ГУМАНИЗИРОВАННЫЕ ГРЫЗУНЫ ДЛЯ ТЕСТИРОВАНИЯ ТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ АГЕНТОВ Российский патент 2023 года по МПК A01K67/27 A61K49/00 

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[0001] Данная заявка заявляет приоритет по предварительной заявке на патент США с серийным номером 62/648197, поданной 26 марта 2018 г., и предварительной заявке на патент США с серийным номером 62/689628, поданной 25 июня 2018 г., каждая из которых в полном объеме включена в данный документ посредством ссылки.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

[0002] Данная заявка содержит Перечень последовательностей, который был подан в электронном виде в формате ASCII и в полном объеме включен в данный документ посредством ссылки. Указанная копия ASCII, созданная 20 марта 2019 г., имеет название RPB-01925_(28744-01925)_SL.txt и размер 12008 байтов.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0003] Безопасность, эффективность и фармакокинетические свойства терапевтических агентов обычно тестируют в животных моделях перед тем, как вводить эти лекарства людям. Использование крупных животных, таких как отличные от человека приматы, в подобных доклинических исследованиях является дорогостоящим, и часто при этом недоступны подходящие модели заболеваний, что ограничивает применимость таких животных при тестировании эффективности лекарств.

[0004] Благодаря малым размерам и хорошо изученной физиологии грызунов уже долгое время используют в качестве животных моделей для доклинического тестирования терапевтических агентов. Кроме того, грызуны хорошо поддаются генетической модификации с применением хорошо отработанных методик и, следовательно, доступно много моделей заболеваний у грызунов, которые недоступны у более крупных животных. Однако комплексные терапевтические агенты, такие как антитела и Fc-слитые белки, часто по-разному ведут себя в случае грызунов и людей. Например, такие терапевтические агенты часто демонстрируют очень отличные фармакокинетические свойства при введении грызунам по сравнению с введением людям, что ограничивает применимость моделей на грызунах в качестве средства прогнозирования безопасности, эффективности и оптимального дозирования комплексных терапевтических агентов для людей. Это, в свою очередь, снижает применимость таких животных моделей в доклиническом тестировании.

[0005] Таким образом, существует большая потребность в новых животных моделях и способах, которые позволяют проводить точное доклиническое тестирование комплексных терапевтических агентов на грызунах, которое дает результаты, более точно прогнозирующие свойства таких терапевтических агентов у пациентов-людей.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0006] В данном документе предложены способы и композиции, относящиеся к in vivo тестированию терапевтических агентов, содержащих Fc человека (например, тестированию фармакокинетических и/или фармакодинамических свойств таких терапевтических агентов и схем введения доз), на генетически модифицированных грызунах (например, мышах или крысах).

[0007] В определенных вариантах осуществления в данном документе предложены генетически модифицированные грызуны, у которых введение человеческих антител и/или слитых с Fc человека белков индуцирует иммунный ответ против Fc человека (например, ответ мышиного антитела против человеческих антител или MAHA у мышей). В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированные грызуны (например, мыши или крысы) экспрессируют антитела, содержащие Fc человека (например, Fc IgG1 человека, Fc IgG4 человека). В некоторых вариантах осуществления грызуны экспрессируют полные человеческие антитела (т. е. антитела, имеющие человеческие тяжелые цепи и человеческие легкие (λ или κ) цепи).

[0008] В некоторых вариантах осуществления в данном документе предложены грызуны, которые экспрессируют один или более гуманизированных или частично гуманизированных Fc-рецепторов, которые взаимодействуют с Fc-слитыми белками или антителами таким образом, который отражает то, как Fc-рецепторы пациента-человека взаимодействовали бы с такими Fc-слитыми белками или антителами. Таким образом, в определенных вариантах осуществления генетически модифицированные грызуны содержат один или более Fc-рецепторов с человеческим внеклеточным доменом (например, неонатальный Fc-рецептор (FcRn), полипептид β-2-микроглобулина (β2M), Fc-ε-рецептор 1 α (FcεR1α), Fc-γ-рецептор 1 альфа (FcγR1a), Fc-гамма-рецептор 2a (FcγR2a), Fc-гамма-рецептор 2b (FcγR2b), Fc-гамма-рецептор 3a (FcγR3a), Fc-гамма-рецептор 3b (FcγR3b), Fc-гамма-рецептор 2c (FcγR2c)). Трансмембранный и цитоплазматический домен таких рецепторов может быть человеческим или не человеческим (например, грызуна, такого как крысы или мышь).

[0009] В определенных аспектах в данном документе предложены грызуны (например, крысы или мыши) и ЭС-клетки грызунов, содержащие в своем геноме генетически модифицированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина (IgH). В определенных вариантах осуществления локус IgH содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую один или более генных сегментов V_H, один или более генных сегментов D_H и один или более генных сегментов J_H (например, крысиных или мышиных генных сегментов V_H, генных сегментов D_H и генных сегментов J_H); и (ii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую один или более генных сегментов C_H, кодирующих константный домен IgG, содержащий домен C_H1 человека, шарнирную область человека, домен C_H2 человека, домен C_H3 человека, трансмембранный домен IgG человека или грызуна и цитоплазматический домен IgG человека или грызуна. В некоторых вариантах осуществления все генные сегменты C_H в константной области тяжелой цепи иммуноглобулина являются человеческими. В некоторых вариантах осуществления вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина таким образом, чтобы грызун вырабатывал антитела IgG, содержащие вариабельные домены, полученные из генного сегмента V_H, генного сегмента D_H и генного сегмента J_H, и константные домены тяжелой цепи, полученные из генного сегмента C_H. В определенных вариантах осуществления указанный локус расположен в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина грызуна. В некоторых вариантах осуществления человеческие антитела и Fc-слитые белки, которые совпадают по изотипу с Fc, кодируемым C_H человека в локусе тяжелой цепи иммуноглобулина грызуна, вызывают сниженный иммунный ответ при введении таким грызунам. Например, в некоторых вариантах осуществления человеческое антитело IgG1 вводят грызуну, предложенному в данном документе, который экспрессирует антитела, имеющие вариабельные домены человека и константные домены IgG1 человека. В некоторых вариантах осуществления человеческое антитело IgG2 вводят грызуну, предложенному в данном документе, который экспрессирует антитела, имеющие вариабельные домены человека и константные домены IgG2 человека. В некоторых вариантах осуществления человеческое антитело IgG3 вводят грызуну, предложенному в данном документе, который экспрессирует антитела, имеющие вариабельные домены человека и константные домены IgG3 человека. В некоторых вариантах осуществления человеческое антитело IgG4 вводят грызуну, предложенному в данном документе, который экспрессирует антитела, имеющие вариабельные домены человека и константные домены IgG4 человека. В некоторых вариантах осуществления человеческое антитело, имеющее легкую цепь κ, вводят грызуну, предложенному в данном документе, который экспрессирует антитела, имеющие легкую цепь κ человека, например, экспрессирует антитела, имеющие константный домен κ человека, или экспрессирует антитела, имеющие вариабельный и константный домены κ человека. В некоторых вариантах осуществления человеческое антитело, имеющее легкую цепь λ, вводят грызуну, предложенному в данном документе, который экспрессирует антитела, имеющие легкую цепь λ человека, например, экспрессирует антитела, имеющие константный домен λ человека, или экспрессирует антитела, имеющие вариабельный и константный домены λ человека. В определенных вариантах осуществления в данном документе предложены животные модели и способы тестирования человеческих антител и Fc-слитых белков с использованием таких грызунов.

[0010] В определенных аспектах в данном документе предложены грызуны (например, крысы или мыши), содержащие в своем геноме генетически модифицированный локус каппа-цепи иммуноглобулина (Igκ). В некоторых вариантах осуществления локус Igκ содержит: (1) вариабельную область цепи κ иммуноглобулина, содержащую один или более генных сегментов V_κ человека и один или более генных сегментов J_κ человека; и (2) константную область цепи κ иммуноглобулина, содержащую генный сегмент C_κ человека. В некоторых вариантах осуществления вариабельная область цепи κ иммуноглобулина функционально связана с константной областью цепи κ иммуноглобулина таким образом, чтобы грызун вырабатывал антитела, содержащие вариабельные домены легкой цепи, полученные из генного сегмента V_κ человека и генного сегмента J_κ человека, и константные домены легкой цепи, полученные из генного сегмента C_κ. В определенных вариантах осуществления указанный локус расположен в эндогенном локусе цепи κ иммуноглобулина грызуна. В некоторых вариантах осуществления человеческие антитела, которые содержат цепь κ человека, вызывают сниженный иммунный ответ при введении таким грызунам. В определенных вариантах осуществления в данном документе предложены животные модели и способы тестирования человеческих антител с использованием таких грызунов.

[0011] В определенных аспектах в данном документе предложены грызуны (например, крысы или мыши), содержащие в своем геноме генетически модифицированный локус лямбда-цепи иммуноглобулина (Igλ). В определенных вариантах осуществления локус Igλ содержит один или более генных сегментов V_λ человека, один или более генных сегментов J_λ человека и один или более генных сегментов C_λ. В некоторых вариантах осуществления генные сегменты J_λ человека и генные сегменты C_λ упорядочены в виде одного или более кластеров J_λ-C_λ. В некоторых вариантах осуществления генные сегменты J_λ человека и генные сегменты C_λ упорядочены так, чтобы генные сегменты J_λ человека вместе были расположены выше одного или более генных сегментов C_λ. В некоторых вариантах осуществления генные сегменты J_λ человека и генные сегменты C_λ упорядочены так, чтобы некоторые генные сегменты J_λ человека и генные сегменты C_λ были упорядочены в виде одного или более кластеров J_λ-C_λ, тогда как другие генные сегменты J_λ вместе были расположены выше одного или более генных сегментов C_λ. В некоторых вариантах осуществления генный сегмент V_λ человека и генный сегмент J_λ человека функционально связаны с генным сегментом C_λ человека таким образом, чтобы грызун вырабатывал антитела, содержащие вариабельные домены легкой цепи, полученные из генного сегмента V_λ человека и генного сегмента J_λ человека, и константные домены легкой цепи, полученные из генного сегмента C_λ. В определенных вариантах осуществления указанный локус расположен в эндогенном локусе цепи λ иммуноглобулина грызуна. В некоторых вариантах осуществления человеческие антитела, которые содержат цепь λ человека, вызывают сниженный иммунный ответ при введении таким грызунам. В определенных вариантах осуществления в данном документе предложены животные модели и способы тестирования человеческих антител с использованием таких грызунов.

[0012] В определенных аспектах в данном документе предложены грызуны (например, крысы или мыши), содержащие в своем геноме генетически модифицированный локус неонатального Fc-рецептора (FcRn). В определенном варианте осуществления локус FcRn содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcRn, содержащий внеклеточный домен человека, трансмембранный домен грызуна или человека и цитоплазматический домен грызуна или человека. В определенных вариантах осуществления указанный локус расположен в эндогенном локусе FcRn грызуна. В некоторых вариантах осуществления грызуны дополнительно содержат в своем геноме локус β-2-микроглобулина (β2M), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид β-2-микроглобулина (β2M) человека. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид β2M человека, расположена в эндогенном локусе β2M грызуна. В определенных вариантах осуществления в данном документе предложены животные модели и способы тестирования человеческих антител и Fc-слитых белков с использованием таких грызунов.

[0013] В определенных аспектах в данном документе предложены грызуны (например, крысы или мыши), содержащие в своем геноме генетически модифицированный локус Fc-эпсилон-рецептора 1 альфа (FcεR1α), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcεR1α, содержащий внеклеточный домен человека, трансмембранный домен грызуна или человека и цитоплазматический домен грызуна или человека. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcεR1α человека, расположена в эндогенном локусе FcεR1α грызуна. В определенных вариантах осуществления в данном документе предложены животные модели и способы тестирования человеческих антител и Fc-слитых белков с использованием таких грызунов.

[0014] В определенных аспектах в данном документе предложены грызуны (например, крысы или мыши), содержащие в своем геноме генетически модифицированный локус α-цепи Fc-гамма-рецептора 1a (FcγR1a), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид α-цепи FcγR1a, содержащий внеклеточный домен человека, трансмембранный домен грызуна или человека и цитоплазматический домен грызуна или человека. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид α-цепи FcγR1a, расположена в эндогенном локусе α-цепи FcγR1a грызуна. В некоторых вариантах осуществления предложенные в данном документе генетически модифицированные грызуны дополнительно содержат функциональную γ-цепь FcR. В определенных вариантах осуществления функциональная γ-цепь FcR представляет собой γ-цепь FcR грызуна (например, γ-цепь FcR, эндогенную для генетически модифицированных грызунов). В определенных вариантах осуществления в данном документе предложены животные модели и способы тестирования человеческих антител и Fc-слитых белков с использованием таких грызунов.

[0015] В определенных аспектах в данном документе предложены грызуны (например, крысы или мыши), содержащие в своем геноме генетически модифицированный локус α-цепи Fc-гамма-рецептора 2a (FcγR2a), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид α-цепи FcγR2a человека. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид α-цепи FcγR2a, расположена в эндогенном локусе α-цепи низкоаффинного FcγR грызуна. В определенных вариантах осуществления в данном документе предложены животные модели и способы тестирования человеческих антител и Fc-слитых белков с использованием таких грызунов.

[0016] В определенных аспектах в данном документе предложены грызуны (например, крысы или мыши), содержащие в своем геноме генетически модифицированный локус α-цепи Fc-гамма-рецептора 2b (FcγR2b), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид α-цепи FcγR2b человека. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид α-цепи FcγR2b, расположена в эндогенном локусе α-цепи низкоаффинного FcγR грызуна. В определенных вариантах осуществления в данном документе предложены животные модели и способы тестирования человеческих антител и Fc-слитых белков с использованием таких грызунов.

[0017] В определенных аспектах в данном документе предложены грызуны (например, крысы или мыши), содержащие в своем геноме генетически модифицированный локус α-цепи Fc-гамма-рецептора 3a (FcγR3a), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид α-цепи FcγR3a человека. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид α-цепи FcγR3a, расположена в эндогенном локусе α-цепи низкоаффинного FcγR грызуна. В некоторых вариантах осуществления предложенные в данном документе генетически модифицированные грызуны дополнительно содержат функциональную γ-цепь FcR. В определенных вариантах осуществления функциональная γ-цепь FcR представляет собой γ-цепь FcR грызуна (например, γ-цепь FcR, эндогенную для генетически модифицированных грызунов). В определенных вариантах осуществления в данном документе предложены животные модели и способы тестирования человеческих антител и Fc-слитых белков с использованием таких грызунов.

[0018] В определенных аспектах в данном документе предложены грызуны (например, крысы или мыши), содержащие в своем геноме генетически модифицированный локус α-цепи Fc-гамма-рецептора 3b (FcγR3b), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид α-цепи FcγR3b человека. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид α-цепи FcγR3b, расположена в эндогенном локусе α-цепи низкоаффинного FcγR грызуна. В определенных вариантах осуществления в данном документе предложены животные модели и способы тестирования человеческих антител и Fc-слитых белков с использованием таких грызунов.

[0019] В определенных аспектах в данном документе предложены грызуны (например, крысы или мыши), содержащие в своем геноме генетически модифицированный локус α-цепи Fc-гамма-рецептора 2c (FcγR2c), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид α-цепи FcγR2c человека. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид α-цепи FcγR2c, расположена в эндогенном локусе α-цепи низкоаффинного FcγR грызуна. В определенных вариантах осуществления в данном документе предложены животные модели и способы тестирования человеческих антител и Fc-слитых белков с использованием таких грызунов.

[0020] В определенных аспектах в данном документе предложены грызуны (например, крысы или мыши), содержащие в своем геноме комбинацию генетически модифицированных локусов, предложенных в данном документе. Например, в некоторых вариантах осуществления предложенные в данном документе грызуны содержат один или более генетически модифицированных локусов, выбранных из генетически модифицированного локуса IgH, предложенного в данном документе, генетически модифицированного локуса Igκ, предложенного в данном документе, генетически модифицированного локуса Igλ, предложенного в данном документе, генетически модифицированного локуса FcRn, предложенного в данном документе, генетически модифицированного локуса β2M, предложенного в данном документе, генетически модифицированного локуса FcεR1α, предложенного в данном документе, генетически модифицированного локуса FcγR1a, предложенного в данном документе, генетически модифицированного локуса FcγR2a, предложенного в данном документе, генетически модифицированного локуса FcγR2b, предложенного в данном документе, генетически модифицированного локуса FcγR2c, предложенного в данном документе, генетически модифицированного локуса FcγR3a, предложенного в данном документе, и/или генетически модифицированного локуса FcγR3b, предложенного в данном документе. В определенных вариантах осуществления предложенные в данном документе грызуны содержат генетически модифицированный локус IgH, предложенный в данном документе, и/или генетически модифицированный локус Igκ, предложенный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления предложенные в данном документе грызуны содержат генетически модифицированный локус IgH, предложенный в данном документе, и/или генетически модифицированный локус Igλ, предложенный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления предложенные в данном документе грызуны содержат генетически модифицированный локус IgH, предложенный в данном документе, генетически модифицированный локус Igκ и/или Igλ, предложенный в данном документе, генетически модифицированный локус FcRn, предложенный в данном документе, и генетически модифицированный локус β2M, предложенный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления предложенные в данном документе грызуны содержат генетически модифицированный локус IgH, предложенный в данном документе, генетически модифицированный локус FcRn, предложенный в данном документе, генетически модифицированный локус β2M, предложенный в данном документе, генетически модифицированный локус FcεR1α, предложенный в данном документе, генетически модифицированный локус FcγR1a, предложенный в данном документе, генетически модифицированный локус FcγR2a, предложенный в данном документе, генетически модифицированный локус FcγR2b, предложенный в данном документе, генетически модифицированный локус FcγR2c, предложенный в данном документе, генетически модифицированный локус FcγR3a, предложенный в данном документе, и/или генетически модифицированный локус FcγR3b, предложенный в данном документе.

[0021] В определенных вариантах осуществления в данном документе предложены способы тестирования терапевтического белка, содержащего Fc-домен человека (например, человеческое антитело или Fc-слитый белок), включающие введение терапевтического белка грызуну (например, мыши или крысы), предложенному в данном документе. В некоторых вариантах осуществления указанный способ дополнительно включает измерение одного или более фармакокинетических свойств вводимого терапевтического белка. В некоторых вариантах осуществления один или более фармакокинетических параметров включают, но не ограничиваются этим, площадь под кривой плазменная концентрация - время (ППК), in vivo восстановление (IVR), скорость выведения (CL), среднее время удержания (СВУ), время полужизни агента и объем распределения в равновесном состоянии (Vss). В некоторых вариантах осуществления указанные способы дополнительно включают определение терапевтической эффективности вводимого терапевтического белка (например, способности вводимой дозы терапевтического белка уменьшать или устранять один или более симптомов заболевания в животной модели). В некоторых вариантах осуществления указанные способы дополнительно включают определение безопасности вводимого терапевтического белка (например, степени, в которой вводимая доза терапевтического белка вызывает одно или более нежелательных явлений в животной модели). В определенных вариантах осуществления указанный способ дополнительно включает определение степени, в которой терапевтический белок индуцирует один или более опосредованных Fc-рецепторами ответов у грызуна (например, степени, в которой терапевтический белок индуцирует антителозависимую клеточноопосредованную цитотоксичность (АЗКЦ)). В некоторых вариантах осуществления указанный способ дополнительно включает определение степени, в которой введение терапевтического белка индуцирует иммунный ответ против Fc человека у грызуна. В некоторых вариантах осуществления указанный способ дополнительно включает оценку безопасности и/или эффективности схемы введения доз терапевтического белка.

[0022] В определенных вариантах осуществления в данном документе предложены животные модели для тестирования терапевтического белка, содержащего Fc-домен человека (например, человеческое антитело или Fc-слитый белок). В некоторых вариантах осуществления животная модель включает введение терапевтического белка грызуну (например, мыши или крысы), предложенному в данном документе. В некоторых вариантах осуществления животная модель дополнительно включает измерение одного или более фармакокинетических свойств вводимого терапевтического белка. В некоторых вариантах осуществления один или более фармакокинетических параметров включают, но не ограничиваются этим, площадь под кривой плазменная концентрация - время (ППК), in vivo восстановление (IVR), скорость выведения (CL), среднее время удержания (СВУ), время полужизни агента и объем распределения в равновесном состоянии (Vss). В некоторых вариантах осуществления животная модель дополнительно включает определение терапевтической эффективности вводимого терапевтического белка (например, способности вводимой дозы терапевтического белка уменьшать или устранять один или более симптомов заболевания в животной модели). В некоторых вариантах осуществления животная модель дополнительно включает определение безопасности вводимого терапевтического белка (например, степени, в которой вводимая доза терапевтического белка вызывает одно или более нежелательных явлений в животной модели). В определенных вариантах осуществления животная модель дополнительно включает определение степени, в которой терапевтический белок индуцирует один или более опосредованных Fc-рецепторами ответов у грызуна (например, степени, в которой терапевтический белок индуцирует антителозависимую клеточноопосредованную цитотоксичность (АЗКЦ)). В некоторых вариантах осуществления животная модель дополнительно включает определение степени, в которой введение терапевтического белка индуцирует иммунный ответ против Fc человека у грызуна. В некоторых вариантах осуществления животная модель дополнительно включает оценку безопасности и/или эффективности схемы введения доз терапевтического белка.

[0023] В некоторых вариантах осуществления вводимый терапевтический агент вызывает сниженный иммунный ответ при введении предложенному в данном документе грызуну. В некоторых вариантах осуществления вводимые человеческое антитело или Fc-слитый белок имеют изотип и/или аллотип, который совпадает с изотипом и/или аллотипом Fc-домена, кодируемого C_H человека в генетически модифицированном локусе IgH предложенного в данном документе грызуна. В некоторых вариантах осуществления человеческие антитела и Fc-слитые белки, которые совпадают по изотипу с Fc, кодируемым C_H человека в локусе тяжелой цепи иммуноглобулина грызуна, вызывают сниженный иммунный ответ при введении таким грызунам. Например, в некоторых вариантах осуществления человеческое антитело IgG1 вводят грызуну, предложенному в данном документе, который экспрессирует антитела, имеющие вариабельные домены человека и константные домены IgG1 человека. В некоторых вариантах осуществления человеческое антитело IgG2 вводят грызуну, предложенному в данном документе, который экспрессирует антитела, имеющие вариабельные домены человека и константные домены IgG2 человека. В некоторых вариантах осуществления человеческое антитело IgG3 вводят грызуну, предложенному в данном документе, который экспрессирует антитела, имеющие вариабельные домены человека и константные домены IgG3 человека. В некоторых вариантах осуществления человеческое антитело IgG4 вводят грызуну, предложенному в данном документе, который экспрессирует антитела, имеющие вариабельные домены человека и константные домены IgG4 человека. В некоторых вариантах осуществления человеческое антитело, имеющее легкую цепь κ, вводят грызуну, предложенному в данном документе, который экспрессирует антитела, имеющие легкую цепь κ человека, например, экспрессирует антитела, имеющие константный домен κ человека, или экспрессирует антитела, имеющие вариабельный и константный домены κ человека. В некоторых вариантах осуществления человеческое антитело, имеющее легкую цепь λ, вводят грызуну, предложенному в данном документе, который экспрессирует антитела, имеющие легкую цепь λ человека, например, экспрессирует антитела, имеющие константный домен λ человека, или экспрессирует антитела, имеющие вариабельный и константный домены λ человека. В некоторых вариантах осуществления агент представляет собой человеческое антитело IgG1, а грызун содержит генетически модифицированный локус IgH, который содержит генный сегмент C_H кодирующий CH₁-домен, шарнирный домен, CH₂- и CH₃-домены IgG1 человека. В некоторых вариантах осуществления агент представляет собой человеческое антитело IgG4, а грызун содержит генетически модифицированный локус IgH, который содержит генный сегмент C_H кодирующий CH₁-домен, шарнирный домен, CH₂- и CH₃-домены IgG4 человека. В некоторых вариантах осуществления терапевтический агент представляет собой человеческое антитело, имеющее легкую цепь Igκ, а грызун содержит генетически модифицированный локус Igκ, предложенный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления терапевтический агент представляет собой человеческое антитело, имеющее легкую цепь Igλ, а грызун содержит генетически модифицированный локус Igλ, предложенный в данном документе.

[0024] В определенных аспектах в данном документе предложены клетки грызунов (например, ЭС-клетки, иммунные клетки, эндотелиальные клетки, B-клетки, NK-клетки, макрофаги, дендритные клетки, клетки Лангерганса, эозинофилы, тучные клетки и базофилы), содержащие один или более генетически модифицированных локусов, предложенных в данном документе. Например, в некоторых вариантах осуществления клетки грызунов (например, ЭС-клетки грызунов), предложенные в данном документе, содержат генетически модифицированный локус IgH, предложенный в данном документе, и/или генетически модифицированный локус Igκ, предложенный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления клетки грызунов (например, ЭС-клетки грызунов), предложенные в данном документе, содержат генетически модифицированный локус IgH, предложенный в данном документе, и/или генетически модифицированный локус Igλ, предложенный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления клетки грызунов (например, ЭС-клетки грызунов), предложенные в данном документе, содержат генетически модифицированный локус IgH, предложенный в данном документе, генетически модифицированный локус Igκ и/или Igλ, предложенный в данном документе, генетически модифицированный локус FcRn, предложенный в данном документе, и генетически модифицированный локус β2M, предложенный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления клетки грызунов (например, ЭС-клетки грызунов), предложенные в данном документе, содержат генетически модифицированный локус IgH, предложенный в данном документе, генетически модифицированный локус FcRn, предложенный в данном документе, генетически модифицированный локус β2M, предложенный в данном документе, генетически модифицированный локус FcεR1α, предложенный в данном документе, генетически модифицированный локус FcγR1a, предложенный в данном документе, генетически модифицированный локус FcγR2a, предложенный в данном документе, генетически модифицированный локус FcγR2b, предложенный в данном документе, генетически модифицированный локус FcγR2c, предложенный в данном документе, генетически модифицированный локус FcγR3a, предложенный в данном документе, и/или генетически модифицированный локус FcγR3b, предложенный в данном документе.

[0025] В некоторых вариантах осуществления в данном документе предложены способы создания генетически модифицированных грызунов (например, крыс или мышей) и ЭС-клеток грызунов (например, ЭС-клеток крыс или мышей), предложенных в данном документе. В определенных вариантах осуществления указанный способ включает генетическую модификацию генома грызуна (например, крысы или мыши) или ЭС-клетки грызуна (например, ЭС-клетки крысы или мыши) так, чтобы он содержал один или более генетически модифицированных локусов, предложенных в данном документе.

Краткое описание графических материалов

[0026] На Фиг. 1A приведены общие схемы, без соблюдения масштаба, типовых модифицированных локусов тяжелой цепи иммуноглобулина в соответствии с определенными типовыми вариантами осуществления, предложенными в данном документе. Как показано, типовой локус 1 тяжелой цепи мыши содержит в порядке от 5’ к 3’ вариабельную область человека (содержащую генные сегменты V_H человека, D_H человека и J_H человека, для упрощения генные сегменты V_H человека не показаны; только небольшое число генных сегментов представлено схематически; полный репертуар возможных присутствующих генных сегментов V, D и J смотрите на imgt.org, в Lefranc, M.-P., Exp. Clin. Immunogenet., 18, 100-116 (2001) и Lefranc, M.-P. and Lefranc, G., The Immunoglobulin FactsBook, Academic Press, London, 458 страниц (2001), включенных в данный документ посредством ссылки), интронный энхансер мыши, генный сегмент C_μ мыши, генный сегмент C_δ мыши, генный сегмент C_γ3 мыши, генный сегмент C_γ1 мыши, генный сегмент C_γ2b мыши, гибридный генный сегмент C_H, кодирующий внеклеточный домен IgG1 человека и трансмембранный и цитоплазматический домены IgG2a мыши, генный сегмент C_ε мыши, генный сегмент C_α мыши и 3’ регуляторную область мыши. Как показано, типовой локус 2 тяжелой цепи мыши содержит в порядке от 5’ к 3’ вариабельную область человека (содержащую генные сегменты V_H человека, D_H человека и J_H человека, для упрощения генные сегменты V_H человека не показаны; только небольшое число генных сегментов представлено схематически; полный репертуар возможных присутствующих генных сегментов V, D и J смотрите на imgt.org, в Lefranc, M.-P., Exp. Clin. Immunogenet., 18, 100-116 (2001) и Lefranc, M.-P. and Lefranc, G., The Immunoglobulin FactsBook, Academic Press, London, 458 страниц (2001), включенных в данный документ посредством ссылки), интронный энхансер мыши, генный сегмент C_μ мыши, генный сегмент C_δ мыши, генный сегмент C_γ3 мыши, генный сегмент C_γ1 мыши, генный сегмент C_γ2b мыши, генный сегмент C_γ1 человека (последовательности, кодирующие как внеклеточный, так и трансмембранный/цитоплазматический домены IgG1, являются человеческими), генный сегмент C_ε мыши, генный сегмент C_α мыши и 3’ регуляторную область мыши. Как показано, типовой локус 3 тяжелой цепи мыши содержит в порядке от 5’ к 3’ вариабельную область человека (содержащую генные сегменты V_H человека, D_H человека и J_H человека, для упрощения генные сегменты V_H человека не показаны; только небольшое число генных сегментов представлено схематически; полный репертуар возможных присутствующих генных сегментов V, D и J смотрите на imgt.org, в Lefranc, M.-P., Exp. Clin. Immunogenet., 18, 100-116 (2001) и Lefranc, M.-P. and Lefranc, G., The Immunoglobulin FactsBook, Academic Press, London, 458 страниц (2001), включенных в данный документ посредством ссылки), интронный энхансер мыши, генный сегмент C_μ мыши, генный сегмент C_δ мыши, генный сегмент C_γ3 мыши, гибридный генный сегмент C_H, кодирующий внеклеточный домен IgG4 человека и трансмембранный и цитоплазматический домены IgG1 мыши, генный сегмент C_γ2b мыши, генный сегмент C_γ2a мыши, генный сегмент C_ε мыши, генный сегмент C_α мыши и 3’ регуляторную область мыши. Как показано, типовой локус 4 тяжелой цепи мыши содержит в порядке от 5’ к 3’ вариабельную область человека (содержащую генные сегменты V_H человека, D_H человека и J_H человека, для упрощения генные сегменты V_H человека не показаны; только небольшое число генных сегментов представлено схематически; полный репертуар возможных присутствующих генных сегментов V, D и J смотрите на imgt.org, в Lefranc, M.-P., Exp. Clin. Immunogenet., 18, 100-116 (2001) и Lefranc, M.-P. and Lefranc, G., The Immunoglobulin FactsBook, Academic Press, London, 458 страниц (2001), включенных в данный документ посредством ссылки), интронный энхансер мыши, генный сегмент C_μ мыши, генный сегмент C_δ мыши, генный сегмент C_γ3 мыши, генный сегмент C_γ4 человека (последовательности, кодирующие как внеклеточный, так и трансмембранный/цитоплазматический домен IgG4, являются человеческими), генный сегмент C_γ2b мыши, генный сегмент C_γ2a мыши, генный сегмент C_ε мыши, генный сегмент Cα мыши и 3’ регуляторную область мыши. Как показано, типовой локус 5 тяжелой цепи мыши содержит в порядке от 5’ к 3’ вариабельную область человека (содержащую генные сегменты V_H человека, D_H человека и J_H человека, для упрощения генные сегменты V_H человека не показаны; только небольшое число генных сегментов представлено схематически; полный репертуар возможных присутствующих генных сегментов V, D и J смотрите на imgt.org, в Lefranc, M.-P., Exp. Clin. Immunogenet., 18, 100-116 (2001) и Lefranc, M.-P. and Lefranc, G., The Immunoglobulin FactsBook, Academic Press, London, 458 страниц (2001), включенных в данный документ посредством ссылки), интронный энхансер человека, генный сегмент C_μ человека, генный сегмент C_δ человека, генный сегмент C_γ3 человека, генный сегмент C_γ1 человека и 3’ регуляторную область мыши. Как показано, типовой локус 6 тяжелой цепи мыши содержит в порядке от 5’ к 3’ вариабельную область человека (содержащую генные сегменты V_H человека, D_H человека и J_H человека, для упрощения генные сегменты V_H человека не показаны; только небольшое число генных сегментов представлено схематически; полный репертуар возможных присутствующих генных сегментов V, D и J смотрите на imgt.org, в Lefranc, M.-P., Exp. Clin. Immunogenet., 18, 100-116 (2001) и Lefranc, M.-P. and Lefranc, G., The Immunoglobulin FactsBook, Academic Press, London, 458 страниц (2001), включенных в данный документ посредством ссылки), интронный энхансер человека, генный сегмент C_μ человека, генный сегмент C_δ человека, генный сегмент C_γ3 человека, генный сегмент C_γ1 человека, генный сегмент C_γ2 человек, генный сегмент C_γ4 человека и 3’ регуляторную область мыши. Как показано, типовой локус 7 тяжелой цепи мыши содержит в порядке от 5’ к 3’ вариабельную область мыши (содержащую генные сегменты V_H мыши, D_H мыши и J_H мыши, для упрощения генные сегменты V_H мыши не показаны; только небольшое число генных сегментов представлено схематически; полный репертуар возможных присутствующих генных сегментов V, D и J смотрите на imgt.org), интронный энхансер мыши, генный сегмент C_μ человека, генный сегмент C_δ человека, генный сегмент C_γ3 человека, генный сегмент C_γ1 человека и 3’ регуляторную область мыши. Как показано, типовой локус 8 тяжелой цепи мыши содержит в порядке от 5’ к 3’ вариабельную область мыши (содержащую генные сегменты V_H мыши, D_H мыши и J_H мыши, для упрощения генные сегменты V_H мыши не показаны; только небольшое число генных сегментов представлено схематически; полный репертуар возможных присутствующих генных сегментов V, D и J смотрите на imgt.org), интронный энхансер мыши, генный сегмент C_μ человека, генный сегмент C_δ человека, генный сегмент C_γ3 человека, генный сегмент C_γ1 человека, генный сегмент C_γ2 человека, генный сегмент C_γ4 человека и 3’ регуляторную область мыши. Хотя это не показано, локусы в этих вариантах осуществления содержат функциональные мышиные гены Adam6 (например, Adam6a и/или Adam6b). Если не указано иное (например, для сайтов lox и т.д.), незакрашенные фигуры и двойные линии представляют человеческие последовательности, а закрашенные фигуры и одинарные линии представляют мышиные последовательности.

[0027] На Фиг. 1B приведена общая схема, без соблюдения масштаба, типового способа создания типового модифицированного локуса 5 тяжелой цепи иммуноглобулина, изображенного на Фиг. 1A, описанного в примере 1.1. Для упрощения генные сегменты V_H человека и ген Adam6 мыши не показаны на каждом схематическом изображении. Если не указано иное (например, для сайтов lox и т.д.), незакрашенные фигуры и двойные линии представляют человеческие последовательности, а закрашенные фигуры и одинарные линии представляют мышиные последовательности.

[0028] На Фиг. 1C приведена общая схема, без соблюдения масштаба, типового способа создания типового модифицированного локуса 6 тяжелой цепи иммуноглобулина, изображенного на Фиг. 1A, описанного в примере 1.1. Для упрощения генные сегменты V_H человека и ген Adam6 мыши не показаны на каждом схематическом изображении. Если не указано иное (например, для сайтов lox и т.д.), незакрашенные фигуры и двойные линии представляют человеческие последовательности, а закрашенные фигуры и одинарные линии представляют мышиные последовательности.

[0029] На Фиг. 1D приведена общая схема, без соблюдения масштаба, типового способа создания типового модифицированного локуса 7 тяжелой цепи иммуноглобулина, изображенного на Фиг. 1A, описанного в примере 1.2. Для упрощения генные сегменты V_H мыши не показаны на каждом схематическом изображении. Если не указано иное (например, для сайтов lox и т.д.), незакрашенные фигуры и двойные линии представляют человеческие последовательности, а закрашенные фигуры и одинарные линии представляют мышиные последовательности.

[0030] На Фиг. 1E приведена общая схема, без соблюдения масштаба, типового способа создания типового модифицированного локуса 8 тяжелой цепи иммуноглобулина, изображенного на Фиг. 1A, описанного в примере 1.2. Для упрощения генные сегменты V_H мыши не показаны на каждом схематическом изображении. Если не указано иное (например, для сайтов lox и т.д.), незакрашенные фигуры и двойные линии представляют человеческие последовательности, а закрашенные фигуры и одинарные линии представляют мышиные последовательности.

[0031] На Фиг. 2A приведены общие схемы, без соблюдения масштаба, типовых модифицированных локусов легкой цепи иммуноглобулина в соответствии с определенными типовыми вариантами осуществления, предложенными в данном документе. На верхней типовой схеме изображен локус Igκ, содержащий вариабельную область человека, интронный энхансер мыши, генный сегмент константной области C_κ человека и 3’ энхансер мыши. На нижней типовой схеме изображен локус Igλ, содержащий генные сегменты V_λ, тандемные пары J_λ-C_λ человека, J_λ7 человека и генный сегмент C_λ1 мыши, энхансеры 1, 2 и 3 человека и 3’ энхансер мыши. Если не указано иное (например, для сайта loxp и т.д.), незакрашенные фигуры и двойные линии представляют человеческие последовательности, а закрашенные фигуры и одинарные линии представляют мышиные последовательности.

[0032] На Фиг. 2B приведена общая схема, без соблюдения масштаба, типового способа создания типового модифицированного локуса каппа-цепи иммуноглобулина, изображенного на Фиг. 2A, описанного в примере 1.3. Если не указано иное (например, для сайтов loxp и т.д.), незакрашенные фигуры и двойные линии представляют человеческие последовательности, а закрашенные фигуры и одинарные линии представляют мышиные последовательности.

[0033] На Фиг. 3A приведены уровни мышиного IgG, мышиного IgM, человеческого IgM, человеческого IgG1 и человеческого IgG3 в сыворотке мышей hVs-hIgM-hIgD-hIgG3-hIgG1 (локус 5), мышей VELOCIMMUNE® и нормальной человеческой сыворотке.

[0034] На Фиг. 3B приведены графики FACS для hIgM в сравнении с mIgM и hIgD в сравнении с mIgD, чтобы проиллюстрировать использование аллелей и наличие аллельного исключения у мышей hVs-hIgM-hIgD-hIgG3-hIgG1 (локус 5) и мышей VELOCIMMUNE®.

[0035] На Фиг. 3C приведены уровни мышиного IgG, мышиного IgM, человеческого IgM, человеческого IgG1 и человеческого IgG4 в сыворотке указанных мышей.

[0036] На Фиг. 3D приведены концентрации мышиных и человеческих антител на 0 сутки и 34 сутки у указанных мышей после инъекции человеческого антитела IgG4.

[0037] На Фиг. 3E приведены концентрации человеческого антитела IgG4 у указанных мышей в течение первых 34 суток после его инъекции.

[0038] На Фиг. 4 приведена общая схема, без соблюдения масштаба, типового способа создания типового модифицированного локуса FcRn, описанного в примере 3. Если не указано иное (например, для сайтов loxp и т.д.), незакрашенные фигуры и двойные линии представляют человеческие последовательности, а закрашенные фигуры и одинарные линии представляют мышиные последовательности.

[0039] На Фиг. 5 приведена общая схема, без соблюдения масштаба, типового способа создания типового модифицированного локуса FcRn и локусов β2M, описанного в примере 3. Если не указано иное (например, для сайтов loxp и т.д.), незакрашенные фигуры и двойные линии представляют человеческие последовательности, а закрашенные фигуры и одинарные линии представляют мышиные последовательности.

[0040] На Фиг. 6 проиллюстрирован клиренс (выраженный в виде концентрации антитела) человеческого антитела у мышей, содержащих типовые модифицированные локусы FcRn и β2M, по сравнению с мышами дикого типа.

[0041] На Фиг. 7 приведена общая схема, без соблюдения масштаба, типового способа создания типовых модифицированных локусов FcγR1α (на фигуре показан как FCGR1), FcγRIIIa, FcγRIIa, FcγRIIc, FcγRIIb, FcγRIIIb и тяжелой цепи, описанного в примере 4. Незакрашенные фигуры и двойные линии представляют человеческие последовательности, а закрашенные фигуры и одинарные линии представляют мышиные последовательности.

[0042] На Фиг. 8A приведены графики FACS, иллюстрирующие использование мышиного IgD в сравнении с мышиным IgM, человеческого IgD в сравнении с человеческим IgM у мышей, несущих высокоаффинный FcγR человека и низкоаффинный FcγR человека и константные области тяжелой цепи человека.

