ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫЕ МЫШИ, ЭКСПРЕССИРУЮЩИЕ ХИМЕРНЫЕ МОЛЕКУЛЫ ГЛАВНОГО КОМПЛЕКСА ГИСТОСОВМЕСТИМОСТИ Российский патент 2023 года по МПК A01K67/27 C07K14/705 

Ссылка на родственную заявку

По настоящей заявке испрашивается приоритет в соответствии с предварительной заявкой на выдачу патента США № 61/552584, поданной 28 октября 2011 г., которая полностью включена в настоящий документ посредством ссылки.

Область техники, к которой относится настоящее изобретение

Настоящее изобретение относится к не являющемуся человеком животному, например, грызуну (например, мыши или крысе), которое генетически сконструировано для экспрессии гуманизированного белка главного комплекса гистосовместимости (MHC) II класса, а также к зародышам, тканям и клеткам, его экспрессирующим. Настоящее изобретение дополнительно относится к способам получения генетически модифицированного не являющегося человеком животного, которое экспрессирует гуманизированный белок MHC II. Также предусматриваются способы применения не яляющихся человеком животных, клеток и тканей, которые экспрессируют гуманизированный белок MHC II класса, для идентификации пептидов, которые активируют лимфоциты и привлекают T-клетки, и для разработки вакцин и других терапевтических средств для человека.

Предшествующий уровень техники настоящего изобретения

В приобретенном иммунном ответе чужеродные антигены распознаются рецепторными молекулами на B-лимфоцитах (например, иммуноглобулинами) и T-лимфоцитах (например, T-клеточным рецептором, или TCR). Эти чужеродные антигены презентируются на поверхности клеток в виде пептидных фрагментов специализированными белками, имеющими общее название молекулы главного комплекса гистосовместимости (MHC). Молекулы MHC кодируются множественными локусами, которые встречаются в виде соединенного кластера генов, который охватывает приблизительно 4 м.п.н. У мышей гены MHC находятся на хромосоме 17, и исторически они называются гены гистосовместимости 2 (H-2). У людей гены находятся на хромосоме 6 и называются гены антигена лейкоцита человека (HLA). Локусы у мышей и людей являются полигенными; они включают в себя три высоко полиморфных класса генов MHC (I, II и III класс), которые проявляют сходную организацию в геноме человека и мыши (смотрите фиг. 2 и фиг. 3, соответственно).

Локусы MHC проявляют самый высокий полиморфизм в геноме; некоторые гены представлены >300 аллелями (например, HLA-DRβ человека и HLA-B человека). Все гены MHC I и II класса могут презентировать пептидные фрагменты, но каждый ген экспрессирует белок с различными характеристиками связывания, отражая полиморфизмы и аллельные варианты. Любой рассматриваемый индивидуум содержит уникальный спектр пептидных фрагментов, которые могут быть презентированы на клеточной поверхности B- и T-клеткам в ходе иммунного ответа.

Как люди, так и мыши содержат гены MHC II класса (смотрите фигуры 2 и 3). У людей классические гены MHC II называются HLA-DP, HLA-DQ и HLA-DR, тогда как у мышей они представляют собой H-2A и H-2E (часто сокращенно I-A и I-E, соответственно). Дополнительные белки, кодируемые генами в локусе MHC II, HLA-DM и HLA-DO у людей и H-2M и H-2O у мышей, не встречаются на клеточной поверхности, но локализуются в компартменте эндоцитоза и обеспечивают правильную загрузку молекул MHC II пептидами. Молекулы II класса состоят из двух полипептидных цепей: α цепи и β цепи. Внеклеточная часть цепи α содержит два внеклеточных домена, α1 и α2; и внеклеточная часть цепи β также содержит два внеклеточных домена, β1 и β2 (смотрите фиг. 1). Цепи α и β нековалентно соединены друг с другом.

Молекулы MHC II класса экспрессируются на антигенпрезентирующих клетках (АПК), например, B-клетках, макрофагах, дендритных клетках, эндотелиальных клетках в ходе воспаления и т.д. Молекулы MHC II, экспрессирующиеся на поверхности АПК, как правило, презентируют образованные во внутриклеточных везикулах антигены CD4+ T-клеткам. Чтобы принимать участие в CD4+ T-клеточной активации, комплекс MHC класса II с представляющим интерес антигеном должен быть достаточно стабильным, чтобы длительно существовать для привлечения CD4+ T-клетки. Когда CD4+ Т-хелперная клетка привлекается комплексом чужеродный пептид/MHC II на поверхности АПК, T-клетка активируется для высвобождения цитокинов, которые принимают участие в иммунном ответе на возбудителя.

Не все антигены будут вызывать активацию T-клеток вследствие механизмов толерантности. Тем не менее, при некоторых заболеваниях (например, злокачественной опухоли, аутоиммунных заболеваниях) пептиды, происходящие из собственных белков, становятся мишенью клеточного компонента иммунной системы, что приводит к разрушению клеток, презентирующих такие пептиды. Произошел значительный прогресс в распознавании антигенов, являющихся клинически значимыми (например, антигенов, связанных с различными типами злокачественных опухолей). Тем не менее, для улучшения идентификации и выбора пептидов, которые будут вызывать подходящий ответ в T-клетке человека, в частности пептидов клинически значимых антигенов, остается потребность в системах in vivo и in vitro, которые имитируют аспекты иммунной системы человека. Таким образом, существует необходимость в биологических системах (например, генетически модифицированных не относящихся к человеку животных и клетках), которые могут проявлять компоненты иммунной системы человека.

Краткое раскрытие настоящего изобретения

Предусматривается биологическая система для получения или идентификации пептидов, которые ассоциируются с белками MHC II класса человека и их химерами и связываются с CD4+ T-клетками. Предусматриваются не являющиеся человеком животные, содержащие не являющиеся человеческими клетки, которые экспрессируют гуманизированные молекулы, функционирующие в клеточном иммунном ответе. Также предусматриваются гуманизированные локусы грызуна, которые кодируют гуманизированные белки MHC II. Также предусматриваются гуманизированные клетки грызуна, которые экспрессируют гуманизированные молекулы MHC. Предусматриваются системы in vivo и in vitro, которые содержат гуманизированные клетки грызуна, причем клетки грызуна экспрессируют одну или несколько гуманизированных молекул иммунной системы.

В настоящем документе предусматривается не являющееся человеком животное, например, грызун (например, мышь или крыса), содержащее в своем геноме нуклеотидную последовательность, кодирующую гуманизированный комплекс MHC II, причем человеческая часть гуманизированного комплекса MHC II содержит внеклеточный домен комплекса MHC II человека, например, гуманизированный внеклеточный домен α MHC II и гуманизированный внеклеточный домен β MHC II.

Согласно одному аспекту в настоящем документе предусматривается не являющееся человеком животное, содержащее на эндогенном локусе гена α MHC II нуклеотидную последовательность, кодирующую химерный человеческий/не относящийся к человеку полипептид α MHC II. Согласно одному варианту осуществления человеческая часть такого химерного человеческого/не относящегося к человеку полипептида α MHC II содержит внеклеточный домен α MHC II человека. Согласно одному варианту осуществления не являющееся человеком животное экспрессирует функциональный комплекс MHC II на поверхности клетки животного. Согласно одному варианту осуществления внеклеточный домен α MHC II человека у животного содержит домены α1 и α2 MHC II человека; согласно одному варианту осуществления не относящаяся к человеку часть химерного человеческого/не относящегося к человеку полипептида α MHC II содержит трансмембранный и цитоплазматический домены эндогенного не относящегося к человеку полипептида α MHC II. Согласно одному варианту осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая химерный человеческий/не относящийся к человеку полипептид α MHC II, экспрессируется под регуляторным контролем эндогенных не относящихся к человеку α промоторных и регуляторных элементов MHC II. Согласно одному варианту осуществления человеческая часть химерного полипептида происходит из белка HLA II класса человека, выбранного из группы, состоящей из HLA-DR, HLA-DQ и HLA-DP, например, человеческая часть происходит из белка HLA-DR4. Не являющееся человеком животное может представлять собой грызуна, например, мышь. Согласно одному аспекту не являющееся человеком животное, содержащее на эндогенном локусе гена α MHC II нуклеотидную последовательность, кодирующую химерный человеческий/не относящийся к человеку полипептид α MHC II, дополнительно содержит на эндогенном локусе гена β MHC II нуклеотидную последовательность, кодирующую химерный человеческий/не относящийся к человеку полипептид β MHC II. Также в настоящем документе предусматривается способ получения генетически модифицированного не являющегося человеком животного, содержащего на эндогенном локусе гена α MHC II нуклеотидную последовательность, кодирующую химерный человеческий/не относящийся к человеку полипептид α MHC II. Такой способ может предусматривать замещение на эндогенном локусе гена α MHC II нуклеотидной последовательности, кодирующей эндогенный не относящийся к человеку полипептид α MHC II, на нуклеотидную последовательность, кодирующую химерный человеческий/не относящийся к человеку полипептид α MHC II.

Также в настоящем документе предусматривается не являющееся человеком животное, содержащее на эндогенном локусе гена β MHC II нуклеотидную последовательность, кодирующую химерный человеческий/не относящийся к человеку полипептид β MHC II. Согласно одному варианту осуществления человеческая часть такого химерного человеческого/не относящегося к человеку полипептида β MHC II содержит внеклеточный домен β MHC II человека. Согласно одному варианту осуществления не являющееся человеком животное экспрессирует функциональный комплекс MHC II на поверхности клетки животного. Согласно одному варианту осуществления человеческий внеклеточный домен β MHC II у животного содержит домены β1 и β2 MHC II человека; согласно одному варианту осуществления не относящаяся к человеку часть химерного человеческого/не относящегося к человеку полипептида β MHC II содержит трансмембранный и цитоплазматический домены эндогенного не относящегося к человеку полипептида β MHC II. Согласно одному варианту осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая химерный человеческий/не относящийся к человеку полипептид β MHC II, экспрессируется под регуляторным контролем эндогенных не относящихся к человеку β промоторных и регуляторных элементов MHC II. Согласно одному варианту осуществления человеческая часть химерного полипептида происходит из белка HLA II класса человека, выбранного из группы, состоящей из HLA-DR, HLA-DQ и HLA-DP, например, человеческая часть происходит из белка HLA-DR4. Не являющееся человеком животное может представлять собой грызуна, например, мышь. Согласно одному аспекту не являющееся человеком животное, содержащее на эндогенном локусе гена β MHC II нуклеотидную последовательность, кодирующую химерный человеческий/не относящийся к человеку полипептид β MHC II, дополнительно содержит на эндогенном локусе гена α MHC II нуклеотидную последовательность, кодирующую химерный человеческий/не относящийся к человеку полипептид α MHC II. Также в настоящем документе предусматривается способ получения генетически модифицированного не являющегося человеком животного, содержащего на эндогенном локусе гена β MHC II нуклеотидную последовательность, кодирующую химерный человеческий/не относящийся к человеку полипептид β MHC II. Такой способ может предусматривать замещение на эндогенном локусе гена β MHC II нуклеотидной последовательности, кодирующей эндогенный не относящийся к человеку полипептид β MHC II, на нуклеотидную последовательность, кодирующую химерный человеческий/не относящийся к человеку полипептид β MHC II.

Согласно одному аспекту предусматривается не являющееся человеком животное, содержащее на эндогенном локусе гена MHC II первую нуклеотидную последовательность, кодирующую химерный человеческий/не относящийся к человеку полипептид α MHC II, и вторую нуклеотидную последовательность, кодирующую химерный человеческий/не относящийся к человеку полипептид β MHC II, причем человеческая часть химерного человеческого/не относящегося к человеку полипептида α MHC II содержит человеческий внеклеточный домен α MHC II, и человеческая часть химерного человеческого/не относящегося к человеку полипептида β MHC II содержит человеческий внеклеточный домен β MHC II. Согласно одному варианту осуществления химерные человеческие/не относящиеся к человеку полипептиды α и β MHC II образуют функциональный химерный комплекс MHC II (например, человеческий/не относящийся к человеку комплекс MHC II) на поверхности клетки. Согласно одному варианту осуществления человеческий внеклеточный домен α MHC II содержит домены α1 и α2 человека MHC II человека. Согласно одному варианту осуществления человеческий внеклеточный домен β MHC II содержит домены β1 и β2 человека MHC II человека. Согласно различным аспектам первая нуклеотидная последовательность экспрессируется под регуляторным контролем эндогенных не относящихся к человеку α промоторных и регуляторных элементов MHC II. Согласно различным аспектам вторая нуклеотидная последовательность экспрессируется под регуляторным контролем эндогенных не относящихся к человеку β промоторных и регуляторных элементов MHC II. Согласно некоторым вариантам осуществления не относящаяся к человеку часть химерного человеческого/не относящегося к человеку полипептида α MHC II содержит трансмембранный и цитоплазматический домены эндогенного не относящегося к человеку полипептида α MHC II. Согласно некоторым вариантам осуществления не относящаяся к человеку часть химерного человеческого/не относящегося к человеку полипептида β MHC II содержит трансмембранный и цитоплазматический домены эндогенного не относящегося к человеку полипептида β MHC II.

Согласно различным вариантам осуществления не являющееся человеком животное представляет собой грызуна, и человеческие части химерных человеческих/относящихся к грызуну полипептидов α и β MHC II содержат последовательности человека, происходящие из белка HLA II класса, выбранного из группы, состоящей из HLA-DR, HLA-DQ и HLA-DP. Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения человеческие части химерных человеческих/относящихся к грызуну последовательностей α и β MHC II происходят из последовательности HLA-DR4 человека; таким образом, нуклеотидная последовательность, кодирующая внеклеточный домен α MHC II, происходит из последовательности гена HLA-DRα*01, и нуклеотидная последовательность, кодирующая внеклеточный домен β MHC II, происходит из последовательности, кодирующей ген HLA-DRβ1*04.

Согласно различным вариантам осуществления настоящего изобретения первая и вторая нуклеотидные последовательности расположены на одной хромосоме. Согласно некоторым аспектам животное содержит две копии локуса MHC II, содержащего первую и вторую нуклеотидные последовательности, тогда как согласно другим аспектам животное содержит одну копию локуса MHC II, содержащего первую и вторую нуклеотидные последовательности. Таким образом, животное может являться гомозиготным или гетерозиготным в отношении локуса MHC II, содержащего первую и вторую нуклеотидные последовательности.

Согласно некоторым аспектам химерный полипептид α MHC II и/или химерный полипептид β MHC II функционально связан с не относящейся к человеку лидерной последовательностью.

Согласно одному аспекту генетически сконструированное не являющееся человеком животное представляет собой грызуна. Согласно одному варианту осуществления грызуна выбирают из группы, состоящей из мыши и крысы. Таким образом, согласно некоторым вариантам осуществления не относящиеся к человеку последовательности химерных генов α и β MHC II происходят из нуклеотидных последовательностей, кодирующих белок MHC II мыши, например, белок H-2E мыши. Согласно одному варианту осуществления грызун (например, мышь или крыса) согласно настоящему изобретению не экспрессирует функциональные эндогенные полипептиды MHC II из их эндогенных локусов. Согласно одному варианту осуществления, в которых грызун представляет собой мышь, мышь не экспрессирует функциональные эндогенные полипептиды H-2E и H-2A из их эндогенных локусов.

