Собирают фракцию супернатанта и осадка. Фракцию супернатанта диализуют против дистиллированной воды до удаления сульфата аммония в соотношении объемов 1:100 с пятикратной сменой воды. Присутствие в растворе ионов аммония определяют реакцией с реактивом Несслера. Полученные фракции супернатантов концентрируют, используя роторный вакуумиспаритель, при температуре ниже 40°С. Фракцию супернатанта сыворотки крови разделяют с помощью метода изоэлектрофокусирования (ИЭФ) в градиенте плотности сахарозы на колонке LKB-440 («LKB», Швеция), используя амфолины диапазона рН 3,5-10,0 (Serva, Германия) (Остерман, 1983). Для разделения готовят следующие растворы: тяжелый электродный раствор - 60% сахарозы в 1%-ный р-р Н3РО4; легкий электродный раствор - 0,1%-ный NaOH; тяжелый градиентный раствор - 75 г сахарозы, 100 мл супернатанта, доводят до 200 мл дистиллированной водой; легкий градиентный раствор -15 г сахарозы, до 200 мл дистиллированной воды. В колонку наслаивают растворы в следующем порядке: тяжелый электродный раствор, тяжелый и легкий градиентные растворы, которые подают из градиентного смесителя, и затем легкий электродный раствор. ИЭФ проводят при +4°С в течение 96 часов при напряжении 500-1500 В. Собирают фракции объемом 10 мл. Детекцию белков осуществляют на любом спектрофотометре при 280 нм, для каждой фракции определяют значение рН с помощью рН-метра. Согласно полученной картине разделения (фиг. 6) собирают фракцию в интервале значений рН<3,0, которую далее диализуют против дистиллированной воды до удаления сахарозы в соотношении объемов 1:100 с пятикратной сменой воды. Данную фракцию анализируют методом масс-спектрометрии на времяпролетном масс-анализаторе UltraFlex 2 (Bruker Daltonic, Германия) с использованием в качестве матрицы α-циано-4-гидроксикоричной кислоты, обнаруживают ряд пептидов с молекулярными массами в диапазоне 1000 Да -10000 Да, в том числе, пептиды с молекулярными массами 1151, 1338, 1448, 1666, 1812, 1915, 2016 Да. Определение первичной последовательности с помощью С-карбоксипептидазы показывает, что они представляют собой продукты протеолиза, соответственно, для пептида с молекулярной массой 1448 Да - MGLRGGPLASLLLR -отмечена полная гомология с N-концевой последовательностью Р-кадгерина, идентифицированного в эндотелии бычьей аорты. Для пептида с молекулярной массой 1151 Да - (dkhgc)n-5 -PAYVSP - гомология с аминокислотной последовательностью фрагмента киназного домена регуляторного белка tribble-2 (TRB-2), полученного из гранулоцитов (granulosa cells) Bos taurus. Для пептида с молекулярной массой 1338 Да была обнаружена гомология с адреномодулинами - белками, продуцируемыми эндотелием сосудов Bos taurus.
Проводят электрофорез в 15%-ном полиакриламидном геле в денатурирующих условиях ИЭФ-фракции, собранной в интервале значений рН<3,0. Из геля вырезают полосу, соответствующую молекулярной массе приблизительно в 66000 Да. Проведенный триптический гидролиз белка в геле с последующим масс-спектрометрическим исследованием продуктов гидролиза показывает, что выделенный белок с молекулярной массой 66367 Да представляет собой белок семейства альбуминов млекопитающих под номером gi| 1351907 в базе данных SwissProt. Методом Эдмана была установлена частичная N-концевая аминокислотная последовательность данного белка (DTHKSEIAHRFKDLGE), которая имеет 100%-ую гомологию с N-концевой последовательностью зрелой молекулы БСА быка.
Таким образом, ИЭФ-фракция, собранная в интервале значений рН<3,0 содержит белок gi| 1351907 - представитель мультисемейства альбуминов сыворотки крови быка, со значением pI в области рН 3,90-4,00, и смеси небольших пептидов с молекулярной массой 1000-6000 Да,, а также ионы кальция, липиды, углеводы, в частности, остатки маннозы, галактозы, глюкозы, N-ацетилглюкозамина, глюкозамина, N-ацетилгалактозамина, которые образуют инозитол-содержащую гликозидную структуру, обеспечивающую ее связь с плазматической мембраной клетки.
Идентификация трех пептидов, входящих в состав БПК показала, что они представляют собой продукты протеолиза адгезивного белка Р-кадгерина и регуляторного белка tribble-2 (TRB-2), выделенного из гранулоцитов и адреномолулинов.
Пример 17. Способ получения субстанции МГТБ из сыворотки крови крыс Wistar
Сыворотку крови крыс Wistar получают после декапитации животных обоего пола, весом 180-240 г путем взятия крови из сердца животных, отстоя, центрифугирования и холодной стерилизации через фильтры с размером пор 0,45 мкм (Б.И. Антонов, В.А. Борисова, П.М.Волкова и др. // Лабораторные исследования в ветеринарии. Справочник под ред. Б.И.Антонова. - М.: Агропромиздат.1986. 352 с.).
К охлажденному раствору сыворотки крови постепенно добавляют сернокислый аммоний при постоянном перемешивании до образования насыщенного раствора соли (на 100 мл сыворотки добавляли 78 г соли). Суспензию белков оставляют на 7 суток при температуре +4°С, после чего центрифугируют при 12000g в течение 30 минут. Собирают фракцию супернатанта и осадка. Фракцию супернатанта диализуют против дистиллированной воды до удаления сульфата аммония в соотношении объемов 1:100 с пятикратной сменой воды. Присутствие в растворе ионов аммония определяют реакцией с реактивом Несслера. Супернатант концентрируют в роторном вакуумном испарителе при температуре ниже 40°С. Фракцию супернатанта сыворотки крови разделяют с помощью метода изоэлектрофокусирования (ИЭФ) в градиенте плотности сахарозы на колонке LKB-440 («LKB», Швеция), используя амфолины диапазона рН 3,5 - 10,0 (Serva, Германия) (Остерман, 1983). Для разделения готовят следующие растворы: тяжелый электродный раствор - 60% сахарозы в 1%-ный р-р Н3РО4; легкий электродный раствор -0,1%-ный NaOH; тяжелый градиентный раствор - 75 г сахарозы, 100 мл супернатанта, доводят до 200 мл дистиллированной водой; легкий градиентный раствор - 15 г сахарозы, до 200 мл дистиллированной воды. В колонку наслаивают растворы в следующем порядке: тяжелый электродный раствор, тяжелый и легкий градиентные растворы, которые подают из градиентного смесителя, и затем легкий электродный раствор. ИЭФ проводят при +4°С в течение 96 часов при напряжении 500-1500 В. Собирают фракции объемом 10 мл. Детекцию белков осуществляют на спектрофотометре при 280 нм, для каждой фракции определяют значение рН с помощью рН-метра. Согласно полученной картине разделения собирают фракцию в интервале значений рН<3,0, которую далее диализуют против дистиллированной воды до удаления сахарозы в соотношении объемов 1:100 с пятикратной сменой воды. Данную фракцию анализируют методом масс-спектрометрии на времяпролетном масс-анализаторе UltraFlex 2 (Bruker Daltonic, Германия) с использованием в качестве матрицы α-циано-4-гидроксикоричной кислоты, обнаруживают ряд пептидов с молекулярными массами в диапазоне 1000 Да - 10000 Да. Методом изоэлектрофокусирования в градиенте сахарозы обнаруживают белок, представляющий собой сывороточный альбумин со значением pI в области рН 4,60-4,63.
Проводят электрофорез в 15%-ном полиакриламидном геле в денатурирующих условиях ИЭФ-фракции, собранной в интервале значений рН<3,0. Из геля вырезают полосу, соответствующую молекулярной массе приблизительно в 66000 Да. Проведенный триптический гидролиз белка в геле с последующим масс-спектрометрическим исследованием продуктов гидролиза показывает, что выделенный белок является представителем семейства альбуминов млекопитающих под номером белка gi| 124028612.
Таким образом, ИЭФ-фракция представляет собой БПК, состоящий из белка gi| 124028612 - альбумина сыворотки крови крысы со значением pI в области рН 4,60-4,63 и смеси пептидов с молекулярными массами от 1000 до 10000 Да, а также ионы кальция, липиды, углеводы - остатки маннозы, галактозы, глюкозы, N-ацетилглюкозамина, глюкозамина, N-ацетилгалактозамина, которые образуют инозитол-содержащую гликозидную структуру, обеспечивающую ее связь с плазматической мембраной клетки.
Пример 18. Получение субстанции МГТБ из сыворотки крови лошади
Сыворотку крови лошади получают по методике (Антонов Б.П., Борисова B.C., Волкова П.М. и др. // Лабораторные исследования в ветеринарии. Справочник под ред. Б.И.Антонова. - М.: Агропромиздат.1986. 352 с.) от животных обоего пола путем взятия крови из яремной вены животных, отстоя, центрифугирования и холодной стерилизации сыворотки через фильтры.
К охлажденному раствору сыворотки крови постепенно добавляют сернокислый аммоний при постоянном перемешивании до образования насыщенного раствора соли (на 1000 мл сыворотки добавляли 780 г соли). Суспензию белков оставляют на 7 суток при температуре +4°С, после чего центрифугируют при 12000g в течение 30 минут. Собирают фракцию супернатанта и осадка. Фракцию супернатанта диализуют против дистиллированной воды до удаления сульфата аммония в соотношении объемов 1:100 с пятикратной сменой воды. Присутствие в растворе ионов аммония определяют реакцией с реактивом Несслера. Супернатант концентрируют в роторном вакуумном испарителе при температуре ниже 40°С. Фракцию супернатанта сыворотки крови разделяют с помощью метода изоэлектрофокусирования (ИЭФ) в градиенте плотности сахарозы на колонке LKB-440 («LKB», Швеция), используя амфолины диапазона рН 3,5 - 10,0 (Serva, Германия) (Остерман, 1983). Для разделения готовят следующие растворы: тяжелый электродный раствор - 60% сахарозы в 1%-ный р-р Н3РО4; легкий электродный раствор -0,1%-ный NaOH; тяжелый градиентный раствор - 75 г сахарозы, 100 мл супернатанта, доводят до 200 мл дистиллированной водой; легкий градиентный раствор - 15 г сахарозы, до 200 мл дистиллированной воды. В колонку наслаивают растворы в следующем порядке: тяжелый электродный раствор, тяжелый и легкий градиентные растворы, которые подают из градиентного смесителя, и затем легкий электродный раствор. ИЭФ проводят при +4°С в течение 96 часов при напряжении 500-1500 В. Собирают фракции объемом 10 мл. Детекцию белков осуществляют на спектрофотометре при 280 нм, для каждой фракции определяют значение рН. Согласно полученной картине разделения собирают фракцию в интервале значений рН<3,0, которую далее диализуют против дистиллированной воды до удаления сахарозы в соотношении объемов 1:100 с пятикратной сменой воды.