[0043] На Фиг. 8B приведены число или процентное содержание T-клеток (mCD3-положительных) и B-клеток (mCD19-положительных) в селезенке мышей, несущих высокоаффинный FcγR человека и низкоаффинный FcγR человека и константные области тяжелой цепи человека, по сравнению с мышами дикого типа.

[0044] На Фиг. 8C приведена сывороточная концентрация человеческого IgM, человеческого IgG1 и человеческого IgG3 мышей, несущих высокоаффинный FcγR человека и низкоаффинный FcγR человека и константные области тяжелой цепи человека, по сравнению с нормальной человеческой сывороткой.

[0045] На Фиг. 9 приведена общая схема, без соблюдения масштаба, типового способа создания мышей, содержащих типовой модифицированный локус FcεR1α, описанного в примере 5. Если не указано иное (например, для сайта loxp и т.д.), незакрашенные фигуры и двойные линии представляют человеческие последовательности, а закрашенные фигуры и одинарные линии представляют мышиные последовательности.

[0046] На Фиг. 10 на левой панели приведен график FACS, демонстрирующий, что гуманизированный FcεR1α экспрессируется на поверхности базофилов у типовых мышей, содержащих гуманизированный локус FcεR1α, раскрытый в данном документе. На левой панели на этой фигуре приведено процентное содержание мышиных или человеческих FcεR1α+ базофилов в селезенке мышей, содержащих гуманизированный локус FcεR1α, раскрытый в данном документе, по сравнению с мышами дикого типа.

[0047] На Фиг. 11 показано, что предложенный в данном документе типовой гуманизированный локус FcεR1α является функциональным. Мышей сенсибилизировали интрадермальными инъекциями в ухо человеческих аллерген-специфических IgE или IgG в качестве отрицательного контроля. Через 1 сутки мышей в/в стимулировали аллергеном, разведенным в красителе Эванса синем. Экстравазацию красителя Эванса синего в ухо определяли по данным дегрануляции тучных клеток. Так как человеческий IgE не связывается с мышиным FcεR1, ответ у мышей, содержащих гуманизированный локус FcεR1α, указывает на выработку функционального FcεR1α.

[0048] На Фиг. 12 показано, что предложенный в данном документе типовой гуманизированный локус FcεR1α является функциональным. Мышей сенсибилизировали в/в инъекцией человеческих аллерген-специфических IgE. Через 1 сутки мышей стимулировали в/в инъекцией аллергена и отслеживали изменения температуры в течение 4-часового периода времени после инъекции. Резкое снижение температуры является результатом общей анафилактической реакции.

[0049] На Фиг. 13 приведена общая схема, без соблюдения масштаба, типового способа создания мышей, содержащих типовые гуманизированные локусы FcRn, β2M, FcεR1α, FcγR1α (на фигуре показан как FCGR1), FcγRIIIa, FcγRIIa, FcγRIIc, FcγRIIb, FcγRIIIb, константной области тяжелой цепи, и локусы вариабельной области тяжелой цепи, описанного в примере 6. Для упрощения в локусах F и F' только небольшое число генных сегментов представлено схематически; полный репертуар возможных присутствующих генных сегментов V, D и J смотрите на imgt.org, в Lefranc, M.-P., Exp. Clin. Immunogenet., 18, 100-116 (2001) и Lefranc, M.-P. and Lefranc, G., The Immunoglobulin FactsBook, Academic Press, London, 458 страниц (2001), включенных в данный документ посредством ссылки. Незакрашенные фигуры и двойные линии представляют человеческие последовательности, а закрашенные фигуры и одинарные линии представляют мышиные последовательности.

Подробное описание

Общие сведения

[0050] В данном документе предложены способы и композиции, относящиеся к in vivo тестированию терапевтических агентов, содержащих Fc человека, на генетически модифицированных грызунах (например, тестированию фармакокинетических и/или фармакодинамических свойств и схем введения доз таких терапевтических агентов на генетически модифицированных грызунах). В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированные грызуны экспрессируют антитела, содержащие Fc человека (например, Fc IgG1 человека, Fc IgG2 человека, Fc IgG3 человека, Fc IgG4 человека) или константные области легкой цепи человека. В некоторых вариантах осуществления грызуны экспрессируют полные человеческие антитела (т. е. антитела, имеющие человеческие тяжелые цепи и человеческие легкие (γ или κ) цепи). В определенных вариантах осуществления генетически модифицированные грызуны содержат один или более Fc-рецепторов с человеческим внеклеточным доменом (например, неонатальный Fc-рецептор (FcRn), полипептид β-2-микроглобулина (β2M), Fc-ε-рецептор 1 α (FcεR1α), Fc-γ-рецептор 1 альфа (FcγR1a), Fc-гамма-рецептор 2a (FcγR2a), Fc-гамма-рецептор 2b (FcγR2b), Fc-гамма-рецептор 3a (FcγR3a), Fc-гамма-рецептор 3b (FcγR3b), Fc-гамма-рецептор 2c (FcγR2c)). Трансмембранный и цитоплазматический домен таких рецепторов может быть человеческим или не человеческим (например, грызуна).

[0051] Терапевтические агенты, содержащие Fc человека, такие как терапевтические человеческие антитела и человеческие Fc-слитые белки, как правило, тестируют на отличных от человека видах перед тем, как вводить их людям. Хотя такие агенты часто тестируют на отличных от человека приматах или других относительно крупных млекопитающих, такое тестирование является дорогостоящим и составляет значительную финансовую нагрузку для разработчиков лекарств. Кроме того, отличные от человека приматы и другие относительно крупные млекопитающие часто не поддаются генетической модификации, что ограничивает количество моделей заболеваний, доступных в таких организмах.

[0052] В противоположность этому, виды грызунов (например, крысы и мыши) являются удобными животными моделями для тестирования терапевтических антител и Fc-слитых белков благодаря своему малому размеру, хорошо изученной физиологии и подверженности генетическим модификациям. К сожалению, агенты, содержащие Fc-область человека, часто демонстрируют очень отличные фармакокинетические и фармакодинамические свойства при введении грызунам известного уровня техники по сравнению с введением людям. Например, когда терапевтические агенты с человеческими Fc-областями вводят традиционным грызунам, человеческие последовательности в Fc-областях часто распознаются как чужеродные иммунной системой грызуна (например, крысы или мыши). Как следствие, у грызуна может развиваться иммунный ответ против вводимых терапевтических агентов (что известно как мышиный ответ против человеческих антител или MAHA (англ. «mouse anti-human response»)), что влияет на фармакокинетические и фармакодинамические свойства вводимых агентов. Кроме того, человеческие Fc-области терапевтических агентов могут по-разному взаимодействовать с Fc-рецепторами грызуна (например, крысы или мыши) у грызунов и с Fc-рецепторами человека у пациентов, что также может влиять на фармакокинетические и фармакодинамические свойства вводимых агентов. Таким образом, традиционные модели на грызунах (например, крысах или мышах) часто обеспечивают плохой прогноз в отношении человеческих терапевтических ответов на терапевтические агенты, содержащие Fc человека. Таким образом, мыши, имеющие области локуса иммуноглобулина человека (например, смотрите локусы на Фиг. 1 и 2), могут помочь в снижении или устранении ответов MAHA.

[0053] Наличие молекулы, которая может специфически связывать лекарственный препарат, очень полезно в исследовательских и диагностических целях. Создание мышей, с мышиными вариабельными областями и человеческими константными областями (например, мышиный локус 8 на Фиг. 1A) обеспечивает усовершенствованный способ для создания антител против лекарственных препаратов, когда лекарственным препаратом является человеческое моноклональное антитело. Любой ответ MAHA, вызываемый введением мышам человеческого антитела, будет направлен на вариабельные области антитела. Это устраняет фоновый ответ против константной области антитела и делает создание специфических к лекарственному препарату антител более эффективным.

[0054] В данном документе предложены in vivo системы для разработки, скрининга и тестирования человеческих антител и Fc-слитых белков для терапевтического применения. В определенных вариантах осуществления в данном документе предложены генетически модифицированные грызуны со сниженным иммунным ответом антител грызуна против антител человека после введения терапевтического агента, содержащего Fc человека. Как продемонстрировано в данном документе, это можно осуществить путем применения грызунов, которые были генетически модифицированы так, чтобы экспрессировать Fc человека, который соответствует Fc, присутствующему во вводимых антителе и Fc-слитом белке. Таких мышей можно создавать, например, посредством вставки последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует константную область тяжелой цепи иммуноглобулина человека, полностью или частично (например, IgG C_H1-H-C_H2-C_H3), вместо последовательности, которая кодирует соответствующие части эндогенного генного сегмента константной области тяжелой цепи иммуноглобулина, не принадлежащего человеку. Такие животные распознают Fc человека как «собственный» белок и, следовательно, у них менее вероятно разовьется иммунный ответ против вводимого терапевтического средства, содержащего Fc человека.

[0055] Кроме того, в некоторых вариантах осуществления в данном документе предложены генетически модифицированные грызуны (например, мыши или крысы), экспрессирующие Fc-рецепторы, способные взаимодействовать с Fc человека аналогично Fc-рецепторам, экспрессируемым пациентом-человеком. Например, в определенных вариантах осуществления генетически модифицированные грызуны, предложенные в данном документе, экспрессируют один или более Fc-рецепторов, имеющих по меньшей мере внеклеточные домены человека (например, трансмембранный и цитоплазматический домены могут принадлежать человеку или грызуну). Таким образом, в определенных вариантах осуществления предложенные в данном документе мыши экспрессируют человеческий или частично человеческий FcRn, человеческий или частично человеческий β2M, человеческий или частично человеческий FcεR1α, человеческий или частично человеческий FcγR1a, человеческий или частично человеческий FcγR2a, человеческий или частично человеческий FcγR2b, человеческий или частично человеческий FcγR3a, человеческий или частично человеческий FcγR3b и/или человеческий или частично человеческий FcγR2c. Следовательно, такие мыши могут более точно имитировать ответы на Fc человека пациентов-людей по сравнению с грызунами с полностью нечеловеческими Fc-рецепторами.

[0056] Таким образом, предложенные в данном документе грызуны (например, мыши или крысы) обеспечивают новую in vivo систему для разработки, отбора и тестирования терапевтических человеческих антител и Fc-слитых белков на основании не только специфичности и/или аффинности к антигену, но также релевантной полной биологической функции выбранного антитела посредством оценки эффекторных функций во внутренней среде иммунной системы. Таким образом, можно осуществлять разработку и отбор человеческих терапевтических кандидатов на основании терапевтического потенциала, оцененного на уровне целых молекул с релевантными биологическими ответами (например, клеточными ответами), вместо прогнозов на основании лишь отдельной оценки индивидуальных компонентов. Таким образом, предложенные в данном документе грызуны обеспечивают систему, которая больше подходит для прогнозирования клинической функции человеческого терапевтического антитела in vivo.

Определения

[0057] В контексте данного документа форма единственного числа используется для обозначения одного или более чем одного (т. е. по меньшей мере одного) грамматического объекта. Как пример, «элемент» означает один элемент или более одного элемента.

[0058] Подразумевается, что термин «аминокислота» включает все молекулы, природные или синтетические, которые имеют как амино-функциональную группу, так и кислую функциональную группу, и могут быть включены в полимер из аминокислот природного происхождения. Примеры аминокислот включают аминокислоты природного происхождения; их аналоги, производные и родственные соединения; аминокислотные аналоги, имеющие вариантные боковые цепи; и все стереоизомеры любых вышеперечисленных соединений.

[0059] В контексте данного документа термин «антитело» может относиться как к интактному антителу, так и к его антигенсвязывающему фрагменту. Интактные антитела представляют собой гликопротеины, которые содержат по меньшей мере две тяжелые (H) цепи и две легкие (L) цепи, связанные между собой дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь содержит вариабельный домен тяжелой цепи и константный домен тяжелой цепи. Каждая легкая цепь содержит вариабельный домен легкой цепи и константный домен легкой цепи. Вариабельные домены тяжелой цепи и вариабельные домены легкой цепи можно дополнительно поделить на домены гипервариабельности, называемые определяющими комплементарность областями (CDR), перемежающиеся более консервативными областями, называемыми каркасными областями (FR). Каждый вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от амино-конца к карбокси-концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные домены тяжелой и легкой цепей содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном.

[0060] В контексте данного документа термин «антигенсвязывающий фрагмент» или «антигенсвязывающая часть» относится к одному или более фрагментам антитела, которые сохраняют способность связываться с антигеном. Примеры связывающих фрагментов, охватываемых термином «антигенсвязывающий фрагмент» антитела, включают Fab, Fab', F(ab')₂, Fv, scFv, дисульфидно-связанный Fv, Fd, одноцепочечные антитела, выделенную CDRH3 и другие фрагменты антитела, которые сохраняют по меньшей мере часть вариабельного домена интактного антитела. Эти фрагменты антитела можно получать, используя традиционные рекомбинантные и/или ферментативные технологии, и проводить их скрининг в отношении связывания антигена так же, как и для интактных антител.

[0061] В контексте данного документа термин «площадь под кривой зависимости плазменной концентрации от времени» или «ППК» относится к скорости и степени элиминирования терапевтического агента после введения. В некоторых вариантах осуществления ППК определяют в течение определенного временного периода, такого как 12, 18, 24, 36, 48 или 72 часа, или до бесконечности, используя экстраполяцию на основании наклона кривой. Если не указано иное, ППК определяют до бесконечности (ППК_беск.). ППК также можно рассчитывать на дозу. Как и в случае многих других ФК-параметров, определение ППК можно проводить на одном животном или на популяции животных, для которой рассчитывают среднее значение.

[0062] В контексте данного документа термин «скорость выведения (клиренса)» или «CL» относится к определению способности организма элиминировать лекарственный препарат и выражается в объеме плазмы, очищенной от лекарственного препарата, в течение времени.

[0063] Выражение «полученный из», используемое в отношении перестроенного гена вариабельной области, «полученного из» неперестроенной вариабельной области и/или неперестроенных генных сегментов вариабельной области, относится к возможности отследить последовательность перестроенного гена вариабельной области до группы неперестроенных генных сегментов вариабельной области, которые были перестроены для образования гена, который экспрессирует вариабельный домен (с учетом, в случае целесообразности, разницы в сплайсинге и соматических мутаций). Например, перестроенный ген вариабельной области, подвергшийся соматической мутации, все еще считается полученным из неперестроенных генных сегментов вариабельной области. В некоторых вариантах осуществления, в которых эндогенный локус замещен универсальным локусом легкой цепи или тяжелой цепи, термин «полученный из» указывает на возможность отследить источник последовательности до указанного перестроенного локуса даже в случае, когда последовательность подверглась соматическим мутациям.

[0064] В контексте данного документа выражение «эндогенный ген» или «эндогенный генный сегмент» относится к гену или генному сегменту, находившемуся в родительском или референсном организме до внесения разрыва, делеции, замены, изменения или модификации, как описано в данном документе. В некоторых вариантах осуществления референсный организм представляет собой организм дикого типа. В некоторых вариантах осуществления референсный организм представляет собой сконструированный организм. В некоторых вариантах осуществления референсный организм представляет собой выращенный в лаборатории организм (дикого типа или сконструированный).

[0065] Термин «in vivo восстановление» или «IVR» относится к постепенному восстановлению (K-значению), которое представляет собой разность наблюдаемой пиковой активности и уровня до введения дозы, деленную на дозу. IVR также можно рассчитывать в процентном виде. Среднее значение IVR можно определять для популяции животных или же индивидуальное значение IVR можно определять для одного животного.

[0066] В контексте данного документа термин «локус» относится к участку в хромосоме, который содержит набор родственных генетических элементов (например, генов, генных сегментов, регуляторных элементов). Например, неперестроенный локус иммуноглобулина может содержать генные сегменты вариабельной области иммуноглобулина, один или более генов константной области иммуноглобулина и связанные с ними регуляторные элементы (например, промоторы, энхансеры, элементы переключения и т.д.), которые управляют рекомбинацией V(D)J и экспрессией иммуноглобулина. Локус может быть эндогенным или неэндогенным. Термин «эндогенный локус» относится к участку в хромосоме, в котором конкретный генетический элемент встречается в природе. В некоторых вариантах осуществления эндогенный локус имеет последовательность, встречающуюся в природе. В некоторых вариантах осуществления эндогенный локус представляет собой локус дикого типа. В некоторых вариантах осуществления эндогенный локус представляет собой сконструированный локус. Например, эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина мыши относится к участку в мышиной хромосоме 12, который содержит генные сегменты вариабельной области тяжелой цепи и гены константной области иммуноглобулина у мыши дикого типа, эндогенный локус легкой цепи λ иммуноглобулина мыши относится к участку в мышиной хромосоме 16, который содержит генные сегменты вариабельной области легкой цепи λ и гены константной области иммуноглобулина у мыши дикого типа, тогда как эндогенный локус легкой цепи κ иммуноглобулина мыши относится к участку в мышиной хромосоме 6, который содержит генные сегменты вариабельной области легкой цепи κ и гены константной области иммуноглобулина у мыши дикого типа.

[0067] Можно сказать, что неперестроенные генные сегменты вариабельной области «функционально связаны» с непрерывным геном константной области, если неперестроенные генные сегменты вариабельной области способны к перестройке с образованием перестроенного гена вариабельной области, который экспрессируется в сочетании с геном константной области в виде полипептидной цепи или антигенсвязывающего белка.

[0068] Термины «полинуклеотид» и «нуклеиновая кислота» используют взаимозаменяемо. Они относятся к полимерной форме нуклеотидов любой длины, как дезоксирибонуклеотидов, так и рибонуклеотидов, или их аналогов. Полинуклеотиды могут иметь любую трехмерную структуру и могут выполнять любую функцию. Неограничивающие примеры полинуклеотидов включают: кодирующие или некодирующие области гена или генного фрагмента, локусы (локус), определенные по анализу связей, экзоны, интроны, матричную РНК (мРНК), транспортную РНК, рибосомальную РНК, рибозимы, кДНК, рекомбинантные полинуклеотиды, разветвленные полинуклеотиды, плазмиды, векторы, выделенную ДНК любой последовательности, выделенную РНК любой последовательности, зонды на основе нуклеиновых кислот и праймеры. Полинуклеотид может содержать модифицированные нуклеотиды, такие как метилированные нуклеотиды и нуклеотидные аналоги. В случае наличия модификации в нуклеотидной структуре могут быть осуществлены до или после сборки полимера. Полинуклеотид можно дополнительно модифицировать, например, путем конъюгации с метящим компонентом. Во всех нуклеотидных последовательностях, приведенных в данном документе, нуклеотиды U взаимно заменяются нуклеотидами T.

[0069] Термин «неперестроенный» включает состояние локуса вариабельной области или генных сегментов вариабельной области иммуноглобулина, в которых генные сегменты V и генные сегменты J (в случае тяжелых вариабельных областей также и генные сегменты D) присутствуют по отдельности, но способны к соединению с образованием перестроенного гена V(D)J («гена вариабельной области»), который содержит один V,(D),J из репертуара V(D)J.

[0070] В контексте данного документа термин «объем распределения в равновесном состоянии» или «Vss» относится к кажущемуся пространству (объему), в котором распределен лекарственный препарат. Конкретнее, Vss представляет количество лекарственного препарата в организме животного, деленное на плазменную концентрацию в равновесном состоянии.

[0071] В контексте данного документа термин «генный сегмент C_H» (например, генный сегмент Cγ1, генный сегмент C_γ2a, генный сегмент C_γ2c, генный сегмент C_μ, генный сегмент C_γ2b, генный сегмент C_γ3, генный сегмент C_δ, генный сегмент Cε, генный сегмент C_α и т. д.) относится к сегменту последовательности ДНК, который кодирует константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, и может взаимозаменяемо использоваться с термином ген C_H (например, ген Cγ, ген C_γ2a, ген C_γ2c, ген C_γ3, ген C_γ2b, ген Cμ, ген C_δ, ген Cε, ген C_α и т. д.). Например, генный сегмент Cγ1 или генный сегмент Cγ1 относится к сегменту последовательности ДНК, который кодирует константную область IgG1. Термин «локус генного сегмента C_H» относится к участку в хромосоме, в котором в природном состоянии находится генный сегмент C_H или ген C_H.

Генетически модифицированные локусы

[0072] В определенных аспектах в данном документе предложены генетически модифицированные грызуны (например, мыши или крысы), применимые для in vivo тестирования терапевтических агентов, содержащих Fc человека, на генетически модифицированных грызунах (например, тестирования фармакокинетических и/или фармакодинамических свойств такого терапевтического агента на генетически модифицированных грызунах). В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированные грызуны содержат генетически модифицированные локусы, которые кодируют тяжелые цепи антител, содержащих Fc человека (например, Fc IgG1 человека, Fc IgG4 человека). В некоторых вариантах осуществления грызуны содержат генетически модифицированные локусы, которые кодируют, полностью или частично, легкие цепи человека (например, которые кодируют легкие цепи γ или легкие цепи κ). В определенных вариантах осуществления генетически модифицированные грызуны содержат один или более локусов, которые кодируют Fc-рецепторы с человеческим внеклеточным доменом (например, α-цепь неонатального Fc-рецептора (FcRn), полипептид β-2-микроглобулина (β2M), α-цепь Fc-ε-рецептора 1 α (FcεR1α), α-цепь Fc-γ-рецептора 1 альфа (FcγR1a), α-цепь Fc-гамма-рецептора 2a (FcγR2a), α-цепь Fc-гамма-рецептора 2b (FcγR2b), α-цепь Fc-гамма-рецептора 3a (FcγR3a), α-цепь Fc-гамма-рецептора 3b (FcγR3b), α-цепь Fc-гамма-рецептора 2c (FcγR2c)). В определенных вариантах осуществления трансмембранный и цитоплазматический домен, кодируемый такими локусами, может быть человеческим или не человеческим (например, грызуна).

Гуманизированные локусы тяжелой цепи иммуноглобулина

[0073] В определенных аспектах в данном документе предложены грызуны (например, мыши или крысы), содержащие генетически модифицированные локусы тяжелой цепи иммуноглобулина (Ig). Такие локусы в общем случае содержат вариабельную область и константную область. Вариабельная область содержит генные сегменты вариабельной области тяжелой цепи Ig (например, по меньшей мере генный сегмент V_H, генный сегмент D_H и генный сегмент J_H). Локус константной области содержит один или более генных сегментов константной области тяжелой цепи Ig (C_H). В определенных вариантах осуществления вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина таким образом, чтобы грызун вырабатывал антитела, содержащие вариабельные домены, полученные из генного сегмента V_H, генного сегмента D_H и генного сегмента J_H, и константные домены тяжелой цепи, полученные из генного сегмента C_H.

[0074] В некоторых вариантах осуществления вариабельная область представляет собой неперестроенную вариабельную область и содержит неперестроенные генные сегменты вариабельной области. В некоторых вариантах осуществления вариабельная область представляет собой перестроенную вариабельную область и, следовательно, содержит перестроенный ген вариабельной области. В определенных вариантах осуществления генные сегменты вариабельной области Ig представляют собой генные сегменты вариабельной области человека. В определенных вариантах осуществления генные сегменты вариабельной области Ig представляют собой генные сегменты вариабельной области грызуна (например, крысы или мыши) (например, генные сегменты вариабельной области крысы или мыши). В определенных вариантах осуществления локус вариабельной области тяжелой цепи Ig содержит генные сегменты вариабельной области Ig человека. Типовые локусы вариабельной области, содержащие генные сегменты вариабельной области человека, описаны в данной области техники. Например, такие локусы описаны в патентах США №№5770429, 5814318, 6114598, 6998514, 8232449, 8502018 и 8697940, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки, и в публикациях патентов США №№2008/0098490, 2012/0167237, 2013/0145484, 2013/0326647, 2014/013275 и 2014/093908, каждая из которых включена в данный документ посредством ссылки.

[0100] В определенных вариантах осуществления локус вариабельной области тяжелой цепи Ig содержит неперестроенные генные сегменты вариабельной области тяжелой цепи Ig человека. В некоторых вариантах осуществления неперестроенные генные сегменты вариабельной области Ig человека содержат один или более сегментов V_H человека, один или более сегментов D_H человека и один или более сегментов J_H человека. В некоторых вариантах осуществления неперестроенные генные сегменты вариабельной области Ig человека содержат по меньшей мере 3 генных сегмента V_H, по меньшей мере 18 генных сегментов V_H, по меньшей мере 20 генных сегментов V_H, по меньшей мере 30 генных сегментов V_H, по меньшей мере 40 генных сегментов V_H, по меньшей мере 50 генных сегментов V_H, по меньшей мере 60 генных сегментов V_H, по меньшей мере 70 генных сегментов V_H или по меньшей мере 80 генных сегментов V_H. В некоторых определенных вариантах осуществления сконструированный локус (или сконструированный аллель) IgH содержит все или практически все функциональные генные сегменты V_H человека, находящиеся между генными сегментами V_H3-74 человека и V_H6-1 человека включительно, локуса IgH человека, который встречается в природе. В некоторых определенных вариантах осуществления сконструированный локус (или сконструированный аллель) IgH содержит по меньшей мере генные сегменты V_H человека V_H3-74, V_H3-73, V_H3-72, V_H2-70, V_H1-69, V_H3-66, V_H3-64, V_H4-61, V_H4-59, V_H1-58, V_H3-53, V_H5-51, V_H3-49, V_H3-48, V_H1-46, V_H1-45, V_H3-43, V_H4-39, V_H4-34, V_H3-33, V_H4-31, V_H3-30, V_H4-28, V_H2-26, V_H1-24, V_H3-23, V_H3-21, V_H3-20, V_H1-18, V_H3-15, V_H3-13, V_H3-11, V_H3-9, V_H1-8, V_H3-7, V_H2-5, V_H7-4-1, V_H4-4, V_H1-3, V_H1-2 и V_H6-1. В некоторых вариантах осуществления предложенные в данном документе отличные от человека животные имеют ограниченный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, характеризующийся одним полиморфным генным сегментом V_H человека, некоторым количеством генных сегментов D_H и некоторым количеством генных сегментов J_H (например, как описано в публикации патента США №2013/0096287, которая включена в данный документ посредством ссылки). В некоторых вариантах осуществления генный сегмент V_H представляет собой V_H1-2 или V_H1-69. В некоторых вариантах осуществления предложенные в данном документе отличные от человека животные имеют перестроенную вариабельную область тяжелой цепи (последовательность, кодирующую универсальную вариабельную область тяжелой цепи или общую тяжелую цепь, например, как описано в публикации патента США №20140245468 и патентах США №№9204624 и 9930871, которые все в полном объеме включены в данный документ посредством ссылки). В некоторых вариантах осуществления предложенные в данном документе отличные от человека животные содержат неперестроенные генные сегменты легкой цепи иммуноглобулина человека, например, κ, функционально связанные с геном константной области тяжелой цепи в локусе тяжелой цепи иммуноглобулина (например, патент США №9516868, в полном объеме включенный в данный документ посредством ссылки).

[0101] В других вариантах осуществления отличный от человека организм может содержать в зародышевой линии и/или геноме локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит вставки и/или замены кодонов гистидина, предназначенные для придания pH-зависимых свойств связывания антителам, вырабатываемым в таком отличном от человека организме. В некоторых таких вариантах осуществления вставка и/или замена кодонов гистидина проведена в последовательностях нуклеиновых кислот, кодирующих CDR3. Различные такие локусы тяжелой цепи иммуноглобулина приведены в патентах США №№9301510, 9334334, публикациях заявок на патенты США №№2013/0247236, 20140013456, включенных в данный документ посредством ссылки.

[0102] В некоторых вариантах осуществления сконструированный локус (или сконструированный аллель) IgH содержит 5, 10, 15, 20, 25 или более (например, 26, 27 и т. д.) генных сегментов D_H человека. В некоторых определенных вариантах осуществления сконструированный локус (или сконструированный аллель) IgH содержит все или практически все функциональные генные сегменты D_H человека, находящиеся между генными сегментами D_H1-1 человека и D_H7-27 человека включительно, локуса IgH человека, который встречается в природе. В некоторых определенных вариантах осуществления сконструированный локус (или сконструированный аллель) IgH содержит по меньшей мере генные сегменты D_H человека D_H1-1, D_H2-2, D_H3-3, D_H4-4, D_H5-5, D_H6-6, D_H1-7, D_H2-8, D_H3-9, D_H3-10, D_H5-12, D_H6-13, D_H2-15, D_H3-16, D_H4-17, D_H6-19, D_H1-20, D_H2-21, D_H3-22, D_H6-25, D_H1-26 и D_H7-27. В некоторых вариантах осуществления неперестроенные генные сегменты Ig человека содержат все генные сегменты D_H человека.

[0103] В некоторых вариантах осуществления сконструированный локус (или сконструированный аллель) IgH содержит 1, 2, 3, 4, 5, 6 или более функциональных генных сегментов J_H человека. В некоторых определенных вариантах осуществления сконструированный локус (или сконструированный аллель) IgH содержит все или практически все функциональные генные сегменты J_H человека, находящиеся между генными сегментами J_H1 человека и J_H6 человека включительно, локуса IgH человека, который встречается в природе. В некоторых определенных вариантах осуществления сконструированный локус (или сконструированный аллель) IgH содержит по меньшей мере генные сегменты J_H человека J_H1, J_H2, J_H3, J_H4, J_H5 и J_H6. В некоторых вариантах осуществления неперестроенные генные сегменты Ig человека содержат все генные сегменты J_H человека.

[0104] В некоторых вариантах осуществления описанный в данном документе сконструированный локус IgH не содержит эндогенный ген Adam6. В некоторых вариантах осуществления описанный в данном документе сконструированный локус IgH не содержит эндогенный ген Adam6 (или последовательность, кодирующую Adam6) в той же геномной позиции зародышевой линии, что и в геноме зародышевой линии отличного от человека животного дикого типа того же вида. В некоторых вариантах осуществления описанный в данном документе сконструированный локус IgH не содержит псевдоген Adam6 человека. В некоторых вариантах осуществления описанный в данном документе сконструированный локус IgH содержит вставку по меньшей мере одной нуклеотидной последовательности, которая кодирует один или более не принадлежащих человеку (например, принадлежащих грызуну) полипептидов Adam6. Указанная вставка может находиться за пределами сконструированного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина, описанного в данном документе (например, выше самого крайнего 5' генного сегмента V_H), в сконструированном локусе IgH или в любом другом месте в геноме зародышевой линии отличного от человека животного (например, случайно внесенной кодирующей не принадлежащий человеку Adam6 последовательности), клетки или ткани.

[0105] В некоторых вариантах осуществления в сконструированном эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина отсутствует функциональный эндогенный ген Adam6 грызуна. В некоторых вариантах осуществления геном зародышевой линии грызуна, содержащий сконструированный локус тяжелой цепи, содержит одну или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих один или более полипептидов ADAM6 грызуна, их функциональных ортологов, функциональных гомологов или функциональных фрагментов. В некоторых вариантах осуществления происходит экспрессия одного или более полипептидов ADAM6 грызуна, их функциональных ортологов, функциональных гомологов или функциональных фрагментов (например, в клетке мужской репродуктивной системы, например в клетке яичек).

[0106] В некоторых вариантах осуществления одна или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих один или более полипептидов ADAM6 грызуна, их функциональных ортологов, функциональных гомологов или функциональных фрагментов, включены в ту же хромосому, что и сконструированный эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления одна или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих один или более полипептидов ADAM6 грызуна, их функциональных ортологов, функциональных гомологов или функциональных фрагментов, включены в сконструированный эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления одна или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих один или более полипептидов ADAM6 грызуна, их функциональных ортологов, функциональных гомологов или функциональных фрагментов, находятся между первым генным сегментом V_H человека и вторым генным сегментом V_H человека. В некоторых вариантах осуществления первый генный сегмент V_H человека представляет собой V_H1-2, а второй генный сегмент V_H человека представляет собой V_H6-1. В некоторых вариантах осуществления одна или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих один или более полипептидов ADAM6 грызуна, их функциональных ортологов, функциональных гомологов или функциональных фрагментов, находятся на месте псевдогена Adam6 человека. В некоторых вариантах осуществления одна или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих один или более полипептидов ADAM6 грызуна, их функциональных ортологов, функциональных гомологов или функциональных фрагментов, замещают псевдоген Adam6 человека. В некоторых вариантах осуществления одна или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих один или более полипептидов ADAM6 грызуна, их функциональных ортологов, функциональных гомологов или функциональных фрагментов, находятся между генным сегментом V_H человека и генным сегментом D_H человека.

[0107] Примеры вариабельных областей Ig, содержащих генные сегменты тяжелой цепи Ig, приведены, например, в Macdonald et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 111:5147-52 и справочной информации, которая включена в данный документ посредством ссылки. Такие мыши описаны, например, в патентах США №№8642835 и 8697940, включенных в данный документ посредством ссылки.

[0108] В некоторых вариантах осуществления генный локус вариабельной области тяжелой цепи Ig, содержащий неперестроенные генные сегменты вариабельной области тяжелой цепи Ig человека, также содержит межгенные последовательности вариабельной области тяжелой цепи Ig человека. В некоторых вариантах осуществления генный локус вариабельной области тяжелой цепи Ig содержит не принадлежащие человеку (например, принадлежащие грызуну, крысе, мыши) межгенные последовательности вариабельной области тяжелой цепи Ig. В некоторых вариантах осуществления локус IgH содержит не принадлежащие человеку регуляторные элементы (например, не принадлежащие человеку промоторы и/или энхансеры). В некоторых вариантах осуществления не принадлежащие человеку регуляторные элементы представляют собой регуляторные элементы грызуна (например, крысиные или мышиные промоторы или энхансеры). В некоторых вариантах осуществления локус IgH содержит энхансер IgM (Eμ). В некоторых вариантах осуществления энхансер IgM представляет собой не принадлежащий человеку Eμ (например, Eμ грызуна, такой как мышиный или крысиный Eμ).

[0109] В некоторых вариантах осуществления вариабельная область тяжелой цепи Ig представляет собой перестроенную вариабельную область, содержащую ген вариабельной области тяжелой цепи Ig (универсальной вариабельной области тяжелой цепи). В некоторых вариантах осуществления ген перестроенной вариабельной области тяжелой цепи Ig представляет собой ген перестроенной вариабельной области тяжелой цепи Ig человека. Примеры перестроенных вариабельных областей тяжелой цепи Ig приведены в публикации патента США №2014/0245468, которая включена в данный документ посредством ссылки.

[0110] В определенных вариантах осуществления константная область иммуноглобулина содержит генный сегмент C_H, кодирующий константный домен IgG, содержащий домен C_H1 человека, шарнирную область человека, домен C_H2 человека, домен C_H3 человека, трансмембранный домен IgG и цитоплазматический домен IgG. В определенных вариантах осуществления трансмембранный домен IgG представляет собой трансмембранный домен IgG грызуна (например, мышиный или крысиный трансмембранный домен). В определенных вариантах осуществления трансмембранный домен представляет собой трансмембранный домен IgG человека. В некоторых вариантах осуществления цитоплазматический домен IgG представляет собой цитоплазматический домен IgG грызуна (например, мышиный или крысиный цитоплазматический домен). В некоторых вариантах осуществления цитоплазматический домен IgG представляет собой цитоплазматический домен IgG человека. В некоторых вариантах осуществления соединительная область IgG представляет собой соединительную область IgG грызуна (например, мышиный или крысиный соединительный домен). В определенных вариантах осуществления соединительный домен IgG представляет собой соединительный домен IgG человека.

[0111] В определенных вариантах осуществления домен C_H1 человека, шарнирная область человека, домен C_H2 человека и домен C_H3 человека представляют собой домены IgG1. В некоторых вариантах осуществления такой домен IgG1 кодируется аллелем, выбранным из IGHG1*01, IGHG1*02, IGHG1*03, IGHG1*04 и IGHG1*05.

[0112] В определенных вариантах осуществления домен C_H1 человека, шарнирная область человека, домен C_H2 человека и домен C_H3 человека представляют собой домены IgG2. В некоторых вариантах осуществления такой домен IgG2 кодируется аллелем, выбранным из IGHG2*01, IGHG2*02, IGHG2*03, IGHG2*04, IGHG2*05 и IGHG2*06.

[0113] В определенных вариантах осуществления домен C_H1 человека, шарнирная область человека, домен C_H2 человека и домен C_H3 человека представляют собой домены IgG3. В некоторых вариантах осуществления такой домен IgG3 кодируется аллелем, выбранным из IGHG3*01, IGHG3*02, IGHG3*03, IGHG3*04, IGHG3*05, IGHG3*06, IGHG3*07, IGHG3*08, IGHG3*09, IGHG3*10, IGHG3*11, IGHG3*12, IGHG3*13, IGHG3*14, IGHG3*15, IGHG3*16, IGHG3*17, IGHG3*18 и IGHG3*19.

[0114] В определенных вариантах осуществления домен C_H1 человека, шарнирная область человека, домен C_H2 человека и домен C_H3 человека представляют собой домены IgG4. В некоторых вариантах осуществления такой домен IgG4 кодируется аллелем, выбранным из IGHG4*01, IGHG4*02, IGHG4*03 и IGHG4*04.

[0115] В некоторых вариантах осуществления генный сегмент C_H кодирует вариантную последовательность константной области тяжелой цепи иммуноглобулина человека (т. е. последовательность константной области тяжелой цепи иммуноглобулина человека, которая содержит одну или более добавок, делеций и/или замен по сравнению с соответствующей референсной последовательностью константной области тяжелой цепи иммуноглобулина человека), которая характеризуется повышенной или сниженной эффекторной функцией и/или аффинностью в отношении FcR по сравнению с референсной константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина человека.

[0116] В некоторых вариантах осуществления генный сегмент C_H кодирует константную область тяжелой цепи иммуноглобулина человека, характеризующуюся измененной аффинностью в отношении активирующих и/или ингибирующих рецепторов. В некоторых вариантах осуществления генный сегмент C_H кодирует константную область тяжелой цепи иммуноглобулина человека, характеризующуюся повышенным или сниженным связыванием с FcRn-рецептором, например, при кислом pH по сравнению с нейтральным pH. В некоторых вариантах осуществления генный сегмент C_H, который кодирует константную область тяжелой цепи иммуноглобулина человека, полностью или частично, кодирует константную область тяжелой цепи иммуноглобулина человека, имеющую одну или более аминокислотных модификаций. Примеры аминокислотных модификаций включают, но не ограничиваются этим, замену в позиции 297 (например, N297A), позиции 250 (например, 250E или 250Q), позиции 252 (например, 252L, 252Y, 252F, 252W или 252T), позиции 254 (например, 254S или 254T), позиции 256 (например, 256S, 256R, 256Q, 256E, 256D, или 256T), позиции 307 (например, 307P или 307A), позиции 308 (например, 308F или 308V), позиции 428 (например, 428L или 428F), позиции 433 (например, 433H, 433Lm, 433R, 433S, 433P, 433Q или 433K), позиции 434 (например, 434A, 434W, 434H, 434F или 434Y) и их комбинации. В некоторых вариантах осуществления генный сегмент C_H кодирует константную область тяжелой цепи иммуноглобулина человека, имеющую одну или более пар или групп аминокислотных модификаций, выбранных из группы, состоящей из 250Q и 248L (например, T250Q и M248L); 252Y, 254T и 256E (например, M252Y, S254T и T256E); 428L и 434S (например, M428L и N434S); 257I и 311I (например, P257I и Q311I); 257I и 434H (например, P257I и N434H); 376V и 434H (например, D376V и N434H); 307A, 380A и 434A (например, T307A, E380A и N434A); и 433K и 434F (например, H433K и N434F).

[0117] В некоторых вариантах осуществления генный сегмент C_H кодирует химерный константный домен тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит сегменты или части, полученные из иммуноглобулина человека более чем одного изотипа (или которые встречаются в них). Например, такая химерная область C_H может содержать домен C_H2, полученный из молекулы IgG1 человека, IgG2 человека или IgG4 человека, в комбинации с доменом C_H3, полученным из молекулы IgG1 человека, IgG2 человека или IgG4 человека. В некоторых определенных вариантах осуществления химерная область C_H дополнительно содержит химерную шарнирную область. Например, химерная шарнирная область может содержать «верхнюю шарнирную» аминокислотную последовательность (аминокислотные остатки от позиции 216 до 227 в соответствии с нумерацией EU), полученную из шарнирной области IgG1 человека, IgG2 человека или IgG4 человека, в комбинации с «нижней шарнирной» последовательностью (аминокислотные остатки от позиции 228 до 236 в соответствии с нумерацией EU), полученной из шарнирной области IgG1 человека, IgG2 человека или IgG4 человека. В некоторых определенных вариантах осуществления химерная шарнирная область содержит аминокислотные остатки, полученные из верхней шарнирной области IgG1 человека или IgG4 человека, и аминокислотные остатки, полученные из нижней шарнирной области IgG2 человека.