Таким образом, согласно некоторым вариантам осуществления предусматривается мышь, содержащая на эндогенном локусе MHC II мыши первую нуклеотидную последовательность, кодирующую химерный человеческий/мышиный полипептид α MHC II, и вторую нуклеотидную последовательность, кодирующую химерный человеческий/мышиный полипептид β MHC II, причем человеческая часть химерного полипептида α MHC II содержит внеклеточный домен, происходящий из полипептида α белка HLA-DR4 человека, и человеческая часть химерного человеческого/мышиного полипептида β MHC II содержит внеклеточный домен, происходящий из полипептида β белка HLA-DR4 человека, причем мишиная часть химерного полипептида α MHC II содержит трансмембранный и цитоплазматический домены цепи α H-2E мыши, и мышиная часть химерного полипептида β MHC II содержит трансмембранный и цитоплазматический домены цепи β H-2E мыши, и при этом мышь экспрессирует функциональный химерный HLA-DR4/H-2E комплекс MHC II. Согласно некоторым аспектам внеклеточный домен химерного полипептида α MHC II содержит домены α1 и α2 человека; согласно некоторым аспектам внеклеточный домен химерного полипептида β MHC II содержит домены β1 и β2 человека. Согласно некоторым вариантам осуществления первая нуклеотидная последовательность экспрессируется под регуляторным контролем эндогенных α промоторных и регуляторных элементов MHC II мыши, и вторая нуклеотидная последовательность экспрессируется под регуляторным контролем эндогенных β промоторных и регуляторных элементов MHC II мыши. Согласно различным вариантам осуществления мышь не экспрессирует функциональные эндогенные полипептиды MHC II, например, полипептиды H-2E и H-2A, из их эндогенных локусов. Согласно некоторым аспектам мышь содержит две копии локуса MHC II, содержащего первую и вторую нуклеотидные последовательности, тогда как согласно другим аспектам мышь содержит одну копию локуса MHC II, содержащего первую и вторую нуклеотидные последовательности.

Также предусматриваются способы получения генетически сконструированных не являющихся человеком животных (например, грызунов, например, мышей или крыс), описанных в настоящем документе. Согласно различным вариантам осуществления не являющихся человеком животных (например, грызунов, например, мышей или крыс) по настоящему изобретению получают путем замещения эндогенных последовательностей MHC II нуклеотидными последовательностями, кодирующими химерные человеческие/не относящиеся к человеку (например, человеческие/мышиные) полипептиды α и β MHC II. Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к способу модификации локуса MHC II грызуна (например, мыши или крысы) для экспрессии химерного человеческого/относящегося к грызуну комплекса MHC II, предусматривающему замещение на эндогенном локусе MHC II мыши нуклеотидной последовательности, кодирующей комплекс MHC II грызуна, на нуклеотидную последовательность, кодирующую химерный человеческий/относящийся к грызуну комплекс MHC II. Согласно одному аспекту способа нуклеотидная последовательность, кодирующая химерный человеческий/относящийся к грызуну комплекс MHC II, содержит первую нуклеотидную последовательность, кодирующую внеклеточный домен цепи α MHC II человека и трансмембранный и цитоплазматический домены цепи α MHC II грызуна, и вторую нуклеотидную последовательность, кодирующую внеклеточный домен цепи β MHC II человека и трансмембранный и цитоплазматический домены цепи β MHC II грызуна. Согласно некоторым аспектам относящаяся к грызуну часть химерного комплекса MHC II происходит из белка H-2E мыши, и человеческая часть происходит из белка HLA-DR4 человека. Согласно некоторым вариантам осуществления замещение описанных в настоящем документе эндогенных локусов MHC II проводят в одной ES (эмбриональной стволовой) клетке, и одну ES клетку вводят в зародыш грызуна (например, мыши или крысы) для получения генетически модифицированного грызуна (например, мыши или крысы).

Также в настоящем документе предусматриваются клетки, например, выделенные антигенпрезентирующие клетки, полученные от описанных в настоящем документе не являющихся человеком животных (например, грызуны, например, мыши или крысы). Также предусматриваются ткани и зародыши, полученные от описанных в настоящем документе не являющихся человеком животных.

Любой из описанных в настоящем документе вариантов осуществления и аспектов может использоваться совместно друг с другом, если иное не указано или не очевидно из контекста. Другие варианты осуществления станут очевидными специалистам в настоящей области техники из обзора последующего подробного раскрытия. Последующее подробное раскрытие включает в себя иллюстративные представления различных вариантов осуществления настоящего изобретения, которые не ограничивают заявленное настоящее изобретение. Прилагаемые фигуры составляют часть настоящего описания изобретения и вместе с описанием служат исключительно для иллюстрации вариантов осуществления, а не для ограничения настоящего изобретения.

Краткое описание графических материалов

На фиг. 1 представлено схематическое изображение молекулы MHC II класса, экспрессирующейся на поверхности антигенпрезентирующей клетки (АПК), содержащей четыре домена: α1, α2, β1 и β2. Серые кружки представляют пептид, связанный на пептидсвязывающей бороздке.

На фиг. 2 представлено схематическое изображение (без соблюдения масштаба) относительной геномной структуры HLA человека, показывающее гены I, II и III класса.

На фиг. 3 представлено схематическое изображение (без соблюдения масштаба) относительной геномной структуры MHC мыши, показывающее гены I, II и III класса.

На фиг. 4 (A-D) схематически проиллюстрирована (без соблюдения масштаба) стратегия создания нацеливающего вектора, содержащего гуманизированные I-E β и I-E α (т.е., химеру H-2Eβ/HLA-DRβ1*04 и H-2Еα/HLA-DRα*01, соответственно). На фиг. 4C конечную гуманизированную последовательность MHC II из фиг. 4B лигируют между сайтами рестрикции PI-SceI и I-CeuI конечной конструкции из фиг. 4A для создания конструкции, содержащей гуманизированный MHC II и экзон 1 I-Eα из BALB/c. Pg=псевдоген; BHR= бактериальная гомологичная рекомбинация; CM=хлорамфеникол; spec=спектиномицин; hyg=гигромицин; neo=неомицин; EP=электропорация. Треугольники представляют экзоны, закрашенные треугольники представляют экзоны мыши от мыши C57BL/6 (за исключением заштрихованных треугольников, которые представляют экзон 1 I-Eα от мыши BALB/c) и незакрашенные треугольники представляют экзоны человека.

На фиг. 5 показано схематическое изображение, без соблюдения масштаба, генов I-E и I-A MHC II класса, показывающее нокаут мышиного локуса с использованием кассеты гигромицина с последующим введением вектора, содержащего гуманизированные I-E β и I-E α (т.е., химеру H-2Eβ/HLA-DRβ1*04 и H-2Eα/HLA-DRα*01, соответственно). Незакрашенные треугольники представляют экзоны человека; закрашенные треугольники представляют экзоны мыши. Используемые для генотипирования зонды обведены кружком.

На фиг. 6 показано схематическое изображение, без соблюдения масштаба, Cre-опосредованного удаления кассеты неомицина из фиг. 5. Незакрашенные треугольники представляют экзоны человека; закрашенные треугольники представляют экзоны мыши. Две верхние цепи представляют локусы MHC II у гетерозиготной мыши с гуманизированным MHC II, несущей селективную кассету неомицина, и две нижние цепи представляют локусы MHC II у гетерозиготной мыши с гуманизированным MHC II с удаленной кассетой неомицина.

На фиг. 7 показано схематическое сравнительное изображение, без соблюдения масштаба, локусов II класса мыши и человека. Гены II класса представлены прямоугольниками, а пустые прямоугольники представляют псевдогены. Представлены относительные размеры (т.п.н.) различных фрагментов нуклеиновой кислоты.

На фиг. 8, на левой панели, представлено схематическое изображение (без соблюдения масштаба) стратегии гуманизации для цепи α MHC II; в частности, на фигуре показано замещение доменов α1 и α2, кодируемых экзонами 2 и 3 гена α MHC II, при сохранении трансмембранной и цитоплазматической хвостовых последовательностей мыши. В гуманизированном локусе лидерная последовательность α MHC II получена от штамма BALB/c мыши. На правой панели показана гуманизация цепи β MHC II; в частности, на фигуре показано замещение доменов β1 и β2, кодируемых экзонами 2 и 3 гена β MHC II, при сохранении мышиной лидерной и трансмембранной и цитоплазматической хвостовых последовательностей мыши. В верхнем ряду представлены все последовательности человека; в среднем ряду представлены все последовательности мыши; в нижнем ряду представлены все гуманизированные последовательности, с экзонами 2 и 3, происходящими из генов HLA-DR человека.

На фиг. 9 показан анализ FACS с антителом к HLA-DR B-клеток от мыши, гетерозиготной в отношении химерного HLA-DR4 (кассета neo удалена) в присутствии (1681HET + поли(I:C) или при отсутствии (1681HET) поли(I:C), и от мыши дикого типа (мыши WT).

Подробное раскрытие настоящего изобретения

Определения

Настоящее изобретение относится к генетически модифицированным не являющимся человеком животным (например, мышам, крысам, кроликам и т.д.), которые экспрессируют относящийся к человеку или гуманизированный полипептид MHC II; к зародышам, клеткам и тканям, его содержащим; способам их получения; а также способам их применения. Если не указано иное, все используемые в настоящем документе термины и фразы включают значения, которые подразумеваются под терминами и фразами в настоящей области техники, если противоположное ясно не указано или ясно не следует из контекста, в котором используется термин или фраза.

Термин "консервативная”, используемый для описания консервативной аминокислотной замены, включает замену аминокислотного остатка другим аминокислотным остатком с R-группой боковой цепи со сходными химическими свойствами (например, зарядом или гидрофобностью). Консервативные аминокислотные замены могут быть достигнуты путем модификации нуклеотидной последовательности так, чтобы ввести изменение нуклеотида, которое будет кодировать консервативную замену. Как правило, консервативная аминокислотная замена не будет существенно изменять представляющие интерес функциональные свойства белка, например, способность MHC II к презентации представляющего интерес пептида. Примеры групп аминокислот, которые содержат боковые цепи со сходными химическими свойствами, включают такие алифатические боковые цепи, как глицин, аланин, валин, лейцин и изолейцин; такие алифатические гидроксильные боковые цепи, как серин и треонин; такие амидсодержащие боковые цепи, как аспарагин и глутамин; такие ароматические боковые цепи, как фенилаланин, тирозин и триптофан; такие основные боковые цепи, как лизин, аргинин и гистидин; такие кислотные боковые цепи, как аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота; и такие серосодержащие боковые цепи, как цистеин и метионин. Группы консервативных аминокислотных замен включают, например, валин/лейцин/изолейцин, фенилаланин/тирозин, лизин/аргинин, аланин/валин, глутамат/аспартат и аспарагин/глутамин. Согласно некоторым вариантам осуществления консервативная аминокислотная замена может представлять собой замену любого нативного остатка в белке на аланин, что используется, например, в сканирующем аланином мутагенезе. Согласно некоторым вариантам осуществления проводят консервативную замену, которая характеризуется положительным значением в матрице логарифмического правдоподобия PAM250, раскрытой в Gonnet et al. ((1992) Exhaustive Matching of the Entire Protein Sequence Database, Science 256:1443-45), включенной в настоящий документ посредством ссылки. Согласно некоторым вариантам осуществления замена представляет собой умеренно консервативную замену, причем замена характеризуется неотрицательным значением в матрице логарифмического правдоподобия PAM250.

Таким образом, в настоящем изобретении также предусматривается генетически модифицированное не являющееся человеком животное, геном которого содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую человеческий или гуманизированный полипептид MHC II, причем полипептид содержит консервативные аминокислотные замены в описанной в настоящем документе аминокислотной последовательности.

Специалисту в настоящей области техники понятно, что в дополнение к остаткам нуклеиновой кислоты, кодирующим описанный в настоящем документе человеческий или гуманизированный полипептид MHC II, вследствие вырожденности генетического кода, другие нуклеиновые кислоты могут кодировать полипептид по настоящему изобретению. Следовательно, в дополнение к генетически модифицированному не являющемуся человеком животному, которое содержит в своем геноме нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид MHC II с консервативными аминокислотными заменами, также предусматривается не являющееся человеком животное, геном которого содержит нуклеотидную последовательность, которая отличается от описанной в настоящем документе нуклеотидной последовательности вследствие вырожденности генетического кода.

Термин “идентичность” при использовании в связи с последовательностью включает идентичность, определяемую с помощью набора различных известных в настоящей области техники алгоритмов, которые могут использоваться для измерения идентичности нуклеотидной и/или аминокислотной последовательности. Согласно некоторым описанным в настоящем документе вариантам осуществления, идентичности определяют с использованием ClustalW v. 1.83 (медленного) выравнивания с использованием штрафа за открытие делеции, составляющего 10,0, штрафа за продление делеции, составляющего 0,1, и с использованием матрицы сравнения согласно Gonnet (MacVector™ 10.0.2, MacVector Inc., 2008). Длина последовательностей, сравниваемых в отношении идентичности последовательностей, будет зависеть от конкретных последовательностей. Согласно различным вариантам осуществления идентичность определяют путем сравнения последовательности зрелого белка в направлении от его N-конца к его C-концу. Согласно различным вариантам осуществления при сравнении химерной человеческой/не относящейся к человеку последовательности с последовательностью человека, человеческая часть химерной человеческой/не относящейся к человеку последовательности (но не часть, не относящаяся к человеку) используется в осуществления сравнения с целью выяснения уровня идентичности между последовательностью человека и человеческой частью химерной человеческий/не относящейся к человеку последовательности (например, сравнивая эктодомен человека химерного человеческого/мыши белка с эктодоменом белка человека).

Термины “гомология” или “гомологичный” в отношении последовательностей, например, нуклеотидных или аминокислотных последовательностей, означает, что две последовательности при оптимальном выравнивании и сравнении являются идентичными по меньшей мере приблизительно в 75% нуклеотидов или аминокислот, по меньшей мере приблизительно в 80% нуклеотидов или аминокислот, по меньшей мере приблизительно в 90-95% нуклеотидов или аминокислот, например, больше чем 97% нуклеотидов или аминокислот. Специалисту в настоящей области техники будет понятно, что для оптимального нацеленного воздействия на ген нацеливающий конструкт должен содержать плечи, гомологичные эндогенным последовательностям ДНК (т.е., “плечи гомологии”); таким образом, гомологичная рекомбинация может происходить между нацеливающей конструкцией и нацеленной эндогенной последовательностью.

Термин "функционально связанный" относится к смежному положению, причем описанные таким образом компоненты находятся во взаимодействии, позволяющем им функционировать предусмотренным для них образом. В связи с этим, кодирующая белок последовательность нуклеиновой кислоты может быть функционально связана с регуляторными последовательностями (например, последовательностью промотора, энхансера, сайленсера и т.д.) так, чтобы сохранять надлежащую транскрипционную регуляцию. Кроме того, различные части химерного или гуманизированного белка по настоящему изобретению могут быть функционально связаны для сохранения надлежащей укладки, процессинга, нацеленного воздействия, экспрессии и других функциональных свойств белка в клетке. Если не указано иное, различные домены химерного или гуманизированного белка по настоящему изобретению функционально связаны друг с другом.

Используемые в настоящем документе термины “ комплекс MHC II”, “белок MHC II” или подобное включают комплекс между полипептидом α MHC II и полипептидом β MHC II. Используемый в настоящем документе термин “полипептид α MHC II” или “полипептид β MHC II” (или подобное) включает полипептид α MHC I отдельно или полипептид β MHC II отдельно, соответственно. Аналогично, термины “комплекс HLA-DR4”, “белок HLA-DR4”, “комплекс H-2E”, “белок H-2E” или подобное относятся к комплексу между полипептидами α и β. Как правило, термины “MHC человека” и “HLA” используются взаимозаменяемо.

Термин “замещение” в отношении замещения гена относится к размещению экзогенного генетического материала на эндогенном генетическом локусе, тем самым замещая весь эндогенный ген или его часть ортологичной или гомологичной последовательностью нуклеиновой кислоты. Как показано в примерах ниже, последовательность нуклеиновой кислоты эндогенного локуса MHC II замещали нуклеотидной последовательностью, содержащей последовательности, кодирующие части полипептидов α и β MHC II человека; в частности, кодирующие внеклеточные части полипептидов α и β MHC II.