ИЭФ-фракцию анализируют методом масс-спектрометрии на времяпролетном масс-анализаторе UltraFlex 2 (Bruker Daltonic, Германия) с использованием в качестве матрицы α-циано-4-гидроксикоричной кислоты, обнаруживают ряд пептидов с молекулярными массами в диапазоне 1000 Да - 10000 Да. Методами электрофореза в полиакриламидном геле, а также изоэлектрофокусирования в градиенте сахарозы обнаруживают белок, представляющий собой сывороточный альбумин со значением pI в области рН 4,6-4,7 и молекулярной массой в области 66000-67000 Да.
Таким образом, ИЭФ-фракция, собранная в области рН<3,0, представляет собой БПК, состоящий из сывороточного альбумина со значением pI в области рН 4,6-4,7 и смеси пептидов с молекулярными массами от 1000 до 10000 Да, а также ионы кальция, липиды, углеводы (остатки маннозы, галактозы, глюкозы, N-ацетилглюкозамина, глюкозамина, N-ацетилгалактозамина), которые образуют инозитол-содержащую гликозидную структуру, обеспечивающую ее связь с плазматической мембраной клетки.
Пример 19. Способ получения субстанции МГТБ из сыворотки крови собаки
Сыворотку крови собаки получают по методике (Антонов Б.И., Борисова B.C., Волкова П.М. и др. // Лабораторные исследования в ветеринарии. Справочник под ред. Б.И. Антонова. - М.: Агропромиздат. 1986. 352 с.) от животных обоего пола путем взятия крови из яремной вены, отстоя, центрифугирования и холодной стерилизации сыворотки через фильтры
К охлажденному раствору сыворотки крови постепенно добавляют сернокислый аммоний при постоянном перемешивании до образования насыщенного раствора соли (на 100 мл сыворотки добавляли 78 г соли). Суспензию белков оставляют на 7 суток при температуре +4°С, после чего центрифугируют при 12000g в течение 30 минут. Собирают фракцию супернатанта и осадка. Фракцию супернатанта диализуют против дистиллированной воды до удаления сульфата аммония в соотношении объемов 1:100 с пятикратной сменой воды. Присутствие в растворе ионов аммония определяют реакцией с реактивом Несслера. Супернатант концентрируют в роторном вакуумном испарителе при температуре ниже 40°С. Фракцию супернатанта сыворотки крови разделяют с помощью метода изоэлектрофокусирования (ИЭФ) в градиенте плотности сахарозы на колонке LKB-440 («LKB», Швеция), используя амфолины диапазона рН 3,5 - 10,0 (Serva, Германия) (Остерман, 1983). Для разделения готовят следующие растворы: тяжелый электродный раствор - 60% сахарозы в 1%-ный р-р Н3РО4; легкий электродный раствор -0,1%-ный NaOH; тяжелый градиентный раствор - 75 г сахарозы, 100 мл супернатанта, доводят до 200 мл дистиллированной водой; легкий градиентный раствор - 15 г сахарозы, до 200 мл дистиллированной воды. В колонку наслаивают растворы в следующем порядке: тяжелый электродный раствор, тяжелый и легкий градиентные растворы, которые подают из градиентного смесителя, и затем легкий электродный раствор. ИЭФ проводят при +4°С в течение 96 часов при напряжении 500-1500 В. Собирают фракции объемом 10 мл. Детекцию белков осуществляют на спектрофотометре при 280 нм, для каждой фракции определяют значение рН с помощью рН-метра. Согласно полученной картине разделения собирают фракцию в интервале значений рН<3,0, которую далее диализуют против дистиллированной воды до удаления сахарозы в соотношении объемов 1:100 с пятикратной сменой воды. Данную фракцию анализируют методом масс-спектрометрии на времяпролетном масс-анализаторе UltraFlex 2 (Bruker Daltonic, Германия) с использованием в качестве матрицы а-циано-4-гидроксикоричной кислоты, обнаруживают ряд пептидов с молекулярными массами в диапазоне 1000 Да - 10000 Да. Методом изоэлектрофокусирования в градиенте сахарозы в ИЭФ-фракции обнаруживают белок, представляющий собой сывороточный альбумин со значением pI в области рН 4,6-4,7. Методом электрофореза в ПААГ обнаруживают в ИЭФ-фракции белок с молекулярной массой около 67000 Да.
Таким образом, данная фракция представляет собой БПК, состоящий из сывороточного альбумина со значением pI в области рН 4,6-4,7 с молекулярной массой около 67000 Да и нескольких пептидов с молекулярными массами до 10000 Да, а также ионы кальция, липиды, углеводы (в частности,остатки маннозы, галактозы, глюкозы, N-ацетилглюкозамина, глюкозамина, N-ацетилгалактозамина), которые образуют инозитол-содержащую гликозидную структуру, обеспечивающую ее связь с плазматической мембраной клетки.
Пример 20. Способ получения субстанции МГТБ из сыворотки крови рыб
Сыворотку крови получают от рыб вида налим, отряда трескообразных или из карпа из отряда карпообразных (Антонов Б.И., Борисова B.C., Волкова П.М. и др. // Лабораторные исследования в ветеринарии. Справочник под ред. Б.И. Антонова. - М.: Агропромиздат.1986. 352 с.) путем взятия крови после декапитации рыб, отстоя и центрифугирования сыворотки и стерилизации через фильтры.
К охлажденному раствору сыворотки крови постепенно добавляют сернокислый аммоний при постоянном перемешивании до образования насыщенного раствора соли (на 100 мл сыворотки добавляли 78 г соли). Суспензию белков оставляют на 7 суток при температуре +4°С, после чего центрифугируют при 12000g в течение 30 минут. Собирают фракцию супернатанта и осадка. Фракцию супернатанта диализуют против дистиллированной воды до удаления сульфата аммония в соотношении объемов 1:100 с пятикратной сменой воды. Присутствие в растворе ионов аммония определяют реакцией с реактивом Несслера. Супернатант концентрируют в роторном вакуумном испарителе при температуре ниже 40°С. Фракцию супернатанта сыворотки крови разделяют с помощью метода изоэлектрофокусирования (ИЭФ) в градиенте плотности сахарозы на колонке LKB-440 («LKB», Швеция), используя амфолины диапазона рН 3,5 - 10,0 (Serva, Германия) (Остерман, 1983). Для разделения готовят следующие растворы: тяжелый электродный раствор - 60% сахарозы в 1%-ный р-р Н3РО4; легкий электродный раствор -0,1%-ный NaOH; тяжелый градиентный раствор - 75 г сахарозы, 100 мл супернатанта, доводят до 200 мл дистиллированной водой; легкий градиентный раствор - 15 г сахарозы, до 200 мл дистиллированной воды. В колонку наслаивают растворы в следующем порядке: тяжелый электродный раствор, тяжелый и легкий градиентные растворы, которые подают из градиентного смесителя, и затем легкий электродный раствор. ИЭФ проводят при +4°С в течение 96 часов при напряжении 500-1500 В. Собирают фракции объемом 10 мл. Детекцию белков осуществляют на спектрофотометре при 280 нм, для каждой фракции определяют значение рН с помощью рН-метра. Согласно полученной картине разделения собирают фракцию в интервале значений рН<3,0, которую далее диализуют против дистиллированной воды до удаления сахарозы в соотношении объемов 1:100 с пятикратной сменой воды. Данную фракцию анализируют методом масс-спектрометрии на времяпролетном масс-анализаторе UltraFlex 2 (Bruker Daltonic, Германия) с использованием в качестве матрицы α-циано-4-гидроксикоричной кислоты, обнаруживают ряд пептидов с молекулярными массами в диапазоне 1000 Да - 10000 Да. Методом изоэлектрофокусирования в градиенте сахарозы обнаруживают белок, представляющий собой сывороточный альбумин со значением pI в области рН 4,5-4,6, который согласно исследованию методом электрофореза в ПААГ имеет молекулярную массу 65000-66000 Да.
Таким образом, ИЭФ-фракция, собранная в интервале рН>3,0 представляет собой БПК, состоящий из белка - представителя мультисемейства альбуминов сыворотки крови рыб имеет значение pI в области рН 4,5-4,6, с молекулярной массой около 65000-66000 Да и смеси пептидов с молекулярными массами от 1000 до 10000 Да, а также ионы кальция, липиды, углеводы (остатки маннозы, галактозы, глюкозы, N-ацетилглюкозамина, глюкозамина, N-ацетилгалактозамина), которые образуют инозитол-содержащую гликозидную структуру, обеспечивающую ее связь с плазматической мембраной клетки.
Пример 21. Способ получения субстанции МГТБ из сыворотки крови кур
Сыворотку крови кур получают от птиц белых пород, например, Леггорн, самки 7-9 месяцев, по методике (Антонов Б.И., Борисова B.C., Волкова П.М. и др. // Лабораторные исследования в ветеринарии. Справочник под ред. Б.И. Антонова. - М.: Агропромиздат. 1986. 352 с.) путем взятия крови из сердца животных, отстоя и холодной стерилизации сыворотки через фильтры.
К охлажденному раствору сыворотки крови постепенно добавляют сернокислый аммоний при постоянном перемешивании до образования насыщенного раствора соли (на 100 мл сыворотки добавляли 78 г соли). Суспензию белков оставляют на 7 суток при температуре +4°С, после чего центрифугируют при 12000g в течение 30 минут. Собирают фракцию супернатанта и осадка. Фракцию супернатанта диализуют против дистиллированной воды до удаления сульфата аммония в соотношении объемов 1:100 с пятикратной сменой воды. Присутствие в растворе ионов аммония определяют реакцией с реактивом Несслера. Супернатант концентрируют в роторном вакуумном испарителе при температуре ниже 40°С. Фракцию супернатанта сыворотки крови разделяют с помощью метода изоэлектрофокусирования (ИЭФ) в градиенте плотности сахарозы на колонке LKB-440 («LKB», Швеция), используя амфолины диапазона рН 3,5 - 10,0 (Serva, Германия) (Остерман, 1983). Для разделения готовят следующие растворы: тяжелый электродный раствор - 60% сахарозы в 1%-ный р-р Н3РО4; легкий электродный раствор -0,1%-ный NaOH; тяжелый градиентный раствор - 75 г сахарозы, 100 мл супернатанта, доводят до 200 мл дистиллированной водой; легкий градиентный раствор - 15 г сахарозы, до 200 мл дистиллированной воды. В колонку наслаивают растворы в следующем порядке: тяжелый электродный раствор, тяжелый и легкий градиентные растворы, которые подают из градиентного смесителя, и затем легкий электродный раствор. ИЭФ проводят при +4°С в течение 96 часов при напряжении 500-1500 В. Собирают фракции объемом 10 мл. Детекцию белков осуществляют на спектрофотометре при 280 нм, для каждой фракции определяют значение рН с помощью рН-метра. Согласно полученной картине разделения собирают фракцию в интервале значений рН<3,0, которую далее диализуют против дистиллированной воды до удаления сахарозы в соотношении объемов 1:100 с пятикратной сменой воды. Данную фракцию анализируют методом масс-спектрометрии на времяпролетном масс-анализаторе UltraFlex 2 (Bruker Daltonic, Германия) с использованием в качестве матрицы α-циано-4-гидроксикоричной кислоты, обнаруживают ряд пептидов с молекулярными массами в диапазоне 1000 Да - 10000 Да. Методом изоэлектрофокусирования в градиенте сахарозы обнаруживают белок, представляющий собой сывороточный альбумин со значением pI в области рН 4,60-4,75, который согласно исследованию методом электрофореза в ПААГ имеет молекулярную массу приблизительно 66000 Да.