[0118] В определенных вариантах осуществления модифицированный генный сегмент C_H расположен в локусе эндогенного генного сегмента C_H. В определенных вариантах осуществления модифицированный генный сегмент C_H расположен в локусе эндогенного генного сегмента C_γ1, локусе эндогенного генного сегмента C_γ2a, локусе эндогенного генного сегмента C_γ2b, локусе эндогенного генного сегмента C_γ2c или локусе эндогенного генного сегмента C_γ3 .

[0119] Структура эндогенного гена константной области тяжелой цепи иммуноглобулина может варьироваться между грызунами. Например, норвежская крыса не имеет генный сегмент C_γ3 в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина, тогда как мышиные линии в общем случае имеют его. Даже в рамках одного вида константная область тяжелой цепи иммуноглобулина может варьироваться между линиями. Например, тогда как некоторые линии мышей имеют генный сегмент C_γ2a в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина, другие линии мышей (например, линии мышей с аллелью Igh1-b) имеют вместо этого генный сегмент C_γ2c, а некоторые линии мышей могут иметь оба генных сегмента, C_γ2a и C_γ2c. Генные сегменты C_γ1, C_γ2a, C_γ2b и C_γ3 грызунов, раскрытые на фигурах, в примерах и/или в описаниях в данном документе, следовательно, представляют собой примеры генных сегментов C_H грызунов, а специалисту в данной области техники понятно, что генная структура конкретной константной области будет варьироваться между линиями грызунов. Таким образом, например, специалисту в данной области техники понятно, что данное раскрытие предусматривает грызунов, содержащих генный сегмент C_γ2c грызуна вместо или в дополнение к любому раскрытому генному сегменту C_γ2a грызуна.

[0120] В некоторых вариантах осуществления модифицированный генный сегмент C_H представляет собой генный сегмент C_γ1 человека (или по меньшей мере часть генного сегмента C_γ1 человека, кодирующую домен C_H1, шарнирную область, домен C_H2 и домен C_H3 константного домена IgG1) и расположен в локусе эндогенного генного сегмента C_γ2a. В некоторых вариантах осуществления часть генного сегмента C_γ1 человека, кодирующая домен C_H1, шарнирную область, домен C_H2 и домен C_H3 константного домена IgG1, функционально связана с частью эндогенного генного сегмента C_γ2a грызуна, кодирующей трансмембранный и/или цитоплазматический домен IgG2a.

[0121] В некоторых вариантах осуществления модифицированный генный сегмент C_H представляет собой генный сегмент C_γ1 человека (или по меньшей мере часть генного сегмента C_γ1 человека, кодирующую домен C_H1, шарнирную область, домен C_H2 и домен C_H3 константного домена IgG1) и расположен в локусе эндогенного генного сегмента C_γ2c. В некоторых вариантах осуществления часть генного сегмента C_γ1 человека, кодирующая домен C_H1, шарнирную область, домен C_H2 и домен C_H3 константного домена IgG1, функционально связана с частью эндогенного генного сегмента C_γ2c грызуна, кодирующей трансмембранный и/или цитоплазматический домен IgG2c.

[0122] В некоторых вариантах осуществления модифицированный генный сегмент C_H представляет собой генный сегмент C_γ4 человека (или по меньшей мере часть генного сегмента C_γ4 человека, кодирующую домен C_H1, шарнирную область, домен C_H2 и домен C_H3 константного домена IgG4) и расположен в локусе эндогенного генного сегмента C_γ1. В некоторых вариантах осуществления часть генного сегмента C_γ4 человека, кодирующая домен C_H1, шарнирную область, домен C_H2 и домен C_H3 константного домена IgG4, функционально связана с частью эндогенного генного сегмента C_γ1 грызуна, кодирующей трансмембранный и/или цитоплазматический домен IgG1.

[0123] В определенных вариантах осуществления модифицированный генный сегмент C_H замещает весь или часть эндогенного генного сегмента C_H. В определенных вариантах осуществления модифицированный генный сегмент C_H замещает весь или часть эндогенного генного сегмента C_γ1, эндогенного генного сегмента C_γ2a, эндогенного генного сегмента C_γ2b, эндогенного генного сегмента C_γ2c или эндогенного генного сегмента C_γ3.

[0124] В некоторых вариантах осуществления модифицированный генный сегмент C_H представляет собой генный сегмент C_γ1 человека (или по меньшей мере часть генного сегмента C_γ1 человека, кодирующую домен C_H1, шарнирную область, домен C_H2 и домен C_H3 константного домена IgG1) и замещает весь или часть локуса эндогенного генного сегмента C_γ2a. В некоторых вариантах осуществления часть генного сегмента C_γ1 человека, кодирующая домен C_H1, шарнирную область, домен C_H2 и домен C_H3 константного домена IgG1, замещает часть эндогенного генного сегмента C_γ2a грызуна, кодирующую домен C_H1, шарнирную область, домен C_H2 и домен C_H3 константного домена IgG2a, так что часть генного сегмента C_γ1 человека, кодирующая домен C_H1, шарнирную область, домен C_H2 и домен C_H3 константного домена IgG1, функционально связана с частью эндогенного генного сегмента C_γ2a грызуна, кодирующей трансмембранный и/или цитоплазматический домен IgG2a.

[0125] В некоторых вариантах осуществления модифицированный генный сегмент C_H представляет собой генный сегмент C_γ4 человека (или по меньшей мере часть генного сегмента C_γ4 человека, кодирующую домен C_H1, шарнирную область, домен C_H2 и домен C_H3 константного домена IgG4) и замещает весь или часть локуса эндогенного генного сегмента C_γ1. В некоторых вариантах осуществления часть генного сегмента C_γ4 человека, кодирующая домен C_H1, шарнирную область, домен C_H2 и домен C_H3 константного домена IgG4, замещает часть эндогенного генного сегмента C_γ1 грызуна, кодирующую домен C_H1, шарнирную область, домен C_H2 и домен C_H3 константного домена IgG1, так что часть генного сегмента C_γ4 человека, кодирующая домен C_H1, шарнирную область, домен C_H2 и домен C_H3 константного домена IgG4, функционально связана с частью эндогенного генного сегмента C_γ1 грызуна, кодирующей трансмембранный и/или цитоплазматический домен IgG1.

[0126] В определенных вариантах осуществления константная область тяжелой цепи Ig содержит один или более генных сегментов C_H грызуна (например, крысы или мыши). В некоторых вариантах осуществления константная область Ig содержит генный сегмент C_μ грызуна (например, крысы или мыши). В некоторых вариантах осуществления константная область Ig содержит генный сегмент C_δ грызуна (например, крысы или мыши). В некоторых вариантах осуществления константная область Ig содержит генный сегмент C_γ1 грызуна (например, крысы или мыши). В некоторых вариантах осуществления константная область Ig содержит генный сегмент C_γ2a грызуна (например, крысы или мыши). В некоторых вариантах осуществления константная область Ig содержит генный сегмент C_γ2b грызуна (например, крысы или мыши). В некоторых вариантах осуществления константная область Ig содержит генный сегмент C_γ2c грызуна (например, крысы или мыши). В некоторых вариантах осуществления константная область Ig содержит генный сегмент C_γ3 грызуна (например, мыши). В некоторых вариантах осуществления константная область Ig содержит генный сегмент C_ε грызуна (например, крысы или мыши). В некоторых вариантах осуществления константная область Ig содержит генный сегмент C_ε грызуна (например, крысы или мыши). В некоторых вариантах осуществления один или более генных сегментов константной области грызуна представляют собой эндогенные генные сегменты константной области. В некоторых вариантах осуществления модифицированный генный сегмент C_H, описанный выше, является единственным модифицированным генным сегментом C_H в константной области тяжелой цепи Ig.

[0127] В некоторых вариантах осуществления модифицированный генный сегмент C_H, описанный выше, представляет собой один из некоторого количества модифицированных генных сегментов C_H в константной области тяжелой цепи Ig (например, один из 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 модифицированных генных сегментов, которые являются частично или полностью гуманизированными, в константной области тяжелой цепи Ig). В некоторых вариантах осуществления константная область тяжелой цепи Ig содержит человеческий или частично человеческий генный сегмент C_μ. В некоторых вариантах осуществления константная область тяжелой цепи Ig содержит человеческий или частично человеческий генный сегмент C_δ. В некоторых вариантах осуществления константная область тяжелой цепи Ig содержит человеческий или частично человеческий генный сегмент C_γ1. В некоторых вариантах осуществления константная область тяжелой цепи Ig содержит человеческий или частично человеческий генный сегмент C_γ2. В некоторых вариантах осуществления константная область тяжелой цепи Ig содержит человеческий или частично человеческий генный сегмент C_γ3. В некоторых вариантах осуществления константная область тяжелой цепи Ig содержит человеческий или частично человеческий генный сегмент C_γ4. В некоторых вариантах осуществления константная область тяжелой цепи Ig содержит человеческий или частично человеческий генный сегмент C_ε. В некоторых вариантах осуществления константная область тяжелой цепи Ig содержит человеческий или частично человеческий генный сегмент C_α. В некоторых вариантах осуществления константная область тяжелой цепи Ig содержит человеческий генный сегмент C_μ, человеческий генный сегмент C_δ, человеческий генный сегмент C_γ1 и человеческий генный сегмент C_γ3. В некоторых вариантах осуществления константная область тяжелой цепи Ig дополнительно содержит человеческий генный сегмент C_γ2 и человеческий генный сегмент C_γ4. В некоторых вариантах осуществления константная область тяжелой цепи Ig дополнительно содержит человеческий генный сегмент C_α. В некоторых вариантах осуществления константная область тяжелой цепи Ig дополнительно содержит человеческий генный сегмент C_ε.

[0128] В некоторых вариантах осуществления локус IgH содержит регуляторные элементы человека или грызуна (например, крысы или мыши). В некоторых вариантах осуществления регуляторный элемент представляет собой эндогенный регуляторный элемент. В определенных вариантах осуществления локус IgH содержит интронный энхансер (E_i) грызуна (например, крысы или мыши) или человека. В некоторых вариантах осуществления локус IgH содержит 3’ регуляторную область (3’ РО) грызуна (например, крысы или мыши) или человека.

[0129] В некоторых вариантах осуществления модифицированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина расположен в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления локус тяжелой цепи иммуноглобулина замещает весь или часть эндогенного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина. В определенных вариантах осуществления модифицированный локус IgH находится в трансгене, расположенном за пределами эндогенного локуса. В некоторых вариантах осуществления эндогенный локус IgH инактивирован (например, посредством делеции, перемещения и/или инверсии всего или части эндогенного локуса тяжелой цепи Ig).

[0130] Таким образом, в некоторых вариантах осуществления одна или более константных областей тяжелой цепи иммуноглобулина (или их частей) локуса тяжелой цепи иммуноглобулина не удалены (т. е. являются интактными). В некоторых вариантах осуществления один или более генных сегментов C_H локуса тяжелой цепи иммуноглобулина изменены, разрушены, удалены или замещены, помимо прочего, последовательностью константной области тяжелой цепи иммуноглобулина, описанной в данном документе (например, последовательностью, кодирующей полипептид C_H1-H-C_H2-C_H3 IgG человека), функционально связанной с кодирующей(ими) трансмембранный и цитоплазматический домен последовательностью(ями) гена константной области тяжелой цепи не принадлежащего человеку иммуноглобулина IgG (например, последовательностью, кодирующей M1 и/или M2 ), и, в некоторых вариантах осуществления, последовательностью константной области тяжелой цепи иммуноглобулина (например, последовательностью, кодирующей полипептид C_H1-C_H2-C_H3-C_H4 IgE человека), функционально связанной с кодирующей(ими) трансмембранный и цитоплазматический домен последовательностью(ями) гена константной области IgE. В некоторых вариантах осуществления вся или практически вся константная область тяжелой цепи иммуноглобулина замещена гетерологичной константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления гетерологичная константная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с кодирующей трансмембранный и цитоплазматический домен последовательностью (например, экзоны M1 и M2) одного или более генов константной области IgG. В некоторых вариантах осуществления гетерологичная константная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с кодирующей трансмембранный и цитоплазматический домен последовательностью (например, экзоны M1 и M2) гена константной области IgE. В некоторых вариантах осуществления гетерологичная константная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с кодирующей трансмембранный и цитоплазматический домен последовательностью (например, экзон(ы) M) гена константной области IgA. В некоторых вариантах осуществления один или более генных сегментов C_H (например, C_μ, C_δ и т. д.) не удалены или не замещены константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит гетерологичную последовательность константной области тяжелой цепи иммуноглобулина, функционально связанную с кодирующей трансмембранный и цитоплазматический домен последовательностью одного или более генов константной области, как описано в данном документе. В некоторых вариантах осуществления гетерологичная последовательность константной области тяжелой цепи иммуноглобулина представляет собой последовательность константной области тяжелой цепи иммуноглобулина человека. В некоторых вариантах осуществления константная область тяжелой цепи иммуноглобулина, которая была изменена, разрушена, удалена, замещена или сконструирована с использованием одной или более гетерологичных последовательностей константной области тяжелой цепи иммуноглобулина, представляет собой константную область тяжелой цепи иммуноглобулина мыши. В некоторых вариантах осуществления гетерологичная последовательность константной области тяжелой цепи иммуноглобулина вставлена в одну копию (т.е. аллель) гена константной области IgG (например, C_γ1, C_γ2a, C_γ2b, C_γ2c или C_γ3) из двух копий гена константной области IgG константной области тяжелой цепи иммуноглобулина, что позволяет получать отличное от человека животное, гетерозиготное в отношении гетерологичной последовательности константной области тяжелой цепи иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления предложено отличное от человека животное, гомозиготное в отношении константной области тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит гетерологичную последовательность константной области тяжелой цепи иммуноглобулина, описанную в данном документе.

[0131] В некоторых вариантах осуществления описанная в данном документе сконструированная константная область тяжелой цепи иммуноглобулина содержит один или более кодирующих IgG генных сегментов C_H, каждый из которых содержит последовательность, кодирующую внеклеточный домен человека (например, C_H1-H-C_H2-C_H3 IgG человека), функционально связанную с последовательностью, кодирующей не принадлежащий человеку трансмембранный и цитоплазматический домен (например, M1-M2 не принадлежащего человеку IgG) такого же или другого подкласса IgG.

[0132] В некоторых вариантах осуществления описанная в данном документе сконструированная константная область тяжелой цепи иммуноглобулина содержит один или более кодирующих IgG генных сегментов C_H, описанных в данном документе, и дополнительно содержит ген константной области C_μ дикого типа (например, не модифицированный и не принадлежащий человеку, например, крысиный или мышиный).

[0133] В некоторых вариантах осуществления описанная в данном документе сконструированная константная область тяжелой цепи иммуноглобулина содержит один или более кодирующих IgG генных сегментов C_H, описанных в данном документе, и дополнительно содержит гены константной области C_μ и C_δ дикого типа (например, не модифицированные и не принадлежащие человеку, например, крысиные или мышиные).

[0134] В различных вариантах осуществления сконструированный кодирующий IgG генный сегмент C_H, содержащий последовательность константной области тяжелой цепи иммуноглобулина человека, описанную в данном документе, представляет собой сконструированный кодирующий IgG генный сегмент C_H подкласса IgG, выбранный из C_γ1, C_γ2a, C_γ2b, C_γ2c или C_γ3.

[0135] В некоторых определенных вариантах осуществления сконструированная константная область тяжелой цепи иммуноглобулина, описанная в данном документе, содержит сконструированный генный сегмент C_γ2a, содержащий последовательность, кодирующую C_H1-H-C_H2-C_H3 IgG1 человека, вместо экзонов C_H1-H-C_H2-C_H3 и функционально связанную с экзонами M1 и M2 не принадлежащего человеку (например, крысиного или мышиного) генного сегмента C_γ2a.

[0136] В некоторых определенных вариантах осуществления сконструированная константная область тяжелой цепи иммуноглобулина, описанная в данном документе, содержит сконструированный генный сегмент C_γ2a, содержащий последовательность, кодирующую C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 IgG1 человека, вместо экзонов C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 и функционально связанную с областью переключения не принадлежащего человеку (например, крысиного или мышиного) генного сегмента C_γ2a.

[0137] В некоторых определенных вариантах осуществления сконструированная константная область тяжелой цепи иммуноглобулина, описанная в данном документе, содержит сконструированный генный сегмент C_γ2c, содержащий последовательность, кодирующую C_H1-H-C_H2-C_H3 IgG1 человека, вместо экзонов C_H1-H-C_H2-C_H3 и функционально связанную с экзонами M1 и M2 не принадлежащего человеку (например, крысиного или мышиного) генного сегмента C_γ2c.

[0138] В некоторых определенных вариантах осуществления сконструированная константная область тяжелой цепи иммуноглобулина, описанная в данном документе, содержит сконструированный генный сегмент C_γ2c, содержащий последовательность, кодирующую C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 IgG1 человека, вместо экзонов C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 и функционально связанную с областью переключения не принадлежащего человеку (например, крысиного или мышиного) генного сегмента C_γ2c.

[0139] В некоторых определенных вариантах осуществления сконструированная константная область тяжелой цепи иммуноглобулина, описанная в данном документе, содержит сконструированный генный сегмент C_γ1, содержащий последовательность, кодирующую C_H1-H-C_H2-C_H3 IgG4 человека, вместо экзонов C_H1-H-C_H2-C_H3 и функционально связанную с экзонами M1 и M2 не принадлежащего человеку (например, крысиного или мышиного) генного сегмента C_γ1.

[0140] В некоторых определенных вариантах осуществления сконструированная константная область тяжелой цепи иммуноглобулина, описанная в данном документе, содержит сконструированный генный сегмент C_γ1, содержащий последовательность, кодирующую C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 IgG4 человека, вместо экзонов C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 и функционально связанную с областью переключения не принадлежащего человеку (например, крысиного или мышиного) генного сегмента C_γ1.

[0141] В некоторых определенных вариантах осуществления сконструированная константная область тяжелой цепи иммуноглобулина, описанная в данном документе, содержит сконструированный генный сегмент C_γ2a, содержащий последовательность, кодирующую C_H1-H-C_H2-C_H3 IgG1 человека, вместо экзонов C_H1-H-C_H2-C_H3 и функционально связанную с экзонами M1 и M2 не принадлежащего человеку (например, крысиного или мышиного) генного сегмента C_γ2a, и сконструированный генный сегмент C_γ1, содержащий последовательность, кодирующую C_H1-H-C_H2-C_H3 IgG4 человека, вместо экзонов C_H1-H-C_H2-C_H3 и функционально связанную с экзонами M1 и M2 не принадлежащего человеку (например, крысиного или мышиного) генного сегмента C_γ1.

[0142] В некоторых определенных вариантах осуществления сконструированная константная область тяжелой цепи иммуноглобулина, описанная в данном документе, содержит сконструированный генный сегмент C_γ2a, содержащий последовательность, кодирующую C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 IgG1 человека, вместо экзонов C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 и функционально связанную с областью переключения не принадлежащего человеку (например, крысиного или мышиного) генного сегмента C_γ2a, и сконструированный генный сегмент C_γ1, содержащий последовательность, кодирующую C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 IgG4 человека, вместо экзонов C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 и функционально связанную с областью переключения не принадлежащего человеку (например, крысиного или мышиного) генного сегмента C_γ1.

[0143] В некоторых определенных вариантах осуществления сконструированная константная область тяжелой цепи иммуноглобулина, описанная в данном документе, содержит сконструированный генный сегмент C_γ2c, содержащий последовательность, кодирующую C_H1-H-C_H2-C_H3 IgG1 человека, вместо экзонов C_H1-H-C_H2-C_H3 и функционально связанную с экзонами M1 и M2 не принадлежащего человеку (например, крысиного или мышиного) генного сегмента C_γ2c, и сконструированный генный сегмент C_γ1, содержащий последовательность, кодирующую C_H1-H-C_H2-C_H3 IgG4 человека, вместо экзонов C_H1-H-C_H2-C_H3 и функционально связанную с экзонами M1 и M2 не принадлежащего человеку (например, крысиного или мышиного) генного сегмента C_γ1.

[0144] В некоторых определенных вариантах осуществления сконструированная константная область тяжелой цепи иммуноглобулина, описанная в данном документе, содержит сконструированный генный сегмент C_γ2c, содержащий последовательность, кодирующую C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 IgG1 человека, вместо экзонов C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 и функционально связанную с областью переключения не принадлежащего человеку (например, крысиного или мышиного) генного сегмента C_γ2c, и сконструированный генный сегмент C_γ1, содержащий последовательность, кодирующую C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 IgG4 человека, вместо экзонов C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 и функционально связанную с областью переключения не принадлежащего человеку (например, крысиного или мышиного) генного сегмента C_γ1.

[0145] В различных вариантах осуществления описанная в данном документе сконструированная константная область тяжелой цепи иммуноглобулина содержит одну или более дополнительных модификаций, в том числе обеспечивающих нефункциональность генов константной области (т.е. изотипов), отличной от одной или более константных областей IgG, которые содержат последовательность, кодирующую C_H1-H-C_H2-C_H3 IgG человека или C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 IgG человека (например, IgG1 и/или IgG2a), например, посредством делеции, полной или частичной, изменения, полного или частичного, разрушения, полного или частичного, замещения, полного или частичного, одного или более генов константной области иммуноглобулина, кодирующих IgD, IgE, IgA и IgG, которые сами не содержат последовательность, кодирующую C_H1-H-C_H2-C_H3 IgG человека или C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 IgG человека, описанные в данном документе (например, IgG2b и/или IgG3). Также предложены сконструированные не принадлежащие человеку эмбрионы, клетки и нацеливающие векторы для создания таких отличных от человека животных, эмбрионов и клеток.

[0146] В некоторых определенных вариантах осуществления сконструированная константная область тяжелой цепи иммуноглобулина, предложенная в данном документе, содержит генный сегмент C_μ дикого типа (например, немодифицированный и не принадлежащий человеку, например, крысиный или мышиный), генный сегмент C_γ1, содержащий последовательность, кодирующую C_H1-H-C_H2-C_H3 IgG4 человека, вместо экзонов C_H1-H-C_H2-C_H3 и функционально связанную с экзонами M1-M2 указанного генного сегмента C_γ1, и делецию генных сегментов C_δ, C_γ2a, C_γ2c, C_γ2b, C_γ3, C_ε и C_α.

[0147] В некоторых определенных вариантах осуществления сконструированная константная область тяжелой цепи иммуноглобулина, предложенная в данном документе, содержит генный сегмент C_μ дикого типа (например, немодифицированный и не принадлежащий человеку, например, крысиный или мышиный), генный сегмент C_γ1, содержащий последовательность, кодирующую C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 IgG4 человека, вместо экзонов C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 и функционально связанную с областью переключения указанного генного сегмента C_γ1, и делецию генных сегментов C_δ, C_γ2a, C_γ2c, C_γ2b, C_γ3, C_ε и C_α.

[0148] В некоторых определенных вариантах осуществления сконструированная константная область тяжелой цепи иммуноглобулина, предложенная в данном документе, содержит генный сегмент C_μ дикого типа (например, немодифицированный и не принадлежащий человеку, например, крысиный или мышиный), генный сегмент C_γ2a, содержащий последовательность, кодирующую C_H1-H-C_H2-C_H3 IgG1 человека, вместо экзонов C_H1-H-C_H2-C_H3 и функционально связанную с экзонами M1-M2 указанного генного сегмента C_γ2a, и делецию генных сегментов C_δ, C_γ1, C_γ2b, C_γ2c, C_γ3, C_ε и C_α.

[0149] В некоторых определенных вариантах осуществления сконструированная константная область тяжелой цепи иммуноглобулина, предложенная в данном документе, содержит генный сегмент C_μ дикого типа (например, немодифицированный и не принадлежащий человеку, например, крысиный или мышиный), генный сегмент C_γ2a, содержащий последовательность, кодирующую C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 IgG1 человека, вместо экзонов C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 и функционально связанную с областью переключения указанного генного сегмента C_γ2a, и делецию генных сегментов C_δ, C_γ1, C_γ2b, C_γ2c, C_γ3, C_ε и C_α.

[0150] В некоторых определенных вариантах осуществления сконструированная константная область тяжелой цепи иммуноглобулина, предложенная в данном документе, содержит генный сегмент C_μ дикого типа (например, немодифицированный и не принадлежащий человеку, например, крысиный или мышиный), генный сегмент C_γ2c, содержащий последовательность, кодирующую C_H1-H-C_H2-C_H3 IgG1 человека, вместо экзонов C_H1-H-C_H2-C_H3 и функционально связанную с экзонами M1-M2 указанного генного сегмента C_γ2c, и делецию генных сегментов C_δ, C_γ1, C_γ2a, C_γ2b, C_γ3, C_ε и C_α.

[0151] В некоторых определенных вариантах осуществления сконструированная константная область тяжелой цепи иммуноглобулина, предложенная в данном документе, содержит генный сегмент C_μ дикого типа (например, немодифицированный и не принадлежащий человеку, например, крысиный или мышиный), генный сегмент C_γ2c, содержащий последовательность, кодирующую C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 IgG1 человека, вместо экзонов C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 и функционально связанную с областью переключения указанного генного сегмента C_γ2c, и делецию генных сегментов C_δ, C_γ1, C_γ2a, C_γ2b, C_γ3, C_ε и C_α.

[0152] В различных вариантах осуществления описанная в данном документе сконструированная константная область тяжелой цепи иммуноглобулина содержит одну или более дополнительных модификаций, в том числе конструирование измененных, модифицированных, замещенных, сконструированных и т. д. генов константной области (т.е. изотипов), отличной от одной или более константных областей IgG, которые содержат последовательность, кодирующую C_H1-H-C_H2-C_H3 IgG человека или C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 IgG человека (например, IgG1 и/или IgG2a), посредством вставки последовательности константной области тяжелой цепи иммуноглобулина человека, описанной в данном документе, в один или более генов константной области иммуноглобулина для IgD, IgE, IgA и IgG, которые сами не содержат последовательность, кодирующую C_H1-H-C_H2-C_H3 IgG человека или C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 IgG человека, описанные в данном документе (например, IgG2b и/или IgG3).

[0153] Также предложены сконструированные не принадлежащие человеку эмбрионы, клетки и нацеленные векторы для создания отличных от человека животных, эмбрионов и клеток, содержащих локусы иммуноглобулина с описанными в данном документе сконструированными константными областями.

[0154] В некоторых определенных вариантах осуществления сконструированная константная область тяжелой цепи иммуноглобулина, предложенная в данном документе, содержит генный сегмент C_μ дикого типа, генный сегмент C_δ дикого типа, генный сегмент C_γ3, содержащий последовательность, кодирующую C_H1-H-C_H2-C_H3 IgG3 человека, вместо экзонов C_H1-H-C_H2-C_H3 и функционально связанную с экзонами M1-M2 указанного генного сегмента C_γ3, генный сегмент C_γ1, содержащий последовательность, кодирующую C_H1-H-C_H2-C_H3 IgG4 человека, вместо экзонов C_H1-H-C_H2-C_H3 и функционально связанную с экзонами M1-M2 указанного генного сегмента C_γ1, генный сегмент C_γ2b, содержащий последовательность, кодирующую C_H1-H-C_H2-C_H3 IgG2 человека, вместо экзонов C_H1-H-C_H2-C_H3 и функционально связанную с экзонами M1-M2 указанного генного сегмента C_γ2b, генный сегмент C_γ2a, содержащий последовательность, кодирующую C_H1-H-C_H2-C_H3 человека, вместо экзонов C_H1-H-C_H2-C_H3 и функционально связанную с экзонами M1-M2 указанного генного сегмента C_γ2a (и/или генный сегмент C_γ2c, содержащий последовательность, кодирующую C_H1-H-C_H2-C_H3 IgG1 человека, вместо экзонов C_H1-H-C_H2-C_H3 и функционально связанную с экзонами M1-M2 указанного генного сегмента C_γ2c), генный сегмент C_ε, содержащий последовательность, кодирующую C_H1-C_H2-C_H3-C_H4 IgE человека, вместо экзонов C_H1-C_H2-C_H3-C_H4 и функционально связанную с экзонами M1-M2 указанного генного сегмента C_ε, и генный сегмент C_α, содержащий последовательность, кодирующую C_H1-H-C_H2-C_H3 IgA1 или IgA2 человека, вместо экзонов C_H1-H-C_H2-C_H3 и функционально связанную с M-экзоном(ами) указанного генного сегмента C_α.

[0155] В некоторых определенных вариантах осуществления сконструированная константная область тяжелой цепи иммуноглобулина, предложенная в данном документе, содержит генный сегмент C_μ дикого типа, генный сегмент C_δ дикого типа, генный сегмент C_γ3, содержащий последовательность, кодирующую C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 IgG3 человека, вместо экзонов C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 и функционально связанную с областью переключения указанного генного сегмента C_γ3, генный сегмент C_γ1, содержащий последовательность, кодирующую C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 IgG4 человека, вместо экзонов C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 и функционально связанную с областью переключения указанного генного сегмента a C_γ1, генный сегмент C_γ2b, содержащий последовательность, кодирующую C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 IgG2 человека, вместо экзонов C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 и функционально связанную с областью переключения указанного генного сегмента C_γ2b, генный сегмент C_γ2a, содержащий последовательность, кодирующую C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 IgG1 человека, вместо экзонов C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 и функционально связанную с областью переключения указанного генного сегмента C_γ2a (и/или генный сегмент C_γ2c, содержащий последовательность, кодирующую C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 IgG1 человека, вместо экзонов C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 и функционально связанную с областью переключения указанного генного сегмента C_γ2c), генный сегмент C_ε, содержащий последовательность, кодирующую C_H1-C_H2-C_H3-C_H4 IgE человека, вместо экзонов C_H1-C_H2-C_H3-C_H4 и функционально связанную с экзонами M1-M2 указанного генного сегмента C_ε, и генный сегмент C_α, содержащий последовательность, кодирующую C_H1-H-C_H2-C_H3 IgA1 или IgA2 человека, вместо экзонов C_H1-H-C_H2-C_H3 и функционально связанную с M-экзоном(ами) указанного генного сегмента C_α.

[0156] В различных вариантах осуществления в данном документе предложены генетически сконструированные локусы тяжелой цепи иммуноглобулина, изображенные на Фиг. 1, а также генетически модифицированные грызуны (например, крысы или мыши), ЭС и другие клетки, и ткани, содержащие такие локусы. Таким образом, в одном варианте осуществления в данном документе предложен генетически сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий генные сегменты вариабельной области тяжелой цепи человека (генные сегменты V, D и J тяжелой цепи человека), энхансер Ei грызуна (например, крысы или мыши), генные сегменты C_μ, C_δ, C_γ3, C_γ1, C_γ2b грызуна (например, крысы или мыши), химерный генный сегмент C_γ2a, содержащий последовательность, кодирующую C_H1-H-C_H2-C_H3 IgG1 человека, вместо экзонов C_H1-H-C_H2-C_H3 и функционально связанную с экзонами M1-M2 генного сегмента C_γ2a грызуна (например, крысы или мыши) (например так, чтобы экзоны, кодирующие внеклеточный домен IgG1 человека, были функционально связаны с экзонами, кодирующими трансмембранный и цитоплазматический домены IgG2a грызуна, например, крысы или мыши) (и/или химерный генный сегмент C_γ2c, содержащий последовательность, кодирующую C_H1-H-C_H2-C_H3 IgG1 человека, вместо экзонов C_H1-H-C_H2-C_H3 и функционально связанную с экзонами M1-M2 генного сегмента C_γ2c грызуна (например, крысы или мыши) (например так, чтобы экзоны, кодирующие внеклеточный домен IgG1 человека, были функционально связаны с экзонами, кодирующими трансмембранный и цитоплазматический домены IgG2c грызуна, например, крысы или мыши), генные сегменты C_ε и C_α грызуна (например, крысы или мыши) и 3’ регуляторную область грызуна (например, крысы или мыши), содержащую 3’ энхансеры грызуна (например, крысы или мыши). Типовой генетически модифицированный локус тяжелой цепи приведен на Фиг. 1 как мышиный локус 1. В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированный локус содержит функциональный ген Adam6, описанный в данном документе и в патентах США №№8642835 и 8697940, каждый из которых в полном объеме включен в данный документ посредством ссылки. Также предложены генетически модифицированные отличные от человека животные, ЭС-клетки и другие клетки, и ткани, содержащие такие генетически сконструированные локусы.

[0157] В одном варианте осуществления в данном документе предложен генетически сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий генные сегменты вариабельной области тяжелой цепи человека (генные сегменты V, D и J тяжелой цепи человека), энхансер Ei грызуна (например, крысы или мыши), генные сегменты C_μ, C_δ, C_γ3, C_γ1, C_γ2b грызуна (например, крысы или мыши), генный сегмент C_γ1 человека, содержащий последовательность, кодирующую C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 IgG1 человека, так что обе последовательности, кодирующие внеклеточный и трансмембранный/цитоплазматический домены IgG1, являются человеческими, генные сегменты C_ε и C_α грызуна (например, крысы или мыши) и 3' регуляторную область грызуна (например, крысы или мыши), содержащую 3' энхансеры грызуна (например, крысы или мыши). Типовой генетически модифицированный локус тяжелой цепи приведен на Фиг. 1 как мышиный локус 2. В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированный локус содержит функциональный ген Adam6, описанный в данном документе и в патентах США №№8642835 и 8697940, каждый из которых в полном объеме включен в данный документ посредством ссылки. Также предложены генетически модифицированные отличные от человека животные, ЭС-клетки и другие клетки, и ткани, содержащие такие генетически сконструированные локусы.

[0158] В одном варианте осуществления в данном документе предложен генетически сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий генные сегменты вариабельной области тяжелой цепи человека (генные сегменты V, D и J тяжелой цепи человека), энхансер Ei грызуна (например, крысы или мыши), генные сегменты C_μ, C_δ, C_γ3 грызуна (например, крысы или мыши), химерный генный сегмент C_γ1, содержащий последовательность, кодирующую C_H1-H-C_H2-C_H3 IgG4 человека, вместо экзонов C_H1-H-C_H2-C_H3 и функционально связанную с экзонами M1-M2 генного сегмента C_γ1 грызуна (например, крысы или мыши) (например так, чтобы экзоны, кодирующие внеклеточный домен IgG4 человека, были функционально связаны с экзонами, кодирующими трансмембранный и цитоплазматический домены IgG1 грызуна, например, крысы или мыши), генные сегменты C_γ2b, C_γ2a (и/или C_γ2c), C_ε, C_α грызуна (например, крысы или мыши) и 3' регуляторную область грызуна (например, крысы или мыши), содержащую 3' энхансеры грызуна (например, крысы или мыши). Типовой генетически модифицированный локус тяжелой цепи приведен на Фиг. 1 как мышиный локус 3. В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированный локус содержит функциональный ген Adam6, описанный в данном документе и в патентах США №№8642835 и 8697940, каждый из которых в полном объеме включен в данный документ посредством ссылки. Также предложены генетически модифицированные отличные от человека животные, ЭС-клетки и другие клетки, и ткани, содержащие такие генетически сконструированные локусы.

[0159] В одном варианте осуществления в данном документе предложен генетически сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий генные сегменты вариабельной области тяжелой цепи человека (генные сегменты V, D и J тяжелой цепи человека), энхансер Ei грызуна (например, крысы или мыши), генные сегменты C_μ, C_δ, C_γ3 грызуна (например, крысы или мыши), генный сегмент C_γ4 человека, содержащий последовательность, кодирующую C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 IgG4 человека, так что обе последовательности, кодирующие внеклеточный и трансмембранный/цитоплазматический домены IgG4, являются человеческими, генные сегменты C_γ2b, C_γ2a (и/или C_γ2c) грызуна (например, крысы или мыши), генные сегменты C_ε и C_α грызуна (например, крысы или мыши) и 3' регуляторную область грызуна (например, крысы или мыши), содержащую 3' энхансеры грызуна (например, крысы или мыши). Типовой генетически модифицированный локус тяжелой цепи приведен на Фиг. 1 как мышиный локус 4. В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированный локус содержит функциональный ген Adam6, описанный в данном документе и в патентах США №№8642835 и 8697940, каждый из которых в полном объеме включен в данный документ посредством ссылки. Также предложены генетически модифицированные отличные от человека животные, ЭС-клетки и другие клетки, и ткани, содержащие такие генетически сконструированные локусы.

[0160] В одном варианте осуществления в данном документе предложен генетически сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий генные сегменты вариабельной области тяжелой цепи человека (генные сегменты V, D и J тяжелой цепи человека), энхансер Ei человека, генные сегменты C_μ, C_δ, C_γ3 и C_γ1 человека и 3' регуляторную область грызуна (например, крысы или мыши), содержащую 3' энхансеры грызуна (например, крысы или мыши). Типовой генетически модифицированный локус тяжелой цепи приведен на Фиг. 1 как мышиный локус 5. В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированный локус содержит функциональный ген Adam6, описанный в данном документе и в патентах США №№8642835 и 8697940, каждый из которых в полном объеме включен в данный документ посредством ссылки. Также предложены генетически модифицированные отличные от человека животные, ЭС-клетки и другие клетки, и ткани, содержащие такие генетически сконструированные локусы.

[0161] В одном варианте осуществления в данном документе предложен генетически сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий генные сегменты вариабельной области тяжелой цепи человека (генные сегменты V, D и J тяжелой цепи человека), энхансер Ei человека, генные сегменты C_μ, C_δ, C_γ3, C_γ1, C_γ2 и C_γ4 человека и 3' регуляторную область грызуна (например, крысы или мыши), содержащую 3' энхансеры грызуна (например, крысы или мыши). Типовой генетически модифицированный локус тяжелой цепи приведен на Фиг. 1 как мышиный локус 6. В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированный локус содержит функциональный ген Adam6, описанный в данном документе и в патентах США №№8642835 и 8697940, каждый из которых в полном объеме включен в данный документ посредством ссылки. Также предложены генетически модифицированные отличные от человека животные, ЭС-клетки и другие клетки, и ткани, содержащие такие генетически сконструированные локусы.

[0162] В одном варианте осуществления в данном документе предложен генетически сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий генные сегменты вариабельной области тяжелой цепи грызуна (например, крысы или мыши) (генные сегменты V, D и J тяжелой цепи грызуна (например, крысы или мыши)), энхансер Ei грызуна (например, крысы или мыши), генные сегменты C_μ, C_δ, C_γ3, и C_γ1 человека и 3' регуляторную область грызуна (например, крысы или мыши), содержащую 3' энхансеры грызуна (например, крысы или мыши). Типовой генетически модифицированный локус тяжелой цепи приведен на Фиг. 1 как мышиный локус 7. В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированный локус содержит функциональный ген Adam6. Также предложены генетически модифицированные отличные от человека животные, ЭС-клетки и другие клетки, и ткани, содержащие такие генетически сконструированные локусы.

[0163] В одном варианте осуществления в данном документе предложен генетически сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий генные сегменты вариабельной области тяжелой цепи грызуна (например, крысы или мыши) (генные сегменты V, D и J тяжелой цепи грызуна (например, крысы или мыши)), энхансер Ei грызуна (например, крысы или мыши), генные сегменты C_μ, C_δ, C_γ3, C_γ1, C_γ2 и C_γ4 человека и 3' регуляторную область грызуна (например, крысы или мыши), содержащую 3' энхансеры грызуна (например, крысы или мыши). Типовой генетически модифицированный локус тяжелой цепи приведен на Фиг. 1 как мышиный локус 8. В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированный локус содержит функциональный ген Adam6. Также предложены генетически модифицированные отличные от человека животные, ЭС-клетки и другие клетки, и ткани, содержащие такие генетически сконструированные локусы.

[0164] Также в данном документе предложены способы создания сконструированных локусов тяжелой цепи иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления способы создания сконструированных локусов тяжелой цепи иммуноглобулина, описанные в данном документе, включают вставку ДНК размером около 1,6 т.п.о., которая содержит нуклеотидную последовательность C_H1-H-C_H2-C_H3 IgG1 человека, кодирующую полипептид константного домена тяжелой цепи иммуноглобулина, вместо экзонов C_H1-H-C_H2-C_H3 генного сегмента C_γ2a, так что указанная нуклеотидная последовательность C_H1-H-C_H2-C_H3 IgG1 человека функционально связана с экзонами M1 и M2 указанного генного сегмента C_γ2a.

[0165] В некоторых вариантах осуществления способы создания сконструированных локусов тяжелой цепи иммуноглобулина, описанные в данном документе, включают вставку ДНК размером около 6,8 т.п.о., которая содержит нуклеотидную последовательность C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 IgG1 человека, кодирующую полипептид константного домена тяжелой цепи иммуноглобулина, вместо экзонов C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 генного сегмента C_γ2a, так что указанная нуклеотидная последовательность C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 IgG1 человека функционально связана с областью переключения указанного генного сегмента C_γ2a.