Используемый в настоящем документе термин “функциональный”, например, по отношению к функциональному полипептиду, относится к полипептиду, который сохраняет по меньшей мере одну биологическую активность, в норме связанную с нативным белком. Например, согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения замещение на эндогенном локус (например, замещение на эндогенном не относящемся к человеку локусе MHC II) дает в результате локус, который не способен экспрессировать функциональный эндогенный полипептид.

Генетически модифицированные в отношении MHC II животные

Согласно различным аспектам настоящее изобретение в основном относится к генетически модифицированным не являющимся человеком животным, которые содержат в своем геноме нуклеотидную последовательность, кодирующую человеческий или гуманизированный комплекс MHC II; таким образом, животные экспрессируют человеческий или гуманизированный комплекс MHC II (например, полипептиды α и β MHC II).

Гены MHC относятся к трем классам: I классу, II классу и III классу, причем все указанные классы кодируются либо на хромосоме 6 человека, либо на хромосоме 17 мыши. Схематическая иллюстрация относительной организации классов MHC человека и мыши представлена на фигурах 2 и 3, соответственно. Большинство генов MHC являются полиморфными, фактически, они представляют собой наиболее полиморфные гены геномов мыши и человека. Предполагают, что полиморфизмы MHC являются важными в обеспечении эволюционного преимущества; изменения в последовательности могут привести к различиям в связывании пептида, что обеспечивает возможность лучшей презентации антигена. Одно исключение составляет цепь HLA-DRα человека и ее мышиный гомолог, Eα (т.е., H-2Ea), которые являются мономорфными.

Комплекс MHC II класса содержит два нековалентно связанных домена: цепь α и цепь β, также в настоящем документе имеющие название полипептид α и полипептид β (фиг. 1). Белок охватывает плазматическую мембрану; таким образом, он содержит внеклеточный домен, трансмембранный домен и цитоплазматический домен. Внеклеточная часть цепи α включает в себя домены α1 и α2, и внеклеточная часть цепи β включает в себя домены β1 и β2. Домены α1 и β1 образуют пептидсвязывающую бороздку на клеточной поверхности. Вследствие трехмерной конформации пептидсвязывающей бороздки комплекса MHC II теоретически не существует верхнего предела в отношении длины связанного антигена, но, как правило, презентируемые с помощью MHC II пептиды составляют от 13 до 17 аминокислот в длину.

В дополнение к своему взаимодействию с антигенными пептидами пептидсвязывающая бороздка молекулы MHC II взаимодействует с инвариантной цепью (Ii) в ходе процессов образования комплекса MHC II и захвата пептида. Димеры α/β MHC II собираются в эндоплазматическом ретикулуме и соединяются с цепью Ii, которая отвечает за контроль связывания пептида и направление MHC II в эндоцитозный путь. В эндосоме Ii подвергается протеолизу, и небольшой фрагмент Ii, пептид связанной с II классом инвариантной цепи (CLIP), остается на пептидсвязывающей бороздке. В эндосоме под контролем HLA-DM (у людей) CLIP обменивается на антигенные пептиды.

MHC II взаимодействует с T-клеточным корецептором CD4 в гидрофобном кармане на стыке между доменами α2 и β2. Wang and Reinherz (2002) Structural Basis of T Cell Recognition of Peptides Bound to MHC Molecules, Molecular Immunology, 38:1039-49. Когда CD4 и T-клеточный рецептор связываются с одной и той же молекулой MHC II в комплексе с пептидом, чувствительность T-клетки к антигену увеличивается, и для активации требуется в 100 раз меньше антигена. Смотрите, Janeway's Immunobiology, 7^th Ed., Murphy et al. eds., Garland Science, 2008, включенную в настоящий документ посредством ссылки.

В отношении трансмембранного и цитоплазматического доменов MHC II предполагали разнообразные функции. В случае цитоплазматического домена, было показано, что он является важным для внутриклеточной передачи сигналов, транспорта к плазматической мембране и, в конце концов, презентации антигена. Например, было показано, что T-клеточные гибридомы слабо отвечают на антигенпрезентирующие клетки (АПК), трансфицированные цепями β MHC II, процессированные на цитоплазматическом домене, а также затрудняется индукция B-клеточной дифференцировки. Смотрите, например, Smiley et al. (1996) Truncation of the class II β-chain cytoplasmic domain influences the level of class II/invariant chain-derived peptide complexes, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:241-44. Вероятно, процессирование молекул II класса нарушает продукцию cAMP. Предполагается, что делеция цитоплазматического хвоста MHC II влияет на внутриклеточный транспорт, таким образом предотвращая контакт комплекса с соответствующими антигенами в эндоцитозном пути. Smiley с соавт. (ранее) показали, что процессирование молекул II класса на цитоплазматическом домене снижает количество комплексов CLIP/II класс, позволяя предположить, что это влияет на способность CLIP эффективно регулировать презентацию антигена.

Выдвинули гипотезу о том, что поскольку кластеризация MHC II важна для запуска T-клеточного рецептора (TCR), если предотвращалось связывание процессированных на цитоплазматическом домене молекул MHC II с цитоскелетом и, таким образом, предотвращалась агрегация, то нарушалась презентация антигена T-клеткам. Ostrand-Rosenberg et al. (1991) Abrogation of Tumorigenicity by MHC Class II Antigen Expression Requires the Cytoplasmic Domain of the Class II Molecule, J. Immunol. 147:2419-22. Действительно, недавно было показано, что процесированный на цитоплазматическом домене HLA-DR не мог связаться с цитоскелетом после олигомеризации. El Fakhy et al. (2004) Delineation of the HLA-DR Region and the Residues Involved in the Association with the Cytoskeleton, J. Biol. Chem. 279:18472-80. Важно, что актиновый цитоскелет представляет собой место действия локализованной передачи сигнала, что может оказывать влияние на презентацию антигена. Кроме ассоциации с цитоскелетом недавние исследования также показали, что до 20% всех молекул HLA-DR постоянно находятся в липидных рафтах АПК, которые представляют собой микродомены, обогащенные холестерином и гликосфинголипидами, и что такая локализация важна для презентации антигена, формирования иммунного синапса и опосредованной MHC II передачи сигнала. Смотрите, например, Dolan et al. (2004) Invariant Chain and the MHC II Cytoplasmic Domains Regulate Localization of MHC Class II Molecules to Lipid Rafts in Tumor Cell-Based Vaccines, J. Immunol. 172:907-14. Dolan с соавт. предположили, что процессирование цитоплазматического домена MHC II снижает постоянную локализацию MHC II в липидных рафтах.

Кроме того, цитоплазматический домен MHC II, в частности цепь β, содержит остаток лейцина, который подвергается убиквитинированию с помощью убиквитинлигизы, мембраноассоциированной RING-CH I (MARCH I), которая контролирует эндоцитозный транспорт, интернализацию и деградацию MHC II; и было показано, что опосредованное MARCH убиквитинирование прекращается при созревании дендритных клеток, приводя к повышенному содержанию MHC II на плазматической мембране. Shin et al. (2006) Surface expression of MHC class II in dendritic cells is controlled by regulated ubiquitination, Nature 444:115-18; De Gassart et al. (2008) MHC class II stabilization at the surface of human dendritic cells is the result of maturation-dependent MARCH I down-regulation, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105:3491-96.

Трансмембранные домены цепей α и β MHC II взаимодействуют друг с другом, и указанное взаимодействие является важным для правильной сборки комплекса MHC II класса. Cosson and Bonifacino (1992) Role of Transmembrane Domain Interactions in the Assembly of Class II MHC Molecules, Nature 258:659-62. Действительно, молекулы MHC II, в которых трансмембранные домены цепей α и β замещены цепью α рецептора IL-2, сохранялись в эндоплазматическом ретикулуме и с трудом обнаруживались на клеточной поверхности (там же). Посредством исследований с помощью мутагенеза было обнаружено, что консервативные остатки Gly на трансмембранных доменах α и β отвечают за сборку MHC II на клеточной поверхности (там же). Таким образом, как трансмембранные, так и цитоплазматические домены являются критически важными для правильного функционирования комплекса MHC II.

Согласно различным вариантам осуществления настоящее изобретение относится к генетически модифицированному не являющемуся человеком животному (например, мыши, крысе, кролику и т.д.), которое содержит в своем геноме нуклеотидную последовательность, кодирующую человеческий или гуманизированный комплекс MHC II, например, челевеческий(е) или гуманизированный(е) полипептид(ы) α и/или β MHC II. Не являющееся человеком животное может содержать в своем геноме нуклеотидную последовательность, которая кодирует комплекс MHC II, который частично является человеческим и частично не относящимся к человеку, например, не являющееся человеком животное, которое экспрессирует химерный человеческий/не относящийся к человеку комплекс MHC II (например, не являющееся человеком животное, которое экспрессирует химерные человеческие/не относящиеся к человеку полипептиды α и β MHC II). Согласно одному аспекту не являющееся человеком животное экспрессирует только человеческий или гуманизированный комплекс MHC II, например, химерный человеческий/не относящийся к человеку комплекс MHC II, и не экспрессирует эндогенный не относящийся к человеку комплекс MHC II из эндогенного локуса MHC II. Согласно некоторым вариантам осуществления животное не способно экспрессировать какой-либо эндогенный не относящийся к человеку комплекс MHC II из эндогенного локуса MHC II, но экспрессирует только человеческий или гуманизированный комплекс MHC II. Согласно различным вариантам осуществления генетически модифицированное не являющееся человеком животное (например, мышь, крыса, кролик и т.д.) содержит в своей зародышевой линии нуклеотидную последовательность, кодирующую человеческий или гуманизированный комплекс MHC II, например, человеческий(е) или гуманизированный(е) полипептид(ы) α и/или β MHC II.

Согласно одному аспекту предусматривается химерный человеческий/не относящийся к человеку комплекс MHC II. Согласно одному варианту осуществления химерный человеческий/не относящийся к человеку комплекс MHC II содержит химерный человеческий/не относящийся к человеку полипептид α MHC II и химерный человеческий/не относящийся к человеку полипептид β MHC II. Согласно одному аспекту человеческая часть химерного полипептида α MHC II и/или человеческая часть химерного полипептида β MHC II содержит пептидсвязывающий домен полипептида α MHC II человека и/или полипептида β MHC II человека, соответственно. Согласно одному аспекту человеческая часть химерного полипептида α и/или β MHC II содержит внеклеточный домен полипептида α и/или β MHC II человека, соответственно. Согласно одному варианту осуществления человеческая часть химерного полипептида α MHC II содержит домен α1 полипептида α MHC II человека; согласно другому варианту осуществления человеческая часть химерного полипептида α MHC II содержит домены α1 и α2 полипептида α MHC II человека. Согласно дополнительному варианту осуществления человеческая часть химерного полипептида β MHC II содержит домен β1 полипептида β MHC II человека; согласно другому варианту осуществления человеческая часть химерного полипептида β MHC II содержит домены β1 и β2 полипептида β MHC II человека.

Человеческая часть описанных в настоящем документе полипептидов α и β MHC II может кодироваться любым из локусов HLA-DP, -DQ, и -DR. Перечень широко используемых антигенов и аллелей HLA представлен в Shankarkumar et al. ((2004) The Human Leukocyte Antigen (HLA) System, Int. J. Hum. Genet. 4(2):91-103), включенной в настоящий документ посредством ссылки. Shankarkumar с соавт. также представляют краткое объяснение используемой в настоящей области техники номенклатуры HLA. Дополнительную информацию относительно номенклатуры HLA и различных аллелей HLA можно найти в Holdsworth et al. (2009) The HLA dictionary 2008: a summary of HLA-A, -B, -C, -DRB1/3/4/5, and DQB1 alleles and their association with serologically defined HLA-A, -B, -C, -DR, and -DQ antigens, Tissue Antigens 73:95-170, и недавно обновленной редакции Marsh et al. (2010) Nomenclature for factors of the HLA system, 2010, Tissue Antigens 75:291-455, включенных в настоящий документ посредством ссылки. Таким образом, человеческий или гуманизированный полипептид MHC II может происходить из любых описанных в настоящем документе функциональных молекул HLA человека.

Согласно одному конкретному аспекту человеческие части описанного в настоящем документе гуманизированного комплекса MHC II происходят из HLA-DR человека, например, HLA-DR4. Как правило, цепи α HLA-DR являются мономорфными, например, цепь α комплекса HLA-DR кодируется геном HLA-DRA (например, геном HLA-DRα*01). С другой стороны, цепь β HLA-DR является полиморфной. Таким образом, HLA-DR4 содержит цепь α, кодируемую геном HLA-DRA, и цепь β, кодируемую геном HLA-DRB1 (например, геном HLA-DRβ1*04). Как описано в настоящем документе ниже, известно, что HLA-DR4 связан с возникновением ряда аутоиммунных заболеваний, например, ревматоидного артрита, диабета I типа, рассеянного склероза и т.д. Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения аллель HLA-DRA представляет собой аллель HLA-DRα*01, например, HLA-DRα*01:01:01:01. Согласно другому варианту осуществления аллель HLA-DRB представляет собой HLA-DRβ1*04, например, HLA-DRβ1*04:01:01. Несмотря на то, что настоящие примеры описывают указанные конкретные последовательности HLA, в настоящем документе предусматриваются любые подходящие последовательности HLA-DR, например, полиморфные варианты, проявляющиеся в человеческой популяции, последовательности с одной или несколькими консервативными или неконсервативными аминокислотными модификациями, последовательности нуклеиновой кислоты, отличающиеся от описанных в настоящем документе последовательностей вследствие вырожденности генетического кода и т.д.

Человеческие части гуманизированного комплекса MHC II могут кодироваться нуклеотидными последовательностями аллелей HLA, которые, как известно, связаны с распространенными заболеваниями человека. Такие аллели HLA включают без ограничения HLA-DRB1*0401, -DRB1*0301, -DQA1*0501, -DQB1*0201, -DRB1*1501, -DRB1*1502, -DQB1*0602, -DQA1*0102, -DQA1*0201, -DQB1*0202, -DQA1*0501 и их комбинации. Обобщенное изложение взаимосвязей аллелей HLA и заболеваний можно найти в Bakker et al. (2006) A high-resolution HLA and SNP haplotype map for disease association studies in the extended human MHC, Nature Genetics 38:1166-72 и Supplementary Information, включенных в настоящий документ посредством ссылки.

Согласно одному аспекту не относящаяся к человеку часть химерного человеческого/не относящегося к человеку комплекса MHC II содержит трансмембранный и/или цитоплазматический домены эндогенного не относящегося к человеку (например, относящегося к грызуну, например, мыши, крысе и т.д.) комплекса MHC II. Таким образом, не относящаяся к человеку часть химерного человеческого/не относящегося к человеку полипептида α MHC II может содержать трансмембранный и/или цитоплазматический домены эндогенного не относящегося к человеку полипептида α MHC II. Не относящаяся к человеку часть химерного человеческого/не относящегося к человеку полипептида β MHC II может содержать трансмембранный и/или цитоплазматический домены эндогенного не относящегося к человеку полипептида β MHC II. Согласно одному аспекту животное представляет собой мышь, и не относящиеся к человеку части химерных полипептидов α и β происходят из белка H-2E мыши. Таким образом, не относящиеся к человеку части химерных полипептидов α и β могут содержать трансмембранный и цитоплазматический домены, происходящие из белка H-2E мыши. Хотя в примерах рассматриваются конкретные последовательности H-2E, в настоящем документе предусматриваются любые подходящие последовательности, например, полиморфные варианты, консервативные/неконсервативные аминокислотные замены и т.д.