Таким образом, ИЭФ-фракция, собранная в интервале рН>3,0 представляет собой БПК, состоящий из белка - представителя мультисемейства альбуминов сыворотки крови курицы имеет значение pI в области рН 4,60-4,75 с молекулярной массой около 66000 Да и смеси пептидов с молекулярными массами от 1000 до 10000 Да, а также ионы кальция, липиды, углеводы (в частности, остатки маннозы, галактозы, глюкозы, N-ацетилглюкозамина, глюкозамина, N-ацетилгалактозамина), которые образуют инозитол-содержащую гликозидную структуру, обеспечивающую ее связь с плазматической мембраной клетки.
Пример 22. Влияние субстанции МГТБ, выделенной из сыворотки крови быка и тканевого экстракта сердца, соответственно, на вязкоупругие свойства мембран клеток печени при множественном кратковременном органном культивировании in vitro (Фиг. 3).
Биотестирование фракций, получаемых на разных этапах очистки тканевых экстрактов и биологических жидкостей, проводили с помощью адгезиометрического метода, специально разработанного для идентификации субстанции МГТБ. Метод позволяет оценивать вязкоупругие свойства ткани при стандартном деформационном воздействии.
В эксперименте использовали мышей CBA/C57BI, самцы, весом 15-18 г.
После декапитации животного из печени или из легкого вырезали фрагменты весом 1,0-2,5 мг. В каждый пенициллиновый флакон опытной серии вносили 1 мл питательной среды 199 и 0,1 мл исследуемого раствора белка в соответствующей концентрации, помещали по пять фрагментов ткани печени или легкого мыши. Интервал активных концентраций для каждого из изучаемых белковых препаратов определяли, исследуя биологическое действие его растворов, полученных при последовательном разведении в 10, 100, 1000 и более раз. В флаконы контрольной серии вместо раствора исследуемого белка вносили 0,1 мл физ. раствора. Органные культуры опытной и контрольной серий инкубировали в течение 2 ч при 37°С. Далее каждый фрагмент ткани вынимали, осушали в течение 10-15 сек на фильтровальной бумаге, взвешивали и подвергали диспергированию в 0,1 мл 0,1%-ного раствора трипанового синего, приготовленного на 199 среде, в дезинтеграторе ткани с зазором 50 мкм в условиях стандартного деформационного воздействия. Полученную суспензию клеток и клеточных ядер исследовали микроскопически в камере Горяева, проводя подсчет клеточных ядер в определенном объеме камеры (0,02 мм).
Определяли параметр, отражающий влияние МГТБ на вязкоупругие свойства ткани печени или легкого по формуле:
где
Ма и Nк -количество клеточных ядер, выделившихся из 1 мг ткани печени или легкого после диспергирования, соответственно, в опытной и контрольной сериях. Статистическую обработку полученных данных проводили методом вариационной статистики с использованием критерия Стьюдента.
В каждом эксперименте на одну точку (раствор исследуемого препарата в определенной концентрации и контроле) просчитывали не менее 5 фрагментов ткани. Каждый эксперимент повторяли не менее 3-х раз.
Пример 23. Исследование противоаритмической активности субстанции МГТБ, выделенной сыворотки крови и из ткани сердца быка
Исследование проводили на экспериментальных моделях аритмий, вызванных введением аконитина или хлорида кальция, в соответствии с методическими рекомендациями по экспериментальному (фармакологическому) изучению препаратов, предлагаемых для клинических испытаний в качестве средств для профилактики и лечения нарушений ритма сердца.
Исследовали следующие препараты субстанции МГТБ.
1. МГТБ 1 - получена из сыворотки крови КРС;
2. МГТБ 2 - получена из сердца быка.
Опыты проводили на 30 беспородных белых крысах (самцы), весом 200-220 г. ЭКГ регистрировали на электрокардиографа «Неагт Mirror-1» (фирма «Innomed Medical Inc», Будапешт).
Статистическую обработку полученных результатов проводили методами вариационной статистики с применением программного обеспечения Statistica для Windows, версия 6.0. Для отрицания «нулевой» гипотезы использовали критерий Манна-Уитни. Различия между группами считались статистически значимыми при р<0,05.
В исследовании препараты МГТБ давали животным обеих опытных групп в течение 7 дней в виде питьевых растворов, приготовленных на дистиллированной воде, в концентрации, соответствующей 10-10 мг белка /мл; в контрольной группе животным давали дистиллированную воду. За 1 час до начала эксперимента животным не давали пить. Аритмогены вводили в хвостовую вену при легком эфирном наркозе.
В ходе эксперимента определяли следующие параметры:
1. выживаемость животных;
2. абсолютный антиаритмический эффект (ААЭ) ~ полное восстановление синусового ритма после воздействия аритмогена;
3. частичный антиаритмический эффект (ЧАЭ) - подавления частоты эктопических сокращений на 50%;
4. периоды времени возникновения и длительности аритмии.
1. Аконитиновая модель аритмии сердца
Всем животным после взвешивая перед экспериментом внутривенно вводили аконитин из расчета 40 мкг/кг.
При применении данной экспериментальной модели возникает политопная экстрасистолия. На последнем этапе развития она может развиться в желудочковую тахикардию с летальным исходом. На этой модели наблюдается низкая выживаемость экспериментальных животных.
У животных контрольной группы (15 шт) развивались смешанные формы нарушений сердечного ритма предсердно-желудочкового типа длительностью 97±5,3 мин; пало 8 животных (приведены данные одного конкретного эксперимента, всего экспериментов было проведено 3). В опытных группах (в каждой группе по 15 шт. ) все животные были живы, но ААЭ не отмечался ни в одной группе, в то время как ЧАЭ - у всех животных обеих групп. В обеих опытных группах наблюдали достоверное увеличение временного периода возникновения аритмии по сравнению с контрольной группой (1,7±0,06), соответственно, в группе №1 - в 2,3±0,05, в группе №2 - в 3,3±0,05. У животных обеих опытных групп наблюдали более быстрое восстановление сердечного ритма - 40,6±1,4 мин и 23,2±0,7 мин, соответственно, в группе №1 и №2. Важно отметить, что оба препарата МГТБ оказали действие на течение патологического процесса: отмечалось уменьшение числа случаев возникновения тахикардии желудочков и частоты экстрасистол.
2. Хлоридкальциевая модель аритмии
После взвешивания животным внутривенно вводили 10%-ный раствор хлорида кальция из расчета 65 мкг/кг.
При использовании данной экспериментальной модели происходит развитие брадикардии с желудочковыми экстрасистолами, которая может перейти в дальнейшем в желудочковую тахикардию, заканчивающуюся в случае больших доз аритмогена фибриляцией желудочков и летальным исходом. При использовании в качестве аритмогена хлорида кальция наблюдается также разобщенность между электрическими импульсами и механическими сокращениями сердечной мышцы. Это связано со способностью хлорида кальция оказывать прямое действие на мембрану кардиомиоцитов и миокардиальные волокна.
В контрольной группе животных (15 шт) после внутривенного введения раствора хлорида кальция наблюдали тяжелое нарушение сердечного ритма, которое привело к гибели 8 животных, вызванной развитием фибриляции желудочков; у выживших животных наблюдали восстановление синусового ритма через 134,2±3,35 мин часа после введения аритмогена (приведены данные одного конкретного эксперимента, всего экспериментов было проведено 3).
В обеих опытных группах (по 15 шт в каждой) животные были живы. ААЭ не отмечался ни у одного животного, ЧАЭ - у всех животных обеих групп. В обеих опытных группах наблюдали достоверное значительное увеличение временного периода возникновения аритмии по сравнению с контрольной группой (1,4±0,09), соответственно, в группе №1 - в 2,5±0,07, в группе №2 - в 3,4±0,05. У животных опытных групп наблюдали намного более быстрое восстановление сердечного ритма - 45±1,7 мин и 35±1,9 мин, соответственно, в группе №1 и №2.
Выводы
Профилактический прием в течение 7 дней двух препаратов МГТБ, выделенных из сыворотки крови и сердца быка, на экспериментальных моделях аритмии продемонстрировали выраженный противоаритмический эффект, который заключался в отмене гибели животных, в уменьшении продолжительности аритмии, а также тяжести развивающейся кардиопатологии.
Оба препарата субстанции МГТБ, выделенной, соответственно, из сыворотки крови и сердца быка, являются перспективными для разработки на их основе новых противоаритмических средств.
Пример 24. Способ получения МГТБ из ткани молочной железы коровы
Молочные железы половозрелых телок получали на Раменском или Сергиев-Посадском мясокомбинате.
Получение тканевого экстракта молочных желез коров
Свежевыделенные железы коровы промывали несколько раз в холодном физ. р-ре до полного удаления крови, нарезали на небольшие фрагменты массой 1-2 г, еще раз промывали физ. р-ром и помещали на 2-3 ч в физ. р-ре при 0°С -+4°С.
Затем образовавшийся экстракт сливали, центрифугировали при 2500g в течение 10 мин. Полученный тканевой экстракт далее фракционировали для получения БПК или же замораживали и сохраняли при -90°С.