[0166] Также в данном документе предложены способы создания сконструированных локусов тяжелой цепи иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления способы создания сконструированных локусов тяжелой цепи иммуноглобулина, описанные в данном документе, включают вставку ДНК размером около 1,6 т.п.о., которая содержит нуклеотидную последовательность C_H1-H-C_H2-C_H3 IgG1 человека, кодирующую полипептид константного домена тяжелой цепи иммуноглобулина, вместо экзонов C_H1-H-C_H2-C_H3 генного сегмента C_γ2c, так что указанная нуклеотидная последовательность C_H1-H-C_H2-C_H3 IgG1 человека функционально связана с экзонами M1 и M2 указанного генного сегмента C_γ2c.

[0167] В некоторых вариантах осуществления способы создания сконструированных локусов тяжелой цепи иммуноглобулина, описанные в данном документе, включают вставку ДНК размером около 6,8 т.п.о., которая содержит нуклеотидную последовательность C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 IgG1 человека, кодирующую полипептид константного домена тяжелой цепи иммуноглобулина, вместо экзонов C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 генного сегмента C_γ2c, так что указанная нуклеотидная последовательность C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 IgG1 человека функционально связана с областью переключения указанного генного сегмента C_γ2c.

[0168] В некоторых вариантах осуществления способы создания сконструированных локусов тяжелой цепи иммуноглобулина, описанные в данном документе, включают вставку ДНК размером около 1,5 т.п.о., которая содержит нуклеотидную последовательность C_H1-H-C_H2-C_H3 IgG4 человека, кодирующую полипептид константного домена тяжелой цепи иммуноглобулина, вместо экзонов C_H1-H-C_H2-C_H3 генного сегмента C_γ1, так что указанная нуклеотидная последовательность C_H1-H-C_H2-C_H3 IgG4 человека функционально связана с экзонами M1 и M2 указанного генного сегмента C_γ1.

[0169] В некоторых вариантах осуществления способы создания сконструированных локусов тяжелой цепи иммуноглобулина, описанные в данном документе, включают вставку ДНК размером около 5,8 т.п.о., которая содержит нуклеотидную последовательность C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 IgG4 человека, кодирующую полипептид константного домена тяжелой цепи иммуноглобулина, вместо экзонов C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 генного сегмента C_γ1, так что указанная нуклеотидная последовательность C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 IgG4 человека функционально связана с областью переключения указанного генного сегмента C_γ1.

[0170] В некоторых вариантах осуществления способы создания сконструированных локусов тяжелой цепи иммуноглобулина, описанные в данном документе, включают вставку ДНК размером около 130 т.п.о., содержащей последовательности C_μ, C_δ, C_γ3, C_γ1 человека. В других вариантах осуществления указанные способы дополнительно включают дополнительную вставку ДНК размером около 43 т.п.о., содержащей последовательности C_γ2 и C_γ4 человека.

[0171] В различных способах создания сконструированных локусов тяжелой цепи иммуноглобулина, описанных выше, ДНК можно вносить в эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина грызуна (например, крысы или мыши), содержащий эндогенные генные сегменты вариабельной области тяжелой цепи грызуна (например, крысы или мыши), или локус тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий генные сегменты вариабельной области тяжелой цепи человека. ДНК можно вносить посредством гомологичной рекомбинации или другими методами, известными в данной области техники или описанными в данном документе.

[0172] В некоторых вариантах осуществления грызун (например, крыса или мышь) является гетерозиготным в отношении модифицированного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина, описанного в данном документе. В определенных вариантах осуществления грызун (например, крыса или мышь) является гомозиготным в отношении модифицированного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина, описанного в данном документе.

Гуманизированные локусы каппа-цепи иммуноглобулина

[0173] В определенных аспектах в данном документе предложены грызуны (например, мыши или крысы), содержащие генетически модифицированные локусы цепи Igκ. Такие локусы содержат вариабельную область κ и константную область κ. Вариабельная область κ содержит генные сегменты вариабельной области цепи Igκ (т.е. по меньшей мере генный сегмент V_κ и генный сегмент J_κ). Константная область содержит генный сегмент константной области цепи Igκ (C_κ). В определенных вариантах осуществления вариабельная область цепи κ иммуноглобулина, такая как вариабельная область Igκ человека, функционально связана с константной областью цепи κ иммуноглобулина таким образом, чтобы грызун (например, крыса или мышь) вырабатывал антитела, содержащие вариабельные домены легкой цепи, полученные из генного сегмента V_κ человека и генного сегмента J_κ человека, и константные домены легкой цепи, полученные из генного сегмента C_κ. В некоторых вариантах осуществления вариабельная область Igκ представляет собой неперестроенную вариабельную область Igκ и, следовательно, содержит неперестроенные генные сегменты вариабельной области Igκ. В некоторых вариантах осуществления вариабельная область Igκ представляет собой перестроенную вариабельную область Igκ и, следовательно, содержит перестроенный ген вариабельной области Igκ. В определенных вариантах осуществления генные сегменты вариабельной области Igκ представляют собой генные сегменты вариабельной области Igκ человека. В определенных вариантах осуществления генные сегменты вариабельной области Igκ представляют собой генные сегменты вариабельной области Igκ грызуна (например, генные сегменты вариабельной области крысы или мыши). В некоторых вариантах осуществления локус константной области Igκ содержит генный сегмент константной области Igκ, который является частично или полностью человеческим. В некоторых вариантах осуществления описанные в данном документе локусы цепи Igκ расположены в эндогенном локусе цепи Igκ.

[0174] В определенных вариантах осуществления вариабельная область Igκ содержит неперестроенные генные сегменты вариабельной области Igκ человека. В некоторых определенных вариантах осуществления сконструированный локус (или сконструированная аллель) легкой цепи Igκ содержит по меньшей мере генные сегменты V_κ человека, которые находятся в дистальном вариабельном кластере (или дистальном плече, или дистальном дубликате) локуса легкой цепи Igκ человека, который встречается в природе. В некоторых определенных вариантах осуществления сконструированный локус (или сконструированная аллель) легкой цепи Igκ содержит по меньшей мере генные сегменты V_κ человека, которые находятся в проксимальном вариабельном кластере (или проксимальном плече, или проксимальном дубликате) локуса легкой цепи Igκ человека, который встречается в природе. В некоторых определенных вариантах осуществления сконструированный локус (или сконструированная аллель) легкой цепи Igκ содержит генные сегменты V_κ человека, которые находятся в дистальном и проксимальном вариабельных кластерах локуса легкой цепи Igκ человека, который встречается в природе. В некоторых определенных вариантах осуществления сконструированный локус (или сконструированная аллель) легкой цепи Igκ содержит все или практически все функциональные генные сегменты V_κ человека, находящиеся между генными сегментами V_κ 2-40 человека (или V_κ 3D-7) и V_κ 4-1 человека включительно, локуса легкой цепи Igκ человека, который встречается в природе.

[0175] В некоторых вариантах осуществления неперестроенные генные сегменты вариабельной области иммуноглобулина человека содержат некоторое количество сегментов V_κ человека и один или более сегментов J_κ человека. В некоторых вариантах осуществления генные сегменты вариабельной области иммуноглобулина содержат четыре функциональных сегмента V_κ и все сегменты J_κ человека. В некоторых вариантах осуществления генные сегменты вариабельной области иммуноглобулина содержат 16 функциональных сегментов V_κ и все сегменты J_κ человека. В некоторых вариантах осуществления неперестроенные генные сегменты вариабельной области иммуноглобулина человека содержат все сегменты V_κ человека и все сегменты J_κ человека.

[0176] В некоторых определенных вариантах осуществления сконструированный локус (или сконструированная аллель) легкой цепи Igκ содержит 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35 или более (например, 36, 37, 38, 39, 40 и т.д.) генных сегментов V_κ человека. В некоторых определенных вариантах осуществления сконструированный локус (или сконструированная аллель) легкой цепи Igκ содержит генные сегменты V_κ человека V_κ 3D-7, V_κ 1D-8, V_κ 1D-43, V_κ 3D-11, V_κ 1D-12, V_κ 1D-13, V_κ 3D-15, V_κ 1D-16, V_κ 1D-17, V_κ 3D-20, V_κ 6D-21, V_κ 2D-26, V_κ 2D-28, V_κ 2D-29, V_κ 2D-30, V_κ 1D-33, V_κ 1D-39, V_κ 2D-40, V_κ 2-40, V_κ 1-39, V_κ 1-33, V_κ 2-30, V_κ 2-28, V_κ 1-27, V_κ 2-24, V_κ 6-21, V_κ 3-20, V_κ 1-17, V_κ 1-16, V_κ 3-15, V_κ 1-12, V_κ 3-11, V_κ 1-9, V_κ 1-8, V_κ 1-6, V_κ 1-5, V_κ 5-2 и V_κ 4-1. В некоторых определенных вариантах осуществления сконструированный локус (или сконструированная аллель) легкой цепи Igκ содержит по меньшей мере генные сегменты V_κ человека V_κ 3D-7, V_κ 1D-8, V_κ 1D-43, V_κ 3D-11, V_κ 1D-12, V_κ 1D-13, V_κ 3D-15, V_κ 1D-16, V_κ 1D-17, V_κ 3D-20, V_κ 6D-21, V_κ 2D-26, V_κ 2D-28, V_κ 2D-29, V_κ 2D-30, V_κ 1D-33, V_κ 1D-39 и V_κ 2D-40. В некоторых определенных вариантах осуществления сконструированный локус (или сконструированная аллель) легкой цепи Igκ содержит по меньшей мере генные сегменты V_κ человека V_κ 2-40, V_κ 1-39, V_κ 1-33, V_κ 2-30, V_κ 2-28, V_κ 1-27, V_κ 2-24, V_κ 6-21, V_κ 3-20, V_κ 1-17, V_κ 1-16, V_κ 3-15, V_κ 1-12, V_κ 3-11, V_κ 1-9, V_κ 1-8, V_κ 1-6, V_κ 1-5, V_κ 5-2 и V_κ 4-1.

[0177] В некоторых вариантах осуществления предложенные в данном документе отличные от человека животные имеют ограниченный локус легкой цепи иммуноглобулина, характеризующийся не более чем двумя генными сегментами V_L человека и некоторым количеством генных сегментов J_L (например, мыши с двойной легкой цепью или DLC (англ. «dual light chain»), описанные в публикации патента США №2013/0198880, которая включена в данный документ посредством ссылки). В некоторых вариантах осуществления генные сегменты V_L представляют собой генные сегменты V_κ. В некоторых вариантах осуществления генные сегменты V_L представляют собой генные сегменты V_λ. В некоторых вариантах осуществления генные сегменты V_κ представляют собой V_κ 3-20 и V_κ 1-39.

[0178] В некоторых вариантах осуществления сконструированный локус (или сконструированная аллель) легкой цепи Igκ содержит 1, 2, 3, 4, 5 или более функциональных генных сегментов J_κ человека. В некоторых определенных вариантах осуществления сконструированный локус (или сконструированная аллель) легкой цепи Igκ содержит все или практически все функциональные генные сегменты J_κ человека, находящиеся между генными сегментами J_κ1 человека и J_κ5 человека включительно, локуса легкой цепи Igκ человека, который встречается в природе. В некоторых определенных вариантах осуществления сконструированный локус (или сконструированная аллель) легкой цепи Igκ содержит по меньшей мере генные сегменты J_κ человека J_κ1, J_κ2, J_κ3, J_κ4 и J_κ5.

[0179] В других вариантах осуществления отличный от человека организм может содержать в зародышевой линии и/или геноме локус легкой цепи иммуноглобулина, который содержит вставки и/или замены кодонов гистидина, предназначенные для придания pH-зависимых свойств связывания антителам, вырабатываемым в таком отличном от человека организме. В некоторых таких вариантах осуществления вставка и/или замена кодонов гистидина проведена в последовательностях нуклеиновых кислот, кодирующих CDR3. Различные такие локусы легкой цепи иммуноглобулина приведены в патентах США №№9301510, 9334334, публикациях заявок на патент США №№2013/0247236, 20140013456, включенных в данный документ посредством ссылки.

[0180] Примеры вариабельных областей, содержащих генные сегменты Igκ, приведены, например, в Macdonald et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 111:5147-52 и справочной информации, которая включена в данный документ посредством ссылки. В некоторых вариантах осуществления неперестроенные генные сегменты вариабельной области иммуноглобулина человека содержат все сегменты Jκ человека.

[0181] В некоторых вариантах осуществления генный локус вариабельной области Igκ, содержащий неперестроенные генные сегменты вариабельной области Igκ человека, также содержит межгенные последовательности вариабельной области Igκ человека. В некоторых вариантах осуществления генный локус вариабельной области Igκ содержит не принадлежащие человеку (например, принадлежащие грызуну, крысе, мыши) межгенные последовательности вариабельной области Igκ. В некоторых вариантах осуществления генный локус Igκ содержит не принадлежащие человеку регуляторные элементы (например, не принадлежащие человеку промоторы и/или энхансеры). В некоторых вариантах осуществления не принадлежащие человеку регуляторные элементы представляют собой регуляторные элементы грызуна (например, крысиные или мышиные промоторы или энхансеры).

[0182] В некоторых вариантах осуществления локус вариабельной области Igκ представляет собой перестроенный локус вариабельной области, содержащий ген вариабельной области Igκ (универсальной вариабельной области легкой цепи). В некоторых вариантах осуществления ген перестроенной вариабельной области Igκ представляет собой ген перестроенной вариабельной области Igκ человека. Применение универсальных вариабельных областей легкой цепи облегчает создание биспецифических антител. Примеры перестроенных вариабельных областей легкой цепи Ig приведены в публикации патента США №2013/0185821, которая включена в данный документ посредством ссылки.

[0183] В некоторых вариантах осуществления локус цепи Igκ содержит регуляторные элементы человека или грызуна (например, крысы или мыши). В некоторых вариантах осуществления регуляторный элемент представляет собой эндогенный регуляторный элемент. В определенных вариантах осуществления локус цепи Igκ содержит интронный энхансер κ (E_κi) грызуна (например, крысы или мыши) или человека. В определенных вариантах осуществления локус IgH содержит 3’ энхансер κ (E_κ3’) грызуна (например, крысы или мыши) или человека.

[0184] В некоторых вариантах осуществления модифицированный локус цепи κ иммуноглобулина расположен в эндогенном локусе цепи κ иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления локус цепи κ иммуноглобулина замещает весь или часть эндогенного локуса цепи κ иммуноглобулина. В определенных вариантах осуществления модифицированный локус цепи Igκ находится в трансгене, расположенном за пределами эндогенного локуса. В некоторых вариантах осуществления эндогенный локус цепи Igκ инактивирован (например, посредством делеции, перемещения и/или инверсии всего или части эндогенного локуса цепи Igκ).

[0185] В некоторых вариантах осуществления способы создания сконструированных локусов легкой цепи κ иммуноглобулина, описанные в данном документе, включают вставку ДНК размером около 0,5 т.п.о., которая содержит нуклеотидную последовательность константной области Igκ человека, кодирующую полипептид константного домена легкой цепи κ иммуноглобулина, вместо экзона константной области Igκ гена константной области Igκ так, чтобы указанная нуклеотидная последовательность константной области Igκ человека была функционально связана с энхансером и/или регуляторными областями указанного гена константной области Igκ.

[0186] В некоторых вариантах осуществления грызун (например, крыса или мышь) является гетерозиготным в отношении модифицированного локуса цепи κ иммуноглобулина, описанного в данном документе. В определенных вариантах осуществления грызун (например, крыса или мышь) является гомозиготным в отношении модифицированного локуса цепи κ иммуноглобулина, описанного в данном документе.

Гуманизированные локусы лямбда-цепи иммуноглобулина

[0187] В определенных аспектах в данном документе предложены грызуны (например, мыши или крысы), содержащие генетически модифицированные локусы цепи Igλ. Такие локусы содержат генные сегменты вариабельной области цепи Igλ (т.е. по меньшей мере генный сегмент V_λ и генный сегмент J_λ). Модифицированный локус λ дополнительно содержит по меньшей мере один генный сегмент константной области Igλ (C_λ). В определенных вариантах осуществления генный сегмент V_λ и генный сегмент J_λ, такие как генный сегмент V_λ человека и генный сегмент J_λ человека, функционально связаны с C_λ человека таким образом, чтобы грызун (например, крыса или мышь) вырабатывал антитела, содержащие вариабельные домены легкой цепи, полученные из генного сегмента V_λ человека и генного сегмента J_λ человека, и константные домены легкой цепи, полученные из генного сегмента C_λ. В некоторых вариантах осуществления генный сегмент V_λ и генный сегмент J_λ являются неперестроенными генными сегментами V_λ и J_λ. В некоторых вариантах осуществления генный сегмент V_λ и генный сегмент J_λ являются перестроенными генными сегментами V_λ и J_λ и, следовательно, находятся в форме перестроенного гена вариабельной области. В определенных вариантах осуществления генные сегменты вариабельной области Ig_λ представляют собой генные сегменты вариабельной области человека. В определенных вариантах осуществления генные сегменты вариабельной области Ig_λ представляют собой генные сегменты вариабельной области грызуна (например, генные сегменты вариабельной области крысы или мыши). В некоторых вариантах осуществления локус константной области Ig_λ содержит генный сегмент константной области λ, который является частично или полностью человеческим. В некоторых вариантах осуществления описанные в данном документе локусы цепи Igλ расположены в эндогенном локусе цепи Igλ. Типовые вариабельные области, содержащие генные сегменты Igλ, приведены, например, в публикациях патентов США №№2012/0073004 и 2002/0088016 и заявке на патент США №15/803,513 (поданной 3 ноября 2017 г.; опубликованной как US 2018/0125043), которые все включены в данный документ посредством ссылки.

[0188] В некоторых вариантах осуществления генный локус вариабельной области Igλ, содержащий неперестроенные генные сегменты вариабельной области Igλ человека, также содержит межгенные последовательности вариабельной области Igλ человека. В некоторых вариантах осуществления генный локус вариабельной области Igλ содержит не принадлежащие человеку (например, принадлежащие грызуну, крысе, мыши) межгенные последовательности вариабельной области Igλ. В некоторых вариантах осуществления генный локус Igλ содержит не принадлежащие человеку регуляторные элементы (например, не принадлежащие человеку промоторы и/или энхансеры). В некоторых вариантах осуществления не принадлежащие человеку регуляторные элементы представляют собой регуляторные элементы грызуна (например, крысиные или мышиные промоторы или энхансеры).

[0189] Локус легкой цепи Igλ человека в некоторых вариантах осуществления содержит генетический материал из локуса легкой цепи Igλ человека. В некоторых вариантах осуществления локус легкой цепи Igλ человека, описанный в данном документе, содержит по меньшей мере один генный сегмент V_λ человека, по меньшей мере один генный сегмент J_λ человека, по меньшей мере один генный сегмент C_λ человека, и одну или более последовательностей, необходимых для стимуляции перестройки (например, последовательностей сигнала рекомбинации) указанного по меньшей мере одного генного сегмента V_λ человека с указанным по меньшей мере одним генным сегментом J_λ человека с образованием функциональной перестроенной последовательности V_λ-J_λ человека, которая кодирует домен V_λ человека. Во многих вариантах осуществления последовательность легкой цепи Igλ человека содержит некоторое количество генных сегментов V_λ человека и одну или более последовательностей, необходимых для стимуляции перестройки указанных генных сегментов V_λ человека с по меньшей мере одним генным сегментом J_λ человека. В некоторых вариантах осуществления последовательность легкой цепи Igλ человека, описанная в данном документе, представляет собой геномную последовательность локуса легкой цепи Igλ человека (например, выделенную и/или клонированную из бактериальной искусственной хромосомы) и содержит некоторое количество генных сегментов V_λ человека в конфигурации зародышевой линии. В некоторых вариантах осуществления последовательность легкой цепи Igλ человека содержит последовательности V_λ, J_λ и C_λ человека в конфигурации зародышевой линии (т. е. в том виде, в котором указанные последовательности V_λ, J_λ и C_λ человека находятся в локусе легкой цепи Igλ в клетке человека, другими словами, последовательности J_λ и C_λ находятся в виде кластеров J_λ C_λ). В некоторых вариантах осуществления последовательность легкой цепи Igλ человека кодирует полипептид легкой цепи Igλ, полностью или частично, причем указанный полипептид легкой цепи Igλ находится в иммуноглобулине, в частности, иммуноглобулине, который экспрессирует B-клетка человека. Также предложены отличные от человека животные, эмбрионы, клетки и нацеленные конструкции для создания отличных от человека животных, отличных от человеческих эмбрионов и клеток, содержащих указанную последовательность легкой цепи Igλ человека вместо соответствующей не принадлежащей человеку последовательности легкой цепи Igλ (например, эндогенный локус легкой цепи Igλ грызуна).

[0190] В некоторых вариантах осуществления последовательность легкой цепи Igλ человека вставлена вместо соответствующей не принадлежащей человеку последовательности легкой цепи Igλ в геноме зародышевой линии отличного от человека животного. В некоторых вариантах осуществления последовательность легкой цепи Igλ человека вставлена выше не принадлежащей человеку последовательности легкой цепи Igλ (например, не принадлежащей человеку последовательности константной области легкой цепи Igλ). В некоторых вариантах осуществления последовательность легкой цепи Igλ человека вставлена посреди одной или более не принадлежащих человеку последовательностей легкой цепи Igλ так, чтобы последовательность легкой цепи Igλ человека находилась рядом с не принадлежащими человеку последовательностями легкой цепи Igλ.

[0191] В определенных вариантах осуществления локус легкой цепи Igλ содержит по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 20, 30 или 40 функциональных генных сегментов V_λ. В некоторых вариантах осуществления локус содержит генные сегменты V_λ человека V_λ3-10, V_λ3-9, V_λ2-8, V_λ4-3 и V_λ3-1. В некоторых вариантах осуществления локус содержит V_λ2-11, V_λ3-12, V_λ2-14, V_λ3-16, V_λ3-19, V3-21, V_λ3-22, V_λ2-23, V_λ3-25 и V_λ3-27. В некоторых вариантах осуществления локус содержит V_λ3-27, V_λ1-36, V_λ5-37, V_λ5-39, V_λ1-40, V_λ7-43, V_λ1-44, V_λ5-45, V_λ7-46, V_λ1-47, V_λ9-49, V_λ1-51 и V_λ5-52. В определенных вариантах осуществления локус содержит V_λ10-54, V_λ6-57, V_λ4-60, V_λ8-61 и V_λ4-69. В некоторых вариантах осуществления локус легкой цепи Igλ содержит одну или более пар J_λ-C_λ человека. Например, в определенных вариантах осуществления локус цепи Igλ содержит J_λ1-C_λ1, J_λ2-C_λ2, J_λ3-C_λ3, J_λ6-C_λ6 и/или J_λ7-C_λ7 человека ниже генных сегментов V_λ человека. В некоторых вариантах осуществления локус цепи Ig_λ содержит J_λ1-C_λ1, J_λ2-C_λ2, J_λ3-C_λ3, J_λ6-C_λ6, человека J_λ7 человека и C_λ1 мыши ниже генных сегментов V_λ человека, как проиллюстрировано на Фиг. 2A.

[0192] В некоторых вариантах осуществления локус Igλ представляет собой перестроенный локус, содержащий ген вариабельной области Igλ (универсальной вариабельной области легкой цепи). В некоторых вариантах осуществления ген перестроенной вариабельной области Igλ представляет собой ген перестроенной вариабельной области Igλ человека. Применение универсальных вариабельных областей легкой цепи облегчает создание биспецифических антител, в которых по меньшей мере один антигенсвязывающий домен обладает связыванием. Примеры перестроенных вариабельных областей легкой цепи Ig приведены в публикации патента США №2013/0185821, которая включена в данный документ посредством ссылки.

[0193] В некоторых вариантах осуществления локус цепи Igλ содержит регуляторные элементы человека или грызуна (например, крысы или мыши). В некоторых вариантах осуществления регуляторный элемент представляет собой эндогенный регуляторный элемент. В определенных вариантах осуществления локус цепи Igλ содержит энхансер 2.4 λ грызуна (например, крысы или мыши). В некоторых вариантах осуществления локус цепи Igλ содержит 3’ энхансер λ человека или грызуна (например, крысы или мыши). В некоторых вариантах осуществления локус цепи Igλ содержит энхансер 3.1 λ грызуна (например, крысы или мыши).

[0194] В некоторых вариантах осуществления модифицированный локус цепи λ иммуноглобулина расположен в эндогенном локусе цепи λ иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления локус цепи λ иммуноглобулина замещает весь или часть эндогенного локуса цепи λ иммуноглобулина. В определенных вариантах осуществления модифицированный локус цепи Igλ находится в трансгене, расположенном за пределами эндогенного локуса. В некоторых вариантах осуществления эндогенный локус цепи Igλ инактивирован (например, посредством делеции, перемещения и/или инверсии всего или части эндогенного локуса цепи Igλ).

[0195] В некоторых вариантах осуществления грызун (например, крыса или мышь) является гетерозиготным в отношении модифицированного локуса цепи λ иммуноглобулина. В определенных вариантах осуществления грызун (например, крыса или мышь) является гомозиготным в отношении модифицированного локуса цепи λ иммуноглобулина.

[0196] В некоторых вариантах осуществления отличный от человека организм содержит в зародышевой линии и/или геноме локус легкой цепи иммуноглобулина, содержащий ограниченный репертуар генных сегментов вариабельной области легкой цепи (например, вариабельной области двойной легкой цепи, содержащей два генных сегмента вариабельной области легкой цепи). В некоторых вариантах осуществления генные сегменты легкой цепи в ограниченном репертуаре генных сегментов легкой цепи представляют собой генные сегменты легкой цепи человека. Примеры вариабельных областей двойной легкой цепи приведены в публикации патента США №2013/0198880, которая включена в данный документ посредством ссылки. В некоторых вариантах осуществления отличный от человека организм, содержащий вариабельную область двойной легкой цепи, используют для выработки биспецифических антител.

Гуманизированные локусы CD79a и CD79b

[0197] В некоторых вариантах осуществления описанные в данном документе грызуны (например, крысы или мыши) содержат человеческие или гуманизированные локусы альфа-цепи белка, связанного с комплексом B-клеточного антиген-распознающего рецептора (CD79a или Igα), и/или бета-цепи белка, связанного с комплексом B-клеточного антиген-распознающего рецептора (CD79b или Igβ). Грызуны, которые содержат человеческие или гуманизированные гены CD79a и CD79b, экспрессируют человеческие или гуманизированные полипептиды CD79a и CD79b в виде гетеродимеров на поверхности B-клеток, которые нековалентно связываются с экспрессируемыми на мембране иммуноглобулинами с образованием B-клеточного рецептора (BCR, нагл. «B cell receptor»). BCR связывается с антигеном и принимает участие в передаче сигналов и интернализации после связывания с антигеном. В некоторых вариантах осуществления описанные в данном документе грызуны содержат человеческие или гуманизированные гены CD79a и CD79b. В некоторых определенных вариантах осуществления описанные в данном документе грызуны дополнительно содержат ген CD79a, который содержит часть CD79a грызуна и часть CD79a человека, и ген CD79b, который содержит часть CD79b грызуна и часть CD79b человека, при этом часть CD79a человека кодирует практически весь внеклеточный домен полипептида CD79a человека (например, аминокислоты, соответствующие остаткам 33-143 полипептида CD79a человека), а часть CD79b человека кодирует практически весь внеклеточный домен полипептида CD79b человека (например, аминокислоты, соответствующие остаткам 29-159 полипептида CD79b человека). В некоторых вариантах осуществления каждая из частей CD79a и CD79b кодирует по меньшей мере внутриклеточный домен эндогенных полипептидов CD79a и CD79b, соответственно; в некоторых определенных вариантах осуществления - трансмембранный и внутриклеточный домены эндогенных полипептидов CD79a и CD79b, соответственно. В некоторых вариантах осуществления человеческая и эндогенная части функционально связаны с эндогенными промоторами CD79a и CD79b, соответственно.

[0198] В некоторых вариантах осуществления описанные в данном документе грызуны дополнительно содержат химерный ген CD79a, который содержит часть CD79a грызуна и часть CD79a человека, при этом часть CD79a человека кодирует последовательность, содержащую аминокислоты, соответствующие остаткам 33-116 полипептида CD79a человека, в одном варианте осуществления она кодирует последовательность, содержащую аминокислоты 33-119 полипептида CD79a человека, в одном варианте осуществления она кодирует последовательность, содержащую аминокислоты 33-143 полипептида CD79a человека, в одном варианте осуществления она кодирует последовательность, содержащую аминокислоты 33-165 полипептида CD79a человека. В некоторых вариантах осуществления химерный полипептид CD79a содержит домен, подобный C2 Ig человека; в некоторых вариантах осуществления химерный полипептид CD79a также содержит стеблевую область человека; в некоторых вариантах осуществления химерный полипептид CD79a также содержит трансмембранный домен человека; и в некоторых вариантах осуществления химерный полипептид CD79a дополнительно содержит цитоплазматический домен грызуна (например, мыши). В некоторых вариантах осуществления грызун содержит химерный ген CD79a, содержащий часть человеческой области, описанную в данном документе, и последовательность, кодирующую сигнальный пептид CD79a человека или грызуна (например, мыши); в одном варианте осуществления последовательность, кодирующая сигнальный пептид, представляет собой последовательность CD79a мыши, кодирующую аминокислоты 1-28 CD79a мыши.

[0199] В некоторых вариантах осуществления описанные в данном документе грызуны дополнительно содержат химерный ген CD79b, который содержит часть CD79b грызуна и часть CD79b человека, при этом часть CD79b человека кодирует последовательность, содержащую аминокислоты, соответствующие остаткам 29-135 полипептида CD79b человека, в одном варианте осуществления она кодирует последовательность, содержащую аминокислоты 29-159 полипептида CD79b человека, в одном варианте осуществления она кодирует последовательность, содержащую аминокислоты 29-184 полипептида CD79b человека. В некоторых вариантах осуществления химерный полипептид CD79b содержит домен, подобный V Ig человека; в некоторых вариантах осуществления химерный полипептид CD79b также содержит стеблевую область человека; в некоторых вариантах осуществления химерный полипептид CD79b также содержит трансмембранный домен человека; и в некоторых вариантах осуществления химерный полипептид CD79b дополнительно содержит цитоплазматический домен грызуна (например, мыши). В некоторых вариантах осуществления грызун содержит химерный ген CD79b, содержащий часть человеческой области, описанную в данном документе, и последовательность, кодирующую сигнальный пептид CD79b человека или грызуна (например, мыши); в одном варианте осуществления последовательность, кодирующая сигнальный пептид, представляет собой последовательность CD79b мыши, кодирующую аминокислоты 1-25 CD79b мыши.

[0200] Под номерами доступа GenBank №№ NP_001774.1, NM_001783.3, NP_067612.1 и NM_021601.3 и UniProt ID P11912 приведены репрезентативные последовательности-источники гена CD79A человека и полипептида CD79A человека, из которых можно получить необходимую человеческую часть. Под номерами доступа GenBank №№ NP_000617.1, NM_000626.2, NP_001035022.1, NM_001039933.1, NP_067613.1 и NM_021602.2 и UniProt ID P40259 приведены репрезентативные последовательности-источники гена CD79B человека и полипептида CD79B человека, из которых можно получить необходимую человеческую часть.

[0201] В некоторых вариантах осуществления предложенные в данном документе грызуны (например, мыши или крысы) дополнительно содержат один или более генов CD79A и CD79B человека, описанных в публикациях патентов США №№ 2011-0093963 A1 и 2009-0053210 A1; публикации заявки на Международный патент № WO 2008/027986; и Европейском патенте №2064325 B1, которые все включены в данный документ посредством ссылки. В некоторых определенных вариантах осуществления предложенные в данном документе грызуны содержат гуманизированный ген CD79a, который содержит часть эндогенного CD79a и часть CD79a человека, и гуманизированный ген CD79b, который содержит часть эндогенного CD79b и часть CD79b человека, при этом часть CD79a человека кодирует практически весь внеклеточный домен полипептида CD79a человека (например, аминокислоты, соответствующие остаткам 33-143 полипептида CD79a человека), а часть CD79b человека кодирует практически весь внеклеточный домен полипептида CD79b человека (например, аминокислоты, соответствующие остаткам 29-159 полипептида CD79b человека). В некоторых вариантах осуществления предложенные в данном документе грызуны содержат гуманизированный ген CD79a, который содержит часть эндогенного CD79a и часть CD79a человека, и гуманизированный ген CD79b, который содержит часть эндогенного CD79b и часть CD79b человека, при этом часть CD79a человека кодирует последовательность, содержащую аминокислоты 33-116 (например, последовательность, содержащую аминокислоты 33-119, последовательность, содержащую аминокислоты 33-143, или последовательность, содержащую аминокислоты 33-165 полипептида CD79a человека), а часть CD79b человека кодирует последовательность, содержащую аминокислоты 29-135 (например, последовательность, содержащую аминокислоты 29-159, или последовательность, содержащую аминокислоты 29-184 полипептида CD79a человека). В некоторых вариантах осуществления эндогенные части CD79a и CD79b, каждая, кодируют по меньшей мере внутриклеточный домен эндогенных полипептидов CD79a и CD79b, соответственно; в некоторых определенных вариантах осуществления - трансмембранный и внутриклеточный домены эндогенных полипептидов CD79a и CD79b, соответственно.

Гуманизированные локусы неонатального Fc-рецептора

[0202] В некоторых вариантах осуществления предложенные в данном документе грызуны (например, мыши или крысы) экспрессируют и/или содержат в геноме гуманизированный или человеческий локус неонатального Fc-рецептора (FcRn). FcRn, также известный как рецептор Брамбелла, представляет собой белок, который экспрессируется эндотелиальными клетками и ассоциирует с бета-2-микроглобулином (β2M), и связывается как с Fc-доменами антител IgG, так и с сывороточным альбумином. FcRn продлевает время полужизни IgG и сывороточного альбумина. В частности, за счет связывания IgG и сывороточного альбумина pH-зависимым образом FcRn способен защищать сывороточные белки от лизосомной деградации эндотелиальными клетками, тем самым повышая сывороточное время полужизни таких белков.

[0203] В некоторых вариантах осуществления локус FcRn содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcRn, содержащий внеклеточный домен человека, трансмембранный домен грызуна (например, мыши или крысы) и цитоплазматический домен грызуна (например, мыши или крысы). В некоторых вариантах осуществления локус FcRn содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcRn, содержащий внеклеточный домен человека, трансмембранный домен человека (например, мыши или крысы) и цитоплазматический домен грызуна (например, мыши или крысы). В некоторых вариантах осуществления локус FcRn содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcRn, содержащий внеклеточный домен человека, трансмембранный домен человека (например, мыши или крысы) и цитоплазматический домен человека (например, мыши или крысы).

[0204] В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcRn, расположена в эндогенном локусе FcRn грызуна. В определенных вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcRn, замещает весь или часть эндогенного гена FcRn грызуна. Например, в некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая внеклеточный домен в эндогенном локусе FcRn, замещена последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей внеклеточный домен FcRn человека, так что грызун, содержащий такой локус, экспрессирует FcRn с внеклеточным доменом человека и трансмембранным и цитоплазматическим доменом грызуна (например, крысы или мыши). В некоторых вариантах осуществления грызун не экспрессирует FcRn грызуна или не экспрессирует функциональный FcRn грызуна. В некоторых вариантах осуществления генный локус FcRn содержит не принадлежащие человеку регуляторные элементы (например, не принадлежащие человеку промоторы и/или энхансеры). В некоторых вариантах осуществления не принадлежащие человеку регуляторные элементы представляют собой регуляторные элементы грызуна (например, крысиные или мышиные промоторы или энхансеры).

[0205] В определенных вариантах осуществления мышиные экзоны, кодирующие домены альфа 1, альфа 2 и альфа 3 (экзоны 3, 4 и 5, которые являются первыми тремя кодирующими экзонами) гена FcRn мыши, замещены человеческими экзонами, кодирующими домены альфа 1, альфа 2 и альфа 3 (экзоны 3, 4 и 5) гена FcRn человека (смотрите Фиг. 4). В некоторых вариантах осуществления ген FcRn содержит мышиный экзон 1 (некодирующий экзон), мышиный экзон 2 (содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую сигнальный пептид) и человеческие экзоны 3-6, мышиные экзоны 6 и 7 (кодирующие трансмембранный и цитоплазматический домены). В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность гуманизированного FcRn, кодируемая локусом, представляет собой SEQ ID NO: 16.

[0206] Под номерами доступа NC_000019.10 (49512279-49526428), NM_001136019.1 и NP_001129491.1 приведены репрезентативные последовательности-источники гена, кДНК и полипептида FcRn человека, из которых можно получить необходимую человеческую часть. Под номерами доступа NC_000073.6 (45092992-45103846), NM_010189.1 и NP_034319.1 приведены репрезентативные последовательности-источники гена, кДНК и полипептида FcRn мыши, из которых можно получить необходимую мышиную часть и/или которые можно использовать при конструировании плеч гомологии нацеленного вектора.

[0207] В некоторых вариантах осуществления грызун является гетерозиготным в отношении генетически модифицированного локуса FcRn. В некоторых вариантах осуществления грызун является гомозиготным в отношении генетически модифицированного локуса FcRn.

Гуманизированный β-2-микроглобулин

[0208] В некоторых вариантах осуществления описанные в данном документе генетически модифицированные грызуны (например, крысы или мыши) и ЭС-клетки экспрессируют и/или содержат в геноме локус, кодирующий полипептид гуманизированного β-2-микроглобулина (β2M). β2M представляет собой полипептид, в котором отсутствует трансмембранная область и который связывается с FcRn и молекулами ГКГС класс I.

[0209] В некоторых вариантах осуществления локус β2M содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид β2M человека. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид β2M человека, расположена в эндогенном локусе β2M грызуна. В определенных вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид β2M замещает весь или часть эндогенного гена β2M грызуна. В некоторых вариантах осуществления грызун не экспрессирует β2M грызуна или не экспрессирует функциональный полипептид β2M грызуна. В некоторых вариантах осуществления генный локус β2M содержит не принадлежащие человеку регуляторные элементы (например, не принадлежащие человеку промоторы и/или энхансеры). В некоторых вариантах осуществления не принадлежащие человеку регуляторные элементы представляют собой регуляторные элементы грызуна (например, крысиные или мышиные промоторы или энхансеры).

[0210] Гуманизированные полипептиды β2M, локусы, кодирующие гуманизированные полипептиды β2M, и отличные от человека животные, экспрессирующие гуманизированные полипептиды β2M, описаны в публикациях патентов США №№2013/0111617 и 2013/0185819, каждая из которых включена в данный документ посредством ссылки. Таким образом, как описано в публикациях патентов США №№2013/0111617 и 2013/0185819, в некоторых вариантах осуществления отличные от человека животные (например, мыши) содержат гуманизированный ген β2M, причем указанный ген содержит экзоны 2, 3 и 4 гена β2M человека, а в некоторых вариантах осуществления гуманизированный ген β2M содержит экзон 1 не принадлежащего человеку (например, мышиного) гена β2M. Гуманизированный локус β2M схематически изображен на Фиг. 5. В некоторых вариантах осуществления грызун является гетерозиготным в отношении генетически модифицированного локуса β2M. В некоторых вариантах осуществления грызун является гомозиготным в отношении генетически модифицированного локуса β2M.

Гуманизированный Fc-эпсилон-рецептор 1 альфа

[0211] В некоторых вариантах осуществления предложенные в данном документе грызуны (например, мыши или крысы) экспрессируют и/или содержат в геноме гуманизированный или человеческий локус Fc-эпсилон-рецептора 1 альфа (FcεR1α). FcεR1α связывается с FcεR1β и FcεR1γ с образованием FcεR1, высокоаффинного рецептора для IgE, который экспрессируется на эпидермальных клетках Лангерганса, эозинофилах, тучных клетках и базофилах. Сайт связывания IgE в FcεR1 находится в субъединице FcεR1α.

[0212] В некоторых вариантах осуществления локус FcεR1α содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcεR1α, содержащий внеклеточный домен человека, трансмембранный домен грызуна (например, мыши или крысы) и цитоплазматический домен грызуна (например, мыши или крысы). В некоторых вариантах осуществления локус FcεR1α содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcεR1α, содержащий внеклеточный домен человека, трансмембранный домен человека и цитоплазматический домен грызуна (например, мыши или крысы). В некоторых вариантах осуществления локус FcεR1α содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcεR1α, содержащий внеклеточный домен человека, трансмембранный домен человека и цитоплазматический домен человека. Пример варианта осуществления сконструированного локуса FcεR1α проиллюстрирован на Фиг. 9.