Согласно различным аспектам настоящего изобретения последовательность(и), кодирующая(ие) химерный человеческий/не относящийся к человеку комплекс MHC II, расположены на эндогенном не относящимся к человеку локусе MHC II (например, локусе H-2A и/или H-2E мыши). Согласно одному варианту осуществления это приводит к замещению эндогенного(ых) гена(ов) MHC II или его(их) части нуклеотидной(ыми) последовательностью(ями), кодирующей(ими) человеческий или гуманизированный белок MHC II, например, химерным геном, кодирующим химерный человеческий/не относящийся к человеку белок MHC II, описанный в настоящем документе. Поскольку нуклеотидные последовательности, кодирующие полипептиды α и β MHC II, расположены на хромосоме в непосредственной близости друг от друга, замещение можно разработать для нацеленного воздействия на два гена либо независимо, либо вместе; причем обе эти возможности предусматриваются в настоящем документе. Согласно одному варианту осуществления замещение предусматривает замещение эндогенной нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептиды α и β MHC II, нуклеотидной последовательностью, кодирующей химерный человеческий/не относящийся к человеку полипептид α MHC и химерный человеческий/не относящийся к человеку полипептид β MHC. Согласно одному аспекту замещение предусматривает замещение нуклеотидных последовательностей, представляющих один или несколько (например, два) эндогенных гена MHC II. Таким образом, не являющееся человеком животное содержит химерную человеческую/не относящуюся к человеку нуклеотидную последовательность на эндогенном локусе MHC II, и экспрессирует химерный человеческий/не относящийся к человеку белок MHC II из эндогенного не относящегося к человеку локуса.

Таким образом, в настоящем документе предусматривается не являющееся человеком животное, содержащее на эндогенном генном локусе MHC II первую нуклеотидную последовательность, кодирующую химерный человеческий/не относящийся к человеку полипептид α MHC II, и вторую нуклеотидную последовательность, кодирующую химерный человеческий/не относящийся к человеку полипептид β MHC II, причем человеческая часть химерного человеческого/не относящегося к человеку полипептида α MHC II содержит внеклеточный домен α MHC II человека, и человеческая часть химерного человеческого/не относящегося к человеку полипептида β MHC II содержит внеклеточный домен β MHC II человека, и при этом химерные человеческие/не относящиеся к человеку полипептиды α MHC II и полипептиды β MHC II образуют функциональный комплекс MHC II на поверхности клетки.

Химерный человеческий/не относящийся к человеку полипептид может быть таким, что он содержит человеческую или не относящуюся к человеку лидерную (сигнальную) последовательность. Согласно одному варианту осуществления химерный полипептид α MHC II содержит не относящуюся к человеку лидерную последовательность эндогенного полипептида α MHC II. Согласно одному варианту осуществления химерный полипептид β MHC II содержит не относящуюся к человеку лидерную последовательность эндогенного полипептида β MHC II. Согласно альтернативному варианту осуществления химерный полипептид α MHC II и/или полипептид β MHC II содержит не относящуюся к человеку лидерную последовательность полипептида α MHC II и/или полипептида β MHC II, соответственно, от другого не являющегося человеком животного, например, другого штамма грызуна или другого штамма мыши. Таким образом, нуклеотидная последовательность, кодирующая химерный полипептид α MHC II и/или полипептид β MHC II, может быть функционально связана с нуклеотидной последовательностью, кодирующей не относящуюся к человеку лидерную последовательность α MHC II и/или лидерную последовательность β MHC II, соответственно. Согласно другому варианту осуществления химерный полипептид α MHC II и/или полипептид β MHC II содержит лидерную последовательность человека полипептида α MHC II человека и/или полипептида β MHC II человека, соответственно (например, лидерную последовательность HLA-DRA человека и/или HLA-DRβ1*04 человека, соответственно).

Химерный человеческий/не относящийся к человеку полипептид α MHC II и/или полипептид β MHC II может содержать в своей человеческой части полный или по существу полный внеклеточный домен полипептида α MHC II человека и/или полипептида β MHC II человека, соответственно. Таким образом, человеческая часть может содержать по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, например, 95% или больше аминокислот, кодирующих внеклеточный домен полипептида α MHC II человека и/или полипептида β MHC II человека (например, HLA-DRA человека и/или HLA-DRβ1*04 человека). Согласно одному примеру по существу полный внеклеточный домен полипептида α MHC II человека и/или полипептида β MHC II человека не содержит лидерной последовательности человека. Согласно другому примеру химерный человеческий/не относящийся к человеку полипептид α MHC II и/или химерный человеческий/не относящийся к человеку полипептид β MHC II содержит лидерную последовательность человека.

Более того, химерный полипептид α MHC II и/или полипептид β MHC II может экспрессироваться под контролем эндогенных не относящихся к человеку промоторных и регуляторных элементов, например, α регуляторных элементов MHC II и/или β регуляторных элементов MHC II мыши, соответственно. Такое расположение будет облегчать надлежащую экспрессию химерных полипептидов MHC II у не являющегося человеком животного, например, в ходе иммунного ответа у не являющегося человеком животного.

Генетически модифицированное не являющееся человеком животное может быть выбрано из группы, состоящей из мыши, крысы, кролика, свиньи, крупного рогатого скота (например, коровы, быка, буйвола), оленя, овцы, козы, курицы, кошки, собаки, хорька, примата (например, игрунки, макака-резуса). Для не являющихся человеком животных, у которых подходящие генетически модифицируемые ES клетки не являются общедоступными, используются другие способы для получения не являющегося человеком животного, содержащего генетическую модификацию. Такие способы включают, например, модификацию генома не относящихся к ES клеток (например, фибробласта или индуцированной плюрипотентной клетки) и использование ядерного транспорта для переноса модифицированного генома в подходящую клетку, например, ооцит, и гестацию модифицированной клетки (например, модифицированного ооцита) в не являющемся человеком животном при подходящих условиях для образования зародыша.

Согласно одному аспекту не являющееся человеком животное представляет собой млекопитающее. Согласно одному аспекту не являющееся человеком животное представляет собой небольшое млекопитающее, например, из надсемейства Dipodoidea или Muroidea. Согласно одному варианту осуществления генетически модифицированное животное представляет собой грызуна. Согласно одному варианту осуществления грызуна выбирают из мыши, крысы и хомяка. Согласно одному варианту осуществления грызуна выбирают из надсемейства Muroidea. Согласно одному варианту осуществления генетически модифицированное животное происходит из семейства, выбранного из Calomyscidae (например, мышеподобные хомяки), Cricetidae (например, хомяк, крысы и мыши Нового Света, полевки), Muridae (настоящие мыши и крысы, карликовые песчанки, иглистые мыши, косматые хомяки), Nesomyidae (рипидомисы, скалистые хомячки, белохвостые крысы, мадагаскарские крысы и мыши), Platacanthomyidae (например, колючие соневидные хомяки), и Spalacidae (например, скальные крысы, бамбуковые крысы и цокоры). Согласно конкретному варианту осуществления генетически модифицированного грызуна выбирают из настоящей мыши или крысы (семейство Muridae), карликовой песчанки, иглистой мыши и косматого хомяка. Согласно одному варианту осуществления генетически модифицированную мышь получают из представителя семейства Muridae. Согласно одному варианту осуществления животное представляет собой грызуна. Согласно конкретному варианту осуществления грызуна выбирают из мыши и крысы. Согласно одному варианту осуществления не являющееся человеком животное представляет собой мышь.

Согласно конкретному варианту осуществления не являющееся человеком животное представляет собой грызуна, который представляет собой мышь штамма C57BL, выбранного из C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr и C57BL/Ola. Согласно другому варианту осуществления мышь представляет собой штамм 129, выбранный из группы, состоящей из штамма, который представляет собой 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1 (например, 129S1/SV, 129S1/SvIm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2 (смотрите, например, Festing et al. (1999) Revised nomenclature for strain 129 mice, Mammalian Genome 10:836, смотрите также Auerbach et al (2000) Establishment and Chimera Analysis of 129/SvEv- and C57BL/6-Derived Mouse Embryonic Stem Cell Lines). Согласно конкретному варианту осуществления генетически модифицированная мышь представляет собой смесь вышеупомянутого штамма 129 и вышеупомянутого штамма C57BL/6. Согласно другому конкретному варианту осуществления мышь представляет собой смесь вышеупомянутых штаммов 129 или смесь вышеупомянутых штаммов BL/6. Согласно конкретному варианту осуществления штамм 129 смеси представляет собой штамм 129S6 (129/SvEvTac). Согласно другому варианту осуществления мышь представляет собой штамм BALB, например, штамм BALB/c. Согласно другому варианту осуществления мышь представляет собой смесь штамма BALB и другого вышеупомянутого штамма.

Согласно одному варианту осуществления не являющееся человеком животное представляет собой крысу. Согласно одному варианту осуществления крысу выбирают из крысы штамма Вистар, штамма LEA, штамма Спрага-Доули, штамма Фишера, F344, F6 и Dark Agouti. Согласно одному варианту осуществления штамм крысы представляет собой смесь двух или больше штаммов, выбранных из группы, состоящей из штамма Вистар, LEA, Спрага-Доули, Фишера, F344, F6 и Dark Agouti.

Таким образом, согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к генетически модифицированной мыши, которая содержит в своем геноме нуклеотидную последовательность, кодирующую химерный человеческий/мышиный комплекс MHC II, например, химерные человеческие/мышиные полипептиды α и β MHC II. Согласно одному варианту осуществления человеческая часть химерного человеческого/мышиного полипептида α MHC II содержит связывающий или внеклеточный домен пептида α MHC II человека, и человеческая часть химерного человеческого/мышиного полипептида β MHC II содержит связывающий или внеклеточный домен пептида β MHC II человека. Согласно некоторым вариантам осуществления мышь не экспрессирует пептидсвязывающий или внеклеточный домен эндогенного мышиного полипептида α и/или β из эндогенного локуса мыши (например, локуса H-2A и/или H-2E). Согласно некоторым вариантам осуществления мышь содержит геном, который не содержит ген, кодирующий функциональную молекулу II класса MHC, содержащую H-2Ab1, H-2Aa, H-2Eb1, H-2Eb2, H-2Ea и их комбинацию. Пептидсвязывающий домен полипептида α MHC II человека может содержать домен α1, и пептидсвязывающий домен полипептида β MHC II человека может содержать домен β1; таким образом, пептидсвязывающий домен химерного комплекса MHC II может содержать домены α1 и β1 человека. Внеклеточный домен полипептида α MHC II человека может содержать домены α1 и α2, и внеклеточный домен полипептида β MHC II человека может содержать домены β1 и β2; таким образом, внеклеточный домен химерного комплекса MHC II может содержать домены α1, α2, β1 и β2человека. Согласно одному варианту осуществления мышиная часть химерного комплекса MHC II содержит трансмембранный и цитозольный домены MHC II мыши, например H-2E мыши (например, трансмембранный и цитозольный домены цепей α и β H-2E мыши).

Следовательно, согласно одному варианту осуществления предусматривается генетически модифицированная мышь, причем мышь содержит на эндогенном локусе MHC II мыши первую нуклеотидную последовательность, кодирующую химерный человеческий/мышиный полипептид α MHC II, и вторую нуклеотидную последовательность, кодирующую химерный человеческий/мышиный полипептид β MHC II, причем человеческая часть химерного полипептида α MHC II содержит внеклеточный домен, происходящий из полипептида α белка HLA-DR4 человека, и человеческая часть химерного полипептида β MHC II содержит внеклеточный домен, происходящий из полипептида β белка HLA-DR4 человека, причем мышиная часть химерного полипептида α MHC II содержит трансмембранный и цитоплазматический домены цепи α H-2E мыши, и мышиная часть химерного полипептида β MHC II содержит трансмембранный и цитоплазматический домены цепи β H-2E мыши, и при этом мышь экспрессирует функциональный химерный комплекс MHC II HLA-DR4/H-2E. Согласно одному варианту осуществления химерный комплекс MHC II HLA-DR4/H-2E содержит цепь α MHC II, которая включает внеклеточные домены (например, домены α1 и α2), происходящие из белка HLA-DR4 (домены α1 и α2 HLA-DRA) и трансмембранный и цитоплазматический домены из цепи α H-2E мыши, а также цепь β MHC II, которая включает внеклеточные домены (например, домены β1 и β2), происходящие из HLA-DR4 (домены β1 и β2 HLA-DRβ1*04) и трансмембранные и цитоплазматические домены из цепи β H-2E мыши. Согласно одному аспекту мышь не экспрессирует функциональные эндогенные полипептиды H-2A и H-2E из их эндогенных локусов мыши (например, мышь не экспрессирует полипептиды H-2Ab1, H-2Aa, H-2Eb1, H-2Eb2 и H-2Ea). Согласно различным вариантам осуществления экспрессия первой и второй нуклеотидных последовательностей находится под контролем соответствующих эндогенных промоторов и регуляторных элементов мыши. Согласно различным вариантам осуществления настоящего изобретения первая и вторая нуклеотидные последовательности расположены на одной хромосоме. Согласно некоторым аспектам мышь содержит две копии химерного локуса MHC II, содержащего первую и вторую нуклеотидные последовательности, тогда как согласно другим аспектам мышь содержит одну копию локуса MHC II, содержащего первую и вторую нуклеотидные последовательности. Таким образом, мышь может являться гомозиготной или гетерозиготной в отношении химерного локуса MHC II, содержащего первую и вторую нуклеотидные последовательности. Согласно различным вариантам осуществления первая и вторая нуклеотидные последовательности содержатся в зародышевой линии мыши.

Согласно некоторым описанным в настоящем документе вариантам осуществления предусматривается мышь, которая содержит химерный локус MHC II на эндогенном локусе MHC II мыши, например, посредством замещения эндогенных генов H-2A и H-2E мыши. Согласно некоторым аспектам химерный локус содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует внеклеточный домен HLA-DRA человека и трансмембранный и цитоплазматический домены цепи α H-2E мыши, а также внеклеточный домен HLA-DRβ1*04 человека и трансмембранный и цитоплазматический домены цепи β H-2E мыши. Различные домены химерного локуса соединены таким образом, чтобы локус экспрессировал функциональный химерный человеческий/мышиный комплекс MHC II.

Согласно различным вариантам осуществления не являющееся человеком животное (например, грызун, например, мышь или крыса), которое экспрессирует функциональный химерный белок MHC II из описанного в настоящем документе химерного локуса MHC II, проявляет химерный белок на клеточной поверхности. Согласно одному варианту осуществления не являющееся человеком животное экспрессирует химерный белок MHC II на клеточной поверхности в клеточной локализации, которая аналогична наблюдаемой у человека. Согласно одному аспекту клетка проявляет пептидный фрагмент (фрагмент антигена), связанный с внеклеточной частью (например, внеклеточной частью HLA-DR4 человека) химерного белка MHC II.

Согласно различным вариантам осуществления клетка, проявляющая химерный белок MHC II, например, белок HLA-DR4/H-2E, представляет собой антигенпрезентирующую клетку (АПК), например, макрофаг, дендритную клетку или B-клетку. Согласно некоторым вариантам осуществления пептидный фрагмент, презентируемый химерным белком, происходит из опухоли. Согласно другим вариантам осуществления пептидный фрагмент, презентируемый химерным белком MHC II, происходит из патогена, например, бактерии, вируса или паразита.