Получение МГТБ из экстракта ткани молочных желез коров
К охлажденному раствору тканевого экстракта постепенно добавляют сернокислый аммоний при постоянном перемешивании до образования насыщенного раствора соли (на 1000 мл экстракта добавляли 780 г соли). Суспензию белков оставляют на 7 суток при температуре +4°С, после чего центрифугируют при 12000g в течение 30 минут. Собирают фракцию супернатанта и осадка. Фракцию супернатанта диализуют против дистиллированной воды до удаления сульфата аммония в соотношении объемов 1:100 с пятикратной сменой воды. Присутствие в растворе ионов аммония определяют реакцией с реактивом Несслера. Фракцию супернатанта концентрируют в роторном вакуумном испарителе при температуре ниже 40°С. Фракцию супернатанта диализуют против дистиллированной воды до удаления сульфата аммония и разделяют с помощью метода изоэлектрофокусирования (ИЭФ) в градиенте плотности сахарозы на колонке LKB-440 («LKB», Швеция), используя амфолины диапазона рН 3,5 - 10,0 (Serva, Германия) (Остерман, 1983). Для разделения готовят следующие растворы: тяжелый электродный раствор - 60% сахарозы в 1%-ный р-р Н3РО4; легкий электродный раствор - 0,1%-ный NaOH; тяжелый градиентный раствор - 75 г сахарозы, 100 мл супернатанта, доводят до 200 мл дистиллированной водой; легкий градиентный раствор - 15 г сахарозы, до 200 мл дистиллированной воды. В колонку наслаивают растворы в следующем порядке: тяжелый электродный раствор, тяжелый и легкий градиентные растворы, которые подают из градиентного смесителя, и затем легкий электродный раствор. ИЭФ проводят при +4°С в течение 96 часов при напряжении 500-1500 В. Собирают фракции объемом 10 мл. Детекцию белков осуществляют на спектрофотометре при 280 нм, для каждой фракции определяют значение рН с помощью рН-метра. Согласно полученной картине разделения (рис. 6) собирают фракцию в интервале значений рН<3,0, которую далее диализуют против дистиллированной воды до удаления сахарозы в соотношении объемов 1:100 с пятикратной сменой воды. Данную фракцию анализируют методом масс-спектрометрии на времяпролетном масс-анализаторе UltraFlex 2 (Bruker Daltonic, Германия) с использованием в качестве матрицы α-циано-4-гидроксикоричной кислоты, обнаруживают ряд пептидов с молекулярными массами в диапазоне 1000 Да - 10000 Да. Проводят электрофорез в 15%-ном полиакриламидном геле в денатурирующих условиях ИЭФ-фракции, собранной в интервале значений рН<3,0. Из геля вырезали полосу, соответствующую молекулярной массе приблизительно 66000 Да. Методом Эдмана была установлена частичная N-концевая аминокислотная последовательность данного белка (DTHKSEIAHRFKDLGE), которая имеет 100%-ную гомологию с N-концевой последовательностью зрелой молекулы БСА Bos taurus.
Таким образом, ИЭФ-фракция представляет собой БПК, состоящий из белка-представителя мультисемейства альбуминов сыворотки крови Bos taurus и смеси пептидов с молекулярными массами от 1000 до 10000 Да, а также ионы кальция,, липиды, углеводы (остатки маннозы, галактозы, глюкозы, N-ацетилглюкозамина, глюкозамина, N-ацетилгалактозамина), которые образуют инозитол-содержащую гликозидную структуру, обеспечивающую ее связь с плазматической мембраной клетки.
Анализ спектров разделения методом изоэлектрофокусирования фракций супернатантов, полученных после высаливания белков, содержащихся в экстрактах различных тканей или биологических жидкостях животных, показал, что они сходны между собой и содержат подфракций МГТБ, различающиеся по заряду: кислых (рН менее 3,00), основных (рН более 8,00), и белково-пептидных комплексов (БПК) со значениями pI в области рН 4,00 - 7,00.
Пример 25. Получение МГТБ из ткани предстательной железы быка
Предстательные железы половозрелых быков получали на Раменском или Сергиевском мясокомбинате.
Получение тканевого экстракта предстательной железы быка.
Свежеполученные железы быка промывали несколько в холодном физ.р-ре до полного удаления крови, нарезали на небольшие фрагменты массой 1-2 г, еще раз промывали физ. р-ром и помещали на 2-3 ч в физ. р-р при 0°С-+4°с. Затем образовавшийся экстракт сливали, центрифугировали при 2500g в течение 30 мин. Полученный экстракт предстательных желез далее фракционировали для получения МГТБ или же замораживали и сохраняли при -90°С. Получение МГТБ из экстракта ткани предстательной железы быка
К охлажденному раствору тканевого экстракта постепенно добавляют сернокислый аммоний при постоянном перемешивании до образования насыщенного раствора соли (на 1000 мл сыворотки добавляли 780 г соли). Суспензию белков оставляют на 7 суток при температуре +4°С, после чего центрифугируют при 12000g в течение 30 минут. Собирают фракцию супернатанта и осадка. Фракцию супернатанта диализуют против дистиллированной воды до удаления сульфата аммония в соотношении объемов 1:100 с пятикратной сменой воды. Присутствие в растворе ионов аммония определяют реакцией с реактивом Несслера. Фракцию супернатанта концентрируют в роторном вакуумном испарителе при температуре ниже 40°С. Фракцию супернатанта диализовали против дистиллированной воды до удаления сульфата аммония и разделяют с помощью метода изоэлектрофокусирования (ИЭФ) в градиенте плотности сахарозы на колонке LKB-440 («LKB», Швеция), используя амфолины диапазона рН 3,5 - 10,0 (Serva, Германия) (Остерман, 1983). Для разделения готовят следующие растворы: тяжелый электродный раствор - 60% сахарозы в 1%-ный р-р Н3РО4; легкий электродный раствор - 0,1%-ный NaOH; тяжелый градиентный раствор - 75 г сахарозы, 100 мл супернатанта, доводят до 200 мл дистиллированной водой; легкий градиентный раствор - 15 г сахарозы, до 200 мл дистиллированной воды. В колонку наслаивают растворы в следующем порядке: тяжелый электродный раствор, тяжелый и легкий градиентные растворы, которые подают из градиентного смесителя, и затем легкий электродный раствор. ИЭФ проводят при +4°С в течение 96 часов при напряжении 500-1500 В. Собирают фракции объемом 10 мл. Детекцию белков осуществляют на спектрофотометре при 280 нм, для каждой фракции определяют значение рН с помощью рН-метра. Согласно полученной картине разделения (рис. 6) собирают фракцию в интервале значений рН<3,0, которую далее диализуют против дистиллированной воды до удаления сахарозы в соотношении объемов 1:100 с пятикратной сменой воды. Данную фракцию анализируют методом масс-спектрометрии на времяпролетном масс-анализаторе UltraFlex 2 (Bruker Daltonic, Германия) с использованием в качестве матрицы α-циано-4-гидроксикоричной кислоты, обнаруживают ряд пептидов с молекулярными массами в диапазоне 1000 Да - 10000 Да.
Проводят электрофорез в 15%-ном полиакриламидном геле в денатурирующих условиях ИЭФ-фракции, собранной в интервале значений рН<3,0.
Из геля вырезают полосу, соответствующую молекулярной массе приблизительно 66000 Да. Проведенный триптический гидролиз белка в геле с последующим масс-спектрометрическим исследованием продуктов гидролиза показал, что выделенный белок с молекулярной массой 66369 Да представляет собой белок семейства альбуминов млекопитающих под номером gi| 1351907 в базе данных SwissProt.
Таким образом, ИЭФ-фракция представляет собой БПК, состоящий из белка gi| 1351907 представителя мультисемейства альбуминов сыворотки крови быка и смеси пептидов с молекулярными массами от 1000 до 10000 Да, а также ионы кальция, липиды, углеводы (остатки маннозы, галактозы, глюкозы, N-ацетилглюкозамина, глюкозамина, N-ацетилгалактозамина), которые образуют инозитол-содержащую гликозидную структуру, обеспечивающую ее связь с плазматической мембраной клетки.
Пример 26. Влияние ИЭФ-фракций, собранных в диапазоне рН менее 3,0, после изоэлектрофокусирования супернатантов тканевых экстрактов предстательной железы быка и молочной железы коровы на вязкоупругие свойства клеток печени при множественном органотипическом культивировании ткани мыши in vitro (диаграммы, фиг. 8).
Исследовали влияние МГТБ, выделенных из супернатантов тканевых экстрактов предстательной железы быка и молочной железы коровы, на вязкоупругие свойства гепатоцитов мыши in vitro, как это описано в примере 10 данного изобретения. На фиг. 8 представлены результаты этого исследования. Показано, что данные МГТБ изменяют вязкоупругие свойства ткани печени мыши in vitro, причем имеет место полимодальная дозовая зависимость биологического действия МГТБ.
Пример 27. Электрофорез в полиакриламидном геле белок-пептидных комплексов, входящих в состав субстанции МГТБ, выделенной из разных тканей и желчи животных
Методом электрофореза Электрофорез в 15%-ном полиакриламидном геле проводили в денатурирующих условиях по методу Лэмли (толщина геля - 0,75 мм, размер 8×10 см). Окрашивание гелей проводили с помощью красителя Кумасси G-250.
Состав 15%-ного разделяющего полиакриламидного геля: мономерный раствор (массовые доли акриламида 30,8%, бис-акриламида 2,7%) - 7,5 мл, Трис - буфер (1,5М Трис- HCl, рН 8,8) - 3,8 мл, 10% -ный раствор додецилсульфата натрия - 0,15 мл, бидистиллированная вода - 3,6 мл, 10%-ный раствор персульфата аммония - 75 мкл, ТЕМЭД (тетраметилэтилендиамин)- 5 мкл. Состав концентрирующего 4%-го полиакриламидного геля: мономерный раствор - 0,44 мл, раствор буфера (0,5 М Трис -HCl, рН 6,8) - 0,83 мл, 10%-ный раствор додецилсульфата натрия - 33 мкл, бидистиллированную воду - 2,03 мл, 10%-ный раствор персульфата аммония - 16,7 мкл, ТЕМЭД - 1,7 мкл. Электродный буфер содержал: 0,025 М Трис, 0,192 М глицин и 0,1% додецилсульфат натрия (рН 8,3).
Для получения электрофоретически чистого белка проводили электрофорез в нативных условиях, без использования при приготовлении гелей и буферов додецилсульфат натрия. В качестве маркеров молекулярных масс использован реактив фирмы Pharmacia (США) (α-лактальбумин - 14,4 кДа, соевый ингибитор трипсина - 20,1 кДа, угольную ангидразу - 30 кДа, овальбумин - 43кДа, бычий сывороточный альбумин -67кД и фосфорилазу b - 94кДа). Использовали также маркеры молекулярных масс LKB (цитохром С лошади - 12,3кДа; миоглобин лошади 17,2 кДа; углерод ангидразу быка -30кДа; овальбумин куриного яйца - 45кДа; альбумин сыворотки крови быка - 66,25 кДа; овотрансферрин куриного яйца - 76-78 кДа).
При окрашивании гелей красителем Кумасси G-250, их сначала помещали на 10-15 мин в фиксирующий раствор (25% изопропанол, 10% уксусная кислота), а затем в раствор Кумасси (10% уксусная кислота, 0,06% Кумасси G-250) до появления окраски. Для снятия фонового окрашивания использовали фиксирующий раствор (5% метанол, 7% уксусная кислота.
Для получения форетически чистой фракции исследуемого образца из геля вырезали окрашенные полосы, элюировали деионизированной водой MilliQ с добавлением азида натрия, затем диализовали против деионизированной воды. Далее полученный раствор белка концентрировали до небольших объемов. Для исследования биологической активности и проведения биологических экспериментов использовали только белковую фракцию, полученную в не денатурирующих (нативных) условиях.