[0213] В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcεR1α человека, расположена в эндогенном локусе FcεR1α грызуна. В определенных вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcεR1α замещает весь или часть эндогенного гена FcεR1α грызуна. Например, в некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая внеклеточный домен в эндогенном локусе FcεR1α, замещена последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей внеклеточный домен FcεR1α человека, так что грызун, содержащий такой локус, экспрессирует FcεR1α с внеклеточным доменом человека и трансмембранным и цитоплазматическим доменом грызуна (например, крысы или мыши). В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcεR1α, содержащий внеклеточный домен человека, трансмембранный домен человека и цитоплазматический домен человека, расположена в эндогенном локусе FcεR1α грызуна. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcεR1α, содержащий внеклеточный домен человека, трансмембранный домен человека и цитоплазматический домен человека, замещает весь или часть эндогенного локуса FcεR1α грызуна. В некоторых вариантах осуществления грызун не экспрессирует FcεR1α грызуна или не экспрессирует функциональный FcεR1α грызуна. В некоторых вариантах осуществления генный локус FcεR1α содержит не принадлежащие человеку регуляторные элементы (например, не принадлежащие человеку промоторы и/или энхансеры). В некоторых вариантах осуществления не принадлежащие человеку регуляторные элементы представляют собой регуляторные элементы грызуна (например, крысиные или мышиные промоторы или энхансеры).

[0214] В определенных вариантах осуществления часть мышиного кодирующего экзона 1, кодирующего экзона 2, кодирующего экзона 3, кодирующего экзона 4 и кодирующего экзона 5 FcεRIα мыши замещены частью человеческого кодирующего экзона 1, кодирующего экзона 2, кодирующего экзона 3, кодирующего экзона 4 и кодирующего экзона 5 гена FcεRIα человека. В некоторых вариантах осуществления ген FcεRIα содержит химерный мышиный/человеческий экзон 1 (содержащий мышиный промотор и 5’ НТО), человеческие кодирующие экзоны 2-5 до стоп-кодона, человеческие 3’ НТО и полиА, за которыми идут мышиные 3' НТО и полиА. В некоторых вариантах осуществления экзоны 1 (частично) и 2 химерного гена кодируют сигнальный пептид, экзоны 3 и 4 кодируют два Ig-подобных домена FcεRIα, которые, как считается, взаимодействуют с IgE, а экзон 5 кодирует цитоплазматический и трансмембранный домены белка (смотрите Фиг. 9).

[0215] Под номерами доступа NC_000001.11 (159283888-159308224), NM_002001.3 и NP_001992.1 приведены репрезентативные последовательности-источники гена, кДНК и полипептида FcεR1α человека, из которых можно получить необходимую человеческую часть. Под номерами доступа NC_000067.6 (173221269-173227232), NM_010184.1 и NP_034314.1 приведены репрезентативные последовательности-источники гена, кДНК и полипептида FcεR1α мыши, из которых можно получить необходимую мышиную часть и/или которые можно использовать при конструировании плеч гомологии нацеленного вектора.

[0216] В некоторых вариантах осуществления грызун является гетерозиготным в отношении генетически модифицированного локуса FcεR1α. В некоторых вариантах осуществления грызун является гомозиготным в отношении генетически модифицированного локуса FcεR1α.

Гуманизированный Fc-гамма-рецептор 1a

[0217] В некоторых вариантах осуществления предложенные в данном документе грызуны (например, мыши или крысы) экспрессируют и/или содержат в геноме гуманизированный или человеческий локус Fc-гамма-рецептор 1a (FcγR1a, часто обозначаемый FcγR1 на фигурах). FcγR1a представляет собой высокоаффинный белок FcγR, экспрессируемый на моноцитах, который связывается с Fc-частью IgG и вызывает активацию клетки-хозяина.

[0218] В некоторых вариантах осуществления локус FcγR1a содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcγR1a, содержащий внеклеточный домен человека, трансмембранный домен грызуна (например, мыши или крысы) и цитоплазматический домен грызуна (например, мыши или крысы). В некоторых вариантах осуществления локус FcγR1a содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcγR1a, содержащий внеклеточный домен человека, трансмембранный домен человека (например, мыши или крысы) и цитоплазматический домен грызуна (например, мыши или крысы). В некоторых вариантах осуществления локус FcγR1a содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcγR1a, содержащий внеклеточный домен человека, трансмембранный домен человека (например, мыши или крысы) и цитоплазматический домен человека (например, мыши или крысы).

[0219] В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcεR1α, расположена в эндогенном локусе FcγR1a грызуна. В определенных вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγR1a замещает весь или часть эндогенного гена FcγR1a грызуна. Например, в некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая внеклеточный домен в эндогенном локусе FcγR1a, замещена последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей внеклеточный домен FcεR1α человека, так что грызун, содержащий такой локус, экспрессирует FcγR1a с внеклеточным доменом человека и трансмембранным и цитоплазматическим доменом грызуна (например, крысы или мыши). В некоторых вариантах осуществления грызун не экспрессирует FcγR1a грызуна или не экспрессирует функциональный FcγR1a грызуна. В некоторых вариантах осуществления генный локус FcγR1a содержит не принадлежащие человеку регуляторные элементы (например, не принадлежащие человеку промоторы и/или энхансеры). В некоторых вариантах осуществления не принадлежащие человеку регуляторные элементы представляют собой регуляторные элементы грызуна (например, крысиные или мышиные промоторы или энхансеры).

[0220] Гуманизированные полипептиды FcγR1a, локусы, кодирующие гуманизированные полипептиды FcγR1a, и отличные от человека животные, экспрессирующие гуманизированные полипептиды FcγR1a, описаны в патенте США №9474255 и публикации патента США №2017/0086432, которые включены в данный документ посредством ссылки.

[0221] В некоторых вариантах осуществления грызун является гетерозиготным в отношении генетически модифицированного локуса FcγR1a. В некоторых вариантах осуществления грызун является гомозиготным в отношении генетически модифицированного локуса FcγR1a.

Гуманизированные низкоаффинные Fc-гамма-рецепторы

[0222] В некоторых вариантах осуществления описанные в данном документе генетически модифицированные грызуны (например, крысы или мыши) и ЭС-клетки экспрессируют и/или содержат в геноме локус, кодирующий, полипептид человеческого низкоаффинного Fc-гамма-рецептора (FcγR) (например, полипептид FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIc, FcγRIIIa или FcγRIIIb человека).

[0223] В некоторых вариантах осуществления локус низкоаффинного FcγR содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcγRIIa человека. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγRIIa человека, расположена в эндогенном локусе низкоаффинного FcγR грызуна. В определенных вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγRIIa замещает весь или часть эндогенного локуса низкоаффинного FcγR грызуна. В конкретном варианте осуществления ген FcγRIIa человека содержит полиморфизм, причем полиморфизм выбран из полиморфизма с низким уровнем ответа 131His и полиморфизма с высоким уровнем ответа 131Arg. В конкретном варианте осуществления полиморфизм FcγRIIa представляет собой полиморфизм с низким уровнем ответа 131His. В некоторых вариантах осуществления грызун не экспрессирует низкоаффинный полипептид FcγR грызуна (например, не экспрессирует полипептид FcγRIIb, FcγRIV и/или FcγRIII грызуна или не экспрессирует функциональный полипептид FcγRIIb, FcγRIV и/или FcγRIII грызуна). В некоторых вариантах осуществления генный локус FcγRIIa содержит не принадлежащие человеку регуляторные элементы (например, не принадлежащие человеку промоторы и/или энхансеры). В некоторых вариантах осуществления не принадлежащие человеку регуляторные элементы представляют собой регуляторные элементы грызуна (например, крысиные или мышиные промоторы или энхансеры).

[0224] В некоторых вариантах осуществления локус низкоаффинного FcγR содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcγRIIb человека. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγRIIb человека, расположена в эндогенном локусе низкоаффинного FcγR грызуна. В определенных вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγRIIb замещает весь или часть эндогенного локуса низкоаффинного FcγR грызуна. В конкретном варианте осуществления ген FcγRIIb человека содержит аминокислотную замену, причем замена выбрана из замены 187Ile или 187Thr. В некоторых вариантах осуществления грызун не экспрессирует низкоаффинный полипептид FcγR грызуна (например, не экспрессирует полипептид FcγRIIb, FcγRIV и/или FcγRIII грызуна или не экспрессирует функциональный полипептид FcγRIIb, FcγRIV и/или FcγRIII грызуна). В некоторых вариантах осуществления генный локус FcγRIIb содержит не принадлежащие человеку регуляторные элементы (например, не принадлежащие человеку промоторы и/или энхансеры). В некоторых вариантах осуществления не принадлежащие человеку регуляторные элементы представляют собой регуляторные элементы грызуна (например, крысиные или мышиные промоторы или энхансеры).

[0225] В некоторых вариантах осуществления локус низкоаффинного FcγR содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcγRIIc человека. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγRIIc человека, расположена в эндогенном локусе низкоаффинного FcγR грызуна. В определенных вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγRIIc замещает весь или часть эндогенного локуса низкоаффинного FcγR грызуна. В одном варианте осуществления ген FcγRIIc является определенным аллельным вариантом, причем аллельный вариант выбран из варианта 57Stop и варианта 57Q. В некоторых вариантах осуществления грызун не экспрессирует низкоаффинный полипептид FcγR грызуна (например, не экспрессирует полипептид FcγRIIB, FcγRIV и/или FcγRIII грызуна). В некоторых вариантах осуществления генный локус FcγRIIc содержит не принадлежащие человеку регуляторные элементы (например, не принадлежащие человеку промоторы и/или энхансеры). В некоторых вариантах осуществления не принадлежащие человеку регуляторные элементы представляют собой регуляторные элементы грызуна (например, крысиные или мышиные промоторы или энхансеры).

[0226] В некоторых вариантах осуществления локус низкоаффинного FcγR содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcγRIIIa человека. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγRIIIa человека, расположена в эндогенном локусе низкоаффинного FcγR грызуна. В определенных вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγRIIIa замещает весь или часть эндогенного локуса низкоаффинного FcγR грызуна. В некоторых вариантах осуществления грызун не экспрессирует низкоаффинный полипептид FcγR грызуна (например, не экспрессирует полипептид FcγRIIb, FcγRIV и/или FcγRIII грызуна или не экспрессирует функциональный полипептид FcγRIIb, FcγRIV и/или FcγRIII грызуна). В одном варианте осуществления ген FcγRIIIa является определенным аллельным вариантом, причем аллельный вариант выбран из варианта 176Val и варианта 176Phe. В конкретном варианте осуществления аллельный вариант FcγRIIIa представляет собой вариант 176Val. В некоторых вариантах осуществления генный локус FcγRIIIa содержит не принадлежащие человеку регуляторные элементы (например, не принадлежащие человеку промоторы и/или энхансеры). В некоторых вариантах осуществления не принадлежащие человеку регуляторные элементы представляют собой регуляторные элементы грызуна (например, крысиные или мышиные промоторы или энхансеры).

[0227] В некоторых вариантах осуществления локус низкоаффинного FcγR содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcγRIIIb человека. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγRIIIb человека, расположена в эндогенном локусе низкоаффинного FcγR грызуна. В определенных вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγRIIIb замещает весь или часть эндогенного локуса низкоаффинного FcγR грызуна. В конкретном варианте осуществления ген FcγRIIIb является определенным аллельным вариантом, причем аллельный вариант выбран из варианта NA1 и варианта NA2. В другом конкретном варианте осуществления аллельный вариант FcγRIIIb представляет собой вариант NA2. В некоторых вариантах осуществления грызун не экспрессирует низкоаффинный полипептид FcγR грызуна (например, не экспрессирует полипептид FcγRIIb, FcγRIV и/или FcγRIII грызуна или не экспрессирует функциональный полипептид FcγRIIb, FcγRIV и/или FcγRIII грызуна). В некоторых вариантах осуществления генный локус FcγRIIIb содержит не принадлежащие человеку регуляторные элементы (например, не принадлежащие человеку промоторы и/или энхансеры). В некоторых вариантах осуществления не принадлежащие человеку регуляторные элементы представляют собой регуляторные элементы грызуна (например, крысиные или мышиные промоторы или энхансеры).

[0228] В некоторых вариантах осуществления предложенный в данном документе грызун (например, мышь или крыса) содержит один или более генов низкоаффинного FcγR человека, описанных в патентах США №№9221894, 9056130, 9089599, 8658154, 8883496 или 8658853. В некоторых вариантах осуществления предложенный в данном документе грызун (например, мышь или крыса) содержит по меньшей мере два гена низкоаффинного FcγR человека и эндогенный ген γ-цепи Fc грызуна (например, крысы или мыши), причем гены низкоаффинного FcγR человека выбраны из группы, состоящей из FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIc, FcγRIIIa и FcγRIIIb человека. В некоторых определенных вариантах осуществления предложенный в данном документе грызун (например, мышь или крыса) содержит FcγRIIa и FcγRIIIb человека и эндогенный ген γ-цепи Fc грызуна (например, крысы или мыши). В некоторых определенных вариантах осуществления предложенный в данном документе грызун (например, мышь или крыса) содержит гены FcγRIIa, FcγRIIIa, FcγRIIb, FcγRIIc и FcγRIIId и эндогенный ген γ-цепи Fc грызуна (например, крысы или мыши). В различных вариантах осуществления грызун (например, мышь или крыса), содержащий один или более FcγR человека, дополнительно содержит гомозиготное разрушение в эндогенных генах FcγRIIB, FcγRIV и FcγRIII грызуна (например, крысы или мыши) (т.е. эндогенных последовательностях, кодирующих α-цепь FcγRIIb, FcγRIV и FcγRIII грызуна). В различных вариантах осуществления грызун (например, мышь или крыса), содержащий один или более низкоаффинных FcγR человека, описанных в данном документе, не экспрессирует на обнаруживаемом уровне эндогенный низкоаффинный полипептид FcγR (например, эндогенный низкоаффинный полипептид α-цепи FcγR).

[0229] В некоторых вариантах осуществления грызун является гетерозиготным в отношении генетически модифицированного локуса низкоаффинного FcγR. В некоторых вариантах осуществления грызун является гомозиготным в отношении генетически модифицированного локуса низкоаффинного FcγR.

Генетически модифицированные отличные от человека животные и ЭС-клетки

[0230] В определенных аспектах в данном документе предложены генетически модифицированные отличные от человека животные (например, грызуны, такие как крысы или мыши), содержащие один или более гуманизированных локусов, раскрытых в данном документе, а также генетически модифицированные ЭС-клетки отличных от человека животных, применимые для получения таких отличных от человека животных.

[0231] В определенных аспектах в данном документе предложены генетически модифицированные отличные от человека животные и ЭС-клетки отличных от человека животных, содержащие в зародышевой линии и/или геноме один или более сконструированных локусов, описанных в данном документе. Например, в некоторых вариантах осуществления отличное от человека животное или ЭС-клетка содержит в зародышевой линии и/или геноме локус IgH, предложенный в данном документе. В определенных вариантах осуществления отличное от человека животное или ЭС-клетка дополнительно содержит локус Igκ и/или Igλ, предложенный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления отличное от человека животное или ЭС-клетка содержит в зародышевой линии и/или геноме локус CD79a и/или CD79b, предложенный в данном документе. В определенных вариантах осуществления отличное от человека животное или ЭС-клетка содержит в зародышевой линии и/или геноме локус FcRn, предложенный в данном документе. В определенных вариантах осуществления отличное от человека животное или ЭС-клетка содержит в зародышевой линии и/или геноме локус β2M, предложенный в данном документе. В определенных вариантах осуществления отличное от человека животное или ЭС-клетка содержит в зародышевой линии и/или геноме локус FcεR1α, предложенный в данном документе. В определенных вариантах осуществления отличное от человека животное или ЭС-клетка содержит в зародышевой линии и/или геноме локус FcγR1a, предложенный в данном документе. В определенных вариантах осуществления отличное от человека животное или ЭС-клетка содержит в зародышевой линии и/или геноме локус FcγR2a, предложенный в данном документе. В определенных вариантах осуществления отличное от человека животное или ЭС-клетка содержит в зародышевой линии и/или геноме локус FcγR2b, предложенный в данном документе. В определенных вариантах осуществления отличное от человека животное или ЭС-клетка содержит в зародышевой линии и/или геноме локус FcγR3a, предложенный в данном документе. В определенных вариантах осуществления отличное от человека животное или ЭС-клетка содержит в зародышевой линии и/или геноме локус FcγR3b, предложенный в данном документе. В определенных вариантах осуществления отличное от человека животное или ЭС-клетка содержит в зародышевой линии и/или геноме локус FcγR2c, предложенный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления отличное от человека животное или ЭС-клетка являются гетерозиготными в отношении одного или более локусов, например, генетически сконструированных локусов, предложенных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления отличное от человека животное или ЭС-клетка являются гомозиготными в отношении одного или более локусов, например, генетически сконструированных локусов, предложенных в данном документе.

[0232] В некоторых вариантах осуществления отличное от человека животное может представлять собой любое отличное от человека животное. В некоторых вариантах осуществления отличное от человека животное представляет собой позвоночное. В некоторых вариантах осуществления отличное от человека животное представляет собой млекопитающее. В некоторых вариантах осуществления описанное в данном документе генетически модифицированное отличное от человека животное может быть выбрано из группы, состоящей из мыши, крысы, кролика, свиньи, представителя бычьих (например, коровы, быка, буйвола), оленя, овцы, козы, ламы, курицы, кошки, собаки, хорька, примата (например, мармозетки, макака-резус). В случае отличных от человека животных, для которых недоступны подходящие для генетической модификации ЭС-клетки, можно применять другие способы для создания отличного от человека животного, содержащего генетические модификации, описанные в данном документе. Такие способы включают, например, модификацию генома отличной от ЭС клетки (например, фибробласта или индуцированной плюрипотентной клетки) и применение ядерного переноса для переноса модифицированного генома в подходящую клетку, такую как ооцит, и вынашивание модифицированной клетки (например, модифицированного ооцита) отличным от человека животным в подходящих условиях для формирования эмбриона.

[0233] В различных вариантах осуществления в данном документе предложены отличные от человека животные, например, грызуны (например, крысы или мыши), содержащие генетически сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина. Типовые варианты осуществления таких генетически сконструированных локусов схематически проиллюстрированы на Фиг. 1 и подробно описаны в данном документе. В некоторых вариантах осуществления отличное от человека животное, описанное в данном документе, содержит в своем геноме (например, геноме зародышевой линии) ген Adam6, который кодирует полипептид ADAM6, его функциональный ортолог, функциональный гомолог или функциональный фрагмент (смотрите, например, патенты США №8642835 и 8697940, каждый из которых в полном объеме включен в данный документ посредством ссылки). В некоторых вариантах осуществления полипептид ADAM6, его функциональный ортолог, функциональный гомолог или функциональный фрагмент экспрессируется из гена Adam6. В некоторых вариантах осуществления ген Adam6 не получен от отличного от человека животного, которое содержит ген Adam6 (например, мыши, которая содержит ген Adam6 крысы или ген Adam6 мыши, полученный от другой линии мышей). В некоторых вариантах осуществления отличное от человека животное, описанное в данном документе, содержит эктопический ген Adam6. В контексте данного документа «эктопический» ген Adam6 относится к гену Adam6, который находится в окружении, отличном от того, в котором Adam6 находится в организме отличного от человека животного дикого типа. Например, ген Adam6 может быть расположен в другой хромосоме, расположен в другом локусе или размещен рядом с другими последовательностями. Типовым эктопическим геном Adam6 является ген Adam6 мыши, расположенный в последовательностях иммуноглобулина человека (например, генных сегментах вариабельной области тяжелой цепи человека). В некоторых вариантах осуществления отличное от человека животное, описанное в данном документе, содержит вставленный или интегрированный ген Adam6.

[0234] В некоторых вариантах осуществления отличное от человека животное, описанное в данном документе, содержит в своем геноме (например, геноме зародышевой линии) вставку одной или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих один или более полипептидов Adam6, не принадлежащих человеку, их функциональных ортологов, функциональных гомологов или функциональных фрагментов.

[0235] В некоторых вариантах осуществления отличное от человека животное, описанное в данном документе, содержит в своем геноме (например, геноме зародышевой линии) одну или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих один или более полипептидов ADAM6, не принадлежащих человеку, их функциональных ортологов, функциональных гомологов или функциональных фрагментов. В некоторых вариантах осуществления отличное от человека животное, описанное в данном документе, содержит в своем геноме (например, геноме зародышевой линии) ген Adam6a мыши и/или ген Adam6b мыши. В некоторых вариантах осуществления отличное от человека животное, описанное в данном документе, содержит одну или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих ADAM6a мыши, его функциональный ортолог, функциональный гомолог или функциональный фрагмент, и/или ADAM6b мыши, его функциональный ортолог, функциональный гомолог или функциональный фрагмент.

[0236] В некоторых вариантах осуществления одна или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих один или более не принадлежащих человеку полипептидов ADAM6, их функциональных ортологов, функциональных гомологов или функциональных фрагментов, вставлены и/или расположены в той же хромосоме, что и эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления одна или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих один или более не принадлежащих человеку полипептидов ADAM6, их функциональных ортологов, функциональных гомологов или функциональных фрагментов, вставлены и/или расположены в позиции так, чтобы одна или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих один или более не принадлежащих человеку полипептидов ADAM6, их функциональных ортологов, функциональных гомологов или функциональных фрагментов, были непрерывными с генными сегментами вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина человека. В некоторых вариантах осуществления одна или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих один или более не принадлежащих человеку полипептидов ADAM6, их функциональных ортологов, функциональных гомологов или функциональных фрагментов, вставлены и/или расположены в позиции так, чтобы одна или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих один или более не принадлежащих человеку полипептидов ADAM6, их функциональных ортологов, функциональных гомологов или функциональных фрагментов, являются смежными с генными сегментами вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина человека. В некоторых вариантах осуществления одна или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих один или более не принадлежащих человеку полипептидов ADAM6, их функциональных ортологов, функциональных гомологов или функциональных фрагментов, вставлены и/или расположены в позиции так, чтобы одна или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих один или более не принадлежащих человеку полипептидов ADAM6, их функциональных ортологов, функциональных гомологов или функциональных фрагментов, расположены между генными сегментами вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина человека. В некоторых вариантах осуществления одна или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих один или более не принадлежащих человеку полипептидов ADAM6, их функциональных ортологов, функциональных гомологов или функциональных фрагментов, вставлены и/или расположены между первым и вторым генным сегментом V_H человека. В некоторых вариантах осуществления первый генный сегмент V_H человека представляет собой V_H1-2 человека, а второй генный сегмент V_H человека представляет собой V_H6-1 человека. В некоторых вариантах осуществления одна или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих один или более не принадлежащих человеку полипептидов ADAM6, их функциональных ортологов, функциональных гомологов или функциональных фрагментов, вставлены и/или расположены на месте псевдогена Adam6 человека. В некоторых вариантах осуществления одна или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих один или более не принадлежащих человеку полипептидов ADAM6, их функциональных ортологов, функциональных гомологов или функциональных фрагментов, вставлены между генным сегментом V_H человека и генным сегментом D_H человека.

[0237] В некоторых вариантах осуществления отличное от человека животное, описанное в данном документе, содержит ген Adam6, который восстанавливает или повышает активность ADAM6. В некоторых вариантах осуществления ген Adam6 восстанавливает активность ADAM6 до уровня, сопоставимого с уровнем отличного от человека животного, которое содержит функциональный эндогенный ген Adam6. В некоторых вариантах осуществления ген Adam6 повышает активность ADAM6 до уровня, который по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 3 раза, по меньшей мере в 4 раза, по меньшей мере в 5 раз, по меньшей мере в 6 раз, по меньшей мере в 7 раз, по меньшей мере в 8 раз, по меньшей мере в 9 раз или по меньшей мере в 10 раз больше по сравнению с активностью ADAM6 сопоставимого отличного от человека животного, которое не содержит функциональный ген Adam6.

[0238] В некоторых вариантах осуществления отличное от человека животное, описанное в данном документе, содержит ген Adam6, который восстанавливает или повышает фертильность самцов отличного от человека животного. В некоторых вариантах осуществления ген Adam6 восстанавливает фертильность самцов отличного от человека животного до уровня, сопоставимого с уровнем отличного от человека животного, которое содержит функциональный эндогенный ген Adam6. В некоторых вариантах осуществления ген Adam6 восстанавливает фертильность самцов отличного от человека животного, так что количество детенышей, полученных в результате спаривания самца отличного от человека животного, составляет по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% от количества детенышей, полученных в результате сопоставимого спаривания сопоставимого самца отличного от человека животного, которое не содержит функциональный ген Adam6. В некоторых вариантах осуществления ген Adam6 повышает фертильность самцов отличного от человека животного так, что количество детенышей, полученных в результате спаривания самца отличного от человека животного, по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 3 раза, по меньшей мере в 4 раза, по меньшей мере в 5 раз, по меньшей мере в 6 раз, по меньшей мере в 7 раз, по меньшей мере в 8 раз, по меньшей мере в 9 раз или по меньшей мере в 10 раз больше количества детенышей, полученных в результате сопоставимого спаривания сопоставимого самца отличного от человека животного, которое не содержит функциональный ген Adam6.

[0239] В некоторых вариантах осуществления в локусе тяжелой цепи не принадлежащего человеку иммуноглобулина, описанном в данном документе, отсутствует по меньшей мере один не принадлежащий человеку эндогенный ген Adam6. В некоторых вариантах осуществления отсутствие по меньшей мере одного не принадлежащего человеку эндогенного гена Adam6 снижает активность ADAM6 и/или фертильность самцов мышей, у которых отсутствует не принадлежащий человеку эндогенный ген Adam6. В некоторых вариантах осуществления в локусе тяжелой цепи не принадлежащего человеку иммуноглобулина, описанном в данном документе, присутствует разрушение по меньшей мере одного не принадлежащего человеку эндогенного гена Adam6. В некоторых вариантах осуществления разрушение по меньшей мере одного не принадлежащего человеку гена Adam6 снижает активность ADAM6 и/или фертильность самцов мышей, у которых отсутствует не принадлежащий человеку эндогенный ген Adam6.

[0240] В некоторых вариантах осуществления отличное от человека животное представляет собой млекопитающее. В некоторых вариантах осуществления отличное от человека животное представляет собой небольшое млекопитающее, например, из надсемейства Dipodoidea или Muroidea. В некоторых вариантах осуществления отличное от человека животное представляет собой грызуна. В определенных вариантах осуществления грызун представляет собой мышь, крысу или хомяка. В некоторых вариантах осуществления грызун выбран из надсемейства Muroidea. В некоторых вариантах осуществления отличное от человека животное принадлежит семейству, выбранному из Calomyscidae (например, мышевидные хомяки), Cricetidae (например хомяк, крысы и мыши Нового Света, полевки), Muridae (например, истинные мыши и крысы, песчанки, колючие рисовые хомяки, косматые хомяки), Nesomyidae (например, рипидомисы, скалистые хомячки, белохвостые крысы, мадагаскарские крысы и мыши), Platacanthomyidae (например, колючие соневидные хомяки), and Spalacidae (например, слепыши, бамбуковые крысы и цокоры). В некоторых вариантах осуществления грызун выбран из истинной мыши или крысы (семейство Muridae), песчанки, колючего рисового хомяка и косматого хомяка. В некоторых вариантах осуществления мышь является представителем семейства Muridae. В некоторых вариантах осуществления отличное от человека животное представляет собой грызуна. В некоторых вариантах осуществления грызун выбран из мыши и крысы. В некоторых вариантах осуществления отличное от человека животное представляет собой мышь.

[0241] В некоторых вариантах осуществления отличное от человека животное представляет собой мышь линии C57BL. В некоторых вариантах осуществления линия C57BL выбрана из C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr и C57BL/Ola. В некоторых вариантах осуществления отличное от человека животное представляет собой мышь линии 129. В некоторых вариантах осуществления линия 129 выбрана из группы, состоящей из линии, которая представляет собой 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1 (например, 129S1/SV, 129S1/SvIm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2. В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированная мышь получена при смешении линии 129 и линии C57BL. В некоторых вариантах осуществления мышь получена при смешении линий 129 и/или смешении линий C57BL/6. В некоторых вариантах осуществления линия 129 из смеси представляет собой линию 129S6 (129/SvEvTac). В некоторых вариантах осуществления мышь принадлежит линии BALB (например, BALB/c). В некоторых вариантах осуществления мышь получена при смешении линии BALB и другой линии (например, линии C57BL и/или линии 129). В некоторых вариантах осуществления предложенное в данном документе отличное от человека животное может представлять собой мышь, полученную из любой комбинации вышеуказанных линий.

[0242] В некоторых вариантах осуществления предложенное в данном документе отличное от человека животное представляет собой крысу. В некоторых вариантах осуществления крыса выбрана из крыс линии Вистар (Wistar), линии LEA, линии Спрег - Доули (Sprague Dawley), линии Фишер (Fischer), F344, F6 и Dark Agouti. В некоторых вариантах осуществления линия крыс представляет собой смесь двух или более линий, выбранных из группы, состоящей из Вистар, LEA, Спрег - Доули, Фишер, F344, F6 и Dark Agouti.

[0243] В определенных вариантах осуществления генетически модифицированные отличные от человека животные или ЭС-клетки содержат в геноме и/или зародышевой линии некоторое количество предложенных в данном документе локусов, например, некоторое количество предложенных в данном документе генетически сконструированных локусов. Например, в некоторых вариантах осуществления отличное от человека животное или ЭС-клетка содержит в зародышевой линии и/или геноме локус IgH, предложенный в данном документе, и локус Igκ и/или Igλ, предложенный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления отличное от человека животное или ЭС-клетка содержит в зародышевой линии и/или геноме локус IgH, предложенный в данном документе, локус Igκ и/или Igλ, предложенный в данном документе, и, необязательно, локус CD79a и/или CD79b, предложенный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления отличное от человека животное или ЭС-клетка содержит в зародышевой линии и/или геноме локус IgH, предложенный в данном документе, локус Igκ и/или Igλ, предложенный в данном документе, локус FcRn, предложенный в данном документе, и локус β2M, предложенный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления отличное от человека животное или ЭС-клетка содержит в зародышевой линии и/или геноме локус IgH, предложенный в данном документе, локус Igκ и/или Igλ, предложенный в данном документе, локус FcRn, предложенный в данном документе, локус β2M, предложенный в данном документе, локус FcεR1α, предложенный в данном документе, локус FcγR1a, предложенный в данном документе, локус FcγR2a, предложенный в данном документе, локус FcγR2b, предложенный в данном документе, локус FcγR3a, предложенный в данном документе, локус FcγR3b, предложенный в данном документе, и/или локус FcγR2c, предложенный в данном документе, и любые их комбинации.

[0244] В определенных аспектах генетически модифицированное отличное от человека животное экспрессирует один или более гуманизированных полипептидов, кодируемых гуманизированными локусами, предложенными в данном документе. Например, в некоторых вариантах осуществления отличное от человека животное экспрессирует гуманизированный полипептид тяжелой цепи Ig. В определенных вариантах осуществления отличное от человека животное экспрессирует гуманизированный полипептид Igκ и/или гуманизированный полипептид Igλ. В некоторых вариантах осуществления отличное от человека животное экспрессирует гуманизированный полипептид CD79a и/или гуманизированный полипептид CD79b. В определенных вариантах осуществления отличное от человека животное экспрессирует гуманизированный полипептид FcRn. В определенных вариантах осуществления отличное от человека животное экспрессирует гуманизированный полипептид β2M. В определенных вариантах осуществления отличное от человека животное экспрессирует гуманизированный полипептид FcεR1α. В определенных вариантах осуществления отличное от человека животное экспрессирует гуманизированный полипептид FcγR1a. В определенных вариантах осуществления отличное от человека животное или ЭС-клетка отличного от человека животного экспрессирует гуманизированный полипептид FcγR2a. В определенных вариантах осуществления отличное от человека животное экспрессирует гуманизированный полипептид FcγR2b. В определенных вариантах осуществления отличное от человека животное экспрессирует гуманизированный полипептид FcγR3a. В определенных вариантах осуществления отличное от человека животное экспрессирует гуманизированный полипептид FcγR3b. В определенных вариантах осуществления отличное от человека животное экспрессирует гуманизированный полипептид FcγR2c.

[0245] Генетически модифицированных отличных от человека животных и ЭС-клетки можно создавать, используя соответствующий способ, известный в данной области техники. Например, такие генетически модифицированные ЭС-клетки отличных от человека животных можно создавать, используя технологию VELOCIGENE®, которая описана в патентах США №№6586251, 6596541, 7105348 и в Valenzuela et al. (2003) “High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis” Nat. Biotech. 21(6): 652-659, которые все включены в данный документ посредством ссылки. Модификации также можно осуществлять, используя нацеленную на геном нуклеазную систему, такую как система CRISPR/Cas, система на основе эффекторных нуклеаз, подобных активаторам транскрипции (TALEN), система на основе цинк-пальцевых нуклеаз (ZFN). В некоторых вариантах осуществления модификации осуществляют, используя систему CRISPR/Cas, описанную, например, в заявках на патенты США №№14/314866, 14/515503, 14/747461 и 14/731914, каждая из которых включена в данный документ посредством ссылки. Типовые способы создания таких генетически модифицированных отличных от человека животных и ЭС-клеток также приведены в данном документе в примерах 1 и 3-5.

[0246] После этого описанные в данном документе ЭС-клетки можно использовать для создания отличного от человека животного, используя способы, известные в данной области техники. Например, описанные в данном документе мышиные ЭС-клетки можно использовать для создания генетически модифицированных мышей, используя способ VELOCIMOUSE®, описанный в патенте США №7294754 и в Poueymirou et al., Nature Biotech 25:91-99 (2007), которые все включены в данный документ посредством ссылки. Полученных в результате мышей можно скрещивать до гомозиготности.

Способы тестирования терапевтических средств, содержащих Fc человека

[0247] В определенных аспектах в данном документе предложены способы тестирования терапевтического белка, содержащего Fc-домен человека (например, человеческое антитело или Fc-слитый белок), включающие введение терапевтического белка грызуну, предложенному в данном документе (например, мыши или крысе, предложенным в данном документе). В определенных вариантах осуществления в данном документе предложены животные модели для осуществления таких способов.

[0248] В некоторых вариантах осуществления вводимые человеческое антитело или Fc-слитый белок имеют изотип и/или аллотип, который совпадает с изотипом и/или аллотипом Fc-домена, кодируемого C_H человека в генетически модифицированном локусе IgH предложенного в данном документе грызуна. Например, в некоторых вариантах осуществления агент представляет собой человеческое антитело IgG1, а грызун содержит генетически модифицированный локус IgH, который содержит генный сегмент C_H, кодирующий CH₁-домен, шарнирный домен, CH₂- и CH₃-домены IgG1 человека. В некоторых вариантах осуществления агент представляет собой человеческое антитело IgG4, а грызун содержит генетически модифицированный локус IgH, который содержит генный сегмент C_H, кодирующий CH₁-домен, шарнирный домен, CH₂- и CH₃-домены IgG4 человека. В некоторых вариантах осуществления агент представляет собой человеческое антитело IgG1, а грызун содержит генетически модифицированный локус IgH, который содержит генный сегмент C_H, кодирующий CH₁-домен, шарнирный домен, CH₂-, CH₃-, M1- и M2- домены IgG1 человека. В некоторых вариантах осуществления агент представляет собой человеческое антитело IgG2, а грызун содержит генетически модифицированный локус IgH, который содержит генный сегмент C_H, кодирующий CH₁-домен, шарнирный домен, CH₂-, CH₃-, M1- и M2- домены IgG2 человека. В некоторых вариантах осуществления агент представляет собой человеческое антитело IgG3, а грызун содержит генетически модифицированный локус IgH, который содержит генный сегмент C_H, кодирующий CH₁-домен, шарнирный домен, CH₂-, CH₃-, M1- и M2- домены IgG3 человека. В некоторых вариантах осуществления агент представляет собой человеческое антитело IgG4, а грызун содержит генетически модифицированный локус IgH, который содержит генный сегмент C_H, кодирующий CH₁-домен, шарнирный домен, CH₂-, CH₃-, M1- и M2- домены IgG4 человека. В некоторых вариантах осуществления агент представляет собой человеческое антитело IgM, а грызун содержит генетически модифицированный локус IgH, который содержит генный сегмент C_H, кодирующий CH₁-, CH₂-, CH₃- и CH₄-домены IgM человека. В некоторых вариантах осуществления агент представляет собой человеческое антитело IgD, а грызун содержит генетически модифицированный локус IgH, который содержит генный сегмент C_H, кодирующий CH₁-, H1-, H2-, CH₂-, CH₃-, M1- и M2-домены IgD человека. В некоторых вариантах осуществления терапевтический агент представляет собой человеческое антитело, имеющее легкую цепь Igκ, а грызун содержит генетически модифицированный локус Igκ, предложенный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления терапевтический агент представляет собой человеческое антитело, имеющее легкую цепь Igλ, а грызун содержит генетически модифицированный локус Igλ, предложенный в данном документе.

[0249] В некоторых вариантах осуществления указанный способ включает измерение одного или более фармакокинетических свойств вводимого терапевтического белка. В определенных вариантах осуществления животная модель, используемая для определения фармакокинетических свойств вводимого человеческого антитела или слитого белка, представляет собой предложенного в данном документе генетически модифицированного грызуна, содержащего модифицированный локус IgH, предложенный в данном документе. В определенных вариантах осуществления животная модель, используемая для определения фармакокинетических свойств вводимого человеческого антитела или слитого белка, представляет собой предложенного в данном документе генетически модифицированного грызуна, содержащего модифицированный локус IgH, предложенный в данном документе, и модифицированный локус Igκ и/или модифицированный локус Igλ, предложенный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления вводимые человеческое антитело или Fc-слитый белок имеют изотип и/или аллотип, который совпадает с изотипом и/или аллотипом константного домена, кодируемого гуманизированным C_H в генетически модифицированном локусе IgH. В некоторых вариантах осуществления грызун дополнительно содержит модифицированный локус FcRn, предложенный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления грызун дополнительно содержит модифицированный локус β2M, предложенный в данном документе.

[0250] В некоторых вариантах осуществления один или более фармакокинетических параметров включают, но не ограничиваются этим, площадь под кривой плазменная концентрация - время (ППК), in vivo восстановление (IVR), скорость выведения (CL), среднее время удержания (СВУ), время полужизни агента и объем распределения в равновесном состоянии (Vss). В общем случае фармакокинетические свойства вводимого терапевтического агента определяют путем введения выбранной дозы терапевтического агента (например, 0,1 мг/кг, 0,2 мг/кг, 0,3 мг/кг, 0,4 мг/кг, 0,5 мг/кг, 1 мг/кг, 2 мг/кг, 3 мг/кг, 4 мг/кг, 5 мг/кг, 7,5 мг/кг, 10 мг/кг, 15 мг/кг, 20 мг/кг, 25 мг/кг, 30 мг/кг, 40 мг/кг или 50 мг/кг или больше) и определения после этого, как меняется со временем плазменная концентрация терапевтического агента (например, в течение 0 ч, 6 ч, 1 суток, 2 суток, 3 суток, 4 суток, 5 суток, 6 суток, 7 суток, 8 суток, 9 суток, 10 суток, 11 суток или до 30 или более суток).

[0251] В некоторых вариантах осуществления указанные способы дополнительно включают определение терапевтической эффективности вводимого терапевтического белка (например, способности вводимой дозы терапевтического белка уменьшать или устранять один или более симптомов заболевания в животной модели). В некоторых вариантах осуществления животная модель представляет собой модель онкологического заболевания, а симптомы заболевания могут включать, например, размер опухоли, метастазирование опухоли и/или выживаемость животного. В определенных вариантах осуществления животная модель представляет собой модель аутоиммунного или воспалительного заболевания, а симптомы заболевания могут включать, например, уровни экспрессии цитокинов, пролиферацию иммунных клеток, повреждение тканей и/или выживаемость животного. В некоторых вариантах осуществления животная модель представляет собой модель инфекционного заболевания, а симптомы заболевания могут включать, например, уровни инфекционного агента, повреждение тканей и/или выживаемость животного.

[0252] В некоторых вариантах осуществления указанные способы дополнительно включают определение безопасности и дозы вводимого терапевтического белка (например, степени, в которой вводимая доза терапевтического белка вызывает одно или более нежелательных явлений в животной модели). Нежелательные явления включают, но не ограничиваются этим, аллергические реакции, алопецию, анафилаксию, анемию, отсутствие аппетита, нарушение равновесия, кровотечение, образование тромбов, затрудненное дыхание, бронхит, кровоподтеки, низкое количество белых кровяных телец, низкое количество красных кровяных телец, низкое количество тромбоцитов, кардиотоксичность, конъюнктивит, запор, кашель, обезвоживание, диарею, нарушения баланса электролитов, утрату фертильности, повышение температуры, выпадение волос, сердечную недостаточность, инфекцию, реакции в месте инъекции, дефицит железа, почечную недостаточность, лейкопению, нарушение функции печени, пневмонию, частое сердцебиение, ректальное кровотечение, судороги, потерю массы и набор массы. Например, в определенных вариантах осуществления в данном документе предложен способ определения аллергических реакций, индуцированных терапевтическим агентом, с использованием моделей пассивной кожной анафилаксии (ПКА) и/или пассивной системной анафилаксии (ПСА).