Описанный в настоящем документе химерный белок MHC II может взаимодействовать с другими белками на поверхности той же клетки или второй клетки. Согласно некоторым вариантам осуществления химерный белок MHC II взаимодействует с эндогенными не относящимися к человеку белками на поверхности указанной клетки. Химерный белок MHC II также может взаимодействовать с человеческими или гуманизированными белками на поверхности той же клетки или второй клетки. Согласно некоторым вариантам осуществления вторая клетка представляет собой T-клетку, и химерный белок MHC II взаимодействует с T-клеточным рецептором (TCR) и его корецептором CD4. Согласно некоторым вариантам осуществления T-клетка представляет собой эндогенную T-клетку мыши. Согласно другим вариантам осуществления T-клетка представляет собой T-клетку человека. Согласно некоторым вариантам осуществления TCR представляет собой человеческий или гуманизированный TCR. Согласно дополнительным вариантам осуществления CD4 представляет собой человеческий или гуманизированный CD4. Согласно другому варианту осуществления или один из TCR и CD4, или оба не относятся к человеку, например, относятся к мыши или крысе.

Согласно одному варианту осуществления предусматривается описанное в настоящем документе генетически модифицированное не являющееся человеком животное, у которого опухоли не развиваются с большей скоростью, чем у животного дикого типа, которое не содержит химерный ген MHC II. Согласно некоторым вариантам осуществления у животного не развивается гематологические злокачественные опухоли, например, различные T- и B-клеточные лимфомы, лейкозы, композитные лимфомы (например, лимфома Ходжкина), с большей скоростью, чем у животного дикого типа.

В дополнение к генетически сконструированному не являющемуся человеком животному, также предусматривается не являющийся человеческим зародыш (например, зародыш грызуна, например, мыши или крысы), причем зародыш содержит донорную ES клетку, которая получена от описанного в настоящем документе не являющегося человеком животного (например, грызуна, например, мыши или крысы). Согласно одному аспекту зародыш содержит ES донорную клетку, которая содержит химерный ген MHC II и клетки зародыша-хозяина.

Также предусматривается ткань, причем ткань получена от описанного в настоящем документе не являющегося человеком животного (например, грызуна, например, мыши или крысы) и экспрессирует химерный белок MHC II (например, белок HLA-DR4/H-2E).

Кроме того, предусматривается не являющаяся человеческой клетка, выделенная из описанного в настоящем документе не являющегося человеком животного. Согласно одному варианту осуществления клетка представляет собой ES клетку. Согласно одному варианту осуществления клетка представляет собой антигенпрезентирующую клетку, например, дендритную клетку, макрофаг, B-клетку. Согласно одному варианту осуществления клетка представляет собой иммунную клетку. Согласно одному варианту осуществления иммунная клетка представляет собой лимфоцит.

Также предусматривается не являющаяся человеческой клетка, содержащая хромосому или ее фрагмент описанного в настоящем документе не являющегося человеком животного. Согласно одному варианту осуществления не являющаяся человеческой клетка содержит ядро описанного в настоящем документе не являющегося человеком животного. Согласно одному варианту осуществления не являющаяся человеческой клетка содержит хромосому или ее фрагмент как результат ядерного транспорта.

Согласно одному аспекту предусматривается не являющаяся человеческой индуцированная плюрипотентная клетка, содержащая ген, кодирующий описанный в настоящем документе химерный белок MHC II (например, белок HLA-DR4/H-2E). Согласно одному варианту осуществления индуцированная плюрипотентная клетка получена из описанного в настоящем документе не являющегося человеком животного.

Согласно одному аспекту предусматривается гибридома или квадрома, происходящая из клетки описанного в настоящем документе не являющегося человеком животного. Согласно одному варианту осуществления не являющееся человеком животное представляет собой мышь или крысу.

Согласно одному аспекту предусматривается препарат in vitro, который содержит первую клетку, несущую химерный человеческий/относящийся к грызуну поверхностный белок MHC II, который содержит связанный пептид для образования химерного человеческого/относящегося к грызуну комплекса MHC II/пептид, и вторую клетку, которая связывает химерный человеческий/относящийся к грызуну комплекс MHC II/пептид. Согласно одному варианту осуществления вторая клетка содержит человеческий или гуманизированный T-клеточный рецептор, и согласно одному варианту осуществления дополнительно содержит человеческий или гуманизированный CD4. Согласно одному варианту осуществления вторая клетка представляет собой клетку грызуна (например, мыши или крысы), содержащую человеческий или гуманизированный T-клеточный рецептор и человеческий или гуманизированный белок CD4. Согласно одному варианту осуществления вторая клетка представляет собой клетку человека.

Также предусматривается способ получения описанного в настоящем документе генетически сконструированного не являющегося человеком животного (например, генетически сконструированного грызуна, например, мыши или крысы). Способ получения генетически сконструированного не являющегося человеком животного дает в результате животного, геном которого содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую химерный белок MHC II (например, химерные полипептиды α и β MHC II). Согласно одному варианту осуществления способ дает в результате генетически сконструированную мышь, геном которой содержит на эндогенном локусе MHC II нуклеотидную последовательность, кодирующую химерный человеческий/мышиный белок MHC II, причем человеческая часть химерного белка MHC II содержит внеклеточный домен HLA-DR4 человека, и мышиная часть содержит трансмембранные и цитоплазматические домены H-2E мыши. Согласно некоторым вариантам осуществления в способе используется нацеливание конструкции, полученной с использованием технологии VELOCIGENE®, введение конструкции в ES клетки и введение нацеленных ES клеточный клонов к мышиный зародыш с использованием технологии VELOCIMOUSE®, описанной в примерах. Согласно одному варианту осуществления ES клетки представляют собой смесь штаммов мышей 129 и C57BL/6; согласно одному варианту осуществления ES клетки представляют собой смесь штаммов мышей BALB/c и 129.

Также предусматривается нуклеотидная конструкция, используемая для создания генетически сконструированных описанных в настоящем документе не являющихся человеком животных. Согласно одному аспекту нуклеотидная конструкция содержит: 5' и 3' не относящиеся к человеку плечи гомологии, фрагмент ДНК, содержащий последовательности цепей α и β HLA-DR человека, и кассету селекции, фланкированную сайтами рекомбинации. Согласно одному варианту осуществления последовательности цепей α и β HLA-DR человека представляют собой геномные последовательности, которые содержат интроны и экзоны генов цепей α и β HLA-DR человека. Согласно одному варианту осуществления не относящиеся к человеку плечи гомологии являются гомологичными по отношению к не относящейся к человеку геномной последовательности MHC II.

Согласно одному варианту осуществления последовательность цепи α HLA-DR человека содержит кодирующую домен α1 и α2 последовательность. Согласно конкретному варианту осуществления она содержит, в направлении 5' - 3': экзон α1 (экзон 2), интрон α1/α2 (интрон 2), и экзон α2 (экзон 3). Согласно одному варианту осуществления последовательность цепи β HLA-DR человека содержит кодирующую домен β1 и β2 последовательность. Согласно конкретному варианту осуществления она содержит, в направлении 5' - 3': экзон β1 (экзон 2), интрон β1/β2 (интрон 2) и экзон β2 (экзон 3).

Кассета селекции представляет собой нуклеотидную последовательность, вставленную в нацеливающую конструкцию для облегчения селекции клеток (например, ES клеток), которые интегрировали представляющей интерес конструкцией. Ряд подходящих кассет селекции известен в настоящей области техники. Как правило, кассета селекции обеспечивает положительную селекцию в присутствии конкретного антибиотика (например, Neo, Hyg, Pur, CM, SPEC и т.д.). Кроме того, кассета селекции может быть фланкирована сайтами рекомбинации, которые обеспечивают делецию кассеты селекции при обработке ферментами рекомбиназами. Широко используемые сайты рекомбинации представляют собой loxP и Frt, распознаваемые ферментами Cre и Flp, соответственно, но в настоящей области техники известны и другие. Кассета селекции может быть расположена где-либо в конструкции вне кодирующей области. Согласно одному варианту осуществления кассета селекции расположена в интроне цепи β, например, интроне β2/трансмембранный домен (интрон 3).

Согласно одному варианту осуществления 5' и 3' плечи гомологии содержат геномные последовательность в положениях 5' и 3' эндогенного не относящегося к человеку локуса MHC II. Согласно одному варианту осуществления 5' плечо гомологии содержит геномную последовательность против хода транскрипции по отношению к гену H-2Ab1 мыши, и 3' плечо гомологии содержит геномную последовательность по ходу транскрипции по отношению к гену H-2Ea мыши. Согласно настоящему варианту осуществления конструкт обеспечивает замещение как генов H-2E, так и H-2A мыши.

Таким образом, согласно одному аспекту предусматривается нуклеотидная конструкция, содержащая в направлении 5' - 3': 5' плечо гомологии, содержащее мышиную геномную последовательность против хода транскрипции по отношению к гену H-2Ab1 мыши, первую нуклеотидную последовательность, содержащую последовательность, кодирующую химерную человеческую/мышиную цепь β MHC II, вторую нуклеотидную последовательность, содержащую последовательность, кодирующую химерную человеческую/мышиную цепь α MHC II, и 3' плечо гомологии, содержащее мышиную геномную последовательность по ходу транскрипции по отношению к гену H-2Ea мыши. Согласно конкретному варианту осуществления первая нуклеотидная последовательность, содержащая последовательность, кодирующую химерную человеческую/мышиную цепь β MHC II, содержит человеческий экзон β1, интрон β1/β2, экзон β2, кассету селекции, фланкированную сайтами рекомбинации, вставленными в интронную область между последовательностью экзона β2 человека и последовательностью экзона трансмембранного домена мыши. Согласно конкретному варианту осуществления вторая нуклеотидная последовательность, содержащая последовательность, кодирующую химерную человеческую/мышиную цепь α MHC II, содержит человеческий экзон α1, интрон α1/α2 и экзон α2 человека. Иллюстративная конструкция по настоящему изобретению изображена на фиг. 5 (MAID 1680).

При завершении нацеленного воздействия на ген ES клетки или генетически модифицированных не являющихся человеком животных подвергают скринингу для подтверждения успешного встраивания представляющей интерес экзогенной нуклеотидной последовательности или экспрессии экзогенного полипептида. Различные техники известны специалистам в настоящей области техники и включают в себя (без ограничения) саузерн-блоттинг, ПЦР длинных фрагментов, количественную ПЦР (например, ПЦР в реальном времени с использованием TAQMAN®), флуоресцентную гибридизацию in situ, нозерн-блоттинг, проточную цитометрию, вестерн-блоттинг, иммуноцитохимию, иммуногистохимию и т.д. Согласно одному примеру не являющиеся человеком животные (например, мыши), несущие представляющую интерес генетическую модификацию, могут быть идентифицированы путем скрининга в отношении потери аллеля мыши и/или приобретения аллеля человека с использованием модификации аллельного анализа, описанного в Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech. 21(6):652-659. Другие анализы, которые идентифицируют конкретную нуклеотидную или аминокислотную последовательность у генетически модифицированных животных, известны специалистам в настоящей области техники.

Настоящее раскрытие также относится к способу модификации локуса MHC II не являющегося человеком животного для экспрессии описанного в настоящем документе химерного человеческого/не относящегося к человеку комплекса MHC II. Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к способу модификации локуса MHC II мыши для экспрессии химерного человеческого/мышиного комплекса MHC II, предусматривающему замещение на эндогенном локусе MHC II мыши нуклеотидной последовательности, кодирующей комплекс MHC II мыши, нуклеотидной последовательностью, кодирующей химерный человеческий/мышиный комплекс MHC II. Согласно конкретному аспекту нуклеотидная последовательность, кодирующая химерный человеческий/мышиный комплекс MHC II, содержит первую нуклеотидную последовательность, кодирующую внеклеточный домен цепи α MHC II человека (например, цепи α HLA-DR4) и трансмембранный и цитоплазматический домены цепи α MHC II мыши (например, цепи α H-2E), и вторую нуклеотидную последовательность, кодирующую внеклеточный домен цепи β MHC II человека (например, цепи β HLA-DR4) и трансмембранный и цитоплазматический домены цепи β MHC II мыши (например, цепи β H-2E, например, цепи H-2Eb1). Согласно некоторым вариантам осуществления модифицированный локус MHC II мыши экспрессирует химерный белок HLA-DR4/H-2E.

Согласно одному аспекту предусматривается способ получения химерной человеческой HLA II класса /не относящейся к человеку MHC II класса молекулы, предусматривающий экспрессию в одной клетке химерного белка HLA-DR4/H-2E из описанной в настоящем документе нуклеотидной конструкции. Согласно одному варианту осуществления нуклеотидная конструкция представляет собой вирусный вектор; согласно конкретному варианту осуществления вирусный вектор представляет собой лентивирусный вектор. Согласно одному варианту осуществления клетку выбирают из CHO, COS, 293, HeLa и ретинальной клетки, экспрессирующей вирусную последовательность нуклеиновой кислоты (например, клетка PERC.6™).

Согласно одному аспекту предусматривается клетка, которая экспрессирует химерный белок HLA-DR4/H-2E. Согласно одному варианту осуществления клетка содержит вектор экспрессии, содержащий описанную в настоящем документе химерную последовательность MHC II класса. Согласно одному варианту осуществления клетку выбирают из CHO, COS, 293, HeLa и ретинальной клетки, экспрессирующей вирусную последовательность нуклеиновой кислоты (например, клетка PERC.6™).

Также предусматривается химерная молекула MHC II класса, полученная с помощью описанного в настоящем документе не являющегося человеком животного, причем химерная молекула MHC II класса содержит домены α1, α2, β1 и β2 из белка MHC II человека, например, белка HLA-DR4, и трансмембранный и цитоплазматический домены из не относящегося к человеку белка MHC II, например, белка H-2E мыши. Химерный комплекс MHC II, содержащий внеклеточный домен HLA-DR4, описанного в настоящем документе, может быть обнаружен с помощью антител к HLA-DR. Таким образом, клетка, проявляющая химерный человеческий/не относящийся к человеку полипептид MHC II, может быть обнаружена и/или выбрана с использованием антитела к HLA-DR.

Несмотря на то, что представленные ниже примеры описывают генетически сконструированное животное, геном которого содержит замещение нуклеотидной последовательности, кодирующей белки H-2A и H-2E мыши, нуклеотидной последовательностью, кодирующей химерный человеческий/мышиный белок HLA-DR4/H-2E, специалисту в настоящей области техники будет понятно, что аналогичная стратегия может использоваться для введения химер, содержащих другие человеческие гены MHC II (HLA-DP и HLA-DQ). Таким образом, дополнительный вариант осуществления настоящего изобретения направлен на генетически сконструированное животное, геном которого содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую химерный белок HLA-DQ/H-2A. Согласно одному варианту осуществления нуклеотидная последовательность кодирует химерный белок HLA-DQ2.5/H-2A. Согласно другому варианту осуществления нуклеотидная последовательность кодирует химерный белок HLA-DQ8/H-2A. Кроме того, также предусматривается введение множественных гуманизированных молекул MHC II (например, химерных HLA-DR/H-2E и HLA-DQ/H-2A).

Применение генетически модифицированных животных

Согласно различным вариантам осуществления описанные в настоящем документе генетически модифицированные не являющиеся человеком животные производят АПК с человеческими или гуманизированным MHC II на клеточной поверхности и, в результате этого, презентируют пептиды, происходящие из цитозольных белков в качестве эпитопов T-клеткам характерным для человека образом, поскольку по существу все компоненты комплекса являются человеческими или гуманизированными. Генетически модифицированные не являющиеся человеком животные по настоящему изобретению могут использоваться для исследования функции иммунной системы человека у гуманизированного животного; для идентификации антигенов и антигенных эпитопов, которые вызывают иммунный ответ (например, T-клеточных эпитопов, например, уникальных эпитопов злокачественных опухолей человека), например, для применения в разработке вакцин; для оценки кандидатных вакцин и других стратегий разработки вакцин; для исследования аутоиммунитета человека; для исследования инфекционных заболеваний человека; и в других случаях для разработки лучших терапевтических стратегий на основании экспрессии MHC человека.