В этом эксперименте было показано, что основным компонентом всех изучаемых ИЭФ-фракций является окрашиваемая Кумасси фракция, характеризующаяся высокой электрофоретической подвижностью (Rf 0.90±0.05) (фиг. 9). Для изучения ее биологической активности был проведен электрофорез в ПААГ в отсутствии додецилсульфата натрия. Далее данную фракцию элюировали из геля и исследовали методом биотестирования. Установлено, что данные низкомолекулярные фракции проявляли мембранотропную активность, характерную для МГТБ.
Пример 28. Исследование липидов, входящих в состав МГТБ
Для определения жирных кислот в составе субстанции МГТБ, выделенной из различных тканей животных, проводили их экстракцию серным эфиром из ИЭФ-фракции, собранной в диапазоне рН менее 3,0. Для этого к охлажденному до 4°С - 8°С водному раствору МГТБ в концентрации, соответствующей 10-3-10-4 мг белка в мл, добавляют равный объем так же охлажденного серного эфира, сосуд плотно закрывают и подвергают воздействию ультразвуковой бани в течение 10-15 мин, стравливают избыток паров серного эфира и повторяют процесс несколько раз. Затем отделяют от водного раствора МГТБ. Фракции серного эфира объединяют, отгоняют эфир, используя вакуумный роторный испаритель, получают маслянистый остаток, который далее исследуют масс-спектрометрическим методом.
Были исследованы субстанции МГТБ, выделенные из сыворотки крови быка, печени быка, легкого быка, желчи быка, молочной железы коровы, предстательной железы быка. На фиг. 10 в качестве примера представлен спектр жирных кислот, полученных из субстанции МГТБ, выделенной из сыворотки крови быка. Было показано присутствие таких жирных кислот как декановая, линолевая, холевая, дезоксихолевая и пальмитиновая. Аналогичные результаты были получены при исследовании состава липидов, выделенных из других тканей.
Данные жирные кислоты являются постоянными компонентами не только сыворотки крови млекопитающих, но и входят в состав практических всех тканей позвоночных животных. Они участвуют в таких важных биологических процессах как генная экспрессия, клеточная миграция, пролиферация, адгезия и дифференцировка [7] (Lapillonne et al., 2004).
Пример 29. Определение вторичной структуры белок-пептидных комплексов, входящих в состав МГТБ, с помощью метода кругового дихроизма
В основе метода кругового дихроизма лежит анализ отклонений плоскости поляризованного света, вызванных различными формами конформации полипептидной цепи. Мерой такого отклонения является угол эллиптичности, определение которого позволяет оценить долю α-спиралей, β-структур и статистического клубка в молекуле изучаемого полипептида. Спектры кругового дихроизма в УФ-области (195-260 нм) снимали на КД-спектрометре Jasco 720 (Япония) при 20°С в кварцевых кюветах с длиной оптического пути 1 мм. Скорость сканирования составила 50 нм/мин, шаг - 1 нм, накопление каждого шага - 2 сек. Концентрация исследуемого белка в водном растворе составляла приблизительно 100 мкг/мл. Итоговый спектр получали по результатам усреднения данных трех сканирований и вычитания спектра базовой линии (контроля). Содержание элементов вторичной структуры оценивали с помощью программы CDNN (http://bioinformatik.biochemtech.uni-halle.de/cdnn) и программы k2d [9] (Venyaminov, Yang, 1996).
Методом кругового дихроизма была охарактеризована вторичная структура БПК кислых МГТБ, выделенных из тканей млекопитающих, а также желчи и молока (табл.).
Было показано, что вторичная структура БПК, входящих в состав МГТБ, описывается, в основном, в терминах β-структур (приблизительно 70%) и статистического клубка (около 30%). Данные этих исследований показывают, что такое состояние вторичной структуры БПК биорегуляторов данной группы является их характерным свойством.
Как показывают данные литературы, вторичная структура белков, проявляющих тенденцию к образованию высокомолекулярных ассоциатов, часто характеризуется высоким содержанием β-структур и неупорядоченных участков полипептидной цепи [8],][13] (Рамис, 2005).
Пример 30. Определение гидродинамического радиуса и формы частиц белково-пептидных комплексов, входящих в состав субстанции МГТБ
Исследование высокомолекулярных ассоциатов, присутствующих в водных растворах МГТБ, было проведено с помощью методов лазерного динамического светорассеяния и атомно-силовой микроскопии. В данной экспериментальной серии были изучены растворы фракций кислых МГТБ, полученных после ИЭФ.
Эксперименты по определению гидродинамического радиуса частиц в растворах фракций выполняли методом динамического рассеивания света на приборе "PhotoCor Complex" (фирма "ФотоКор", Россия), снабженном автоматическим гониометром, мульти-временным коррелятором реального времени "PhotoCor-FC" и гелий-неоновым лазером "Uniphase 1135Р" мощностью 20 мВт (λ=633 нм) в качестве источника света. Измерения проводили при угле рассеяния 90°С и температуре 25°С. Пыль из растворов удаляли путем фильтрования через мембраны "Durapore" с диаметром пор 0,45 мкм ("Millipore"). Определяли гомодинную корреляционную функцию интенсивности G(2)(t) в интервале времен задержки от 2×10-8 до 103 с/ Распределение по временам корреляции получено методом обратного преобразования Лапласа с использованием программы CONTIN, Для перехода от времен корреляции (τ) к гидродинамическому радиусу (Rh) использовали следующие соотношения 
и 
где η - вязкость растворителя, k - константа Больцмана, D - коэффициент диффузии, q- волновой вектор.
Результаты исследования, проведенного методом динамического рассеяния, показали, что в растворах фракций кислых МГТБ присутствуют частицы, средний гидродинамический радиус которых составлял 40-60 нм. Распределение этих частиц во всех фракциях МГТБ было унимодальным. На фиг. 11, 12 представлены кривые распределения по размеру частиц, присутствующих во фракциях МГТБ, выделенных из печени, легкого, тонкого кишечника крысы и желчи быка.
Результаты исследования водных растворов МГТБ, проведенного динамическим лазерным светорассеянием, согласуются с данными, полученными методом атомно-силовой микроскопии (АСМ).
Пример 31. Определение радиуса частиц белок-пептидных комплексов, входящих в состав субстанции МГТБ, методом атомно-силовой микроскопии (АСМ)
Размеры частиц присутствующих в водном растворе МГТБ, определяли с помощью атомно-силовой микроскопии. Радиус частиц, определяли с использованием сканирующего зондового микроскопа ФемтоСкан (Россия). Растворы, содержащие БПК, предварительно обеспыливали с помощью фильтров Durapore" с диаметром пор 0,45 мкм ("Millipore"). 2 мкл исследуемых проб с помощью микропипетки наносили, соответственно, на поверхность свежесколотой слюды и высушивали при температуре 25°С. Для снятия данных использовали однолеверные кантилеверы категории Standart ФемтоСкан (Россия) с жесткостью 0,03 Н/м. Данные обрабатывали при помощи программы обсчета FemtoScan Online (http://www.nanoscopy.net) [14] (Филонов и др., 2005). Сканирование осуществляли контактным методом.
АСМ было показано, что на подложке после удаления растворителя из фракции БПК, входящей в состав МГТБ, обнаруживаются частицы, размером 30-80 нм (фиг. 15).
Результаты, полученные при исследовании отдельных подфракций, входящих в состав субстанции МГТБ, выделенной из печени, легкого, тонкого кишечника, а также желчи, показывают, что в их водных растворах присутствуют наноразмерные частицы. Данные литературы указывают на способность веществ в виде наноразмерных частиц (10-1000 нм) проявлять уникальные физико-химические свойства и биологическое действие [13] (Рамис, 2005). Следует отметить сходство между наноразмерными частицами, присутствующими в водно-белковых системах как in vitro, так и in vivo [13] (Рамис, 2005). Было сформулировано предположение о том, что образование наночастиц в биологических объектах может быть результатом проявления способности материи к самоорганизации в неравновесных системах [8] (Рамис, 2006). В связи с этими данными можно предположить, что биологическая активность субстанции МГТБ обусловлена способностью образовывать устойчивые наночастицы
Пример 32. Изучение резистентности МГТБ к воздействию физико-химических факторов методом кругового дихроизма
Исследуемая субстанция МГТБ проявляет очень высокую резистентность к воздействию таких экстремальных физико-химических факторов как нагревание ее раствора до 100°С, а также действию гуанидинхлорида, применяемого в качестве дезагрегирующего агента, и Са+2-хелатирующего агента - ЭДТА. В качестве примера на фиг. 13-15 представлены значения эллиптичности, отражающей состояние вторичной структуры БПК, входящего в состав субстанции МГТБ, выделенной из сыворотки крови быка, при воздействии физико-химических факторов. Полученные данные свидетельствуют об отсутствии изменений во вторичной структуре БПК при повышении температуры раствора до 100°С и воздействии гуанидинхлорида по сравнению с исходным раствором МГТБ.
Воздействие ЭДТА приводит к изменению эллиптичности растворов БПК (всех подфракций), выделенных из сыворотки крови быка, причем с увеличением концентрации ЭДТА значение эллиптичности имело тенденцию к уменьшению. Эти данные указывают на участие ионов Са+2 в организации вторичной структуры БПК, входящих в состав МГТБ.
Пример 33. Исследование субстанции МГТБ методом ЯМР-спектроскопии
Исследовали кислых фракции субстанции МГТБ, выделенные изоэлектрофокусированием из супернатантов экстракта различных тканей, в том числе сыворотки крови, предстательной железы быка, молочной железы коровы. Исследование проводили на ЯМР-спектрометре Avance 600 
произведенный в Германии. Измерение спин-решеточных времен релаксации осуществляли в ампулах с диаметром равным 5 мм. Внешним стандартом являлся раствор дейтерированного ацетона, который в ампуле погружали в капилляр и центрировали специальными тефлоновыми вставками. Использовали стандартную программу восстановления. Точность измерения времени релаксации равна ±5%.
Во всех изученных методом ЯМР субстанциях МГТБ были обнаружены сходные спектры, что указывает на практически одинаковый состав субстанции МГТБ, выделенной из различных источников.