[0253] В определенных вариантах осуществления указанный способ дополнительно включает определение степени, в которой терапевтический белок индуцирует один или более опосредованных Fc-рецепторами ответов у грызуна (например, степени, в которой терапевтический белок индуцирует антителозависимую клеточноопосредованную цитотоксичность (АЗКЦ)). Например, в определенных вариантах осуществления в данном документе предложен способ скрининга терапевтического агента, содержащего человеческую Fc-область человеческого антитела, включающий: (a) введение агента, содержащего Fc-область человеческого антитела, предложенному в данном документе грызуну, причем агент связывается с целевой клеткой в организме грызуна; (b) определение антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности (АЗКЦ) естественных клеток-киллеров (NK) против целевой клетки; и (c) сравнение уровня АЗКЦ на этапе (b) с контролем, причем повышенное уничтожение целевых клеток указывает на то, что агент обладает повышенной способностью опосредовать АЗКЦ.

[0254] В некоторых вариантах осуществления указанный способ дополнительно включает определение степени, в которой введение терапевтического белка индуцирует иммунный ответ против Fc человека у грызуна.

[0255] В некоторых вариантах осуществления вводимый терапевтический агент вызывает сниженный иммунный ответ при введении предложенному в данном документе грызуну. В некоторых вариантах осуществления вводимые человеческое антитело или Fc-слитый белок имеют изотип и/или аллотип, который совпадает с изотипом и/или аллотипом Fc-домена, кодируемого C_H человека в генетически модифицированном локусе IgH предложенного в данном документе грызуна. Например, в некоторых вариантах осуществления агент представляет собой человеческое антитело IgG1, а грызун содержит генетически модифицированный локус IgH, который содержит генный сегмент C_H, кодирующий CH₁-домен, шарнирный домен, CH₂- и CH₃-домены IgG1 человека. В некоторых вариантах осуществления агент представляет собой человеческое антитело IgG4, а грызун содержит генетически модифицированный локус IgH, который содержит генный сегмент C_H, кодирующий CH₁-домен, шарнирный домен, CH₂- и CH₃-домены IgG4 человека. В некоторых вариантах осуществления агент представляет собой человеческое антитело IgG1, а грызун содержит генетически модифицированный локус IgH, который содержит генный сегмент C_H, кодирующий CH₁-домен, шарнирный домен, CH₂-, CH₃-, M1- и M2- домены IgG1 человека. В некоторых вариантах осуществления агент представляет собой человеческое антитело IgG2, а грызун содержит генетически модифицированный локус IgH, который содержит генный сегмент C_H, кодирующий CH₁-домен, шарнирный домен, CH₂-, CH₃-, M1- и M2- домены IgG2 человека. В некоторых вариантах осуществления агент представляет собой человеческое антитело IgG3, а грызун содержит генетически модифицированный локус IgH, который содержит генный сегмент C_H, кодирующий CH₁-домен, шарнирный домен, CH₂-, CH₃-, M1- и M2- домены IgG3 человека. В некоторых вариантах осуществления агент представляет собой человеческое антитело IgG4, а грызун содержит генетически модифицированный локус IgH, который содержит генный сегмент C_H, кодирующий CH₁-домен, шарнирный домен, CH₂-, CH₃-, M1- и M2- домены IgG4 человека. В некоторых вариантах осуществления агент представляет собой человеческое антитело IgM, а грызун содержит генетически модифицированный локус IgH, который содержит генный сегмент C_H, кодирующий CH₁-, CH₂-, CH₃- и CH₄-домены IgM человека. В некоторых вариантах осуществления агент представляет собой человеческое антитело IgD, а грызун содержит генетически модифицированный локус IgH, который содержит генный сегмент C_H, кодирующий CH₁-, H1-, H2-, CH₂-, CH₃-, M1- и M2-домены IgD человека. В некоторых вариантах осуществления терапевтический агент представляет собой человеческое антитело, имеющее легкую цепь Igκ, а грызун содержит генетически модифицированный локус Igκ, предложенный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления терапевтический агент представляет собой человеческое антитело, имеющее легкую цепь Igλ, а грызун содержит генетически модифицированный локус Igλ, предложенный в данном документе.

[0256] В определенных вариантах осуществления предложенные в данном документе способы включают тестирование терапевтических антител, содержащих Fc человека. В некоторых вариантах осуществления тестируемые антитела содержат вариабельные домены тяжелой цепи человека. В некоторых вариантах осуществления антитела содержат константные домены тяжелой цепи человека. В некоторых вариантах осуществления предложенные в данном документе антитела содержат константный домен IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM или IgD. Последовательности константных доменов тяжелой цепи человека известны в данной области техники (смотрите, например, Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, публикацию NIH № 91-3242 и базу данных IMGT, доступную на www.imgt.org).

[0257] В некоторых вариантах осуществления тестируемые антитела содержат модифицированный Fc-домен (например, мутацию, которая меняет взаимодействие между Fc и Fc-рецептором). Например, в некоторых вариантах осуществления предложенные в данном документе антитела содержат модификацию в Fc-домене в позиции 235, 236, 237, 239, 265, 267, 268, 269, 270, 298, 326, 327, 330, 332, 350, 351, 366, 392, 394, 405 и/или 407 (по системе нумерации EU). В некоторых вариантах осуществления модификация выбрана из группы, состоящей из L235A, G236E, G237F, S239E, S239D, D265E, D265S, S267E, S267D, S267G, H268E, H268D, E269L, D270N, D270E, S298A, K326A, K326D, A327H, A327V, A327L, A330I, A330S, I332E, T350V, L351Y, T366L, K392M, K392L, T394W, F405A и/или Y407V (по системе нумерации EU). В некоторых вариантах осуществления антитела содержать некоторое количество модификаций в Fc-домене. В некоторых вариантах осуществления некоторое количество модификаций выбраны из группы, состоящей из D270N/K326D, S239E/S298A/K326A/A327H, L235A/S239E/D265E/A327H, G236E/G237F/S239E, G237F/S239E/D265E, G327F/S239E/H268D, G236E/D270N/A327V/I332E, G237F/S239E/A327H, G237F/A327L/A330I, S239D/D265S/S298A/I332E, S239E/D265S/H268D/I332E, S239E/D265S/I332E, S239E/S267E/H268D, S239E/A327L/A330I, D265E/S267D/A330S, S267G/H268E/D270E, H268D/E269L/S298A/K326A/A327H, H268D//K326A/A327H. Дополнительные Fc-модификации и комбинации Fc-модификаций приведены в патентах США №№5624821, 5648260, 6528624, 6737056, 7122637, 7183387, 7297775, 7317091, 7332581, 7632497, 7662925, 7695936, 8093359, 8216805, 8218805, 8388955 и 8937158, и публикациях патентов США №№2005/0054832, 2006/0222653, 2006/0275282, 2006/0275283, 2007/0190063, 2008/0154025, 2009/0042291 2013/0108623 и 2013/0089541, которые все включены в данный документ посредством ссылки.

[0258] В некоторых вариантах осуществления тестируемое антитело представляет собой биспецифическое антитело. В некоторых вариантах осуществления два антигенсвязывающих домена биспецифического антитела имеют отличные вариабельные домены тяжелой цепи, но имеют идентичные вариабельные домены легкой цепи. В некоторых вариантах осуществления Fc-домены тяжелых цепей содержат модификации для облегчения образования гетеродимеров тяжелых цепей и/или ингибирования образования гомодимеров тяжелых цепей. Такие модификации приведены, например, в патентах США №№5731168, 5807706, 5821333, 7642228 и 8679785 и в публикации патента США №2013/0195849, которые все включены в данный документ посредством ссылки.

[0259] В некоторых вариантах осуществления антитела, тестируемые в предложенных в данном документе способах, имеют вариабельные домены легкой цепи человека. В некоторых вариантах осуществления вариабельные домены легкой цепи представляют собой вариабельные домены легкой цепи λ. В некоторых вариантах осуществления вариабельные домены легкой цепи представляют собой вариабельные домены легкой цепи κ. В некоторых вариантах осуществления антитела содержат константные домены легкой цепи человека. В некоторых вариантах осуществления константные домены легкой цепи представляют собой константные домены легкой цепи λ. В некоторых вариантах осуществления константные домены легкой цепи представляют собой константные домены легкой цепи κ. Последовательности константных доменов легкой цепи человека известны в данной области техники (смотрите, например, Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, публикацию NIH №91-3242 и базу данных IMGT, доступную на www.imgt.org).

[0260] В определенных вариантах осуществления терапевтический агент вводят предложенному в данном документе грызуну в виде части фармацевтической композиции, например, фармацевтической композиции, содержащей человеческое антитело или Fc-слитый белок, смешанные с фармацевтически приемлемым носителем.

[0261] Предложенные в данном документе фармацевтические композиции могут быть составлены специально для введения в твердой или жидкой форме, включая адаптированные для: (1) перорального введения, например, жидкие формы (водные или неводные растворы или суспензии), таблетки, например, предназначенные для буккального, подъязычного и системного всасывания, болюсы, порошки, гранулы, пасты для применения под язык; или (2) парентерального введения, например, путем подкожной, внутримышечной, внутривенной или эпидуральной инъекции, такие как, например, стерильные растворы или суспензии, или составы с замедленным высвобождением.

[0262] Фармацевтические композиции, подходящие для парентерального введения, содержат человеческое антитело или Fc-слитый белок в комбинации с одним или более фармацевтически приемлемыми стерильными изотоническими водными или неводными растворами, дисперсиями, суспензиями или эмульсиями, или стерильными порошками, которые можно восстанавливать в стерильных инъекционных растворах или дисперсиях непосредственно перед применением, которые могут содержать сахара, спирты, антиоксиданты, буферы, бактериостатические агенты, растворимые вещества, которые придают составу изотоничность с кровью предполагаемого реципиента, или суспендирующие или загущающие агенты.

[0263] Примеры подходящих водных и неводных носителей, которые можно применять в фармацевтических композициях, предложенных в данном документе, включают воду, этанол, полиолы (такие как глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и т. п.) и их подходящие смеси, растительные масла, такие как оливковое масло, и инъекционные органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Надлежащую текучесть можно поддерживать, например, путем использования материалов для покрытия, таких как лецитин, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсий и путем использования поверхностно-активных веществ.

[0264] В определенных вариантах осуществления композиции содержат человеческое антитело или Fc-слитый белок в концентрации, дающей в результате надлежащее соотношение масс./об. для необходимой дозы. Антитело может присутствовать в композиции в концентрации по меньшей мере 1 мг/мл, по меньшей мере 5 мг/мл, по меньшей мере 10 мг/мл, по меньшей мере 15 мг/мл, по меньшей мере 20 мг/мл, по меньшей мере 25 мг/мл, по меньшей мере 30 мг/мл, по меньшей мере 35 мг/мл, по меньшей мере 40 мг/мл, по меньшей мере 45 мг/мл, по меньшей мере 50 мг/мл, по меньшей мере 55 мг/мл, по меньшей мере 60 мг/мл, по меньшей мере 65 мг/мл, по меньшей мере 70 мг/мл, по меньшей мере 75 мг/мл, по меньшей мере 80 мг/мл, по меньшей мере 85 мг/мл, по меньшей мере 90 мг/мл, по меньшей мере 95 мг/мл, по меньшей мере 100 мг/мл, по меньшей мере 105 мг/мл, по меньшей мере 110 мг/мл, по меньшей мере 115 мг/мл, по меньшей мере 120 мг/мл, по меньшей мере 125 мг/мл, по меньшей мере 130 мг/мл, по меньшей мере 135 мг/мл, по меньшей мере 140 мг/мл, по меньшей мере 150 мг/мл, по меньшей мере 200 мг/мл, по меньшей мере 250 мг/мл или по меньшей мере 300 мг/мл.

[0265] В некоторых вариантах осуществления композиции готовят путем смешивания антитела или Fc-слитого белка человека с необязательными физиологически приемлемыми носителями, эксципиентами или стабилизаторами, включая, но не ограничиваясь этим, буферные агенты, сахариды, соли, поверхностно-активные вещества, солюбилизаторы, полиолы, разбавители, связующие вещества, стабилизаторы, соли, липофильные растворители, аминокислоты, хелаторы, консерванты и т.п. (Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 12th edition, L. Brunton, et al. and Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. Ed. (1999)), в форме лиофилизированных композиций или водных растворов в необходимой конечной концентрации. Приемлемые носители, эксципиенты или стабилизаторы являются нетоксичными для реципиентов в применяемых дозировках и концентрациях и включают буферы, такие как гистидин, фосфат, цитрат, глицин, ацетат и другие органические кислоты; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как хлорид октадецилдиметилбензиламмония; хлорид гексаметония; хлорид бензалкония, хлорид бензетония; феноловый, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехол; резорцин; циклогексанол; 3-пентанол; и м-крезол); низкомолекулярные (менее чем около 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая трегалозу, глюкозу, маннозу или декстрины; хелатообразующие агенты, такие как ЭДТА; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы металлов (например, комплексы Zn-белок); и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как ТВИН, полисорбат 80, ПЛЮРОНИКИ® или полиэтиленгликоль (ПЭГ).

[0266] В некоторых вариантах осуществления буферный агент представляет собой гистидин, цитрат, фосфат, глицин или ацетат. Сахаридный эксципиент может представлять собой трегалозу, сахарозу, маннит, мальтозу или раффинозу. Поверхностно-активное вещество может представлять собой полисорбат 20, полисорбат 40, полисорбат 80 или плюроник F68. Соль может представлять собой NaCl, KCl, MgCl2 или CaCl2.

[0267] В некоторых вариантах осуществления композиция содержит буферный или pH-регулирующий агент для обеспечения улучшенного контроля pH. Такая композиция может иметь pH от около 3,0 до около 9,0, от около 4,0 до около 8,0, от около 5,0 до около 8,0, от около 5,0 до около 7,0, от около 5,0 до около 6,5, от около 5,5 до около 8,0, от около 5,5 до около 7,0 или от около 5,5 до около 6,5. В дополнительном варианте осуществления такая композиция имеет pH около 3,0, около 3,5, около 4,0, около 4,5, около 5,0, около 5,1, около 5,2, около 5,3, около 5,4, около 5,5, около 5,6, около 5,7, около 5,8, около 5,9, около 6,0, около 6,1, около 6,2, около 6,3, около 6,4, около 6,5, около 6,6, около 6,7, около 6,8, около 6,9, около 7,0, около 7,5, около 8,0, около 8,5 или около 9,0. В конкретном варианте осуществления композиция имеет pH около 6,0. Специалисту в данной области техники понятно, что pH композиции в общем случае не должен быть равным изоэлектрической точке антитела или Fc-слитого белка человека, предназначенного для применения в композиции. Как правило, буферный агент представляет собой соль, полученную из органических или неорганических кислот или оснований. Типовые буферные агенты включают, но не ограничиваются этим, соли органических кислот, такие как соли лимонной кислоты, аскорбиновой кислоты, глюконовой кислоты, угольной кислоты, винной кислоты, янтарной кислоты, уксусной кислоты или фталевой кислоты; Трис, трометамина гидрохлорид или фосфатные буферы. Кроме того, аминокислотные компоненты также могут служить в качестве буферного средства. Типовые аминокислотные компоненты, которые можно использовать в композиции в качестве буферных агентов, включают, но не ограничиваются этим, глицин и гистидин. В определенных вариантах осуществления буферный агент выбран из гистидина, цитрата, фосфата, глицина и ацетата. В конкретном варианте осуществления буферный агент представляет собой гистидин. В другом конкретном варианте осуществления буферный агент представляет собой цитрат. В другом конкретном варианте осуществления буферный агент представляет собой глицин. Чистота буферного агента должна составлять по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или по меньшей мере 99,5%. В данном документе термин «чистота» в контексте гистидина и глицина относится к химической чистоте гистидина или глицина, как известно в данной области техники, например, как описано в The Merck Index, 13th ed., O'Neil et al. ed. (Merck & Co., 2001).

[0268] В определенных вариантах осуществления композиция содержит гистидин в качестве буферного агента. В определенных вариантах осуществления гистидин присутствует в композиции в концентрации по меньшей мере около 1 мМ, по меньшей мере около 5 мМ, по меньшей мере около 10 мМ, по меньшей мере около 20 мМ, по меньшей мере около 30 мМ, по меньшей мере около 40 мМ, по меньшей мере около 50 мМ, по меньшей мере около 75 мМ, по меньшей мере около 100 мМ, по меньшей мере около 150 мМ или по меньшей мере около 200 мМ гистидина. В другом варианте осуществления композиция содержит от около 1 мМ до около 200 мМ, от около 1 мМ до около 150 мМ, от около 1 мМ до около 100 мМ, от около 1 мМ до около 75 мМ, от около 10 мМ до около 200 мМ, от около 10 мМ до около 150 мМ, от около 10 мМ до около 100 мМ, от около 10 мМ до около 75 мМ, от около 10 мМ до около 50 мМ, от около 10 мМ до около 40 мМ, от около 10 мМ до около 30 мМ, от около 20 мМ до около 75 мМ, от около 20 мМ до около 50 мМ, от около 20 мМ до около 40 мМ или от около 20 мМ до около 30 мМ гистидина. В дополнительном варианте осуществления композиция содержит около 1 мМ, около 5 мМ, около 10 мМ, около 20 мМ, около 25 мМ, около 30 мМ, около 35 мМ, около 40 мМ, около 45 мМ, около 50 мМ, около 60 мМ, около 70 мМ, около 80 мМ, около 90 мМ, около 100 мМ, около 150 мМ или около 200 мМ гистидина. В конкретном варианте осуществления композиция может содержать около 10 мМ, около 25 мМ гистидина или не содержать его.

[0269] В некоторых вариантах осуществления композиция содержит углеводный эксципиент. Углеводные эксципиенты могут действовать, например, как агенты, повышающие вязкость, стабилизаторы, объемообразующие агенты, солюбилизирующие агенты и т.п. Углеводные эксципиенты в общем случае присутствуют в количестве от около 1% до около 99% по массе или объему, например, от около 0,1% до около 20%, от около 0,1% до около 15%, от около 0,1% до около 5%, от около 1% до около 20%, от около 5% до около 15%, от около 8% до около 10%, от около 10% до около 15%, от около 15% до около 20%, от 0,1% до 20%, от 5% до 15%, от 8% до 10%, от 10% до 15%, от 15% до 20%, от около 0,1% до около 5%, от около 5% до около 10% или от около 15% до около 20%. В других конкретных вариантах осуществления углеводный эксципиент может присутствовать в количестве 1%, или 1,5%, или 2%, или 2,5%, или 3%, или 4%, или 5%, или 10%, или 15%, или 20%.

[0270] В некоторых вариантах осуществления композиция содержит углеводный эксципиент. Углеводные эксципиенты, подходящие для применения в композиции, включают, но не ограничиваются этим, моносахариды, такие как фруктоза, мальтоза, галактоза, глюкоза, D-манноза, сорбоза и т.п.; дисахариды, такие как лактоза, сахароза, трегалоза, целлобиоза и т.п.; полисахариды, такие как раффиноза, мелицитоза, мальтодекстрины, декстраны, крахмалы и т.п.; и альдиты, такие как маннит, ксилит, мальтит, лактит, ксилит, сорбит (глюцит) и т.п. В определенных вариантах осуществления углеводные эксципиенты для применения в предложенных в данном документе композициях выбраны из сахарозы, трегалозы, лактозы, маннита и раффинозы. В конкретном варианте осуществления углеводный эксципиент представляет собой трегалозу. В другом конкретном варианте осуществления углеводный эксципиент представляет собой маннит. В другом конкретном варианте осуществления углеводный эксципиент представляет собой сахарозу. В другом конкретном варианте осуществления углеводный эксципиент представляет собой раффинозу. Чистота буферного углеводного эксципиента должна составлять по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или по меньшей мере 99,5%.

[0271] В некоторых вариантах осуществления композиция содержит трегалозу. В определенных вариантах осуществления композиция содержит по меньшей мере около 1%, по меньшей мере около 2%, по меньшей мере около 4%, по меньшей мере около 8%, по меньшей мере около 20%, по меньшей мере около 30% или по меньшей мере около 40% трегалозы. В другом варианте осуществления композиция содержит от около 1% до около 40%, от около 1% до около 30%, от около 1% до около 20%, от около 2% до около 40%, от около 2% до около 30%, от около 2% до около 20%, от около 4% до около 40%, от около 4% до около 30% или от около 4% до около 20% трегалозы. В другом варианте осуществления композиция содержит около 1%, около 2%, около 4%, около 6%, около 8%, около 15%, около 20%, около 30% или около 40% трегалозы. В конкретном варианте осуществления композиция содержит около 4%, около 6% или около 15% трегалозы.

[0272] В определенных вариантах осуществления композиция содержит эксципиент. В конкретном варианте осуществления композиция содержит по меньшей мере один эксципиент, выбранный из сахара, соли, поверхностно-активного вещества, аминокислоты, полиола, хелатирующего агента, эмульгатора и консерванта. В определенных вариантах осуществления композиция содержит соль, например, соль, выбранную из NaCl, KCl, CaCl2 и MgCl2. В конкретном варианте осуществления композиция содержит NaCl.

[0273] В некоторых вариантах осуществления композиция содержит аминокислоту, например, лизин, аргинин, глицин, гистидин, или соль аминокислоты. Композиция может содержать по меньшей мере около 1 мМ, по меньшей мере около 10 мМ, по меньшей мере около 25 мМ, по меньшей мере около 50 мМ, по меньшей мере около 100 мМ, по меньшей мере около 150 мМ, по меньшей мере около 200 мМ, по меньшей мере около 250 мМ, по меньшей мере около 300 мМ, по меньшей мере около 350 мМ или по меньшей мере около 400 мМ аминокислоты. В другом варианте осуществления композиция может содержать от около 1 мМ до около 100 мМ, от около 10 мМ до около 150 мМ, от около 25 мМ до около 250 мМ, от около 25 мМ до около 300 мМ, от около 25 мМ до около 350 мМ, от около 25 мМ до около 400 мМ, от около 50 мМ до около 250 мМ, от около 50 мМ до около 300 мМ, от около 50 мМ до около 350 мМ, от около 50 мМ до около 400 мМ, от около 100 мМ до около 250 мМ, от около 100 мМ до около 300 мМ, от около 100 мМ до около 400 мМ, от около 150 мМ до около 250 мМ, от около 150 мМ до около 300 мМ или от около 150 мМ до около 400 мМ аминокислоты. В дополнительном варианте осуществления композиция содержит около 1 мМ, 1,6 мМ, 25 мМ, около 50 мМ, около 100 мМ, около 150 мМ, около 200 мМ, около 250 мМ, около 300 мМ, около 350 мМ или около 400 мМ аминокислоты.

[0274] В некоторых вариантах осуществления композиция содержит поверхностно-активное вещество. В контексте данного документа термин «поверхностно-активное вещество» относится к органическим веществам, имеющим амфипатическую структуру; а именно, они состоят из групп с противоположной растворимостью, как правило, растворимой в масле углеводородной цепи и растворимой в воде ионной группы. Поверхностно-активные вещества можно классифицировать в зависимости от заряда поверхностно-активного фрагмента, на анионные, катионные и неионные поверхностно-активные вещества. Поверхностно-активные вещества часто используют в качестве смачивающих, емульгирующих, солюбилизирующих и диспергирующих агентов для различных фармацевтических композиций и препаратов биологических материалов. Фармацевтически приемлемые поверхностно-активные вещества, такие как полисорбаты (например, полисорбаты 20 или 80); полиоксамеры (например, полоксамер 188); Тритон; октилгликозид натрия; лаурил-, миристил-, линолеил- или стеарил-сульфобетаин; лаурил-, миристил-, линолеил- или стеарил-саркозин; линолеил-, миристил- или цетил-бетаин; лауроамидопропил-, кокамидопропил-, линолеамидопропил-, миристамидопропил-, пальмидопропил- или изостеарамидопропил-бетаин (например, лауроамидопропил); миристамидопропил-, пальмидопропил- или изостеарамидопропил-диметиламин; натрия метил-кокоил- или динатрия метил олеил-таурат; и ряд MONAQUA® (Mona Industries, Inc., Paterson, N.J.), полиэтилгликоль, полипропилгликоль и сополимеры этилен- и пропиленгликоля (например, ПЛЮРОНИКИ® PF68 и т.д.), можно необязательно добавлять в композиции для снижения агрегации. В определенных вариантах осуществления композиция содержит полисорбат 20, полисорбат 40, полисорбат 60 или полисорбат 80. Поверхностно-активные вещества в особенности полезны в случае применения насоса или пластикового контейнера для введения композиции. Наличие фармацевтически приемлемого поверхностно-активного вещества снижает подверженность белка агрегации. Композиции могут содержать полисорбат в концентрации от около 0,001% до около 1%, или от около 0,001% до около 0,1%, или от около 0,01% до около 0,1%. В других конкретных вариантах осуществления композиции содержат полисорбат в концентрации 0,001%, или 0,002%, или 0,003%, или 0,004%, или 0,005%, или 0,006%, или 0,007%, или 0,008%, или 0,009%, или 0,01%, или 0,015%, или 0,02%.

[0275] В некоторых вариантах осуществления композиция содержит другие эксципиенты и/или добавки, включая, но не ограничиваясь этим, разбавители, связующие вещества, стабилизаторы, липофильные растворители, консерванты, адъюванты и т.п. Фармацевтически приемлемые эксципиенты и/или добавки можно использовать в предложенных в данном документе композициях. Обычно используемые эксципиенты/добавки, такие как фармацевтически приемлемые хелаторы (например, без ограничения, ЭДТА, ДТПА или ЭГТА), можно необязательно добавлять в композиции для снижения агрегации. Эти добавки в особенности полезны в случае применения насоса или пластикового контейнера для введения композиции.

[0276] В некоторых вариантах осуществления композиция содержит консервант. Консерванты, такие как фенол, м-крезол, п-крезол, о-крезол, хлорокрезол, бензиловый спирт, фенилмеркурнитрит, феноксиэтанол, формальдегид, хлорбутанол, хлорид магния (например, без ограничения, гексагидрат), алкилпарабен (метил-, этил-, пропил-, бутил- и т.п.), бензалкония хлорид, бензетония хлорид, дегидроацетат натрия и тимеросал или их смеси, можно необязательно добавлять в композиции в любой подходящей концентрации, например, от около 0,001% до около 5%, или любом промежуточном диапазоне. Концентрация консерванта, используемого в композициях, представляет собой концентрацию, достаточную для оказания противомикробного действия. Такие концентрации зависят от выбранного консерванта и могут быть легко определены специалистом в данной области техники.

[0277] В некоторых вариантах осуществления композиция является изотонической с человеческой кровью, при этом композиции имеют практические такое же осмотическое давление, что и человеческая кровь. Такие изотонические композиции в общем случае имеют осмотическое давление от около 250 мОсм до около 350 мОсм. Изотоничность можно измерять, например, используя осмометр давления пара или осмометр по точке замерзания. Тоничность композиции доводят, используя модификаторы тоничности. «Модификаторами тоничности» являются фармацевтически приемлемые инертные вещества, которые можно добавлять в композицию для обеспечения изотоничности композиции. Модификаторы тоничности, подходящие для предложенных в данном документе композиций, включают, но не ограничиваются этим, сахариды, соли и аминокислоты.

[0278] В определенных вариантах осуществления композиция является апирогенной композицией, которая практически не содержит эндотоксины и/или родственные пирогенные вещества. Эндотоксины включают токсины, которые содержатся внутри микроорганизма и высвобождаются только при разрушении или гибели микроорганизма. Пирогенные вещества также включают индуцирующие повышение температуры термостабильные вещества из внешней мембраны бактерий и других микроорганизмов. Оба типа веществ могут вызывать повышение температуры, гипотензию и шок при введении людям. Из-за потенциальных вредоносных эффектов даже низкие количества эндотоксинов необходимо удалять из внутривенно вводимых фармацевтических лекарственных растворов. Управление по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных препаратов США («FDA») установило верхнюю границу в 5 единиц эндотоксина (ЕЭ) на дозу на килограмм массы тела в одночасовой период для внутривенного применения лекарственных препаратов (Фармакопейная конвенция США, Фармакопейный форум 26 (1):223 (2000)). Когда терапевтические белки вводят в количествах нескольких сотен или тысяч миллиграммов на килограмм массы тела, как может быть в случае с представляющими интерес белками (например, антителами), даже следовые количества вредоносного и опасного эндотоксина необходимо удалять. В некоторых вариантах осуществления уровни эндотоксинов и пирогенные уровни в композиции составляют менее 10 ЕЭ/мг, или менее 5 ЕЭ/мг, или менее 1 ЕЭ/мг, или менее 0,1 ЕЭ/мг, или менее 0,01 ЕЭ/мг, или менее 0,001 ЕЭ/мг.

[0279] В случае применения для in vivo введения, описанная в данном документе композиция должна быть стерильной. Композицию можно стерилизовать различными методами стерилизации, включая стерильную фильтрацию, облучение и т.д. В определенных вариантах осуществления композицию подвергают стерильной фильтрации с помощью предварительно простерилизованного 0,22-микронного фильтра. Стерильные композиции для инъекции можно составлять в соответствии с традиционной фармацевтической практикой, как описано в “Remington: The Science & Practice of Pharmacy”, 21st ed., Lippincott Williams & Wilkins, (2005). Композиции, содержащие представляющие интерес белки (например, антитела), такие как раскрыты в данном документе, обычно хранят в лиофилизированной форме или в растворе. Подразумевается, что стерильные композиции, содержащие представляющие интерес белки (например, антитела), помещают в контейнер, имеющий стерильный порт доступа, например, пакет или флакон для внутривенного раствора, имеющий адаптер, который позволяет извлекать композицию, такой как пробка, прокалываемая гиподермической иглой для инъекций. В определенных вариантах осуществления композиция предложена в виде предварительно заполненного шприца.

[0280] В определенных вариантах осуществления композиция представляет собой лиофилизированный состав. Термин «лиофилизированный» или «высушенный сублимацией» включает состояние вещества, которое было подвергнуто процедуре сушки, такой как лиофилизация, в которой было удалено по меньшей мере 50% влаги.

[0281] Вне зависимости от выбранного пути введения, предложенные в данном документе агенты, которые можно использовать в подходящей гидратированной форме, и/или предложенные в данном документе фармацевтические композиции готовят в фармацевтически приемлемых дозированных формах традиционными способами, известными специалистам в данной области техники.

[0282] В предложенных в данном документе способах человеческое антитело, Fc-слитый белок и/или фармацевтические композиции можно доставлять любым подходящим путем введения, включая пероральный, назальный, например в виде спрея, ректальный, внутривагинальный, парентеральный, интрацистернальный и местный, например, используя порошки, мази или капли, включая буккальный и подъязычный. В определенных вариантах осуществления фармацевтические композиции доставляют обычным способом (например, путем перорального или парентерального введения).

[0283] В определенных вариантах осуществления фактические уровни дозировки активных ингредиентов в описанных в данном документе фармацевтических композициях можно варьировать, чтобы получить количество активного ингредиента, эффективное для достижения необходимого терапевтического ответа для животной модели, композиции и режима введения, без токсического эффекта для животной модели.

[0284] Например, в определенных вариантах осуществления описанных в данном документе отличных от человека животных используют для определения фармакокинетических профилей одного или более кандидатных человеческих антител. В различных вариантах осуществления одно или более описанных в данном документе отличных от человека животных и одно или более контрольных или референсных отличных от человека животных подвергают воздействию одного или более кандидатных человеческих антител в различных дозах (например, 0,1 мг/кг, 0,2 мг/кг, 0,3 мг/кг, 0,4 мг/кг, 0,5 мг/кг, 1 мг/кг, 2 мг/кг, 3 мг/кг, 4 мг/кг, 5 мг/кг, 7,5 мг/кг, 10 мг/кг, 15 мг/кг, 20 мг/кг, 25 мг/кг, 30 мг/кг, 40 мг/кг или 50 мг/кг или более), Кандидатные терапевтические антитела можно вводить любым необходимым путем введения, включая парентеральный и непарентеральный пути введения. Парентеральные пути включают, например, внутривенный, внутриартериальный, внутрипортальный, внутримышечный, подкожный, внутрибрюшинный, интраспинальный, интратекальный, интрацеребровентрикулярный, внутричерепной, внутриплевральный или другие пути введения. Непарентеральные пути включают, например, пероральный, назальный, трансдермальный, легочный, ректальный, буккальный, вагинальный, глазной. Введение также можно осуществлять путем непрерывной инфузии, местного введения, замедленного высвобождения из имплантатов (гелей, мембран и т.п.) и/или внутривенной инъекции. Кровь берут у отличных от человека животных (гуманизированных и контрольных) в различные моменты времени (например, 0 ч, 6 ч, 1 сутки, 2 суток, 3 суток, 4 суток, 5 суток, 6 суток, 7 суток, 8 суток, 9 суток, 10 суток, 11 суток или до 30 и более суток). Можно проводить различные анализы для определения фармакокинетических профилей вводимых кандидатных терапевтических антител, используя образцы, полученные от отличных от человека животных, описанных в данном документе, включая, но не ограничиваясь этим, анализ на общий IgG, ответ против терапевтического антитела, агглютинацию и т.д.

[0285] В различных вариантах осуществления отличных от человека животных, описанных в данном документе, используют для определения терапевтического эффекта блокировки или модуляции активности представляющего интерес полипептида и влияния на генную экспрессию в результате клеточных изменений или, в контексте рецепторного полипептида, плотность рецепторного полипептида на поверхности клеток у отличных от человека животных. В различных вариантах осуществления отличное от человека животное, описанное в данном документе, или выделенные из него клетки, подвергают воздействию кандидатного терапевтического средства, которое связывает представляющий интерес полипептид, и через некоторое время анализируют в отношении эффектов на специфические клеточные процессы, которые связаны с указанным представляющим интерес полипептидом, например, взаимодействия лиганд-рецептор или передачу сигнала.

[0286] Описанные в данном документе отличные от человека животные обеспечивают улучшенную in vivo систему для разработки и отбора человеческих антител для применения при онкологических и/или инфекционных заболеваниях. В различных вариантах осуществления отличным от человека животным, описанным в данном документе, и контрольным отличным от человека животным (например, имеющим генетическую модификацию, которая отличается от описанной в данном документе, или не имеющим генетической модификации, т.е. дикого типа) могут имплантировать опухоли (или опухолевые клетки) или инфицировать вирусом (например, вирусом гриппа, ВИЧ, HCV, HPV и т.д.). После имплантации или инфекции отличным от человека животным можно вводить кандидатное терапевтическое средство. Опухоли или вирусу можно давать достаточное время для развития в одной или более локациях в организме отличных от человека животных перед введением кандидатного терапевтического средства. В альтернативном и/или дополнительном варианте у таких отличных от человека животных можно отслеживать иммунный ответ для изучения характеристик и отбора потенциальных человеческих антител, которые можно разрабатывать в качестве терапевтического средства.

Способы получения человеческих антител

[0287] В определенных аспектах в данном документе предложен способ получения человеческого антитела с использованием грызуна (например, мыши или крысы), который содержит гуманизированный локус тяжелой цепи, предложенный в данном документе, и человеческий локус легкой цепи, предложенный в данном документе (например, гуманизированный локус легкой цепи κ и/или λ, предложенный в данном документе). В некоторых вариантах осуществления грызун дополнительно содержит гуманизированный локус CD79a, предложенный в данном документе, и/или гуманизированный локус CD79b, предложенный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления грызун дополнительно содержит гуманизированный локус FcRn, предложенный в данном документе, и/или гуманизированный локус β2M, предложенный в данном документе. В определенных вариантах осуществления грызун дополнительно содержит гуманизированный локус FcγR1a, предложенный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления грызун дополнительно содержит гуманизированный локус FcεR1α, предложенный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления грызун дополнительно содержит гуманизированный локус FcγR2b, предложенный в данном документе, гуманизированный локус FcγR2c, предложенный в данном документе, гуманизированный локус FcγR3a, предложенный в данном документе, и/или гуманизированный локус FcγR3b, предложенный в данном документе.

[0288] Предложенных в данном документе грызунов можно использовать для создания антитела (например, человеческого антитела), используя стандартные способы, известные в данной области техники. Например, в некоторых вариантах осуществления предложенного в данном документе грызуна иммунизируют представляющим интерес антигеном в условиях и в течение времени, достаточных для того, чтобы у грызуна развился иммунный ответ на указанный представляющий интерес антиген. В некоторых вариантах осуществления представляющий интерес антиген представляет собой человеческое антитело (например, человеческое терапевтическое антитело) или Fc-слитый белок (например, терапевтической Fc-слитый белок). Антитела выделяют из грызуна (или одной или более клеток, например, одной или более B-клеток) и изучают их характеристики, используя различные анализы с определением, например, аффинности, специфичности, картирования эпитопов, способности блокировать взаимодействие лиганд-рецептор, ингибирования активации рецепторов и т.д.

[0289] В некоторых вариантах осуществления предложен способ получения антитела в организме грызуна (например, мыши или крысы), включающий этапы (а) иммунизации грызуна, который вырабатывает антитела, описанные в данном документе, представляющим интерес антигеном; (b) содержание грызуна в условиях, достаточных для того, чтобы у грызуна вырабатывался иммунный ответ на представляющий интерес антиген; и (c) выделение из грызуна или клетки грызуна антитела, которое связывает представляющий интерес антиген. В некоторых вариантах осуществления указанный способ дополнительно включает нарушение иммунологической толерантности к антигену у грызуна или удаление представляющего интерес антигена иным способом, например, с применением системы CRISPR/Cas9 и использованием некоторого количества направляющих РНК, для снижения или устранения экспрессии собственного антигена, гомологичного или содержащего одинаковый представляющий интерес эпитоп с представляющим интерес антигеном, которым иммунизирован грызун (например, как описано в публикации патента США №2017/0332610, которая включена в данный документ посредством ссылки).

[0290] В некоторых вариантах осуществления предложен способ получения нуклеиновой кислоты, кодирующей тяжелую и/или легкую цепь человека, в организме грызуна, включающий этапы (а) иммунизации грызуна, который экспрессирует человеческие антитела, описанные в данном документе, представляющим интерес антигеном; (b) содержание грызуна в условиях, достаточных для того, чтобы у грызуна вырабатывался иммунный ответ на представляющий интерес антиген; и (c) выделение из грызуна или клетки грызуна нуклеиновой кислоты, кодирующей тяжелую и/или легкую цепь человека.

[0291] В некоторых вариантах осуществления предложенных в данном документе грызунов можно использовать для создания антител против лекарственных препаратов (например, анти-идиотипических антител). Например, в некоторых вариантах осуществления предложенного в данном документе грызуна иммунизируют человеческим терапевтическим антителом в условиях и в течение времени, достаточных для того, чтобы у грызуна развился иммунный ответ на указанное человеческое терапевтическое антитело. В некоторых вариантах осуществления человеческое терапевтическое антитело имеет такие же константные домены тяжелой цепи, что и константные домены тяжелой цепи, кодируемые гуманизированным локусом тяжелой цепи иммуноглобулина предложенного в данном документе грызуна. В некоторых вариантах осуществления человеческое терапевтическое антитело имеет такой же константный домен легкой цепи, что и константный домен легкой цепи, кодируемый гуманизированным локусом легкой цепи иммуноглобулина (например, гуманизированным локусом легкой цепи κ и/или λ) предложенного в данном документе грызуна. В некоторых вариантах осуществления грызун не содержит в геноме один или более генных сегментов вариабельной области человека, из которых получено терапевтическое антитело (например, один или более локусов иммуноглобулина у грызуна содержат вариабельные области грызуна или их части). Антитела против лекарственного препарата (например, анти-идиотипические антитела) выделяют из грызуна (или одной или более клеток, например, одной или более B-клеток) и изучают их характеристики, используя различные анализы с определением, например, аффинности, специфичности, картирования эпитопов, способности блокировать взаимодействие антиген-терапевтическое антитело и т.д. Созданные антитела против лекарственного препарата (например, анти-идиотипические антитела) можно использовать для анализа фармакокинетики (ФК) человеческого терапевтического антитела, или использовать для анализа иммуногенности человеческого терапевтического антитела во время доклинического анализа, или использовать для локализации человеческого терапевтического антитела.

[0292] В некоторых вариантах осуществления предложен способ получения антитела против лекарственного препарата (например, анти-идиотипического антитела), включающий этапы (а) иммунизации грызуна, который вырабатывает антитела, содержащие человеческие константные области, описанные в данном документе, человеческим терапевтическим антителом, которое совпадает по изотипу с человеческой константной областью, присутствующей у грызуна; (b) содержание грызуна в условиях, достаточных для того, чтобы у грызуна вырабатывался иммунный ответ на человеческое терапевтическое антитело; и (c) выделение из грызуна или клетки грызуна антитела, которое связывает человеческое терапевтическое антитело.