Комплекс MHC II связывает пептиды, происходящие из внеклеточных белков, например, внеклеточной бактерии, соседних клеток или полипептидов, связанных B-клеточными рецепторами и интернализованных в B-клетку. Как только внеклеточные белки попадают в эндоцитозный путь, они распадаются на пептиды, и пептиды связываются и презентируются с помощью MHC II. Как только пептид, презентируемый MHC II, распознается CD4+ T-клетками, T-клетки активируются, пролиферируют, дифференцируются до различных подтипов Т-хелперов (например, T_H1, T_H2), и приводят к ряду событий, включающих активацию опосредованного макрофагами лизиса патогена, B-клеточную пролиферацию и продукцию антител. Вследствие роли MHC II в иммунном ответе, понимание презентации пептида MHC II важна в разработке способов лечения патологий у человека. Тем не менее, презентация антигенов в сочетании с MHC II мыши лишь в некоторой степени имеет отношение к заболеванию человека, поскольку комплексы MHC человека и мыши распознают антигены различным образом, например, MHC II мыши может не распознавать одинаковые антигены или может презентировать другие эпитопы, в отличие от MHC II человека. Таким образом, наиболее релевантные данные для патологий человека получают посредством исследования презентации антигенных эпитопов MHC II человека.

Таким образом, согласно различным вариантам осуществления генетически сконструированные животные по настоящему изобретению являются применимыми, среди прочего, для оценки способности антигена инициировать иммунный ответ у человека, и для создания разнообразных антигенов и идентификации специфического антигена, который может использоваться для разработки вакцины для человека.

Согласно одному аспекту предусматривается способ определения у человека антигенности пептидной последовательности, предусматривающий воздействие на описанное в настоящем документе генетически модифицированное не являющееся человеком животное молекулой, содержащей пептидную последовательность, предоставление не являющемуся человеком животному возможности развить иммунный ответ и обнаружение у не являющегося человеком животного клетки, которая связывает последовательность пептида, презентируемого описанным в настоящем документе гуманизированным комплексом MHC II.

Согласно одному аспекту предусматривается способ определения того, будет ли пептид вызывать иммунный ответ у человека, предусматривающий воздействие на описанное в настоящем документе генетически модифицированное не являющееся человеком животное пептидом, предоставление не являющемуся человеком животному возможности развить иммунный ответ и обнаружение у не являющегося человеком животного клетки, которая связывает последовательность пептида описанной в настоящем документе химерной человеческой/не относящейся к человеку молекулой MHC II класса. Согласно одному варианту осуществления не являющееся человеком животное после воздействия содержит рестриктированную по MHC II класса CD4+ T-клетку, которая связывает пептид.

Согласно одному аспекту предусматривается способ идентификации CD4+ T-клеточного эпитопа человека, предусматривающий воздействие на описанное в настоящем документе не являющееся человеком животное антигена, содержащего предполагаемый T-клеточный эпитоп, предоставление не являющемуся человеком животному возможности развить иммунный ответ и идентификацию эпитопа, связанного рестриктированной по MHC II класса CD4+ T-клеткой.

Согласно одному аспекту предусматривается способ идентификации антигена, который вызывает CD4+ T-клеточный ответ у человека, предусматривающий воздействие предполагаемого антигена на описанную в настоящем документе мышь, предоставление мыши возможности развития иммунного ответа, обнаружение CD4+ T-клеточного ответа, который является специфическим для антигена в сочетании с молекулой MHC II человека (например, молекулой HLA-DR), и идентификацию антигена, связанного рестриктированной по MHC II молекулой человека (например, рестриктированной по HLA-DR молекулой человека).

Согласно одному варианту осуществления антиген содержит бактериальный белок. Согласно одному варианту осуществления антиген содержит антиген опухолевой клетки человека. Согласно одному варианту осуществления антиген содержит предполагаемую вакцину для применения у человека, или другое биофармацевтическое средство. Согласно одному варианту осуществления антиген содержит эпитоп человека, который вызывает образование антител у человека. Согласно другому варианту осуществления антиген содержит антиген дрожжевой или грибковой клетки. Согласно другому варианту осуществления антиген происходит из паразита человека.

Согласно одному аспекту предусматривается способ определения, содержит ли предполагаемый антиген эпитоп, который при воздействии на иммунную систему человека будет вызывать рестриктированный по HLA-DR иммунный ответ (например, рестриктированный по HLA-DR4 ответ), предусматривающий воздействие на описанную в настоящем документе мышь предполагаемого антигена и измерение антигенспецифического рестриктированного по HLA-DR (например, рестриктированного по HLA-DR4) иммунного ответа у мыши. Согласно другому аспекту предусматривается способ определения, причем предполагаемый антиген содержит эпитоп, который при воздействии на иммунную систему человека, будет вызывать рестриктированный по HLA-DQ ответ.

Также предусматривается способ получения антител к антигену, например, антигену, происходящему из бактерии, паразита и т.д., презентированному в сочетании с комплексом MHC II человека, предусматривающий воздействие на описанную в настоящем документе мышь антигеном, предоставлении мыши возможности развить иммунный ответ, причем иммунный ответ включает продукцию антител, и выделение антитела, которой распознает антиген, презентированный в сочетании с комплексом MHC II человека. Согласно одному варианту осуществления для получения антител к комплексу пептид-MHC II гуманизированную в отношении MHC II мышь иммунизируют с помощью иммуногена пептид-MHC II.

Согласно одному аспекту предусматривается способ идентификации вариабельного домена T-клеточного рецептора, который распознает антиген, презентированный в сочетании с MHC II (например, опухолевый антиген человека, вакцина и т.д.), предусматривающий воздействие на мышь, содержащую описанный в настоящем документе гуманизированный комплекс MHC II, антигеном, предоставлении мыши возможности развить иммунный ответ и выделение из мыши последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельный домен Т-клеточного рецептора, который связывает рестриктированный по MHC II антиген. Согласно одному варианту осуществления антиген презентируется в сочетании с гуманизированным MHC II (например, эктодоменом HLA II человек/трансмембранным и/или цитоплазматическим доменом MHC II мыши).

Последствие взаимодействия между T-клеткой и АПК, представляющей пептид в сочетании с MHC II (например, эктодоменом HLA II человека/трансмембранным и/или цитоплазматическим доменом MHC II мыши), может быть измерено с помощью ряда методов, известных в настоящей области техники, например, с помощью анализов T-клеточной пролиферации, анализов высвобождения цитокинов и т.д.

В дополнение к способности идентифицировать антигены и их T-клеточные эпитопы из патогенов или новообразований, генетически модифицированные животные по настоящему изобретению могут использоваться для идентификации аутоантигенов, имеющих отношение к аутоиммунному заболеванию человека, и для других исследований прогрессирования аутоиммунного заболевания человека. Известно, что полиморфизмы в пределах локусов HLA играют роль в предрасположенности к аутоиммунному заболеванию человека. Действительно установили, что специфические полиморфизмы в локусах HLA-DR и HLA-DQ коррелируют с развитием ревматоидного артрита, диабета I типа, тиреоидита Хашимото, рассеянного склероза, тяжелой миастении, диффузного токсического зоба, системной красной волчанки, глютеновой болезни, болезни Крона, язвенного колита и других аутоиммунных нарушений. Смотрите, например, Wong and Wen (2004) What can the HLA transgenic mouse tell us about autoimmune diabetes?, Diabetologia 47:1476-87; Taneja and David (1998) HLA Transgenic Mice as Humanized Mouse Models of Disease and Immunity, J. Clin. Invest. 101:921-26; Bakker et al. (2006), ранее; и International MHC and Autoimmunity Genetics Network (2009) Mapping of multiple susceptibility variants within the MHC region for 7 immune-mediated diseases, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106:18680-85.

Таким образом, способы получения описанных в настоящем документе гуманизированных в отношении комплекса MHC II животных могут использоваться для введения молекул MHC II, которые, как полагают, связаны с конкретными аутоиммунными заболеваниями человека, и может изучаться прогрессирование аутоиммунного заболевания человека. Кроме того, описанные в настоящем документе не являющиеся человеком животные могут использоваться для разработки животных моделей аутоиммунного заболевания человека. Мыши согласно настоящему изобретению, несущие описанные в настоящем документе гуманизированные белки MHC II, могут использоваться для идентификации потенциальных аутоантигенов, для картирования эпитопов, вовлеченных в прогрессирование заболевания, и для разработки стратегий для модулирования аутоиммунных заболеваний.

Кроме того, описанные в настоящем документе генетически модифицированные животные могут использоваться в изучении аллергического ответа человека. Поскольку аллергические ответы, вероятно, связаны с аллелями MHC II, описанные в настоящем документе генетически модифицированные животные могут использоваться для определения рестрикции по HLA специфического в отношении аллергена T-клеточного ответа и для разработки стратегий борьбы с аллергическим ответом.

Примеры

Настоящее изобретение будет дополнительно проиллюстрированы представленными ниже не ограничивающими примерами. Эти примеры представлены для содействия в понимании настоящего изобретения, но не предусмотрены для ограничения и не должны рассматриваться как ограничивающие его объем каким-либо образом. Примеры не включают подробные описания общепринятых методов, которые будут хорошо известны специалистам в настоящей области техники (методы молекулярного клонирования и т.д.). Если не указано иное, части представляют собой части по весу, молекулярный вес представляет собой средний молекулярный вес, температура указана в градусах Цельсия и давление равно или близко атмосферному.

Пример 1. Делеция эндогенных локусов H-2A и H-2E MHC II класса

Нацеливающий вектор для введения делеции эндогенных генов MHC II класса H-2Ab1, H-2Aa, H-2Eb1, H-2Eb2 и H-2Ea получали с использованием технологии генной инженерии VELOCIGENE® (смотрите, например, патент США № 6586251 и Valenzuela et al., ранее). Бактериальную искусственную хромосомную (BAC) RP23-458i22 (Invitrogen) ДНК модифицировали для удаления эндогенных генов MHC II класса H-2Ab1, H-2Aa, H-2Eb1, H-2Eb2 и H-2Ea.

Кратко, плечи гомологии против хода транскрипции и по ходу транскрипции получали с помощью ПЦР BAC ДНК мыши из положений 5' гена H-2Ab1 и 3' гена H-2Ea, соответственно. Как показано на фиг. 5, эти плечи гомологии использовали для получения кассеты, которая удаляла ~79 т.п.н. RP23-458i22, содержащей гены H-2Ab1, H-2Aa, H-2Eb1, H-2Eb2 и H-2Ea локуса MHC II класса с помощью бактериальной гомологичной рекомбинации (BHR). Эту область замещали кассетой гигромицина, фланкированной сайтами lox66 и lox71. Конечный нацеливающий вектор в направлении 5' - 3' включал в себя плечо гомологии длиной 34 т.п.н., содержащее геномную последовательность мыши 5' в отношении гена H-2Ab1 эндогенного локуса MHC II класса, 5' сайт lox66, кассету гигромицина, 3' сайт lox71 и плечо гомологии длиной 63 т.п.н., содержащее геномную последовательность мыши 3' по отношению к гену H-2Ea эндогенного локуса MHC II класса (MAID 5111, смотрите фиг. 5).

Нацеливающий вектор BAC ДНК (описанный выше) использовали для электропорации ES клеток мыши для получения модифицированных ES клеток, содержащих делецию эндогенного локуса MHC II класса. Положительные ES клетки, содержащие подвергнутый делеции эндогенный локус MHC II класса идентифицировали с помощью анализа количественной ПЦР с использованием зондов TAQMAN™ (Lie and Petropoulos (1998) Curr. Opin. Biotechnology 9:43-48). Область против хода транскрипции подвергнутого делеции локуса подтверждали с помощью ПЦР с использованием праймеров 5111U F (CAGAACGCCAGGCTGTAAC; SEQ ID NO:1) и 5111U R (GGAGAGCAGGGTCAGTCAAC; SEQ ID NO:2) и зонда 5111U P (CACCGCCACTCACAGCTCCTTACA; SEQ ID NO:3), тогда как область по ходу транскрипции подвергнутого делеции локуса подтверждали с использованием праймеров 5111D F (GTGGGCACCATCTTCATCATTC; SEQ ID NO:4) и 5111D R (CTTCCTTTCCAGGGTGTGACTC; SEQ ID NO:5) и зонда 5111D P (AGGCCTGCGATCAGGTGGCACCT; SEQ ID NO:6). Присутствие кассеты гигромицина из нацеливающего вектора подтверждали с использованием праймеров HYGF (TGCGGCCGATCTTAGCC; SEQ ID NO:7) и HYGR (TTGACCGATTCCTTGCGG; SEQ ID NO:8) и зонда HYGP (ACGAGCGGGTTCGGCCCATTC; SEQ ID NO:9). Нуклеотидная последовательность, охватывающая точку делеции против хода транскрипции (SEQ ID NO:10), включала в себя следующее, что показывает эндогенную мышиную последовательность против хода транскрипции по отношению к точке делеции (которая находится в скобках ниже), соединенную смежным образом с последовательностью кассеты, присутствующей в точке делеции: (TTTGTAAACA AAGTCTACCC AGAGACAGAT GACAGACTTC AGCTCCAATG CTGATTGGTT CCTCACTTGG GACCAACCCT) CTCGAGTACC GTTCGTATAA TGTATGCTAT ACGAAGTTAT ATGCATCCGG GTAGGGGAGG. Нуклеотидная последовательность, охватывающая точку делеции по ходу транскрипции (SEQ ID NO:11), включала в себя следующее, что показывает последовательность кассеты, смежную с эндогенной мышиной последовательностью по ходу транскрипции по отношению к точке делеции (которая содержится в скобках ниже): CCTCGACCTG CAGCCCTAGG ATAACTTCGT ATAATGTATG CTATACGAAC GGTAGAGCTC (CACAGGCATT TGGGTGGGCA GGGATGGACG GTGACTGGGA CAATCGGGAT GGAAGAGCAT AGAATGGGAG TTAGGGAAGA). Положительные ES клеточные клоны затем использовали для имплантации самкам мышей с использованием способа VELOCIMOUSE® (описанного ниже) для получения помета детенышей, содержащих делецию эндогенного локуса MHC II класса.

Описанные выше нацеленные ES клетки использовали в качестве донорных ES клеток и вводили в зародыш мыши на стадии 8 клеток с помощью способа VELOCIMOUSE® (смотрите, например, патент США № 7294754 и Poueymirou et al. (2007) F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses, Nature Biotech. 25(1):91-99). Мышей, несущих делецию генов H-2Ab1, H-2Aa, H-2Eb1, H-2Eb2 и H-2Ea в эндогенном локусе MHC II класса, идентифицировали путем генотипирования с использованием модификации аллельного анализа (Valenzuela et al., ранее), который обнаруживал присутствие кассеты гигромицина и подтверждал отсутствие эндогенных последовательностей MHC II класса.

Мышей, несущих делецию генов H-2Ab1, H-2Aa, H-2Eb1, H-2Eb2 и H-2Ea в эндогенном локусе MHC II класса, могут скрещивать с Cre-детекторным штаммом мышей (смотрите, например, публикацию международной патентной заявки № WO 2009/114400) для удаления какой-либо фланкированной сайтами lox кассеты гигромицина, введенной с помощью нацеливающего вектора, которая не удалена, например, на стадии ES клеток или у зародыша. Необязательно, у мышей сохраняют кассету гигромицина.