В качестве примера на фиг. 16 приведен спектр 1Н ЯМР субстанции МГТБ, выделенной из предстательной железы быка (А), на фиг. 16 (Б) - субстанции МГТБ, выделенной из молочной железы коровы, на фиг. 16 (В) - спектр инозитола. Спектр 1Н ЯМР был зарегистрирован в диапазоне 25÷-8 м.д. Широкий неразрешенный сигнал в области 1÷2.5 м.д. относится, по всей видимости, к протонам части белка, находящегося в ассоциированных микрочастицах, связанных между собой посредством взаимодействия через молекулы воды водородными связями, что подтверждается их разрушением и исчезновением этой линии при дополнительном воздействии (накачкой) на сигнал воды или небольшом нагреве (до 40°С). В области нахождения ароматических протонов можно выделить сигналы протонов фенилаланина (δ=8,7; 8,5; 8,0 м.д.) и гистидина (δ=7,67; 7,36 м.д.), сдвинутые в более слабое поле, чем обычно, вследствие кислого раствора (рН<3,0). В этой же области находятся сигналы протонов NN3+-групп (δ=7,16; 7,07; 7,00 м.д.). В области высокого поля (0,4÷1,5 м.д.) находятся сигналы липидов (очень низкой плотности δ=1,3÷1,18 м.д.; низкой плотности δ=1,10÷1,04 м.д.; широкий сигнал высокой плотности с δ=0,75 м.д.). Дублет с δ=1,28 м.д. относится к протонам лактата. Сигналы протонов, находящиеся в области 2÷4 м.д., можно отнести к протонам углеводных компонент: NAc - глюкозамина (δ=2,13 м.д.), глюкозы (δ=3,30 и 3,38 м.д.), холина (δ=3,28÷3,30 м.д.) и др. Синглет при 2,6 м.д. появляется, возможно, вследствие какой-либо примеси с ацетильной группой. Таким образом, по данным ЯМР 1H можно сделать вывод, что в состав исследуемых фракции МГТБ входят липидные и углеводные, а также белковые компоненты. Отличительной особенностью спектра белков данной фракции является большое число хорошо разрешенных линий, как в области проявления ароматических протонов, так и в области выше 5 м.д., что указывает на возможность присутствия достаточно коротких пептидных цепей. Эти данные вполне согласуются и свидетельствуют в пользу предположения о составе и структуре МГТБ.
Пример 34. Получение субстанции МГТБ из ткани поджелудочной и щитовидной железы быка
Получение тканевого экстракта поджелудочной железы быка
Полученные железы быка- поджелудочную или щитовидную, промывают несколько раз в холодном физ. р-ре до полного удаления крови, нарезают на небольшие фрагменты массой 2-4 г, еще раз промывают несколько раз физ. р-ром и помещают на 2-3 ч в физ. р-р при 0°С-+4°с. Затем образовавшийся экстракт сливают, центрифугируют при 2500g в течение 30 мин. Полученный экстракт желез далее фракционируют для получения МГТБ или же замораживают и сохраняют при -90°С.
Получение МГТБ из экстракта ткани поджелудочной железы быка
К охлажденному раствору тканевого экстракта постепенно добавляют сернокислый аммоний при постоянном перемешивании до образования насыщенного раствора соли (на 1000 мл сыворотки добавляли 780 г соли). Суспензию белков оставляют на 7 суток при температуре +4°С, после чего центрифугируют при 12000g в течение 30 минут. Собирают фракцию супернатанта и осадка. Фракцию супернатанта диализуют против дистиллированной воды до удаления сульфата аммония в соотношении объемов 1:100 с пятикратной сменой воды. Присутствие в растворе ионов аммония определяют реакцией с реактивом Несслера. Фракцию супернатанта концентрируют в роторном вакуумном испарителе при температуре ниже 40°С. Фракцию супернатанта диализуют против дистиллированной воды до удаления сульфата аммония и разделяют с помощью метода изоэлектрофокусирования (ИЭФ) в градиенте плотности сахарозы на колонке LKB-440 («LKB», Швеция), используя амфолины диапазона рН 3,5 - 10,0 (Serva, Германия) (Остерман, 1983). Для разделения готовят следующие растворы: тяжелый электродный раствор - 60% сахарозы в 1%-ный р-р Н3РО4; легкий электродный раствор - 0,1%-ный NaOH; тяжелый градиентный раствор - 75 г сахарозы, 100 мл супернатанта, доводят до 200 мл дистиллированной водой; легкий градиентный раствор - 15 г сахарозы, до 200 мл дистиллированной воды. В колонку наслаивают растворы в следующем порядке: тяжелый электродный раствор, тяжелый и легкий градиентные растворы, которые подают из градиентного смесителя, и затем легкий электродный раствор. ИЭФ проводят при +4°С в течение 96 часов при напряжении 500-1500 В. Собирают фракции объемом 10 мл. Детекцию белков осуществляют на спектрофотометре при 280 нм, для каждой фракции определяют значение рН с помощью рН-метра. Согласно полученной картине разделения (фиг. 20) собирают фракцию в интервале значений рН<3,0, которую далее диализуют против дистиллированной воды до удаления сахарозы в соотношении объемов 1:100 с пятикратной сменой воды. Данную фракцию анализируют методом масс-спектрометрии на времяпролетном масс-анализаторе UltraFlex 2 (Bruker Daltonic, Германия) с использованием в качестве матрицы α-циано-4-гидроксикоричной кислоты, обнаруживают ряд пептидов с молекулярными массами в диапазоне 1 000 Да - 10000 Да. Проводят электрофорез в 15%-ном полиакриламидном геле в денатурирующих условиях ИЭФ-фракции, собранной в интервале значений рН<3,0. Из геля вырезают полосу, соответствующую молекулярной массе приблизительно 66000 Да. Проведенный триптический гидролиз белка в геле с последующим масс-спектрометрическим исследованием продуктов гидролиза показал, что выделенный белок является представителем мультисемейства альбумина быка. Методом Эдмана была установлена частичная N-концевая аминокислотная последовательность данного белка (DTHKSEIAHRFKDLGE), которая имеет 100%-ную гомологию с N-концевой последовательностью зрелой молекулы сывороточного альбумина Bos taurus. Таким образом, ИЭФ-фракция, собранная в интервале значений рН<3,0 содержала альбумин сыворотки крови быка и смесь небольших пептидов с молекулярными массами от 1000 до 10000 Да, а также ионы кальция, липиды, углеводы (остатки маннозы, галактозы, глюкозы, N-ацетилглюкозамина, глюкозамина, N-ацетилгалактозамина), которые образуют инозитол-содержащую гликозидную структуру, обеспечивающую ее связь с плазматической мембраной клетки.
Пример 34. Получение субстанции МГТБ из ткани поджелудочной и щитовидной железы быка
Получение тканевого экстракта поджелудочной железы быка Полученные железы быка- поджелудочную или щитовидную, промывают несколько раз в холодном физ. р-ре до полного удаления крови, нарезают на небольшие фрагменты массой 2-4 г, еще раз промывают несколько раз физ. р-ром и помещают на 2-3 ч в физ. р-р при 0°С-+4°с. Затем образовавшийся экстракт сливают, центрифугируют при 2500g в течение 30 мин. Полученный тканевой экстракт железы далее фракционируют для получения МГТБ или же замораживают и сохраняют при -90°С.
Получение МГТБ из экстракта ткани поджелудочной или щитовидной железы быка К охлажденному раствору тканевого экстракта постепенно добавляют сернокислый аммоний при постоянном перемешивании до образования насыщенного раствора соли (на 1000 мл сыворотки добавляли 780 г соли). Суспензию белков оставляют на 7 суток при температуре +4°С, после чего центрифугируют при 12000g в течение 30 минут. Собирают фракцию супернатанта и осадка. Фракцию супернатанта диализуют против дистиллированной воды до удаления сульфата аммония в соотношении объемов 1:100 с пятикратной сменой воды. Присутствие в растворе ионов аммония определяют реакцией с реактивом Несслера. Фракцию супернатанта концентрируют в роторном вакуумном испарителе при температуре ниже 40°С. Фракцию супернатанта диализуют против дистиллированной воды до удаления сульфата аммония и разделяют с помощью метода изоэлектрофокусирования (ИЭФ) в градиенте плотности сахарозы на колонке LKB-440 («LKB», Швеция), используя амфолины диапазона рН 3,5 - 10,0 (Serva, Германия) (Остерман, 1983). Для разделения готовят следующие растворы: тяжелый электродный раствор - 60% сахарозы в 1%-ный р-р Н3РО4; легкий электродный раствор - 0,1%-ный NaOH; тяжелый градиентный раствор - 75 г сахарозы, 100 мл супернатанта, доводят до 200 мл дистиллированной водой; легкий градиентный раствор - 15 г сахарозы, до 200 мл дистиллированной воды. В колонку наслаивают растворы в следующем порядке: тяжелый электродный раствор, тяжелый и легкий градиентные растворы, которые подают из градиентного смесителя, и затем легкий электродный раствор. ИЭФ проводят при +4°С в течение 96 часов при напряжении 500-1500 В. Собирают фракции объемом 10 мл. Детекцию белков осуществляют на спектрофотометре при 280 нм, для каждой фракции определяют значение рН с помощью рН-метра. Согласно полученной картине разделения (фиг. 20) собирают фракцию в интервале значений рН<3,0, которую далее диализуют против дистиллированной воды до удаления сахарозы в соотношении объемов 1:100 с пятикратной сменой воды. Данную фракцию анализируют методом масс-спектрометрии на времяпролетном масс-анализаторе UltraFlex 2 (Bruker Daltonic, Германия) с использованием в качестве матрицы α-циано-4-гидроксикоричной кислоты, обнаруживают ряд пептидов с молекулярными массами в диапазоне 1000 Да - 10000 Да. Проводят электрофорез в 15%-ном полиакриламидном геле в денатурирующих условиях ИЭФ-фракции, собранной в интервале значений рН<3,0. Из геля вырезают полосу, соответствующую молекулярной массе приблизительно 66000 Да. Проведенный триптический гидролиз белка в геле с последующим масс-спектрометрическим исследованием продуктов гидролиза показал, что выделенный белок является представителем мультисемейства альбумина быка. Методом Эдмана была установлена частичная N-концевая аминокислотная последовательность данного белка (DTHKSEIAHRFKDLGE), которая имеет 100%-ную гомологию с N-концевой последовательностью зрелой молекулы сывороточного альбумина Bos taurus.
Таким образом, ИЭФ-фракция, собранная в интервале значений рН<3,0 содержала альбумин сыворотки крови быка и смесь небольших пептидов с молекулярными массами от 1000 до 10000 Да, а также ионы кальция, липиды, углеводы (остатки маннозы, галактозы, глюкозы, N-ацетилглюкозамина, глюкозамина, N-ацетилгалактозамина), которые образуют инозитол-содержащую гликозидную структуру, обеспечивающую ее связь с плазматической мембраной клетки.
Пример 35. Влияние субстанции МГТБ, выделенной из ткани поджелудочной или щитовидной железы быка, на вязкоупругие свойства плазматической мембраны клеток млекопитающих in vitro. (фиг. 18)
Биотестирование фракций, получаемых на разных этапах очистки тканевых экстрактов и биологических жидкостей, проводили с помощью адгезиометрического метода, специально разработанного для идентификации субстанции МГТБ. Метод позволяет оценивать вязкоупругие свойства ткани при стандартном деформационном воздействии.