Способы создания генетически модифицированных отличных от человека животных и ЭС-клеток

[0293] В определенных аспектах в данном документе предложены способы создания отличных от человека животных (например, мыши или крысы) и ЭС-клеток, которые содержат один или более генетически модифицированных локусов, предложенных в данном документе. Например, в некоторых вариантах осуществления в данном документе предложены способы получения отличных от человека животных (например, мыши или крысы) и ЭС-клеток, которые содержат гуманизированный локус тяжелой цепи, предложенный в данном документе, и человеческий локус легкой цепи, предложенный в данном документе (например, гуманизированный локус легкой цепи κ и/или λ, предложенный в данном документе). В некоторых вариантах осуществления в данном документе предложены способы получения отличных от человека животных (например, мыши или крысы) и ЭС-клеток, которые дополнительно содержат гуманизированный локус CD79a, предложенный в данном документе, и/или гуманизированный локус CD79b, предложенный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления в данном документе предложены способы получения отличных от человека животных (например, мыши или крысы) и ЭС-клеток, которые дополнительно содержат гуманизированный локус FcRn, предложенный в данном документе, и/или гуманизированный локус β2M, предложенный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления в данном документе предложены способы получения отличных от человека животных (например, мыши или крысы) и ЭС-клеток, которые дополнительно содержат гуманизированный локус FcεR1α, предложенный в данном документе. В определенных вариантах осуществления в данном документе предложены способы получения отличных от человека животных (например, мыши или крысы) и ЭС-клеток, которые дополнительно содержат гуманизированный локус FcγR1a, предложенный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления в данном документе предложены способы получения отличных от человека животных (например, мыши или крысы) и ЭС-клеток, которые дополнительно содержат гуманизированный локус FcεR1α, предложенный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления в данном документе предложены способы получения отличных от человека животных (например, мыши или крысы) и ЭС-клеток, которые дополнительно содержат гуманизированный локус FcγR2a, предложенный в данном документе, гуманизированный локус FcγR2b, предложенный в данном документе, гуманизированный локус FcγR2c, предложенный в данном документе, гуманизированный локус FcγR3a, предложенный в данном документе, и/или гуманизированный локус FcγR3b, предложенный в данном документе. В определенных вариантах осуществления в данном документе предложены способы получения отличных от человека животных (например, мыши или крысы) и ЭС-клеток, которые содержат гуманизированный локус FcRn, предложенный в данном документе, и/или гуманизированный локус β2M, предложенный в данном документе. В определенных вариантах осуществления в данном документе предложены способы получения отличных от человека животных (например, мыши или крысы) и ЭС-клеток, которые содержат гуманизированный локус FcεR1α, предложенный в данном документе. Типовые способы получения генетически модифицированных отличных от человека животных и ЭС-клеток, предложенных в данном документе, описаны в описании, примерах и/или на фигурах.

Наборы

[0294] В данном документе предложены упаковка или набор, содержащие один или более контейнеров, заполненных по меньшей мере одним отличным от человека животным, не принадлежащими человеку клеткой, фрагментом ДНК и/или нацеленным вектором, описанными в описании, примерах и/или на фигурах. Наборы можно использовать любым приемлемым способов (например, исследовательским способом). Необязательно, к таким контейнерам может прилагаться уведомление в форме, предписанной государственным органом, регулирующим производство, использование или продажу фармацевтических препаратов или биологических продуктов, причем это уведомление отображает (а) утверждение органом, регулирующим производство, использование или продажу препаратов для введения человеку, (b) инструкции по применению, (c) контракт, который регулирует передачу материалов и/или биологических продуктов (например, отличного от человека животного или не принадлежащей человеку клетки, описанных в данном документе), между двумя или более сторонами, и их комбинации.

Дополнительные типовые варианты осуществления

[0295] В типовом варианте осуществления 1 в данном документе предложен грызун, содержащий в геноме: сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H, генный сегмент D_H и генный сегмент J_H; и (ii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент C_H, кодирующий константный домен IgG, содержащий домен C_H1 человека, шарнирную область человека, домен C_H2 человека, домен C_H3 человека, трансмембранный домен IgG и цитоплазматический домен IgG, причем вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина так, чтобы грызун вырабатывал антитела IgG, содержащие вариабельные домены, полученные из генного сегмента V_H, генного сегмента D_H и генного сегмента J_H, и константные домены тяжелой цепи, полученные из генного сегмента C_H.

[0296] В типовом варианте осуществления 2 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 1, отличающийся тем, что трансмембранный домен IgG представляет собой трансмембранный домен IgG грызуна.

[0297] В типовом варианте осуществления 3 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 1, отличающийся тем, что трансмембранный домен IgG представляет собой трансмембранный домен IgG человека.

[0298] В типовом варианте осуществления 4 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-3, отличающийся тем, что цитоплазматический домен IgG представляет собой цитоплазматический домен IgG грызуна.

[0299] В типовом варианте осуществления 5 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-3, отличающийся тем, что цитоплазматический домен IgG представляет собой цитоплазматический домен IgG человека.

[0300] В типовом варианте осуществления 6 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-5, отличающийся тем, что домен C_H1 человека, шарнирная область человека, домен C_H2 человека и домен C_H3 человека представляют собой домены IgG1.

[0301] В типовом варианте осуществления 7 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 6, отличающийся тем, что домен IgG1 кодируется аллелем, выбранным из IGHG1*01, IGHG1*02, IGHG1*03, IGHG1*04 и IGHG1*05.

[0302] В типовом варианте осуществления 8 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-5, отличающийся тем, что домен C_H1 человека, шарнирная область человека, домен C_H2 человека и домен C_H3 человека представляют собой домены IgG2.

[0303] В типовом варианте осуществления 9 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 8, отличающийся тем, что домен IgG2 кодируется аллелем, выбранным из IGHG2*01, IGHG2*02, IGHG2*03, IGHG2*04, IGHG2*05 и IGHG2*06.

[0304] В типовом варианте осуществления 10 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-5, отличающийся тем, что домен C_H1 человека, шарнирная область человека, домен C_H2 человека и домен C_H3 человека представляют собой домены IgG3.

[0305] В типовом варианте осуществления 11 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 10, отличающийся тем, что домен IgG3 кодируется аллелем, выбранным из IGHG3*01, IGHG3*02, IGHG3*03, IGHG3*04, IGHG3*05, IGHG3*06, IGHG3*07, IGHG3*08, IGHG3*09, IGHG3*10, IGHG3*11, IGHG3*12, IGHG3*13, IGHG3*14, IGHG3*15, IGHG3*16, IGHG3*17, IGHG3*18 и IGHG3*19.

[0306] В типовом варианте осуществления 12 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-5, отличающийся тем, что домен C_H1 человека, шарнирная область человека, домен C_H2 человека и домен C_H3 человека представляют собой домены IgG4.

[0307] В типовом варианте осуществления 13 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 12, отличающийся тем, что домен IgG4 кодируется аллелем, выбранным из IGHG4*01, IGHG4*02, IGHG4*03 и IGHG4*04.

[0308] В типовом варианте осуществления 14 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 6-13, отличающийся тем, что генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 человека, шарнирную область человека, домен C_H2 человека и домен C_H3 человека, расположен в локусе эндогенного генного сегмента C_γ2a или C_γ2c.

[0309] В типовом варианте осуществления 15 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 14, отличающийся тем, что генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 человека, шарнирную область человека, домен C_H2 человека и домен C_H3 человека, замещает эндогенный генный сегмент C_γ2a или C_γ2c.

[0310] В типовом варианте осуществления 16 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 6-13, отличающийся тем, что генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 человека, шарнирную область человека, домен C_H2 человека и домен C_H3 человека, расположен в локусе эндогенного генного сегмента C_γ1.

[0311] В типовом варианте осуществления 17 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 16, отличающийся тем, что генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 человека, шарнирную область человека, домен C_H2 человека и домен C_H3 человека, замещает эндогенный генный сегмент C_γ1.

[0312] В типовом варианте осуществления 18 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 6-13, отличающийся тем, что генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 человека, шарнирную область человека, домен C_H2 человека и домен C_H3 человека, расположен в локусе эндогенного генного сегмента C_γ2b.

[0313] В типовом варианте осуществления 19 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 18, отличающийся тем, что генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 человека, шарнирную область человека, домен C_H2 человека и домен C_H3 человека, замещает эндогенный генный сегмент C_γ2b.

[0314] В типовом варианте осуществления 20 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 6-13, отличающийся тем, что генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 человека, шарнирную область человека, домен C_H2 человека и домен C_H3 человека, расположен в локусе эндогенного генного сегмента C_γ3.

[0315] В типовом варианте осуществления 21 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 20, отличающийся тем, что генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 человека, шарнирную область человека, домен C_H2 человека и домен C_H3 человека, замещает эндогенный генный сегмент C_γ3.

[0316] В типовом варианте осуществления 22 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-21, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_μ грызуна.

[0317] В типовом варианте осуществления 23 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-21, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_μ человека.

[0318] В типовом варианте осуществления 24 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-23, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_δ грызуна.

[0319] В типовом варианте осуществления 25 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-23, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_δ человека.

[0320] В типовом варианте осуществления 26 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-25, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_γ1 грызуна.

[0321] В типовом варианте осуществления 27 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-26, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_γ2a и/или C_γ2c грызуна.

[0322] В типовом варианте осуществления 28 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-27, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_γ2b грызуна.

[0323] В типовом варианте осуществления 29 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-28, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_γ3 грызуна.

[0324] В типовом варианте осуществления 30 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-29, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_ε грызуна.

[0325] В типовом варианте осуществления 31 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-29, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_ε человека.

[0326] В типовом варианте осуществления 32 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-31, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_α грызуна.

[0327] В типовом варианте осуществления 33 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-31, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_α человека.

[0328] В типовом варианте осуществления 34 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-21, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина содержит генный сегмент C_μ человека, генный сегмент C_δ человека, генный сегмент C_γ3 человека и генный сегмент C_γ1 человека.

[0329] В типовом варианте осуществления 35 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 34, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_γ2 человека и генный сегмент C_γ4 человека.

[0330] В типовом варианте осуществления 36 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 34, или осуществления 35, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_α человека.

[0331] В типовом варианте осуществления 37 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 34-36, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_ε человека.

[0332] В типовом варианте осуществления 38 в данном документе предложен грызун, содержащий в геноме: сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H, генный сегмент D_H и генный сегмент J_H; и (ii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент C_H, кодирующий константный домен IgM, содержащий домен C_H1 человека, домен C_H2 человека, домен C_H3 человека, домен C_H4 человека, трансмембранный домен IgM человека и цитоплазматический домен IgM человека, причем вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина так, чтобы грызун вырабатывал антитела IgM, содержащие вариабельные домены, полученные из генного сегмента V_H, генного сегмента D_H и генного сегмента J_H, и константные домены тяжелой цепи, полученные из генного сегмента C_H.

[0333] В типовом варианте осуществления 39 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 38, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_δ человека.

[0334] В типовом варианте осуществления 40 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 38 или 39, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_γ3 человека.

[0335] В типовом варианте осуществления 41 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 38-40, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_γ1 человека.

[0336] В типовом варианте осуществления 42 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 38-41, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_γ2 человека.

[0337] В типовом варианте осуществления 43 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 38-42, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_γ4 человека.

[0338] В типовом варианте осуществления 44 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 38-43, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина содержит генный сегмент C_μ человека, генный сегмент C_δ человека, генный сегмент C_γ3 человека и генный сегмент C_γ1 человека.

[0339] В типовом варианте осуществления 45 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 44, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_γ2 человека и генный сегмент C_γ4 человека.

[0340] В типовом варианте осуществления 46 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 44 или варианту осуществления 45, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_α человека.

[0341] В типовом варианте осуществления 47 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 44-46, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_ε человека.

[0342] В типовом варианте осуществления 48 в данном документе предложен грызун, содержащий в геноме: сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H, генный сегмент D_H и генный сегмент J_H; и (ii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент C_H, кодирующий константный домен IgD, содержащий домен C_H1 человека, шарнирный домен H1 человека, шарнирный домен H2 человека, домен C_H2 человека, домен C_H3 человека, трансмембранный домен IgD человека и цитоплазматический домен IgD человека, причем вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина так, чтобы грызун вырабатывал антитела IgD, содержащие вариабельные домены, полученные из генного сегмента V_H, генного сегмента D_H и генного сегмента J_H, и константные домены тяжелой цепи, полученные из генного сегмента C_H.

[0343] В типовом варианте осуществления 49 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 48, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_μ человека.

[0344] В типовом варианте осуществления 50 в данном документе предложен грызун по вариантам осуществления 48 или 49, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_γ3 человека.

[0345] В типовом варианте осуществления 51 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 48-50, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_γ1 человека.

[0346] В типовом варианте осуществления 52 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 48-51, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_γ2 человека.

[0347] В типовом варианте осуществления 53 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 48-52, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_γ4 человека.

[0348] В типовом варианте осуществления 54 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 48-53, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина содержит генный сегмент C_μ человека, генный сегмент C_δ человека, генный сегмент C_γ3 человека и генный сегмент C_γ1 человека.

[0349] В типовом варианте осуществления 55 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 54, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_γ2 человека и генный сегмент C_γ4 человека.

[0350] В типовом варианте осуществления 56 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 54 или варианту осуществления 55, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_α человека.

[0351] В типовом варианте осуществления 57 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 54-56, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_ε человека.

[0352] В типовом варианте осуществления 58 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-57, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит интронный энхансер (E_i) грызуна.

[0353] В типовом варианте осуществления 59 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-57, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит интронный энхансер (E_i) человека.

[0354] В типовом варианте осуществления 60 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-59, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит 3’ регуляторную область (3’ РО) грызуна.

[0355] В типовом варианте осуществления 61 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-5, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит 3’ регуляторную область (3’ РО) человека.

[0356] В типовом варианте осуществления 62 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-61, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит сайт переключения S_μ грызуна.

[0357] В типовом варианте осуществления 63 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-62, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит сайт переключения S_γ3 грызуна.

[0358] В типовом варианте осуществления 64 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-63, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит сайт переключения S_γ1 грызуна.

[0359] В типовом варианте осуществления 65 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-64, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит сайт переключения S_γ2b грызуна.

[0360] В типовом варианте осуществления 66 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-65, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит сайт переключения S_γ2a и/или S_γ2c грызуна.

[0361] В типовом варианте осуществления 67 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-66, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит сайт переключения S_ε грызуна.

[0362] В типовом варианте осуществления 68 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-67, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит сайт переключения S_α грызуна.

[0363] В типовом варианте осуществления 69 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-61, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит сайт переключения S_μ человека.

[0364] В типовом варианте осуществления 70 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-61 и 69, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит сайт переключения S_γ3 человека.

[0365] В типовом варианте осуществления 71 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-61 и 69-70, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит сайт переключения S_γ1 человека.

[0366] В типовом варианте осуществления 72 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-61 и 69-71, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит сайт переключения S_γ2 человека.

[0367] В типовом варианте осуществления 73 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-61 и 69-72, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит сайт переключения S_γ4 человека.

[0368] В типовом варианте осуществления 74 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-61 и 69-73, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит сайт переключения S_ε человека.

[0369] В типовом варианте осуществления 75 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-61 и 69-74, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит сайт переключения S_α человека.

[0370] В типовом варианте осуществления 76 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-75, отличающийся тем, что генный сегмент V_H представляет собой генный сегмент V_H грызуна, генный сегмент D_H представляет собой генный сегмент D_H грызуна, а генный сегмент J_H представляет собой генный сегмент J_H грызуна.

[0371] В типовом варианте осуществления 77 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 76, отличающийся тем, что генный сегмент V_H грызуна, генный сегмент D_H грызуна и генный сегмент J_H грызуна представляют собой эндогенные генные сегменты грызуна.

[0372] В типовом варианте осуществления 78 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-75, отличающийся тем, что генный сегмент V_H представляет собой генный сегмент V_H человека, генный сегмент D_H представляет собой генный сегмент D_H человека, а генный сегмент J_H представляет собой генный сегмент J_H человека.

[0373] В типовом варианте осуществления 79 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 78, отличающийся тем, что вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина содержит по меньшей мере 3 генных сегмента V_H человека.

[0374] В типовом варианте осуществления 80 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 78 или варианту осуществления 79, отличающийся тем, что вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина содержит все генные сегменты D_H человека.

[0375] В типовом варианте осуществления 81 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 78-80, отличающийся тем, что вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина содержит все генные сегменты J_H человека.

[0376] В типовом варианте осуществления 82 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 78-81, отличающийся тем, что в вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина отсутствует функциональный эндогенный ген Adam6 грызуна.

[0377] В типовом варианте осуществления 83 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 78-82, отличающийся тем, что геном зародышевой линии дополнительно содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую функциональный полипептид Adam6 грызуна, его функциональный ортолог, функциональный гомолог или функциональный фрагмент.

[0378] В типовом варианте осуществления 84 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 83, отличающийся тем, что происходит экспрессия функционального полипептида Adam6 грызуна, его функционального ортолога, функционального гомолога или функционального фрагмента.

[0379] В типовом варианте осуществления 85 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 83 или варианту осуществления 84, отличающийся тем, что нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид ADAM6 грызуна, его функциональный ортолог, функциональный гомолог или функциональный фрагмент, находится в той же хромосоме, что и вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина.

[0380] В типовом варианте осуществления 86 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 83-85, отличающийся тем, что нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид ADAM6 грызуна, его функциональный ортолог, функциональный гомолог или функциональный фрагмент, находится в сконструированном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина.

[0381] В типовом варианте осуществления 87 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 83-86, отличающийся тем, что нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид ADAM6 грызуна, его функциональный ортолог, функциональный гомолог или функциональный фрагмент, находится на месте псевдогена Adam6 человека.

[0382] В типовом варианте осуществления 88 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 83-87, отличающийся тем, что нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид ADAM6 грызуна, его функциональный ортолог, функциональный гомолог или функциональный фрагмент, замещает псевдоген Adam6 человека.

[0383] В типовом варианте осуществления 89 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 83-88, отличающийся тем, что нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид ADAM6 грызуна, его функциональный ортолог, функциональный гомолог или функциональный фрагмент, находится между первым генным сегментом V_H человека и вторым генным сегментом V_H человека.

[0384] В типовом варианте осуществления 90 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 89, отличающийся тем, что первый генный сегмент V_H человека представляет собой V_H1-2, а второй генный сегмент V_H человека представляет собой V_H6-1.

[0385] В типовом варианте осуществления 91 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 83-86, отличающийся тем, что нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид ADAM6 грызуна, его функциональный ортолог, функциональный гомолог или функциональный фрагмент, находится между генным сегментом V_H человека и генным сегментом D_H человека.

[0386] В типовом варианте осуществления 92 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-91, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина расположен в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина.

[0387] В типовом варианте осуществления 93 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 92, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина замещает весь или часть эндогенного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина.

[0388] В типовом варианте осуществления 94 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-93, отличающийся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина.

[0389] В типовом варианте осуществления 95 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-93, отличающийся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина.

[0390] В типовом варианте осуществления 96 в данном документе предложен грызун, содержащий в геноме: сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H человека, генный сегмент D_H человека и генный сегмент J_H человека; (ii) интронный энхансер (E_i) грызуна; (iii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую: (a) генный сегмент C_μ грызуна; (b) генный сегмент C_δ грызуна; (c) генный сегмент C_γ3 грызуна; (d) генный сегмент C_γ1 грызуна; (e) генный сегмент C_γ2b грызуна; (f) модифицированный генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 IgG1 человека, шарнирную область IgG1 человека, домен C_H2 IgG1 человека, домен C_H3 IgG1 человека, трансмембранный домен IgG2a грызуна и цитоплазматический домен IgG2a грызуна; (g) генный сегмент C_ε грызуна; и (h) генный сегмент C_α грызуна; и (iv) 3’ регуляторную область (3’ РО) грызуна, причем вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина так, чтобы грызун вырабатывал антитела IgG, содержащие вариабельные домены, полученные из генного сегмента V_H человека, генного сегмента D_H человека и генного сегмента J_H человека, и константные домены тяжелой цепи, полученные из модифицированного генного сегмента C_H.

[0391] В типовом варианте осуществления 97 в данном документе предложен грызун, содержащий в геноме: сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H человека, генный сегмент D_H человека и генный сегмент J_H человека; (ii) интронный энхансер (E_i) грызуна; (iii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую: (a) генный сегмент C_μ грызуна; (b) генный сегмент C_δ грызуна; (c) генный сегмент C_γ3 грызуна; (d) генный сегмент C_γ1 грызуна; (e) генный сегмент C_γ2b грызуна; (f) модифицированный генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 IgG1 человека, шарнирную область IgG1 человека, домен C_H2 IgG1 человека, домен C_H3 IgG1 человека, трансмембранный домен IgG1 человека и цитоплазматический домен IgG1 человека; (g) генный сегмент C_ε грызуна; и (h) генный сегмент C_α грызуна; и (iv) 3’ регуляторную область (3’ РО) грызуна, причем вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина так, чтобы грызун вырабатывал антитела IgG, содержащие вариабельные домены, полученные из генного сегмента V_H человека, генного сегмента D_H человека и генного сегмента J_H человека, и константные домены тяжелой цепи, полученные из модифицированного генного сегмента C_H.

[0392] В типовом варианте осуществления 98 в данном документе предложен грызун, содержащий в геноме: сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H человека, генный сегмент D_H человека и генный сегмент J_H человека; (ii) интронный энхансер (E_i) грызуна; (iii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую: (a) генный сегмент C_μ грызуна; (b) генный сегмент C_δ грызуна; (c) генный сегмент C_γ3 грызуна; (d) модифицированный генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 IgG4 человека, шарнирную область IgG4 человека, домен C_H2 IgG4 человека, домен C_H3 IgG4 человека, трансмембранный домен IgG1 грызуна и цитоплазматический домен IgG1 грызуна; (e) генный сегмент C_γ2b грызуна; (f) генный сегмент C_γ2a и/или C_γ2c грызуна; (g) генный сегмент C_ε грызуна; и (h) генный сегмент C_α грызуна; и (iv) 3’ регуляторную область (3’ РО) грызуна, причем вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина так, чтобы грызун вырабатывал антитела IgG, содержащие вариабельные домены, полученные из генного сегмента V_H человека, генного сегмента D_H человека и генного сегмента J_H человека, и константные домены тяжелой цепи, полученные из модифицированного генного сегмента C_H.

[0393] В типовом варианте осуществления 99 в данном документе предложен грызун, содержащий в геноме: сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H человека, генный сегмент D_H человека и генный сегмент J_H человека; (ii) интронный энхансер (E_i) грызуна; (iii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую: (a) генный сегмент C_μ грызуна; (b) генный сегмент C_δ грызуна; (c) генный сегмент C_γ3 грызуна; (d) модифицированный генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 IgG4 человека, шарнирную область IgG4 человека, домен C_H2 IgG4 человека, домен C_H3 IgG4 человека, трансмембранный домен IgG4 человека и цитоплазматический домен IgG4 человека; (e) генный сегмент C_γ2b грызуна; (f) генный сегмент C_γ2a и/или C_γ2c грызуна; (g) генный сегмент C_ε грызуна; и (h) генный сегмент C_α грызуна; и (iv) 3’ регуляторную область (3’ РО) грызуна, причем вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина так, чтобы грызун вырабатывал антитела IgG, содержащие вариабельные домены, полученные из генного сегмента V_H человека, генного сегмента D_H человека и генного сегмента J_H человека, и константные домены тяжелой цепи, полученные из модифицированного генного сегмента C_H.

[0394] В типовом варианте осуществления 100 в данном документе предложен грызун, содержащий в геноме: сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H человека, генный сегмент D_H человека и генный сегмент J_H человека; (ii) интронный энхансер (E_i) человека; (iii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую: (a) генный сегмент C_μ человека; (b) генный сегмент C_δ человека; (c) генный сегмент C_γ3 человека; (d) генный сегмент C_γ1 человека; и (iv) 3’ регуляторную область (3’ РО) грызуна, причем вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина так, чтобы грызун вырабатывал антитела IgG, содержащие полностью человеческую тяжелую цепь.

[0395] В типовом варианте осуществления 101 в данном документе предложен грызун, содержащий в геноме: сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H человека, генный сегмент D_H человека и генный сегмент J_H человека; (ii) интронный энхансер (E_i) человека; (iii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую: (a) генный сегмент C_μ человека; (b) генный сегмент C_δ человека; (c) генный сегмент C_γ3 человека; (d) генный сегмент C_γ1 человека; (c) генный сегмент C_γ2 человека; (d) генный сегмент C_γ4 человека; и (iv) 3’ регуляторную область (3’ РО) грызуна, причем вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина так, чтобы грызун вырабатывал антитела IgG, содержащие полностью человеческую тяжелую цепь.

[0396] В типовом варианте осуществления 102 в данном документе предложен грызун, содержащий в геноме: сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H грызуна, генный сегмент D_H грызуна и генный сегмент _H грызуна; (ii) интронный энхансер (E_i) грызуна; (iii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую: (a) генный сегмент C_μ человека; (b) генный сегмент C_δ человека; (c) генный сегмент C_γ3 человека; (d) генный сегмент C_γ1 человека; и (iv) 3’ регуляторную область (3’ РО) грызуна, причем вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина так, чтобы грызун вырабатывал антитела IgG, содержащие тяжелую цепь, содержащую вариабельный домен грызуна и константный домен человека.

[0397] В типовом варианте осуществления 103 в данном документе предложен грызун, содержащий в геноме: сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H грызуна, генный сегмент D_H грызуна и генный сегмент J_H грызуна; (ii) интронный энхансер (E_i) грызуна; (iii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую: (a) генный сегмент C_μ человека; (b) генный сегмент C_δ человека; (c) генный сегмент C_γ3 человека; (d) генный сегмент C_γ1 человека; (c) генный сегмент C_γ2 человека; (d) генный сегмент C_γ4 человека; и (iv) 3’ регуляторную область (3’ РО) грызуна, причем вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина так, чтобы грызун вырабатывал антитела IgG, содержащие тяжелую цепь, содержащую вариабельный домен грызуна и константный домен человека.

[0398] В типовом варианте осуществления 104 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 96-103, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина расположен в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина.

[0399] В типовом варианте осуществления 105 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 104, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина замещает весь или часть эндогенного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина.

[0400] В типовом варианте осуществления 106 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 96-105, отличающийся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина.

[0401] В типовом варианте осуществления 107 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 96-105, отличающийся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина.

[0402] В типовом варианте осуществления 108 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-107, дополнительно содержащий в геноме: сконструированный локус цепи каппа (κ) иммуноглобулина, который содержит: (1) вариабельную область цепи κ иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_κ человека и генный сегмент J_κ человека; и (2) константную область цепи κ иммуноглобулина, содержащую генный сегмент C_κ человека, причем вариабельная область цепи κ иммуноглобулина функционально связана с константной областью цепи κ иммуноглобулина так, чтобы грызун вырабатывал антитела, содержащие вариабельные домены легкой цепи, полученные из генного сегмента V_κ человека и генного сегмента J_κ человека, и константные домены легкой цепи, полученные из генного сегмента C_κ человека.

[0403] В типовом варианте осуществления 109 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 108, отличающийся тем, что сконструированный локус цепи κ иммуноглобулина дополнительно содержит интронный энхансер κ (E_κi) грызуна.

[0404] В типовом варианте осуществления 110 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 108, отличающийся тем, что сконструированный локус цепи κ иммуноглобулина дополнительно содержит интронный энхансер κ (E_κi) человека.

[0405] В типовом варианте осуществления 111 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 108-110, отличающийся тем, что сконструированный локус цепи κ иммуноглобулина дополнительно содержит 3’ энхансер κ (E_κ3’) грызуна.

[0406] В типовом варианте осуществления 112 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 108-110, отличающийся тем, что сконструированный локус цепи κ иммуноглобулина дополнительно содержит 3’ энхансер κ (E_κ3’) человека.

[0407] В типовом варианте осуществления 113 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 108-112, отличающийся тем, что вариабельная область цепи κ иммуноглобулина содержит по меньшей мере 6 генных сегментов V_κ человека.

[0408] В типовом варианте осуществления 114 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 108-113, отличающийся тем, что вариабельная область цепи κ иммуноглобулина содержит все генные сегменты J_κ человека.

[0409] В типовом варианте осуществления 115 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 108-114, отличающийся тем, что сконструированный локус цепи κ иммуноглобулина расположен в эндогенном локусе цепи κ иммуноглобулина.

[0410] В типовом варианте осуществления 116 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 115, отличающийся тем, что сконструированный локус цепи κ иммуноглобулина замещает весь или часть эндогенного локуса цепи κ иммуноглобулина.

[0411] В типовом варианте осуществления 117 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 108-116, отличающийся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса цепи κ иммуноглобулина.

[0412] В типовом варианте осуществления 118 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 108-116, отличающийся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса цепи κ иммуноглобулина.

[0413] В типовом варианте осуществления 119 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-118, дополнительно содержащий в геноме: сконструированный локус цепи лямбда (λ) иммуноглобулина, который содержит: генный сегмент V_λ человека, генный сегмент J_λ человека и генный сегмент C_λ человека, причем генный сегмент V_λ человека и генный сегмент J_λ человека функционально связаны с генным сегментом C_λ человека так, чтобы грызун вырабатывал антитела, содержащие вариабельные домены легкой цепи, полученные из генного сегмента V_λ человека и генного сегмента J_λ человека, и константные домены легкой цепи, полученные из генного сегмента C_λ человека.

[0414] В типовом варианте осуществления 120 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 119, отличающийся тем, что генный сегмент C_λ человека представляет собой генный сегмент C_λ1 человека.

[0415] В типовом варианте осуществления 121 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 120, отличающийся тем, что генный сегмент J_λ человека представляет собой генный сегмент J_λ1 человека.

[0416] В типовом варианте осуществления 122 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 119, отличающийся тем, что генный сегмент C_λ человека представляет собой генный сегмент C_λ2 человека.

[0417] В типовом варианте осуществления 123 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 122, отличающийся тем, что генный сегмент J_λ человека представляет собой генный сегмент J_λ2 человека.

[0418] В типовом варианте осуществления 124 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 119, отличающийся тем, что генный сегмент C_λ человека представляет собой генный сегмент C_λ3 человека.

[0419] В типовом варианте осуществления 125 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 124, отличающийся тем, что генный сегмент J_λ человека представляет собой генный сегмент J_λ3 человека.

[0420] В типовом варианте осуществления 126 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 119, отличающийся тем, что генный сегмент C_λ человека представляет собой генный сегмент C_λ6 человека.

[0421] В типовом варианте осуществления 127 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 126, отличающийся тем, что генный сегмент J_λ человека представляет собой генный сегмент J_λ6 человека.

[0422] В типовом варианте осуществления 128 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 119, отличающийся тем, что генный сегмент J_λ человека представляет собой генный сегмент J_λ7 человека.

[0423] В типовом варианте осуществления 129 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 119-128, отличающийся тем, что сконструированный локус цепи λ иммуноглобулина содержит генный сегмент C_λ1 человека, генный сегмент C_λ2 человека, генный сегмент C_λ3 человека, генный сегмент C_λ6 человека и генный сегмент C_λ1 грызуна.

[0424] В типовом варианте осуществления 130 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 129, отличающийся тем, что сконструированный локус цепи λ иммуноглобулина содержит генный сегмент J_λ1 человека, генный сегмент J_λ2 человека, генный сегмент J_λ3 человека, генный сегмент J_λ6 человека и генный сегмент J_λ7 человека.

[0425] В типовом варианте осуществления 131 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 130, отличающаяся тем, что сконструированный локус цепи λ иммуноглобулина содержит кластер генных сегментов J_λ1 - C_λ1 человека, кластер генных сегментов J_λ2 - C_λ2 человека, кластер генных сегментов J_λ3 - C_λ3 человека, кластер генных сегментов J_λ6 - C_λ6 человека и кластер генных сегментов J_λ7 человека - C_λ1 грызуна.

[0426] В типовом варианте осуществления 132 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 119-131, отличающийся тем, что сконструированный локус цепи λ иммуноглобулина содержит по меньшей мере 7 генных сегментов V_λ человека.

[0427] В типовом варианте осуществления 133 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 119-132, отличающийся тем, что сконструированный локус цепи λ иммуноглобулина дополнительно содержит энхансер 2.4 λ грызуна.

[0428] В типовом варианте осуществления 134 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 119-133, отличающийся тем, что сконструированный локус цепи λ иммуноглобулина дополнительно содержит 3’ энхансер λ грызуна.

[0429] В типовом варианте осуществления 135 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 119-134, отличающийся тем, что сконструированный локус цепи λ иммуноглобулина дополнительно содержит энхансер 3.1 λ грызуна.

[0430] В типовом варианте осуществления 136 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 119-135, отличающийся тем, что сконструированный локус цепи λ иммуноглобулина дополнительно содержит 3’ энхансер λ человека.

[0431] В типовом варианте осуществления 137 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 119-136, отличающийся тем, что сконструированный локус цепи λ иммуноглобулина расположен в эндогенном локусе цепи λ иммуноглобулина.

[0432] В типовом варианте осуществления 138 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 137, отличающийся тем, что сконструированный локус цепи λ иммуноглобулина замещает весь или часть эндогенного локуса цепи λ иммуноглобулина.

[0433] В типовом варианте осуществления 139 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 119-138, отличающийся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса цепи λ иммуноглобулина.

[0434] В типовом варианте осуществления 140 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 119-138, отличающийся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса цепи λ иммуноглобулина.

[0435] В типовом варианте осуществления 141 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-140, дополнительно содержащий в геноме сконструированный локус неонатального Fc-рецептора (FcRn), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcRn, содержащий внеклеточный домен человека.

[0436] В типовом варианте осуществления 142 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 141, отличающийся тем, что полипептид FcRn дополнительно содержит трансмембранный домен грызуна.

[0437] В типовом варианте осуществления 143 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 141, отличающийся тем, что полипептид FcRn дополнительно содержит трансмембранный домен человека.

[0438] В типовом варианте осуществления 144 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 141-143, отличающийся тем, что полипептид FcRn дополнительно содержит цитоплазматический домен грызуна.

[0439] В типовом варианте осуществления 145 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 141-143, отличающийся тем, что полипептид FcRn дополнительно содержит цитоплазматический домен человека.

[0440] В типовом варианте осуществления 146 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 141-145, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcRn, расположена в эндогенном локусе FcRn грызуна.

[0441] В типовом варианте осуществления 147 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 146, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcRn, замещает весь или часть эндогенного гена FcRn грызуна.

[0442] В типовом варианте осуществления 148 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 141, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая внеклеточный домен FcRn, замещает эндогенную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую внеклеточный домен FcRn грызуна.

[0443] В типовом варианте осуществления 149 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 141-148, отличающийся тем, что грызун не экспрессирует FcRn грызуна.

[0444] В типовом варианте осуществления 150 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 141-149, отличающийся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса FcRn.

[0445] В типовом варианте осуществления 151 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 141-149, отличающийся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса FcRn.

[0446] В типовом варианте осуществления 152 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 141-151, дополнительно содержащий в геноме сконструированный локус β-2-микроглобулина (β2M), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую человеческий или гуманизированный полипептид β-2-микроглобулина (β2M).

[0447] В типовом варианте осуществления 153 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 152, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая человеческий или гуманизированный полипептид β2M, расположена в эндогенном локусе β2M грызуна.

[0448] В типовом варианте осуществления 154 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 153, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая человеческий или гуманизированный полипептид β2M, замещает весь или часть эндогенного гена β2M грызуна.

[0449] В типовом варианте осуществления 155 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 152-154, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты содержит экзоны 2-4 гена β2M человека.

[0450] В типовом варианте осуществления 156 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 152-155, отличающийся тем, что грызун не экспрессирует полипептид β2M грызуна.

[0451] В типовом варианте осуществления 157 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 152-156, отличающийся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса β2M.

[0452] В типовом варианте осуществления 158 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 152-156, отличающийся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса β2M.

[0453] В типовом варианте осуществления 159 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-158, дополнительно содержащий в геноме сконструированный локус Fc-эпсилон-рецептора 1 альфа (FcεR1α), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcεR1α, содержащий внеклеточный домен человека.

[0454] В типовом варианте осуществления 160 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 159, отличающийся тем, что полипептид FcεR1α дополнительно содержит трансмембранный домен грызуна.

[0455] В типовом варианте осуществления 161 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 159, отличающийся тем, что полипептид FcεR1α дополнительно содержит трансмембранный домен человека.

[0456] В типовом варианте осуществления 162 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 159-161, отличающийся тем, что полипептид FcεR1α дополнительно содержит цитоплазматический домен грызуна.

[0457] В типовом варианте осуществления 163 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 159-161, отличающийся тем, что полипептид FcεR1α дополнительно содержит цитоплазматический домен человека.

[0458] В типовом варианте осуществления 164 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 159-163, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcεR1α, расположена в эндогенном локусе FcεR1α грызуна.

[0459] В типовом варианте осуществления 165 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 164, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcεR1α, замещает весь или часть эндогенного гена FcεR1α грызуна.

[0460] В типовом варианте осуществления 166 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 165, отличающийся тем, что полипептид FcεR1α содержит внеклеточный домен человека, трансмембранный домен человека и цитоплазматический домен человека.

[0461] В типовом варианте осуществления 167 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 159, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая внеклеточный домен FcεR1α человека, замещает эндогенную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую внеклеточный домен FcεR1α грызуна.

[0462] В типовом варианте осуществления 168 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 159-167, отличающийся тем, что грызун не экспрессирует FcεR1α грызуна.

[0463] В типовом варианте осуществления 169 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 159-168, отличающийся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса FcεR1α.

[0464] В типовом варианте осуществления 170 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 159-168, отличающийся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса FcεR1α.

[0465] В типовом варианте осуществления 171 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-170, дополнительно содержащий в геноме сконструированный локус Fc-гамма-рецептора 1a (FcγR1a), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcγR1a, содержащий внеклеточный домен человека.

[0466] В типовом варианте осуществления 172 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 171, отличающийся тем, что полипептид FcγR1a дополнительно содержит трансмембранный домен грызуна.

[0467] В типовом варианте осуществления 173 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 171, отличающийся тем, что полипептид FcγR1a дополнительно содержит трансмембранный домен человека.

[0468] В типовом варианте осуществления 174 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 171-173, отличающийся тем, что полипептид FcγR1a дополнительно содержит цитоплазматический домен грызуна.

[0469] В типовом варианте осуществления 175 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 171-173, отличающийся тем, что полипептид FcγR1a дополнительно содержит цитоплазматический домен человека.

[0470] В типовом варианте осуществления 176 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 171-175, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγR1a, расположена в эндогенном локусе FcγR1a грызуна.

[0471] В типовом варианте осуществления 177 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 176, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγR1a, замещает весь или часть эндогенного гена FcγR1a грызуна.

[0472] В типовом варианте осуществления 178 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 171, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая внеклеточный домен FcγR1a человека, замещает эндогенную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую внеклеточный домен FcγR1a грызуна.

[0473] В типовом варианте осуществления 179 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 171-178, отличающийся тем, что грызун не экспрессирует FcγR1a грызуна.

[0474] В типовом варианте осуществления 180 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 171-179, отличающийся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса FcγR1a.

[0475] В типовом варианте осуществления 181 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 171-179, отличающийся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса FcγR1a.

[0476] В типовом варианте осуществления 182 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-181, дополнительно содержащий в геноме сконструированный локус Fc-гамма-рецептора 2a (FcγR2a), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcγR2a человека.

[0477] В типовом варианте осуществления 183 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 182, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγR2a, расположена в эндогенном локусе низкоаффинного FcγR грызуна.

[0478] В типовом варианте осуществления 184 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 183, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγR2a человека, замещает весь или часть эндогенного гена низкоаффинного FcγR грызуна.

[0479] В типовом варианте осуществления 185 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 182-184, отличающийся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса FcγR2a.

[0480] В типовом варианте осуществления 186 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 182-184, отличающийся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса FcγR2a.

[0481] В типовом варианте осуществления 187 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-186, дополнительно содержащий в геноме сконструированный локус Fc-гамма-рецептора 2b (FcγR2b), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcγR2b человека.

[0482] В типовом варианте осуществления 188 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 187, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγR2b, расположена в эндогенном локусе низкоаффинного FcγR грызуна.

[0483] В типовом варианте осуществления 189 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 188, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγR2b человека, замещает весь или часть эндогенного гена низкоаффинного FcγR грызуна.

[0484] В типовом варианте осуществления 190 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 187-189, отличающийся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса FcγR2b.

[0485] В типовом варианте осуществления 191 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 187-189, отличающийся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса FcγR2b.