Пример 2. Получение большого нацеливающего вектора (LTVEC), содержащего гуманизированные гены H-2Eb1 и H-2Ea

Нацеливающий вектор для введения гуманизированных последовательностей MHC II разрабатывали, как показано на фиг. 4. с использованием технологии генной инженерии VELOCIGENE®, ДНК бактериальной искусственной хромосомы (BAC) RP23-458i22 модифицировали на различных стадиях для: (1) создания вектора, содержащего функциональный I-E α экзон 1 из гена BALB/c H-2Ea (ФИГ. 4A); (2) создания вектора, содержащего замещение экзонов 2 и 3 гена β I-E мыши экзонами из DRβ1*04 человека и замещение экзонов 2 и 3 α I-E мыши экзонами DRα1*01 человека (фиг. 4B); (3) создания вектора, несущего экзоны 2 и 3 DRβ1*04 человека среди остальных I-E β экзонов мыши, и экзоны 2 и 3 DRα1*01 человека среди остальных I-E α экзонов мыши, включая в себя функциональный I-E α экзон 1 из BALB/c мыши (стадия (1) (фиг. 4C); и (4) удаления скрытого сайта сплайсинга в векторе, созданном в (3) (фиг. 4D).

В частности, поскольку у мышей C57Bl/6 I-E α ген представляет собой псевдоген вследствие присутствия нефункционального экзона 1, вначале создавали вектор, содержащий функциональный I-E α экзон 1 из гена BALB/c H-2Ea (фиг. 4A). RP23-458i22 BAC модифицировали с помощью бактериальной гомологичной рекомбинации (1.BHR) для замещения гена устойчивости к хлорамфениколу на ген устойчивости к спектромицину. Полученный вектор дополнительно модифицировали с помощью BHR для замещения полной I-A и I-E кодирующей области на кассету неомицина, фланкированную сайтами рекомбинации (2.BHR). Другой цикл BHR (3. BHR) с конструкцией, содержащей экзон, кодирующий BALB/c I-Eα лидерную последовательность (экзон 1) и ген устойчивости к хлорамфениколу, фланкированный сайтами рестрикции PI-SceI и I-CeuI, давал в результате вектор, содержащий функциональный экзон 1 BALB/c H-2Ea.

Независимо, для создания вектора, содержащего замещение экзонов 2 и 3 I-E β гена мыши экзонами DRβ1*04 человека и замещение экзонов 2 и 3 I-E α мыши экзонами DRα1*01 человека, RP23-458i22 BAC модифицировали посредством нескольких стадий гомологичной рекомбинации, 4. BHR - 8. BHR (фиг. 4B). Полученную последовательность нуклеиновой кислоты фланкировали сайтами рестрикции PI-SceI/I-CeuI для обеспечения лигирования в конструкцию, несущую экзон 1 BALB/c I-Eα, упомянутый выше (фиг. 4C).

Последовательность конечной конструкции, изображенной на фиг. 4C, содержала скрытый сайт сплайсинга на 3'-конце интрона BALB/c. Несколько стадий BHR (11. BHR - 12. BHR) с последующей стадией делеции проводили для получения конечного нацеливающего вектора (MAID 1680), который использовали для электропорации в ES клетки (фиг. 4D).

Подробно, конечный нацеливающий вектор (MAID 1680), в направлении 5' - 3', состоял из 5' мышиного плеча гомологии, состоящего из ~26 т.п.н. мышиной геномной последовательности, заканчивающейся сразу выше против хода транскрипции по отношению к гену H-2Ab1 эндогенного локуса MHC II класса; вставки ~59 т.п.н., содержащей гуманизированный ген MHC II β цепи (гуманизированный ген H-2Eb1) и гуманизированный ген MHC II α цепи (гуманизированный ген H-2Ea) и фланкированную flox кассету неомицина; и 3' мышиного плеча гомологии, состоящей из ~57 т.п.н. мышиной геномной последовательности, начинающейся сразу ниже по ходу транскрипции по отношению к гену H-2Ea эндогенного локуса MHC II класса. Нуклеотидная последовательность, охватывающая соединение между 5' плечом и вставкой (SEQ ID NO:12), включала в себя следующее: (TGCTGATTGG TTCCTCACTT GGGACCAACC C) TAAGCTTTA TCTATGTCGG GTGCGGAGAA AGAGGTAATG AAATGGCACA AGGAGATCAC ACACCCAAAC CAAACTCGCC, где последовательность, выделенная курсивом, представляет собой уникальный сайт PI-SceI, и мышиная геномная последовательность в 5' плече гомологии представлена в скобках. Нуклеотидная последовательность, охватывающая соединение между вставкой и 3' плечом (SEQ ID NO:13), включала в себя следующее: CACATCAGTG AGGCTAGAAT AAATTAAAAT CGCTAATATG AAAATGGGG (ATTTGTACCT CTGAGTGTGA AGGCTGGGAA GACTGCTTTC AAGGGAC), где мышиная геномная последовательность в 3' плече гомологии представлена в скобках.

В пределах вставки ~59 т.п.н. ген H-2Eb1 модифицировали следующим образом: 5136 п.н. область H-2Eb1, включающую в себя последние 153 п.н. интрона 1, экзон 2, интрон 2, экзон 3 и первые 22 п.н. интрона 3, замещали 3111 п.н. гомологичной областью HLA-DRB1*04 человека, включающей в себя последние 148 п.н. интрона 1, экзон 2, интрон 2, экзон 3 и первые 132 п.н. интрона 3. На соединении между последовательностями человека и мыши интрона 3, вводили кассету, состоящую из сайта 5' lox2372, промотора UbC, гена устойчивости к неомицину и сайта 3' lox2372. Полученный ген кодировал химерный белок HLA-DRB1*04/H-2Eb1, состоящий из H-2Eb1 лидерной последовательности мыши, β1 и β2 доменов человека из DRB1*04 и мышиного трансмембранного домена и цитоплазматического хвоста. Нуклеотидная последовательность, охватывающая соединение последовательностей мыши/человека в интроне 1 (SEQ ID NO:14), включала в себя следующее: (TCCATCACTT CACTGGGTAG CACAGCTGTA ACTGTCCAGC CTG) GGTACCGAGC TCGGATCCAC TAGTAACGGC CGCCAGTGTG CTGGAATTC GCCCTTGATC GAGCTCCCTG GGCTGCAGGT GGTGGGCGTT GCGGGTGGGG CCGGTTAA, где последовательность, выделенная курсивом, представляет собой сайт множественного клонирования, введенный в ходе стадий клонирования, и последовательности интрона 1 мыши представлены в скобках. Нуклеотидная последовательность, охватывающая соединение между интроном 3 человека и кассетой неомицина (SEQ ID NO:15), включала в себя следующее: (ATCTCCATCA GAAGGGCACC GGT) ATAACTT CGTATAAGGT ATCCTATACG AAGTTATATG CATGGCCTCC GCGCCGGGTT, где сайт 5' lox2372 представлен курсивом, и последовательность интрона 3 человека представлена в скобках. Нуклеотидная последовательность, охватывающая соединение между кассетой неомицина и интроном 3 мыши (SEQ ID NO:16), включала в себя следующее: ATAACTTCGT ATAAGGTATC CTATACGAAG TTATCTCGAG (TGGCTTACAG GTAGGTGCGT GAAGCTTCTA CAAGCACAGT TGCCCCCTGG), где сайт 3' lox2372 представлен курсивом, и последовательность интрона 3 мыши представлена в скобках.

Также в пределах вставки длиной ~59 т.п.н. ген H-2Ea модифицировали следующим образом: 1185 п.н. область H-2Ea, включающую в себя последние 101 п.н. интрона 1, экзон 2, интрон 2, экзон 3 и первые 66 п.н. интрона 3, замещали 1189 п.н. гомологичной областью HLA-DRA1*01 человека, включающей в себя последние 104 п.н. интрона 1, экзон 2, интрон 2, экзон 3 и первые 66 п.н. интрона 3. Как описано выше, поскольку экзон 1 аллеля C57BL/6 H-2Ea содержит делецию, которая делает ген нефункциональным, экзон 1 H-2Ea и оставшуюся часть интрона 1 замещали эквивалентной 2616 п.н. областью из аллеля BALB/c H-2Ea, который является функциональным. Полученный ген кодировал химерный белок H-2Ea/HLA-DRA1*01, состоящий из H-2Ea лидерной последовательности мыши из BALB/c, α1 и α2 доменов человека из DRA1*01 и мышиного трансмембранного домена и цитоплазматического хвоста. Нуклеотидная последовательность, охватывающая соединение последовательностей мыши/человека в интроне 1 (SEQ ID NO:17), включала в себя следующее: (CTGTTTCTTC CCTAACTCCC ATTCTATGCT CTTCCATCCC GA) CCGCGGCCCA ATCTCTCTCC ACTACTTCCT GCCTACATGT ATGTAGGT, где последовательность, выделенная курсивом, представляет собой сайт фермента рестрикции, введенный в ходе стадий клонирования, и последовательности интрона 1 BALB/c представлены в скобках. Нуклеотидная последовательность, охватывающая соединение последовательностей человека/мыши в интроне 3 (SEQ ID NO:18), включала в себя следующее: CAAGGTTTCC TCCTATGATG CTTGTGTGAA ACTCGGGGCC GGCC (AGCATTTAAC AGTACAGGGA TGGGAGCACA GCTCAC), где последовательность, выделенная курсивом, представляет собой сайт фермента рестрикции, введенный в ходе стадий клонирования, и последовательности интрона 3 мыши представлены в скобках. Нуклеотидная последовательность, охватывающая соединение C57BL/6-BALB/c 5' от экзона 1 (SEQ ID NO:19), включала в себя следующее: (GAAAGCAGTC TTCCCAGCCT TCACACTCAG AGGTACAAAT) CCCCATTTTC ATATTAGCGA TTTTAATTTA TTCTAGCCTC, где C57BL/6-специфические последовательности представлены в скобках. Нуклеотидная последовательность, охватывающая соединение BALB/c-C57BL/6 3' от экзона 1 (SEQ ID NO:20), включала в себя следующее: TCTTCCCTAA CTCCCATTCT ATGCTCTTCC ATCCCGA CCG CGG (CCCAATC TCTCTCCACT ACTTCCTGCC TACATGTATG), где сайт рекстрикции SacII представлен курсивом, а последовательности C57BL/6 представлены в скобках.

Пример 3. Получение гуманизированных в отношении MHC II мышей

Упрощенные диаграммы стратегии получения гуманизированных в отношении MHC II мышей с использованием вектора из примера 2 представлены на фигурах 5 и 8.

В частности, BAC ДНК MAID1680 (описанную выше) использовали для электропорации MAID5111 ES клеток для создания модифицированных ES клеток, содержащих замещение эндогенных локусов I-A и I-E мыши геномным фрагментом, содержащим химерный локус DR4 человека/ I-E мыши. Положительные ES клетки, содержащие подвергнутые делеции эндогенные локусы I-A и I-E, замещенные геномным фрагментом, содержащим химерный локус DR4 человека/ I-E мыши, идентифицировали с помощью анализа количественной ПЦР с использованием зондов TAQMAN™ (Lie and Petropoulos, ранее). Вставку последовательностей DRα человека подтверждали с помощью ПЦР с использованием праймеров hDRA1F (CTGGCGGCTTGAAGAATTTGG; SEQ ID NO:21), hDRA1R (CATGATTTCCAGGTTGGCTTTGTC; SEQ ID NO:22) и зонда hDRA1P (CGATTTGCCAGCTTTGAGGCTCAAGG; SEQ ID NO:23). Вставку последовательностей DRβ человека подтверждали с помощью ПЦР с использованием праймеров hDRB1F (AGGCTTGGGTGCTCCACTTG; SEQ ID NO:24), hDRB1R (GACCCTGGTGATGCTGGAAAC; SEQ ID NO:25) и зонда hDRB1P (CAGGTGTAAACCTCTCCACTCCGAGGA; SEQ ID NO:26). Потерю кассеты гигромицина из нацеливающего вектора подтверждали с помощью праймеров HYGF (TGCGGCCGATCTTAGCC; SEQ ID NO:7) и HYGR (TTGACCGATTCCTTGCGG; SEQ ID NO:8) и зонда HYGP (ACGAGCGGGTTCGGCCCATTC; SEQ ID NO:9).

Положительные ES клеточные клоны затем использовали для имплантации самкам мышей с использованием способа VELOCIMOUSE® (ранее) для получения помета детенышей, содержащих замещение эндогенных локусов I-A и I-E химерным локусом DR4 человека/ I-E мыши. Описанные выше нацеленные ES клетки использовали в качестве донорных ES клеток и вводили в зародыш мыши на стадии 8 клеток с помощью способа VELOCIMOUSE®. Мышей, несущих химерный локус DR4 человека/ I-E мыши, идентифицировали путем генотипирования с использованием модификации аллельного анализа (Valenzuela et al., ранее), который обнаруживает присутствие химерного локуса DR4 человека/ I-E мыши.

Мышей, несущих химерный локус DR4 человека/ I-E мыши, могут скрестить с Cre-детекторным штаммом мышей (смотрите, например, публикацию международной патентной заявки № WO 2009/114400) для удаления какой-либо фланкированной lox кассеты неомицина, введенной с помощью нацеливающего вектора, которая не удалена, например, на стадии ES клеток или у зародыша (смотрите фиг. 6).

Пример 4. Экспрессия химерного HLA-DR4 у генетически модифицированных мышей

Селезенки от мышей дикого типа (WT) или гетерозиготных гуманизированных HLA-DR4 мышей (“1681 HET”) перфузировали Collagenase D (Roche Bioscience) и эритроциты лизировали с помощью лизирующего буфера ACK. Спленоциты культивировали в течение двух дней с помощью 25 мкг/мл поли(I:C) для стимуляции экспрессии генов MHC-II Экспрессию HLA-DR4 человека на клеточной поверхности анализировали с помощью FACS с использованием конъюгированного с флуорохромом антитела к CD3 (17A2), антитела к CD19 (1D3), антитела к CD11c (N418), антитела к F480 (BM8), антитела к I-A/I-E (M15) и антитела к HLADR (L243). Проточную цитометрию проводили с использованием BD-LSRII. Экспрессия HLA-DR4 человека была ясно обнаруживаемой на поверхности CD19+ B-клеток и в значительной степени положительно регулировалась при стимуляции агонистом toll-подобного рецептора поли(I:C) (смотрите фиг. 9).

Эквиваленты

Специалистам в настоящей области техники будут понятны, или с использованием не более чем рутинного экспериментирования они смогут установить многие эквиваленты описанных в настоящем документе конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения. Предусматривается, что такие эквиваленты включены в представленную ниже формулу изобретения.

Полное содержание всех процитированных в настоящей заявке непатентных документов, патентных заявок и патентов полностью включено посредством ссылки в настоящем документе.

В частных аспектах настоящее изобретение может относиться к следующим вариантам:

Вариант 1. Не являющееся человеком животное, содержащее на эндогенном локусе гена α главного комплекса гистосовместимости II (MHC II) нуклеотидную последовательность, кодирующую химерный человеческий/не относящийся к человеку полипептид α MHC II,

причем человеческая часть химерного человеческого/не относящегося к человеку полипептида α MHC II содержит внеклеточный домен α MHC II человека, и

причем животное экспрессирует функциональный комплекс MHC II на поверхности клетки животного.

Вариант 2. Животное согласно варианту 1, у которого внеклеточный домен α MHC II человека содержит домены α1 и α2 человека.

Вариант 3. Животное согласно варианту 1, у которого нуклеотидная последовательность экспрессируется под регуляторным контролем эндогенных не относящихся к человеку α промоторных и регуляторных элементов MHC II.

Вариант 4. Животное согласно варианту 1, у которого не относящаяся к человеку часть химерного человеческого/не относящегося к человеку полипептида α MHC II содержит трансмембранный и цитоплазматический домены эндогенного не относящегося к человеку полипептида α MHC II.