В эксперименте использовали мышей CBA/C57BI, самцы, весом 15-18 г. После декапитации животного из печени или из легкого вырезали фрагменты весом 1,0-2,5 мг. В каждый пенициллиновый флакон опытной серии вносили 1 мл питательной среды 199 и 0,1 мл исследуемого раствора белка в соответствующей концентрации, помещали по пять фрагментов ткани печени или легкого мыши. Интервал активных концентраций для каждого из изучаемых белковых препаратов определяли, исследуя биологическое действие его растворов, полученных при последовательном разведении в 10, 100, 1000 и более раз. В флаконы контрольной серии вместо раствора исследуемого белка вносили 0,1 мл физ. раствора. Органные культуры опытной и контрольной серий инкубировали в течение 2 ч при 37°С. Далее каждый фрагмент ткани вынимали, осушали в течение 10-15 сек на фильтровальной бумаге, взвешивали и подвергали диспергированию в 0,1 мл 0,1%-ного раствора трипанового синего, приготовленного на 199 среде, в дезинтеграторе ткани с зазором 50 мкм в условиях стандартного деформационного воздействия. Полученную суспензию клеток и клеточных ядер исследовали микроскопически в камере Горяева, проводя подсчет клеточных ядер в определенном объеме камеры (0,02 мм).
Определяли параметр, отражающий влияние МГТБ на вязкоупругие свойства ткани печени или легкого по формуле:
где
Ма и Nк -количество клеточных ядер, выделившихся из 1 мг ткани печени или легкого после диспергирования, соответственно, в опытной и контрольной сериях. Статистическую обработку полученных данных проводили методом вариационной статистики с использованием критерия Стьюдента.
В каждом эксперименте на одну точку (раствор исследуемого препарата в определенной концентрации и контроле) просчитывали не менее 5 фрагментов ткани. Каждый эксперимент повторяли не менее 3-х раз.
Пример 36. Влияние субстанции МГТБ, выделенной из поджелудочной железы быка, на развитие экспериментального диабета 2-го типа у крыс in vitro
Эксперимент проводили на крысах Wistar, самцы, 250 г. Экспериментальный диабет второго типа вызывали внутрибрюшинным введением стриптозотоцина (Химмед, РФ) (СПТ), приготовленном на стерильном физ. растворе в дозе 60 мг/кг Были образованы 4 группы (по 15 штук):
1 группа -контрольная (интактные крысы)
2 группа-контрольная (которым вводили физ. раствор)
3 группа контрольная (СПТ+физ. раствор)
4 опытная (СПТ+фракция МГТБ рН<3.0)
В качестве протекторного вещества исследовали фракцию МГТБ, выделенную из поджелудочной железы быка, с рН<3.0, которую подавали животным в виде питьевого раствора в поилки ежедневно в концентрацией, соответствующей, 10-10 мг/мл. Эксперимент проводили в течение 2 недель. Содержание глюкозы и инсулина определяли с помощью стандартного глюкометра.
После введения СПТ одно животное погибло. Все остальные крысы, получившие СПТ и СПТ+МГТБ из поджелудочной железы, в течение эксперимента остались живы. Крысы 4 опытной группы выглядили более активно на третий день эксперимента: они принимали корм и активно пили, стул был нормальный. Результаты исследования содержания в крови глюкозы и инсулина (хвостовая вена) на 14 день после введения СПТ приведены в табл 7. У крыс 4 группы результаты разделились на две подгруппы: в одной из них (9 шт) параметры содержания глюкозы и инсулина статистически не отличались от 1 контрольной группы (интактные животные). Эти результаты указывают на выраженное не только протекторное, но и лечебное действие МГТБ, выделенной из поджелудочной железы быка, в отношении модельной патологии диабета 2 типа у млекопитающих. Остальные 6 животных этой группы имели показатели выше, чем у интактных животных, однако, они были приблизительно в два раза ниже результатов у животных контрольной группы, принимавших СПТ. Полученные результаты указывают на протекторное действие субстанции МГТБ, выделенной из поджелудочной железы быка, принимаемой перорально в виде питьевого раствора в концентрацией белка 10-10 мг/мл, в отношении развития индуцированного диабета у крыс in vivo. Полученные данные позволяют рассматривать МГТБ, как потенциальную субстанцию для разработки фармакологического препарата для предупреждения и лечения диабета второго типа на начальных этапах развития.
Пример 37. Исследование действия субстанции МГТБ, выделенной из экстракта щитовидной железы быка, на состояние щитовидной железы у крыс на экспериментальной модели гипотиреоза in vivo
Мерказолил - антитиреоидный препарат, механизм действия которого заключается в блокировании фермента пероксидазы, который отвечает в щитовидной железе за активацию молекулы йода в виде свободных радикалов, которые осуществляют иодирования тироглобулина, что, в свою очередь, приводит к уменьшение концентрации тиреоидных гормонов в крови.
Исследование проведено на 45 крысах Wistar обоего пола, 200-220 г.
Контрольная группа (К1) - интактные животные (15 шт) принимали дистиллированную воду в свободной доступе и корм.
У 30 крыс вызывали экспериментальный гипотиреоз путем ежедневного введения мерказолила в дозе 10 мг/кг в течение 28 дней внутрибрюшинно.
После этого у всех 30 крыс брали кровь для исследования из хвостовой вены и определяли уровень тиреотропного гормона (ТТГ), тироксина (Т4) и трийодтиронина (Т3).
Далее 30 крыс разделяли на две группы:
Контрольная группа (К2) - животные принимали дистиллированную воду в свободной доступе и корм.
Опытная группа (ОП1) - животные этой группы принимали раствор субстанции МГТБ, выделенной из экстракта щитовидной железы быка, в концентрации, соответствующей 10-10, приготовленной на дистиллированной воде, при свободном доступе и корм.
Через 21 день всех животных выводили из эксперимента. Кровь у животных забирали из бифуркации аорты и определяли в ней уровень ТТГ, Т3 и Т4 радиоиммунным методом. Статистическую обработку полученных данных осуществляли с помощью критерия Стьюдента. Результаты исследований
У животных с экспериментальным гипотериозом (группа К2) было выявлено значительное изменение уровня тиреоидных гормонов по сравнению с данными контрольной группы К1 (интактные животные): уровень ТТГ увеличился в 4,6±2 раз, Т3 снизился на 11±6%, а уровень Т4 снизился на 32±4%,. Полученные результаты показали, что путем введения мерказолила по указанной методике, у крыс группы К2 и группы ОП1 была получена адекватная модель экспериментального гипотиреоза.
Исследование уровня гормонов щитовидной железы у животных группы ОП1 на 21 сутки эксперимента показало, что уровень ТТГ снизился на 53±3%, уровень ТЗ увеличился на 43±5%, а уровень Т4 - увеличился в 2,8 раз по сравнению с показателями контрольной группы К2. Полученные данные показывают, что субстанция МГТБ, выделенная из щитовидной железы быка, вызывала восстановление функции железы на модели экспериментального гипотериоза у крыс in vivo.
Выводы
Полученные данные показывают, что субстанция МГТБ, выделенная из ткани щитовидной железы быка, в виде питьевого раствора способствует восстановлению функции щитовидной железы на модели экспериментального гипотериоза у крыс in vivo и может быть использована для разработки новых лекарственных средств для лечения патологий щитовидной железы.
Пример 38. Исследование противовирусной активности субстанции МГТБ
Исследование проведено совместно с Институтом вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН.
В работе использовали высокопатогенный штамм вируса гриппа птиц A (H5N1). Вируссодержащий материал представлял собой культуральную жидкость, собранную из зараженных вирусом H5N1 культур эмбриональных клеток эпителия почки свиньи (СПЭВ) на высоте развития цитопатических проявлений. Использовали инфекционные дозы вируссодержащего материала, равные 100 ТЦД50/0,2 мл.
Клеточные культуры. Исследование противовирусной активности препаратов субстанций МГТБ проводили в культурах клеток СПЭВ, выращенных в виде однодневного монослоя в 48-луночных панелях на питательной среде 199 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и антибиотиков.
Препараты. Исследовали действие субстанций МГТБ, представляющих собой фракции соответствующих тканевых экстрактов, собранных после ИЭФ в интервале рН менее 3,0:
- МГТБ №1 - субстанция МГТБ, выделенная из экстракта тимуса крыс;
- МГТБ №2 - субстанция МГТБ, выделенная из сыворотки крови быка;
- МГТБ №3 - субстанция МГТБ, выделенная из экстракта тонкого кишечника крыс;
-№К4 - «композиция» данных субстанций МГТБ, полученная смешиванием растворов МГТБ №№1-3 в одном объеме (1:1:1 по объему).
Все препараты МГТБ изучали в конечной концентрации 10-12 мг белка/мл.
В зависимости от времени добавления исследуемых препаратов МГТБ №1-К4 в питательную среду клеточных культур СПЭВ, были образованы следующие опытные серии:
1-ая серия - препараты МГТБ №№1-К4 добавляли за 1 час до заражения клеток;
2-ая серия - препараты МГТБ №№1-К4 добавляли одновременно с заражением вирусом;
3-ья серия - препараты МГТБ №№1-К4 добавляли через 1 час после заражения вирусом;
4-ая серия - контрольная серия, в которой клетки были заражены вирусом H5N1;
5-ая серия - контрольная серия, интактные культуры.
Результаты исследования учитывали по влиянию препаратов на жизнеспособность инфицированных вирусом H5N1 клеток СПЭВ в сравнении с контрольной серией, в которой использовали зараженные вирусом птичьего гриппа А клеточные культуры СПЭВ.
Как видно из результатов, приведенных в табл.8, максимальная противовирусная активность препаратов МГТБ №№1-К4 была зарегистрирована при обработке клеточной культуры за 1 час до заражения вирусом, т.е. наиболее выраженным было профилактическое действие препаратов МГТБ. Следует отметить, что в этих условиях эксперимента при добавлении в культуральную среду препаратов МГТБ №1 и №3 в течение 48 часов после заражения вирусом выживало 100% клеток. Обработка препаратом №К4 приводила к сохранению жизнеспособными 90% клеток, но только 25% клеток выживало в случае обработки клеток МГТБ №2.
Внесение в культуральную среду МГТБ №3 и №К4 через 1 час после заражения клеточных культур вирусом приводили, соответственно, к 100% защите клеток в течение 48 часов после заражения вирусом в обоих случаях.
Выводы
Изучение противовирусной активности 4-х препаратов МГТБ на развитие инфекции, вызванной высокопатогенным вариантом вируса гриппа птиц A/H5N1, позволило выявить высокую лечебно-профилактическую активность субстанции МГТБ, выделенной из тонкого кишечника, и препарата, представляющего собой «композицию» изучаемых субстанций МГТБ. В данном исследовании было показано, что субстанция МГТБ, выделенная из тонкого кишечника крыс, при внесении в культуральную среду во всех трех вариантах постановки эксперимента в течение 48 час способствовала 100%-ной жизнеспособности клеток-мишеней в условиях культивирования. Важно, что профилактическую активность в течение 24 часов проявили все изучаемые субстанции МГТБ. Результаты данного исследования указывают на тканеспецифический характер противовирусного действия МГТБ: наиболее активными в отношении вируса «птичьего» гриппа H5N1, поражающего эпителиальные клетки кишечника, оказались субстанция МГТБ, выделенная из тонкого кишечника, и «композиция» субстанций МГТБ, в которой она присутствовала.
Показано, что вторичная структура БПК, входящих в состав МГТБ, описывается, в основном, в терминах β-структур (приблизительно 70%) и статистического клубка (около 30%). Такое состояние вторичной структуры БПК биорегуляторов данной группы является их характерным свойством.
Литература
1. Ямскова В.П., Нечаева Н.В., Туманова Н.Б., Юровицкий Ю.Г., Новикова Т.Е., Фатеева В.И., Гвазава И.Г. Исследование влияния макромолекулярных адгезионных факторов, выделенных из сыворотки крови и печени млекопитающих на интенсивность синтеза белка и содержание АТФ в гепатоцитах in vitro II Известия Акад. наук, серия биол. 1994. N.2. с. 190-196.
2. Ямскова В.П., Краснов М.С., Маргасюк Д.В., Ямсков И.А. Влияние адгезии на состояние ткани роговицы при культивировании in vitro // Изв. АН Сер. Биол. 2009. №1. с. 11-17.
3. Ямскова В.П., Краснов М.С., Скрипникова B.C., Ямсков И.А. Экспериментальные модели культивирования тканей глаза тритона Pleurodeles waltl для исследования специфического действия активного в сверхмалых дозах биорегулятора склеры // БЭБМ. 2010. №4. С.393-395.
4. Константиновский А.А., Краснов М.С., Ямскова В.П., Рыбакова Е.Ю., Ямсков И.А. Исследование ранозаживляющего действия биорегуляторов, выделенных из тканей глаза и сыворотки крови быка, на модели экспериментальной травмы роговицы у кроликов in vzW/БЭБМ. 2012. №2. С.177-182.
5. Peters Т. Jr. 1996. All About Albumin: Biochemistry, genetics and medical applications // Academic Press. San Diego. CA. 432 P.
6. Ferguson M.A. The structure, biosynthesis, and functions of glycosylphosphatidylinositol anchors and the contributions of trypanosome research // J. Cell Sci. 1999. V. 112. P. 2799-2809.
7. Lapillonne A, Clarke SD, Heird WC. Polyunsaturated fatty acids and gene expression // Curr OpIn Clin Nutr Metab Care. 2004 Mar; 7(2):151-6.
8. Рамис Е. Неравновесное состояние наноструктур белка при его самоорганизации // Ж. техн. физики. 2006. Т.76. С.121-127.
9. Venyaminov S. Yu, Yang J.T. "Determination of protein secondary structure" In "Circular Dichroism and the conformational analysis of Biomolecules" // Edited by G.D.Fasman. 1996. New York. Plenum Press. P. 69-107.
10. Антонов Б.И., Борисова B.C., Волкова П.М. и др. //Лабораторные исследования в ветеринарии. Справочник под ред. Б.И.Антонова. - М.: Агропромиздат.1986. 352 С.
11. Rivier A.S, Castillon G.A, Michon L, Fukasawa M, Romanova-Michaelides M, Jaensch N, Hanada K, Watanabe R. Exit of GPI-anchored proteins from the ER differs in yeast and mammalian cells // Traffic. 2010. Aug; 11 (8): 1017-33. doi: 10.1111 /j. 1600-0854.2010.01081.x. Epub 2010 May 11.
12. Sichel G., Scalia M., Corsaro C. Amphibia Kupffer cells // Microsc. Res. Tech. 2002. V.57. P.477-490.
13. Рамис E. К проблеме нуклеации (образования клеток) при самоорганизации наноструктур белка in vitro и in vivo // Ж. техн. физики. 2005. Т.75. С.107-113.
7. Филонов А.С., Гаврилко Д.Ю., Яминский И.В. Программное обеспечение для обработки трехмерных изображений «ФемтоСкан Онлайн». // М.: Центр перспективных технологий, 2005. С.89. (http://www.nanoscopy.net).
14. Гланц, С. Медико-биологическая статистика. - М.: Бином, 1999. - 459 С.
15. Самылина И.А. и др. // Фармация. - 1988. - №6. - С.33-36. Международные рекомендации по проведению медико-биологических исследований с использованием животных // Хроника ВОЗ. - 1985. - №39(3). - С.3 - 96.
16. Недоступ, А.В. Вопросы стратегии терапии аритмий сердца // Русский медицинский журнал. - 2008. - Т. 16, №6. - С.431-435.
17. И.А. Ямсков, И.В. Благодатских, М.С. Краснов, А.В. Борисенко, Д.В. Маргасюк, В.В. Вечеркин, B.C. Скрипникова, П.А. Назарова, С.А. Битко, Б.Б. Березин, И.В. Яминский, Г.Б. Мешков, С.А. Грачев, М.В. Серебрякова, Е.Ю. Рыбакова, В.П. Ямскова. Физико-химические свойства биологически активных в микродозах регуляторных белков, выделенных из различных тканей млекопитающих // Изв.АН Сер. Хим. 2009. №3. С.623-628.
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| Набор фармакологического средства, предназначенного для улучшения кровотока в коре головного мозга и восстановления двигательных и когнитивных функций организма | 2021 |
|
RU2787479C1 |
| Белково-пептидный комплекс, обладающий протекторным действием на состояние тканей заднего отдела глаза - склеральную оболочку, сетчатку, пигментный эпителий, хороид | 2018 |
|
RU2701566C1 |
| Субстанция для получения средства, повышающего жизнеспособность и подвижность сперматозоидов млекопитающих | 2018 |
|
RU2725491C2 |
| БЕЛКОВО-ПЕПТИДНЫЙ КОМПЛЕКС И СРЕДСТВО ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ЛЕКАРСТВЕННОГО ПРЕПАРАТА, ПРЕДСТАВЛЯЮЩЕЕ СОБОЙ БЕЛКОВО-ПЕПТИДНЫЙ КОМПЛЕКС | 2018 |
|
RU2716819C1 |
| Биологически активная субстанция и фармацевтическая композиция в виде стерильной водной дисперсии для конъюнктивального в виде капель и субъюнктивального, пара-, ретробульбарного инъекционного введения при проведении терапии сосудистых и дисметаболических офтальмологических заболеваний | 2021 |
|
RU2771678C1 |
| РАНОЗАЖИВЛЯЮЩИЙ ГЕЛЬ | 2011 |
|
RU2468814C1 |
| НОВЫЙ КЛАСС ФИЗИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ГЛИКОПРОТЕИНОВ | 2000 |
|
RU2223781C2 |
| ПРОТИВООЖОГОВЫЙ ГЕЛЬ | 2011 |
|
RU2481121C2 |
| Косметическая композиция, способствующая активации восстановительных и регенеративных процессов в коже различных типов и в ее производных " волосах и ногтях | 2023 |
|
RU2807113C1 |
| Композиция активной стоматологической основы для средств по уходу за ротовой полостью, стимулирующая восстановительные и репаративные процессы в тканях полости рта, и композиция для гигиены ротовой полости на ее основе (варианты) | 2023 |
|
RU2822421C1 |
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к фармакологической субстанции мембранотропных гомеостатических тканеспецифических биорегуляторов МГТБ в виде их растворов в фармацевтически приемлемом носителе и/или разбавителе, обладающая способностью к поддержанию и восстановлению функции тканей органов после развития в них различных патологических процессов. Фармакологическая субстанция мембранотропных гомеостатических тканеспецифических биорегуляторов МГТБ в виде их растворов в фармацевтически приемлемом носителе и/или разбавителе обладает способностью к поддержанию и восстановлению функции тканей органов после развития в них различных патологических процессов, субстанция выделена из различных тканей и биологических жидкостей животных, выбранных из группы, включающей сыворотку крови, ткани печени, легкого, кишечника, сердца, поджелудочной, щитовидной, предстательной и молочной желез, желчи, содержащая в качестве активно действующей основы белок-пептидные комплексы, которые состоят из белков мультисемейства сывороточных альбуминов, имеющие молекулярную массу в диапазоне 65000-68000 Да и биологически активных пептидов с молекулярными массами 1000-10000 Да, являющихся продуктами протеолиза ряда белков, а также ионы кальция, липиды, инозитол, углеводы, такие как остатки маннозы, галактозы, глюкозы, N-ацетилглюкозамина, глюкозамина, N-ацетилгалактозамина, которые образуют инозитол-содержащую гликозидную структуру, обеспечивающую ее связь с плазматической мембраной клетки. Вышеописанное изобретение расширяет арсенал средств для создания фармакологических препаратов природного происхождения, основу которых составляют ранее недостаточно изученные биологически активные (белок-пептидные) комплексы, содержащиеся в различных тканях и биологических жидкостях животных. 1 з.п. ф-лы, 18 ил., 8 табл., 38 пр.
1. Фармакологическая субстанция мембранотропных гомеостатических тканеспецифических биорегуляторов МГТБ в виде их растворов в фармацевтически приемлемом носителе и/или разбавителе, обладающая способностью к поддержанию и восстановлению функции тканей органов после развития в них различных патологических процессов, выделенная из различных тканей и биологических жидкостей животных, выбранных из группы, включающей сыворотку крови, ткани печени, легкого, кишечника, сердца, поджелудочной, щитовидной, предстательной и молочной желез, желчи, содержащая в качестве активно действующей основы белок-пептидные комплексы, которые состоят из белков мультисемейства сывороточных альбуминов, имеющие молекулярную массу в диапазоне 65000-68000 Да и биологически активных пептидов с молекулярными массами 1000-10000 Да, являющихся продуктами протеолиза ряда белков, а также ионы кальция, липиды, инозитол, углеводы, такие как остатки маннозы, галактозы, глюкозы, N-ацетилглюкозамина, глюкозамина, N-ацетилгалактозамина, которые образуют инозитол-содержащую гликозидную структуру, обеспечивающую ее связь с плазматической мембраной клетки.
2. Фармакологическая субстанция мембранотропных гомеостатических тканеспецифических биорегуляторов МГТБ по п. 1, отличающаяся тем, что предназначена для приготовления на ее основе лекарственного средства для профилактики и лечения различных заболеваний человека и животных в виде растворов в диапазоне концентраций от 10-17 до 10-5 мг белка/мл при разведении в фармацевтически приемлемом носителе и/или разбавителе, и присутствующая в виде наноразмерных частиц 50-200 нм.
| ILYINA ANNA P., SIDORSKY EGOR V | |||
| et al, Peptide-protein complex from cattle sclera: Structural aspects and chaperone activity// Biochem Biophys Rep | |||
| Способ восстановления спиралей из вольфрамовой проволоки для электрических ламп накаливания, наполненных газом | 1924 |
|
SU2020A1 |
| Печь-кухня, могущая работать, как самостоятельно, так и в комбинации с разного рода нагревательными приборами | 1921 |
|
SU10A1 |
| ИЛЬИНА А.П., СИДОРСКИЙ Е.В., ЕЛИСТРАТОВ П.А., ЧЕКОВА В.М., ЯМСКОВА В.П., ЯМСКОВ И.А | |||
| Анализ изоформ | |||