Вариант 5. Животное согласно варианту 1, у которого человеческая часть химерного человеческого/не относящегося к человеку полипептида α MHC II происходит из белка HLA II класса человека, выбранного из группы, состоящей из HLA-DR, HLA-DQ и HLA-DP.

Вариант 6. Животное согласно варианту 5, у которого человеческая часть химерного человеческого/не относящегося к человеку полипептида α MHC II происходит из белка HLA-DR4 человека.

Вариант 7. Животное согласно варианту 1, которое представляет собой грызуна.

Вариант 8. Грызун согласно варианту 7, который представляет собой мышь.

Вариант 9. Животное согласно варианту 1, которое дополнительно содержит на эндогенном локусе гена β MHC II нуклеотидную последовательность, кодирующую химерный человеческий/не относящийся к человеку полипептид β MHC II.

Вариант 10. Не являющееся человеком животное, содержащее на эндогенном локусе гена β MHC II нуклеотидную последовательность, кодирующую химерный человеческий/не относящийся к человеку полипептид β MHC II,

причем человеческая часть химерного человеческого/не относящегося к человеку полипептида β MHC II содержит внеклеточный домен β MHC II человека, и

причем животное экспрессирует функциональный комплекс MHC II на поверхности клетки животного.

Вариант 11. Животное согласно варианту 10, у которого внеклеточный домен β MHC II человека содержит домены β1 и β2 человека.

Вариант 12. Животное согласно варианту 10, у которого нуклеотидная последовательность экспрессируется под регуляторным контролем эндогенных не относящихся к человеку β промоторных и регуляторных элементов MHC II.

Вариант 13. Животное согласно варианту 10, у которого не относящаяся к человеку часть химерного человеческого/не относящегося к человеку полипептида β MHC II содержит трансмембранный и цитоплазматический домены эндогенного не относящийся к человеку полипептида β MHC II.

Вариант 14. Животное согласно варианту 10, у которого человеческая часть химерного человеческого/не относящегося к человеку полипептида β MHC II происходит из белка HLA II класса человека, выбранного из группы, состоящей из HLA-DR, HLA-DQ и HLA-DP.

Вариант 15. Животное согласно варианту 14, у которого человеческая часть химерного человеческого/не относящегося к человеку полипептида β MHC II происходит из белка HLA-DR4 человека.

Вариант 16. Животное согласно варианту 10, которое представляет собой грызуна.

Вариант 17. Грызун согласно варианту 16, который представляет собой мышь.

Вариант 18. Животное согласно варианту 10, которое дополнительно содержит на эндогенном локусе гена α MHC II нуклеотидную последовательность, кодирующую химерный человеческий/не относящийся к человеку полипептид α MHC II.

Вариант 19. Грызун, содержащий на эндогенном локусе гена MHC II первую нуклеотидную последовательность, кодирующую химерный человеческий/относящийся к грызуну полипептид α MHC II, и вторую нуклеотидную последовательность, кодирующую химерный человеческий/относящийся к грызуну полипептид β MHC II,

причем человеческая часть химерного человеческого/относящегося к грызуну полипептида α MHC II содержит внеклеточный домен α MHC II человека, и человеческая часть химерного человеческого/относящегося к грызуну полипептида β MHC II содержит внеклеточный домен β MHC II человека, и

причем химерные человеческие/относящиеся к грызуну полипептиды α и β MHC II образуют функциональный комплекс MHC II на поверхности клетки грызуна.

Вариант 20. Грызун согласно варианту 19, у которого внеклеточный домен α MHC II человека содержит домены α1 и α2 человека.

Вариант 21. Грызун согласно варианту 19, у которого внеклеточный домен β MHC II человека содержит домены β1 и β2 человека.

Вариант 22. Грызун согласно варианту 19, у которого первая нуклеотидная последовательность экспрессируется под регуляторным контролем эндогенных α промоторных и регуляторных элементов MHC II грызуна, и вторая нуклеотидная последовательность экспрессируется под регуляторным контролем эндогенных β промоторных и регуляторных элементов MHC II грызуна.

Вариант 23. Грызун согласно варианту 19, у которого относящаяся к грызуну часть химерного человеческого/относящегося к грызуну полипептида α MHC II содержит трансмембранный и цитоплазматический домены эндогенного полипептида α MHC II грызуна.

Вариант 24. Грызун согласно варианту 19, у которого относящаяся к грызуну часть химерного человеческого/относящегося к грызуну полипептида β MHC II содержит трансмембранный и цитоплазматический домены эндогенного полипептида β MHC II грызуна.

Вариант 25. Грызун согласно варианту 19, у которого человеческие части химерных человеческих/относящихся к грызуну полипептидов α и β MHC II происходят из белка HLA II класса человека, выбранного из группы, состоящей из HLA-DR, HLA-DQ и HLA-DP.

Вариант 26. Грызун согласно варианту 25, у которого человеческие части химерных человеческих/относящихся к грызуну полипептидов α и β MHC II происходят из белка HLA-DR4 человека.

Вариант 27. Грызун согласно варианту 19, который представляет собой мышь.

Вариант 28. Мышь согласно варианту 27, у которой относящиеся к грызуну части химерных полипептидов α и β MHC II происходят из белка H-2E мыши.

Вариант 29. Грызун согласно варианту 19, который не экспрессирует функциональные эндогенные полипептиды MHC II из их эндогенных локусов MHC II грызуна.

Вариант 30. Мышь, содержащая на эндогенном локусе MHC II мыши первую нуклеотидную последовательность, кодирующую химерный человеческий/мышиный полипептид α MHC II, и вторую нуклеотидную последовательность, кодирующую химерный человеческий/мышиный полипептид β MHC II,

причем человеческая часть химерного полипептида α MHC II содержит внеклеточный домен, происходящий из полипептида α белка HLA-DR4 человека, и человеческая часть химерного полипептида β MHC II содержит внеклеточный домен, происходящий из полипептида β белка HLA-DR4 человека,

причем мышиная часть химерного полипептида α MHC II содержит трансмембранный и цитоплазматический домены цепи α H-2E мыши, и мышиная часть химерного полипептида β MHC II содержит трансмембранный и цитоплазматический домены цепи β H-2E мыши,

и причем мышь экспрессирует функциональный химерный HLA-DR4/H-2E комплекс MHC II на поверхности клетки мыши.

Вариант 31. Мышь согласно варианту 30, у которой внеклеточный домен полипептида α содержит домены α1 и α2 человека.

Вариант 32. Мышь согласно варианту 30, у которой внеклеточный домен полипептида β содержит домены β1 и β2 человека.

Вариант 33. Мышь согласно варианту 30, у которой первая нуклеотидная последовательность экспрессируется под регуляторным контролем эндогенных α промоторных и регуляторных элементов MHC II мыши, и вторая нуклеотидная последовательность экспрессируется под регуляторным контролем эндогенных β промоторных и регуляторных элементов MHC II мыши.

Вариант 34. Мышь согласно варианту 30, которая не экспрессирует функциональные эндогенные полипептиды MHC II из их эндогенных локусов мыши.

Вариант 35. Способ модификации локуса MHC II мыши для экспрессии химерного человеческого/мышиного комплекса MHC II, предусматривающий замещение на эндогенном локусе MHC II мыши нуклеотидной последовательности, кодирующей комплекс MHC II мыши, нуклеотидной последовательностью, кодирующей химерный человеческий/мышиный комплекс MHC II.

Вариант 36. Способ согласно варианту 35, в котором нуклеотидная последовательность, кодирующая химерный человеческий/мышиный комплекс MHC II, содержит первую нуклеотидную последовательность, кодирующую внеклеточный домен полипептида α MHC II человека и трансмембранный и цитоплазматический домены полипептида α MHC II мыши, и вторую нуклеотидную последовательность, кодирующую внеклеточный домен полипептида β MHC II человека и трансмембранный и цитоплазматический домены полипептида β MHC II мыши.

Вариант 37. Способ согласно варианту 35, в котором человеческая часть химерного комплекса MHC II происходит из белка HLA II класса человека, выбранного из группы, состоящей из HLA-DR, HLA-DQ и HLA-DP.

Вариант 38. Способ согласно варианту 35, в котором мышиная часть химерного комплекса MHC II происходит из белка H-2E мыши, а человеческая часть химерного комплекса MHC II происходит из белка HLA-DR4 человека.

Вариант 39. Способ согласно варианту 36, в котором человеческие части химерных полипептидов α и β MHC II происходят из белка HLA II класса человека, выбранного из группы, состоящей из HLA-DR, HLA-DQ и HLA-DP.

Вариант 40. Способ согласно варианту 36, в котором мышиные части химерных полипептидов α и β MHC II происходят из белка H-2E мыши, а человеческие части химерных полипептидов α и β MHC II происходят из белка HLA-DR4 человека.

Вариант 41. Способ согласно варианту 35, в котором замещение проводят в одной ES клетке, и одну ES клетку вводят в зародыш мыши для получения мыши.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc.

<120> ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫЕ МЫШИ, ЭКСПРЕССИРУЮЩИЕ ХИМЕРНЫЕ МОЛЕКУЛЫ ГЛАВНОГО

КОМПЛЕКСА ГИСТОСОВМЕСТИМОСТИ

<130> 1210A-WO

<140> To be assigned

<141> Filed herewith

<150> 61/552,584

<151> 2011-10-28

<160> 26

<170> FastSEQ for Windows Version 4.0

<210> 1

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 1

cagaacgcca ggctgtaac 19

<210> 2

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 2

ggagagcagg gtcagtcaac 20

<210> 3

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 3

caccgccact cacagctcct taca 24

<210> 4

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 4

gtgggcacca tcttcatcat tc 22

<210> 5

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 5

cttcctttcc agggtgtgac tc 22

<210> 6

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 6

aggcctgcga tcaggtggca cct 23

<210> 7

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 7

tgcggccgat cttagcc 17

<210> 8

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 8

ttgaccgatt ccttgcgg 18

<210> 9

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 9

acgagcgggt tcggcccatt c 21

<210> 10

<211> 140

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 10

tttgtaaaca aagtctaccc agagacagat gacagacttc agctccaatg ctgattggtt 60

cctcacttgg gaccaaccct ctcgagtacc gttcgtataa tgtatgctat acgaagttat 120

atgcatccgg gtaggggagg 140

<210> 11

<211> 140

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 11

cctcgacctg cagccctagg ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaac ggtagagctc 60

cacaggcatt tgggtgggca gggatggacg gtgactggga caatcgggat ggaagagcat 120

agaatgggag ttagggaaga 140

<210> 12

<211> 110

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 12

tgctgattgg ttcctcactt gggaccaacc ctaagcttta tctatgtcgg gtgcggagaa 60

agaggtaatg aaatggcaca aggagatcac acacccaaac caaactcgcc 110

<210> 13

<211> 96

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 13

cacatcagtg aggctagaat aaattaaaat cgctaatatg aaaatgggga tttgtacctc 60

tgagtgtgaa ggctgggaag actgctttca agggac 96

<210> 14

<211> 150

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 14

tccatcactt cactgggtag cacagctgta actgtccagc ctgggtaccg agctcggatc 60

cactagtaac ggccgccagt gtgctggaat tcgcccttga tcgagctccc tgggctgcag 120

gtggtgggcg ttgcgggtgg ggccggttaa 150

<210> 15

<211> 80

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 15

atctccatca gaagggcacc ggtataactt cgtataaggt atcctatacg aagttatatg 60

catggcctcc gcgccgggtt 80

<210> 16

<211> 90

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 16

ataacttcgt ataaggtatc ctatacgaag ttatctcgag tggcttacag gtaggtgcgt 60

gaagcttcta caagcacagt tgccccctgg 90

<210> 17

<211> 90

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 17

ctgtttcttc cctaactccc attctatgct cttccatccc gaccgcggcc caatctctct 60

ccactacttc ctgcctacat gtatgtaggt 90

<210> 18

<211> 80

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 18

caaggtttcc tcctatgatg cttgtgtgaa actcggggcc ggccagcatt taacagtaca 60

gggatgggag cacagctcac 80

<210> 19

<211> 80

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 19

gaaagcagtc ttcccagcct tcacactcag aggtacaaat ccccattttc atattagcga 60

ttttaattta ttctagcctc 80

<210> 20

<211> 80

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 20

tcttccctaa ctcccattct atgctcttcc atcccgaccg cggcccaatc tctctccact 60

acttcctgcc tacatgtatg 80

<210> 21

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 21

ctggcggctt gaagaatttg g 21

<210> 22

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 22

catgatttcc aggttggctt tgtc 24

<210> 23

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 23

cgatttgcca gctttgaggc tcaagg 26

<210> 24

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 24

aggcttgggt gctccacttg 20

<210> 25

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 25

gaccctggtg atgctggaaa c 21

<210> 26

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 26

caggtgtaaa cctctccact ccgagga 27

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к нуклеиновой кислоте, содержащей экзон 2 и экзон 3 гена α антигена лейкоцита человека (HLA) II класса, функционально связанные с экзоном 4 гена α МНС II грызуна, причем ген α МНС II грызуна представляет собой ген α МНС II крысы или мыши и/или ii) экзон 2 и экзон 3 гена β HLA II класса, функционально связанные с экзоном 4 и экзоном 5 гена β МНС II грызуна, причем ген β МНС II грызуна представляет собой ген β МНС II крысы или мыши, а также к клетке, ее содержащей. Изобретение эффективно для экспрессии гуманизированного белка МНС II. 2 н. и 7 з.п. ф-лы, 9 ил., 4 пр.

1. Нуклеиновая кислота для экспрессии гуманизированного белка МНС II, причем нуклеиновая кислота содержит:

i) экзон 2 и экзон 3 гена α антигена лейкоцита человека (HLA) II класса, функционально связанные с экзоном 4 гена α МНС II грызуна, причем ген α МНС II грызуна представляет собой ген α МНС II крысы или мыши и/или

ii) экзон 2 и экзон 3 гена β HLA II класса, функционально связанные с экзоном 4 и экзоном 5 гена β МНС II грызуна, причем ген β МНС II грызуна представляет собой ген β МНС II крысы или мыши.

2. Нуклеиновая кислота по п. 1, где:

(i) ген α МНС II грызуна представляет собой ген α МНС II мыши и

(ii) ген β МНС II грызуна представляет собой ген β МНС II мыши.

3. Нуклеиновая кислота по п. 1 или 2, причем

(i) ген α HLA II класса выбран из группы, состоящей из гена α HLA-DR, гена α HLA-DQ и гена α HLA-DP, и ген α МНС II грызуна представляет собой ген α Н-2Е мыши; и

(ii) ген β цепи МНС II человека выбран из группы, состоящей из гена β HLA-DR, гена β HLA-DQ и гена β HLA-DP, и ген β цепи МНС II грызуна представляет собой ген β Н-2Е мыши.

4. Выделенная клетка грызуна для экспрессии гуманизированного белка МНС II, причем выделенная клетка грызуна содержит нуклеиновую кислоту по любому из пп. 1-3.

5. Выделенная клетка грызуна по п. 4, причем выделенная клетка грызуна представляет собой антигенпрезентирующую клетку, и причем клетка грызуна экспрессирует гуманизированный полипептид МНС II.

6. Выделенная клетка грызуна по п. 4 или 5, причем выделенная клетка грызуна представляет собой В-клетку, макрофаг или дендритную клетку, и причем клетка грызуна экспрессирует гуманизированный полипептид МНС II.

7. Выделенная клетка грызуна по п. 4, причем клетка грызуна представляет собой эмбриональную стволовую клетку грызуна, пригодную для создания генетически модифицированного грызуна, который экспрессирует гуманизированный полипептид МНС II.

8. Выделенная клетка грызуна по любому из пп. 4-7, где клетка грызуна представляет собой клетку крысы.

9. Выделенная клетка грызуна по любому из пп. 4-7, где клетка грызуна представляет собой клетку мыши.