[0486] В типовом варианте осуществления 192 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-191, дополнительно содержащий в геноме сконструированный локус Fc-гамма-рецептора 3a (FcγR3a), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcγR3a человека.

[0487] В типовом варианте осуществления 193 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 192, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγR3a, расположена в эндогенном локусе низкоаффинного FcγR грызуна.

[0488] В типовом варианте осуществления 194 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 193, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγR3a человека, замещает весь или часть эндогенного гена низкоаффинного FcγR грызуна.

[0489] В типовом варианте осуществления 195 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 192-194, отличающийся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса FcγR3a.

[0490] В типовом варианте осуществления 196 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 192-194, отличающийся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса FcγR3a.

[0491] В типовом варианте осуществления 197 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-196, дополнительно содержащий в геноме сконструированный локус Fc-гамма-рецептора 3b (FcγR3b), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcγR3b человека.

[0492] В типовом варианте осуществления 198 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 197, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγR3b, расположена в эндогенном локусе низкоаффинного FcγR грызуна.

[0493] В типовом варианте осуществления 199 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 197, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγR3b человека, замещает весь или часть эндогенного гена низкоаффинного FcγR грызуна.

[0494] В типовом варианте осуществления 200 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 197-199, отличающийся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса FcγR3b.

[0495] В типовом варианте осуществления 201 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 197-199, отличающийся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса FcγR3b.

[0496] В типовом варианте осуществления 202 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-201, дополнительно содержащий в геноме сконструированный локус Fc-гамма-рецептора 2c (FcγR2c), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcγR2c человека.

[0497] В типовом варианте осуществления 203 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 202, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγR2c, расположена в эндогенном локусе низкоаффинного FcγR грызуна.

[0498] В типовом варианте осуществления 204 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 203, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγR2c человека, замещает весь или часть эндогенного гена низкоаффинного FcγR грызуна.

[0499] В типовом варианте осуществления 205 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 202-204, отличающийся тем, что грызун не экспрессирует FcγR2c грызуна.

[0500] В типовом варианте осуществления 206 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 202-205, отличающийся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса FcγR2c.

[0501] В типовом варианте осуществления 207 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 202-205, отличающийся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса FcγR2c.

[0502] В типовом варианте осуществления 208 в данном документе предложен грызун, содержащий в геноме сконструированный локус неонатального Fc-рецептора (FcRn), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcRn, содержащий внеклеточный домен человека.

[0503] В типовом варианте осуществления 209 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 208, отличающийся тем, что полипептид FcRn дополнительно содержит трансмембранный домен грызуна.

[0504] В типовом варианте осуществления 210 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 208, отличающийся тем, что полипептид FcRn дополнительно содержит трансмембранный домен человека.

[0505] В типовом варианте осуществления 211 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 208-210, отличающийся тем, что полипептид FcRn дополнительно содержит цитоплазматический домен грызуна.

[0506] В типовом варианте осуществления 212 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 208-210, отличающийся тем, что полипептид FcRn дополнительно содержит цитоплазматический домен человека.

[0507] В типовом варианте осуществления 213 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 208-212, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcRn, расположена в эндогенном локусе FcRn грызуна.

[0508] В типовом варианте осуществления 214 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 213, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcRn, замещает весь или часть эндогенного гена FcRn грызуна.

[0509] В типовом варианте осуществления 215 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 208, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая внеклеточный домен FcRn человека, замещает эндогенную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую внеклеточный домен FcRn грызуна.

[0510] В типовом варианте осуществления 216 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 208-215, отличающийся тем, что грызун не экспрессирует FcRn грызуна.

[0511] В типовом варианте осуществления 217 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 208-216, отличающийся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса FcRn.

[0512] В типовом варианте осуществления 218 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 208-216, отличающийся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса FcRn.

[0513] В типовом варианте осуществления 219 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 208-218, дополнительно содержащий в геноме локус β-2-микроглобулина (β2M), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую человеческий или гуманизированный полипептид β-2-микроглобулина (β2M).

[0514] В типовом варианте осуществления 220 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 219, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая человеческий или гуманизированный полипептид β2M, расположена в эндогенном локусе β2M грызуна.

[0515] В типовом варианте осуществления 221 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 220, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая человеческий или гуманизированный полипептид β2M, замещает весь или часть эндогенного гена β2M грызуна.

[0516] В типовом варианте осуществления 222 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 219-221, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты содержит экзоны 2-4 гена β2M человека.

[0517] В типовом варианте осуществления 223 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 219-222, отличающийся тем, что грызун не экспрессирует полипептид β2M грызуна.

[0518] В типовом варианте осуществления 224 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 219-223, отличающийся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса β2M.

[0519] В типовом варианте осуществления 225 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 219-223, отличающийся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса β2M.

[0520] В типовом варианте осуществления 226 в данном документе предложен грызун, содержащий в геноме сконструированный локус Fc-эпсилон-рецептора 1 альфа (FcεR1α), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcεR1α, содержащий внеклеточный домен человека.

[0521] В типовом варианте осуществления 227 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 226, отличающийся тем, что полипептид FcεR1α дополнительно содержит трансмембранный домен грызуна.

[0522] В типовом варианте осуществления 228 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 226, отличающийся тем, что полипептид FcεR1α дополнительно содержит трансмембранный домен человека.

[0523] В типовом варианте осуществления 229 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 226-228, отличающийся тем, что полипептид FcεR1α дополнительно содержит цитоплазматический домен грызуна.

[0524] В типовом варианте осуществления 230 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 226-228, отличающийся тем, что полипептид FcεR1α дополнительно содержит цитоплазматический домен человека.

[0525] В типовом варианте осуществления 231 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 226-230, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcεR1α, расположена в эндогенном локусе FcεR1α грызуна.

[0526] В типовом варианте осуществления 232 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 231, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcεR1α, замещает весь или часть эндогенного гена FcεR1α грызуна.

[0527] В типовом варианте осуществления 233 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 232, отличающийся тем, что полипептид FcεR1α содержит внеклеточный домен человека, трансмембранный домен человека и цитоплазматический домен человека.

[0528] В типовом варианте осуществления 234 в данном документе предложен грызун по варианту осуществления 226, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая внеклеточный домен FcεR1α человека, замещает эндогенную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую внеклеточный домен FcεR1α грызуна.

[0529] В типовом варианте осуществления 235 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 226-234, отличающийся тем, что грызун не экспрессирует FcεR1α грызуна.

[0530] В типовом варианте осуществления 236 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 226-235, отличающийся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса FcεR1α.

[0531] В типовом варианте осуществления 237 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 226-235, отличающийся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса FcεR1α.

[0532] В типовом варианте осуществления 238 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-237, отличающийся тем, что грызун представляет собой мышь.

[0533] В типовом варианте осуществления 239 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 1-237, отличающийся тем, что грызун представляет собой крысу.

[0534] В типовом варианте осуществления 240 в данном документе предложен способ тестирования терапевтического белка, содержащего Fc-домен человека, включающий введение терапевтического белка грызуну по любому из вариантов осуществления 1-207 и измерение одного или более фармакокинетических свойств вводимого терапевтического белка.

[0535] В типовом варианте осуществления 241 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 240, отличающийся тем, что одно или более фармакокинетических свойств выбраны из одного или более из площади под кривой плазменная концентрация - время (ППК), in vivo восстановления (IVR), скорости выведения (CL), среднего времени удержания (СВУ), времени полужизни агента и объема распределения в равновесном состоянии (Vss).

[0536] В типовом варианте осуществления 242 в данном документе предложен способ тестирования эффективности терапевтического белка, содержащего Fc-домен человека, включающий введение терапевтического белка грызуну по любому из вариантов осуществления 1-207 и измерение терапевтической эффективности вводимого терапевтического белка.

[0537] В типовом варианте осуществления 243 в данном документе предложен способ определения терапевтически эффективной дозы терапевтического белка, содержащего Fc-домен человека, включающий введение некоторого количества доз терапевтического белка грызуну по любому из вариантов осуществления 1-207 и определение терапевтической эффективности каждой дозы терапевтического белка.

[0538] В типовом варианте осуществления 244 в данном документе предложен способ определения безопасной дозы терапевтического белка, содержащего Fc-домен человека, включающий введение некоторого количества доз терапевтического белка грызуну по любому из вариантов осуществления 1-207 и определение безопасности каждой дозы терапевтического белка.

[0539] В типовом варианте осуществления 245 в данном документе предложен способ определения переносимой дозы терапевтического белка, содержащего Fc-домен человека, включающий введение некоторого количества доз терапевтического белка грызуну по любому из вариантов осуществления 1-207 и определение переносимости каждой дозы терапевтического белка.

[0540] В типовом варианте осуществления 246 в данном документе предложен способ тестирования терапевтического белка, содержащего Fc-домен человека, включающий введение терапевтического белка грызуну по любому из вариантов осуществления 148-239 и измерение одного или более опосредованных Fc-рецепторами ответов у грызуна.

[0541] В типовом варианте осуществления 247 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 246, отличающийся тем, что один или более опосредованных Fc-рецепторами ответов включают ответ АЗКЦ.

[0542] В типовом варианте осуществления 248 в данном документе предложен способ скрининга терапевтического агента, содержащего человеческую Fc-область человеческого антитела, включающий: (a) введение агента, содержащего Fc-область человеческого антитела, грызуну по любому из вариантов осуществления 148-239, причем агент связывается с целевой клеткой в организме мыши; (b) определение антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности (АЗКЦ) естественных клеток-киллеров (NK) против целевой клетки; и (c) сравнение уровня АЗКЦ на этапе (b) с контролем, причем повышенное уничтожение целевых клеток указывает на то, что агент обладает повышенной способностью опосредовать АЗКЦ.

[0543] В типовом варианте осуществления 249 в данном документе предложен способ измерения иммунного ответа, вырабатываемого грызуном против терапевтического белка, содержащего Fc-домен человека, включающий введение терапевтического белка грызуну по любому из вариантов осуществления 1-207 и измерение иммунного ответа, вырабатываемого грызуном против терапевтического белка.

[0544] В типовом варианте осуществления 250 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 240-249, отличающийся тем, что терапевтический белок представляет собой человеческое антитело.

[0545] В типовом варианте осуществления 251 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 240-249, отличающийся тем, что терапевтический белок представляет собой Fc-слитый белок.

[0546] В типовом варианте осуществления 252 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 240-251, отличающийся тем, что Fc-домен человека представляет собой Fc-домен IgG1 человека.

[0547] В типовом варианте осуществления 253 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 252, отличающийся тем, что терапевтический белок представляет собой человеческое антитело IgG1.

[0548] В типовом варианте осуществления 254 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 252, отличающийся тем, что терапевтический белок представляет собой Fc-слитый белок, содержащий Fc-домен IgG1 человека.

[0549] В типовом варианте осуществления 255 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 252-254, отличающийся тем, что генный сегмент C_H, кодирующий константный домен IgG, содержащий домен C_H1 человека, шарнирную область человека, домен C_H2 человека, домен C_H3 человека, трансмембранный домен IgG и цитоплазматический домен IgG, представляет собой генный сегмент C_γ1.

[0550] В типовом варианте осуществления 256 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 240-251, отличающийся тем, что Fc-домен человека представляет собой Fc-домен IgG2 человека.

[0551] В типовом варианте осуществления 257 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 256, отличающийся тем, что терапевтический белок представляет собой человеческое антитело IgG2.

[0552] В типовом варианте осуществления 258 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 256, отличающийся тем, что терапевтический белок представляет собой Fc-слитый белок, содержащий Fc-домен IgG2 человека.

[0553] В типовом варианте осуществления 259 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 256-258, отличающийся тем, что генный сегмент C_H, кодирующий константный домен IgG, содержащий домен C_H1 человека, шарнирную область человека, домен C_H2 человека, домен C_H3 человека, трансмембранный домен IgG и цитоплазматический домен IgG, представляет собой генный сегмент C_γ2.

[0554] В типовом варианте осуществления 260 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 240-251, отличающийся тем, что Fc-домен человека представляет собой Fc-домен IgG3 человека.

[0555] В типовом варианте осуществления 261 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 260, отличающийся тем, что терапевтический белок представляет собой человеческое антитело IgG3.

[0556] В типовом варианте осуществления 262 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 260, отличающийся тем, что терапевтический белок представляет собой Fc-слитый белок, содержащий Fc-домен IgG3 человека.

[0557] В типовом варианте осуществления 263 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 260-262, отличающийся тем, что генный сегмент C_H, кодирующий константный домен IgG, содержащий домен C_H1 человека, шарнирную область человека, домен C_H2 человека, домен C_H3 человека, трансмембранный домен IgG и цитоплазматический домен IgG, представляет собой генный сегмент C_γ3.

[0558] В типовом варианте осуществления 264 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 240-251, отличающийся тем, что Fc-домен человека представляет собой Fc-домен IgG4 человека.

[0559] В типовом варианте осуществления 265 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 264, отличающийся тем, что терапевтический белок представляет собой человеческое антитело IgG4.

[0560] В типовом варианте осуществления 266 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 264, отличающийся тем, что терапевтический белок представляет собой Fc-слитый белок, содержащий Fc-домен IgG4 человека.

[0561] В типовом варианте осуществления 267 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 264-266, отличающийся тем, что генный сегмент C_H, кодирующий константный домен IgG, содержащий домен C_H1 человека, шарнирную область человека, домен C_H2 человека, домен C_H3 человека, трансмембранный домен IgG и цитоплазматический домен IgG, представляет собой генный сегмент C_γ4.

[0562] В типовом варианте осуществления 268 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 250, 252, 253, 255-257, 259-261, 263-265 и 267, отличающийся тем, что терапевтический белок представляет собой человеческое антитело с легкой цепью κ, а грызун экспрессирует антитела, содержащие легкие цепи κ человека.

[0563] В типовом варианте осуществления 269 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 250, 252, 253, 255-257, 259-261, 263-265 и 267, отличающийся тем, что терапевтический белок представляет собой человеческое антитело с легкой цепью λ, а грызун экспрессирует антитела, содержащие легкие цепи λ человека.

[0564] В типовом варианте осуществления 270 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 240-269, отличающийся тем, что грызун представляет собой мышь.

[0565] В типовом варианте осуществления 271 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 240-269, отличающийся тем, что грызун представляет собой крысу.

[0566] В типовом варианте осуществления 272 в данном документе предложена животная модель для тестирования терапевтического белка, содержащего Fc-домен человека, включающая введение терапевтического белка грызуну по любому из вариантов осуществления 1-207 и измерение одного или более фармакокинетических свойств вводимого терапевтического белка.

[0567] В типовом варианте осуществления 273 в данном документе предложена животная модель по варианту осуществления 272, отличающаяся тем, что одно или более фармакокинетических свойств выбраны из одного или более из площади под кривой плазменная концентрация - время (ППК), in vivo восстановления (IVR), скорости выведения (CL), среднего времени удержания (СВУ), времени полужизни агента и объема распределения в равновесном состоянии (Vss).

[0568] В типовом варианте осуществления 274 в данном документе предложена животная модель для тестирования эффективности терапевтического белка, содержащего Fc-домен человека, включающая введение терапевтического белка грызуну по любому из вариантов осуществления 1-207 и измерение терапевтической эффективности вводимого терапевтического белка.

[0569] В типовом варианте осуществления 275 в данном документе предложена животная модель для определения терапевтически эффективной дозы терапевтического белка, содержащего Fc-домен человека, включающая введение некоторого количества доз терапевтического белка грызуну по любому из вариантов осуществления 1-207 и определение терапевтической эффективности каждой дозы терапевтического белка.

[0570] В типовом варианте осуществления 276 в данном документе предложена животная модель для определения безопасной дозы терапевтического белка, содержащего Fc-домен человека, включающая введение некоторого количества доз терапевтического белка грызуну по любому из вариантов осуществления 1-207 и определение безопасности каждой дозы терапевтического белка.

[0571] В типовом варианте осуществления 277 в данном документе предложена животная модель для определения переносимой дозы терапевтического белка, содержащего Fc-домен человека, включающая введение некоторого количества доз терапевтического белка грызуну по любому из вариантов осуществления 1-207 и определение переносимости каждой дозы терапевтического белка.

[0572] В типовом варианте осуществления 278 в данном документе предложена животная модель для тестирования терапевтического белка, содержащего Fc-домен человека, включающая введение терапевтического белка грызуну по любому из вариантов осуществления 148-239 и измерение одного или более опосредованных Fc-рецепторами ответов у грызуна.

[0573] В типовом варианте осуществления 279 в данном документе предложена животная модель по варианту осуществления 278, отличающаяся тем, что один или более опосредованных Fc-рецепторами ответов включают ответ АЗКЦ.

[0574] В типовом варианте осуществления 280 в данном документе предложена животная модель для скрининга терапевтического агента, содержащего человеческую Fc-область человеческого антитела, включающая: (a) введение агента, содержащего Fc-область человеческого антитела, грызуну по любому из вариантов осуществления 148-239, причем агент связывается с целевой клеткой в организме мыши; (b) определение антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности (АЗКЦ) естественных клеток-киллеров (NK) против целевой клетки; и (c) сравнение уровня АЗКЦ на этапе (b) с контролем, причем повышенное уничтожение целевых клеток указывает на то, что агент обладает повышенной способностью опосредовать АЗКЦ.

[0575] В типовом варианте осуществления 281 в данном документе предложена животная модель для измерения иммунного ответа, вырабатываемого грызуном против терапевтического белка, содержащего Fc-домен человека, включающая введение терапевтического белка грызуну по любому из вариантов осуществления 1-207 и измерение иммунного ответа, вырабатываемого грызуном против терапевтического белка.

[0576] В типовом варианте осуществления 282 в данном документе предложена животная модель по любому из вариантов осуществления 272-281, отличающаяся тем, что терапевтический белок представляет собой человеческое антитело.

[0577] В типовом варианте осуществления 283 в данном документе предложена животная модель по любому из вариантов осуществления 272-281, отличающаяся тем, что терапевтический белок представляет собой Fc-слитый белок.

[0578] В типовом варианте осуществления 284 в данном документе предложена животная модель по любому из вариантов осуществления 272-283, отличающаяся тем, что Fc-домен человека представляет собой Fc-домен IgG1 человека.

[0579] В типовом варианте осуществления 285 в данном документе предложена животная модель по варианту осуществления 284, отличающаяся тем, что терапевтический белок представляет собой человеческое антитело IgG1.

[0580] В типовом варианте осуществления 286 в данном документе предложена животная модель по варианту осуществления 284, отличающаяся тем, что терапевтический белок представляет собой Fc-слитый белок, содержащий Fc-домен IgG1 человека.

[0581] В типовом варианте осуществления 287 в данном документе предложена животная модель по любому из вариантов осуществления 272-286, отличающаяся тем, что генный сегмент C_H, кодирующий константный домен IgG, содержащий домен C_H1 человека, шарнирную область человека, домен C_H2 человека, домен C_H3 человека, трансмембранный домен IgG и цитоплазматический домен IgG, представляет собой генный сегмент C_γ1.

[0582] В типовом варианте осуществления 288 в данном документе предложена животная модель по любому из вариантов осуществления 272-283, отличающаяся тем, что Fc-домен человека представляет собой Fc-домен IgG2 человека.

[0583] В типовом варианте осуществления 289 в данном документе предложена животная модель по варианту осуществления 288, отличающаяся тем, что терапевтический белок представляет собой человеческое антитело IgG2.

[0584] В типовом варианте осуществления 290 в данном документе предложена животная модель по варианту осуществления 288, отличающаяся тем, что терапевтический белок представляет собой Fc-слитый белок, содержащий Fc-домен IgG2 человека.

[0585] В типовом варианте осуществления 291 в данном документе предложена животная модель по любому из вариантов осуществления 288-290, отличающаяся тем, что генный сегмент C_H, кодирующий константный домен IgG, содержащий домен C_H1 человека, шарнирную область человека, домен C_H2 человека, домен C_H3 человека, трансмембранный домен IgG и цитоплазматический домен IgG, представляет собой генный сегмент C_γ2.

[0586] В типовом варианте осуществления 292 в данном документе предложена животная модель по любому из вариантов осуществления 272-283, отличающаяся тем, что Fc-домен человека представляет собой Fc-домен IgG3 человека.

[0587] В типовом варианте осуществления 293 в данном документе предложена животная модель по варианту осуществления 292, отличающаяся тем, что терапевтический белок представляет собой человеческое антитело IgG3.

[0588] В типовом варианте осуществления 294 в данном документе предложена животная модель по варианту осуществления 292, отличающаяся тем, что терапевтический белок представляет собой Fc-слитый белок, содержащий Fc-домен IgG3 человека.

[0589] В типовом варианте осуществления 295 в данном документе предложена животная модель по любому из вариантов осуществления 292-294, отличающаяся тем, что генный сегмент C_H, кодирующий константный домен IgG, содержащий домен C_H1 человека, шарнирную область человека, домен C_H2 человека, домен C_H3 человека, трансмембранный домен IgG и цитоплазматический домен IgG, представляет собой генный сегмент C_γ3.

[0590] В типовом варианте осуществления 296 в данном документе предложена животная модель по любому из вариантов осуществления 272-283, отличающаяся тем, что Fc-домен человека представляет собой Fc-домен IgG4 человека.

[0591] В типовом варианте осуществления 297 в данном документе предложена животная модель по варианту осуществления 296, отличающаяся тем, что терапевтический белок представляет собой человеческое антитело IgG4.

[0592] В типовом варианте осуществления 298 в данном документе предложена животная модель по варианту осуществления 296, отличающаяся тем, что терапевтический белок представляет собой Fc-слитый белок, содержащий Fc-домен IgG4 человека.

[0593] В типовом варианте осуществления 299 в данном документе предложена животная модель по любому из вариантов осуществления 296-298, отличающаяся тем, что генный сегмент C_H, кодирующий константный домен IgG, содержащий домен C_H1 человека, шарнирную область человека, домен C_H2 человека, домен C_H3 человека, трансмембранный домен IgG и цитоплазматический домен IgG, представляет собой генный сегмент C_γ4.

[0594] В типовом варианте осуществления 300 в данном документе предложена животная модель по любому из вариантов осуществления 282, 284, 285, 287-289, 291-293, 295-297 и 299, отличающаяся тем, что терапевтический белок представляет собой человеческое антитело с легкой цепью κ, а грызун экспрессирует антитела, содержащие легкие цепи κ человека.

[0595] В типовом варианте осуществления 301 в данном документе предложена животная модель по любому из вариантов осуществления 282, 284, 285, 287-289, 291-293, 295-297 и 299, отличающаяся тем, что терапевтический белок представляет собой человеческое антитело с легкой цепью λ, а грызун экспрессирует антитела, содержащие легкие цепи λ человека.

[0596] В типовом варианте осуществления 302 в данном документе предложена животная модель по любому из вариантов осуществления 272-301, отличающаяся тем, что грызун представляет собой мышь.

[0597] В типовом варианте осуществления 303 в данном документе предложена животная модель по любому из вариантов осуществления 272-301, отличающаяся тем, что грызун представляет собой крысу.

[0598] В типовом варианте осуществления 304 в данном документе предложена эмбриональная стволовая (ЭС) клетка грызуна, содержащая в геноме: сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H, генный сегмент D_H и генный сегмент J_H; и (ii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент C_H, кодирующий константный домен IgG, содержащий домен C_H1 человека, шарнирную область человека, домен C_H2 человека, домен C_H3 человека, трансмембранный домен IgG и цитоплазматический домен IgG, причем вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина.

[0599] В типовом варианте осуществления 305 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 304, отличающаяся тем, что трансмембранный домен IgG представляет собой трансмембранный домен IgG грызуна.

[0600] В типовом варианте осуществления 306 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 304, отличающаяся тем, что трансмембранный домен IgG представляет собой трансмембранный домен IgG человека.

[0601] В типовом варианте осуществления 307 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304-306, отличающаяся тем, что цитоплазматический домен IgG представляет собой цитоплазматический домен IgG грызуна.

[0602] В типовом варианте осуществления 308 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304-306, отличающаяся тем, что цитоплазматический домен IgG представляет собой цитоплазматический домен IgG человека.

[0603] В типовом варианте осуществления 309 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304-308, отличающаяся тем, что домен C_H1 человека, шарнирная область человека, домен C_H2 человека и домен C_H3 человека представляют собой домены IgG1.

[0604] В типовом варианте осуществления 310 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 309, отличающаяся тем, что домен IgG1 кодируется аллелем, выбранным из IGHG1*01, IGHG1*02, IGHG1*03, IGHG1*04 и IGHG1*05.

[0605] В типовом варианте осуществления 311 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304-308, отличающаяся тем, что домен C_H1 человека, шарнирная область человека, домен C_H2 человека и домен C_H3 человека представляют собой домены IgG2.

[0606] В типовом варианте осуществления 312 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 311, отличающаяся тем, что домен IgG2 кодируется аллелем, выбранным из IGHG2*01, IGHG2*02, IGHG2*03, IGHG2*04, IGHG2*05 и IGHG2*06.

[0607] В типовом варианте осуществления 313 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304-308, отличающаяся тем, что домен C_H1 человека, шарнирная область человека, домен C_H2 человека и домен C_H3 человека представляют собой домены IgG3.

[0608] В типовом варианте осуществления 314 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 313, отличающаяся тем, что домен IgG3 кодируется аллелем, выбранным из IGHG3*01, IGHG3*02, IGHG3*03, IGHG3*04, IGHG3*05, IGHG3*06, IGHG3*07, IGHG3*08, IGHG3*09, IGHG3*10, IGHG3*11, IGHG3*12, IGHG3*13, IGHG3*14, IGHG3*15, IGHG3*16, IGHG3*17, IGHG3*18 и IGHG3*19.

[0609] В типовом варианте осуществления 315 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304-308, отличающаяся тем, что домен C_H1 человека, шарнирная область человека, домен C_H2 человека и домен C_H3 человека представляют собой домены IgG4.

[0610] В типовом варианте осуществления 316 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 315, отличающаяся тем, что домен IgG4 кодируется аллелем, выбранным из IGHG4*01, IGHG4*02, IGHG4*03 и IGHG4*04.

[0611] В типовом варианте осуществления 317 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 309-316, отличающаяся тем, что генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 человека, шарнирную область человека, домен C_H2 человека и домен C_H3 человека, расположен в локусе эндогенного генного сегмента C_γ2a или C_γ2c.

[0612] В типовом варианте осуществления 318 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 317, отличающаяся тем, что генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 человека, шарнирную область человека, домен C_H2 человека и домен C_H3 человека, замещает эндогенный генный сегмент C_γ2a или C_γ2c.

[0613] В типовом варианте осуществления 319 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 309-316, отличающаяся тем, что генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 человека, шарнирную область человека, домен C_H2 человека и домен C_H3 человека, расположен в локусе эндогенного генного сегмента C_γ1.

[0614] В типовом варианте осуществления 320 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 319, отличающаяся тем, что генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 человека, шарнирную область человека, домен C_H2 человека и домен C_H3 человека, замещает эндогенный генный сегмент C_γ1.

[0615] В типовом варианте осуществления 321 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 309-316, отличающаяся тем, что генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 человека, шарнирную область человека, домен C_H2 человека и домен C_H3 человека, расположен в локусе эндогенного генного сегмента C_γ2b.

[0616] В типовом варианте осуществления 322 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 321, отличающаяся тем, что генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 человека, шарнирную область человека, домен C_H2 человека и домен C_H3 человека, замещает эндогенный генный сегмент C_γ2b.

[0617] В типовом варианте осуществления 323 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 309-316, отличающаяся тем, что генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 человека, шарнирную область человека, домен C_H2 человека и домен C_H3 человека, расположен в локусе эндогенного генного сегмента C_γ3.

[0618] В типовом варианте осуществления 324 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 323, отличающаяся тем, что генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 человека, шарнирную область человека, домен C_H2 человека и домен C_H3 человека, замещает эндогенный генный сегмент C_γ3.

[0619] В типовом варианте осуществления 325 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304-324, отличающаяся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_μ грызуна.

[0620] В типовом варианте осуществления 326 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304-324, отличающаяся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_μ человека.

[0621] В типовом варианте осуществления 327 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304-326, отличающаяся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_δ грызуна.

[0622] В типовом варианте осуществления 328 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304-326, отличающаяся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_δ человека.

[0623] В типовом варианте осуществления 329 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304-328, отличающаяся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_γ1 грызуна.

[0624] В типовом варианте осуществления 330 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304-329, отличающаяся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_γ2a и/или C_γ2c грызуна.

[0625] В типовом варианте осуществления 331 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304-330, отличающаяся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_γ2b грызуна.

[0626] В типовом варианте осуществления 332 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304-331, отличающаяся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_γ3 грызуна.

[0627] В типовом варианте осуществления 333 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304-332, отличающаяся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_ε грызуна.

[0628] В типовом варианте осуществления 334 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304-332, отличающаяся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_ε человека.

[0629] В типовом варианте осуществления 335 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304-334, отличающаяся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_α грызуна.

[0630] В типовом варианте осуществления 336 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304-334, отличающаяся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_α человека.

[0631] В типовом варианте осуществления 337 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304-324, отличающаяся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина содержит генный сегмент C_μ человека, генный сегмент C_δ человека, генный сегмент C_γ3 человека и генный сегмент C_γ1 человека.

[0632] В типовом варианте осуществления 338 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 337, отличающаяся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_γ2 человека и генный сегмент C_γ4 человека.

[0633] В типовом варианте осуществления 339 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 337 или варианту осуществления 338, отличающаяся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_α человека.

[0634] В типовом варианте осуществления 340 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 337-339, отличающаяся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_ε человека.

[0635] В типовом варианте осуществления 341 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304-340, отличающаяся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит интронный энхансер (E_i) грызуна.

[0636] В типовом варианте осуществления 342 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304-340, отличающаяся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит интронный энхансер (E_i) человека.

[0637] В типовом варианте осуществления 343 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304-342, отличающаяся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит 3’ регуляторную область (3’ РО) грызуна.

[0638] В типовом варианте осуществления 344 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304-342, отличающаяся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит 3’ регуляторную область (3’ РО) человека.

[0639] В типовом варианте осуществления 345 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304-344, отличающаяся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит сайт переключения S_μ грызуна.

[0640] В типовом варианте осуществления 346 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304-345, отличающаяся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит сайт переключения S_γ3 грызуна.

[0641] В типовом варианте осуществления 347 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304-346, отличающаяся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит сайт переключения S_γ1 грызуна.

[0642] В типовом варианте осуществления 348 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304-347, отличающаяся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит сайт переключения S_γ2b грызуна.

[0643] В типовом варианте осуществления 349 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304-348, отличающаяся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит сайт переключения S_γ2a и/или S_γ2c грызуна.

[0644] В типовом варианте осуществления 350 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304-349, отличающаяся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит сайт переключения S_ε грызуна.

[0645] В типовом варианте осуществления 351 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304-350, отличающаяся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит сайт переключения S_α грызуна.

[0646] В типовом варианте осуществления 352 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 304-344, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит сайт переключения S_μ человека.

[0647] В типовом варианте осуществления 353 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 304-344 и 352, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит сайт переключения S_γ3 человека.

[0648] В типовом варианте осуществления 354 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 304-344 и 352-353, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит сайт переключения S_γ1 человека.

[0649] В типовом варианте осуществления 355 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 304-344 и 352-354, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит сайт переключения S_γ2 человека.

[0650] В типовом варианте осуществления 356 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 304-344 и 352-355, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит сайт переключения S_γ4 человека.

[0651] В типовом варианте осуществления 357 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 304-344 и 352-356, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит сайт переключения S_ε человека.

[0652] В типовом варианте осуществления 358 в данном документе предложен грызун по любому из вариантов осуществления 304-344 и 352-357, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит сайт переключения S_α человека.

[0653] В типовом варианте осуществления 359 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304-358, отличающаяся тем, что генный сегмент V_H представляет собой генный сегмент V_H грызуна, генный сегмент D_H представляет собой генный сегмент D_H грызуна, а генный сегмент J_H представляет собой генный сегмент J_H грызуна.

[0654] В типовом варианте осуществления 360 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 359, отличающаяся тем, что генный сегмент V_H грызуна, генный сегмент D_H грызуна и генный сегмент J_H грызуна представляют собой эндогенные генные сегменты грызуна.

[0655] В типовом варианте осуществления 361 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304-358, отличающаяся тем, что генный сегмент V_H представляет собой генный сегмент V_H человека, генный сегмент D_H представляет собой генный сегмент D_H человека, а генный сегмент J_H представляет собой генный сегмент J_H человека.

[0656] В типовом варианте осуществления 362 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 361, отличающаяся тем, что вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина содержит по меньшей мере 3 генных сегмента V_H человека.

[0657] В типовом варианте осуществления 363 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 361 или варианту осуществления 362, отличающаяся тем, что вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина содержит все генные сегменты D_H человека.

[0658] В типовом варианте осуществления 364 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 361-363, отличающаяся тем, что вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина содержит все генные сегменты J_H человека.

[0659] В типовом варианте осуществления 365 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 361-364, отличающаяся тем, что в вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина отсутствует функциональный эндогенный ген Adam6 грызуна.

[0660] В типовом варианте осуществления 366 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 361-365, отличающаяся тем, что геном зародышевой линии дополнительно содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую функциональный полипептид Adam6 грызуна, его функциональный ортолог, функциональный гомолог или функциональный фрагмент.

[0661] В типовом варианте осуществления 367 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 366, отличающаяся тем, что происходит экспрессия функционального полипептида Adam6 грызуна, его функционального ортолога, функционального гомолога или функционального фрагмента.

[0662] В типовом варианте осуществления 368 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 366 или варианту осуществления 367, отличающаяся тем, что нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид ADAM6 грызуна, его функциональный ортолог, функциональный гомолог или функциональный фрагмент, находится в той же хромосоме, что и вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина.

[0663] В типовом варианте осуществления 369 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 366-368, отличающаяся тем, что нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид ADAM6 грызуна, его функциональный ортолог, функциональный гомолог или функциональный фрагмент, находится в сконструированном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина.

[0664] В типовом варианте осуществления 370 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 366-369, отличающаяся тем, что нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид ADAM6 грызуна, его функциональный ортолог, функциональный гомолог или функциональный фрагмент, находится на месте псевдогена Adam6 человека.

[0665] В типовом варианте осуществления 371 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 366-370, отличающаяся тем, что нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид ADAM6 грызуна, его функциональный ортолог, функциональный гомолог или функциональный фрагмент, замещает псевдоген Adam6 человека.

[0666] В типовом варианте осуществления 372 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 366-371, отличающаяся тем, что нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид ADAM6 грызуна, его функциональный ортолог, функциональный гомолог или функциональный фрагмент, находится между первым генным сегментом V_H человека и вторым генным сегментом V_H человека.

[0667] В типовом варианте осуществления 373 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 372, отличающаяся тем, что первый генный сегмент V_H человека представляет собой V_H1-2, а второй генный сегмент V_H человека представляет собой V_H6-1.

[0668] В типовом варианте осуществления 374 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 366-369, отличающаяся тем, что нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид ADAM6 грызуна, его функциональный ортолог, функциональный гомолог или функциональный фрагмент, находится между генным сегментом V_H человека и генным сегментом D_H человека.

[0669] В типовом варианте осуществления 375 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304-374, отличающаяся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина расположен в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина.

[0670] В типовом варианте осуществления 376 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 375, отличающаяся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина замещает весь или часть эндогенного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина.

[0671] В типовом варианте осуществления 377 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304-376, отличающаяся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина.

[0672] В типовом варианте осуществления 378 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304-376, отличающаяся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина.

[0673] В типовом варианте осуществления 379 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна, содержащая в геноме: сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H человека, генный сегмент D_H человека и генный сегмент J_H человека; (ii) интронный энхансер (E_i) грызуна; (iii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую: (a) генный сегмент C_μ грызуна; (b) генный сегмент C_δ грызуна; (c) генный сегмент C_γ3 грызуна; (d) генный сегмент C_γ1 грызуна; (e) генный сегмент C_γ2b грызуна; (f) модифицированный генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 IgG1 человека, шарнирную область IgG1 человека, домен C_H2 IgG1 человека, домен C_H3 IgG1 человека, трансмембранный домен IgG2a грызуна и цитоплазматический домен IgG2a грызуна; (g) генный сегмент C_ε грызуна; и (h) генный сегмент C_α грызуна; и (iv) 3’ регуляторную область (3’ РО) грызуна, причем вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина.

[0674] В типовом варианте осуществления 380 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна, содержащая в геноме: сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H человека, генный сегмент D_H человека и генный сегмент J_H человека; (ii) интронный энхансер (E_i) грызуна; (iii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую: (a) генный сегмент C_μ грызуна; (b) генный сегмент C_δ грызуна; (c) генный сегмент C_γ3 грызуна; (d) генный сегмент C_γ1 грызуна; (e) генный сегмент C_γ2b грызуна; (f) модифицированный генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 IgG1 человека, шарнирную область IgG1 человека, домен C_H2 IgG1 человека, домен C_H3 IgG1 человека, трансмембранный домен IgG1 человека и цитоплазматический домен IgG1 человека; (g) генный сегмент C_ε грызуна; и (h) генный сегмент C_α грызуна; и (iv) 3’ регуляторную область (3’ РО) грызуна, причем вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина.

[0675] В типовом варианте осуществления 381 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна, содержащая в геноме: сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H человека, генный сегмент D_H человека и генный сегмент J_H человека; (ii) интронный энхансер (E_i) грызуна; (iii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую: (a) генный сегмент C_μ грызуна; (b) генный сегмент C_δ грызуна; (c) генный сегмент C_γ3 грызуна; (d) модифицированный генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 IgG4 человека, шарнирную область IgG4 человека, домен C_H2 IgG4 человека, домен C_H3 IgG4 человека, трансмембранный домен IgG1 грызуна и цитоплазматический домен IgG1 грызуна; (e) генный сегмент C_γ2b грызуна; (f) генный сегмент C_γ2a и/или C_γ2c грызуна; (g) генный сегмент C_ε грызуна; и (h) генный сегмент C_α грызуна; и (iv) 3’ регуляторную область (3’ РО) грызуна, причем вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина.

[0676] В типовом варианте осуществления 382 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна, содержащая в геноме: сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H человека, генный сегмент D_H человека и генный сегмент J_H человека; (ii) интронный энхансер (E_i) грызуна; (iii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую: (a) генный сегмент C_μ грызуна; (b) генный сегмент C_δ грызуна; (c) генный сегмент C_γ3 грызуна; (d) модифицированный генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 IgG4 человека, шарнирную область IgG4 человека, домен C_H2 IgG4 человека, домен C_H3 IgG4 человека, трансмембранный домен IgG4 человека и цитоплазматический домен IgG4 человека; (e) генный сегмент C_γ2b грызуна; (f) генный сегмент C_γ2a и/или C_γ2c грызуна; (g) генный сегмент C_ε грызуна; и (h) генный сегмент C_α грызуна; и (iv) 3’ регуляторную область (3’ РО) грызуна, причем вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина.

[0677] В типовом варианте осуществления 383 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна, содержащая в геноме: сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H человека, генный сегмент D_H человека и генный сегмент J_H человека; (ii) интронный энхансер (E_i) человека; (iii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую: (a) генный сегмент C_μ человека; (b) генный сегмент C_δ человека; (c) генный сегмент C_γ3 человека; (d) генный сегмент C_γ1 человека; и (iv) 3’ регуляторную область (3’ РО) грызуна, причем вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина.

[0678] В типовом варианте осуществления 384 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна, содержащая в геноме: сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H человека, генный сегмент D_H человека и генный сегмент J_H человека; (ii) интронный энхансер (E_i) человека; (iii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую: (a) генный сегмент Cμ человека; (b) генный сегмент C_δ человека; (c) генный сегмент C_γ3 человека; (d) генный сегмент C_γ1 человека; (c) генный сегмент C_γ2 человека; (d) генный сегмент C_γ4 человека; и (iv) 3’ регуляторную область (3’ РО) грызуна, причем вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина.

[0679] В типовом варианте осуществления 385 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна, содержащая в геноме: сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H грызуна, генный сегмент D_H грызуна и генный сегмент J_H грызуна; (ii) интронный энхансер (E_i) грызуна; (iii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую: (a) генный сегмент C_μ человека; (b) генный сегмент C_δ человека; (c) генный сегмент C_γ3 человека; (d) генный сегмент C_γ1 человека; и (iv) 3’ регуляторную область (3’ РО) грызуна, причем вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина.

[0680] В типовом варианте осуществления 386 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна, содержащая в геноме: сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H грызуна, генный сегмент D_H грызуна и генный сегмент J_H грызуна; (ii) интронный энхансер (E_i) грызуна; (iii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую: (a) генный сегмент C_μ человека; (b) генный сегмент C_δ человека; (c) генный сегмент C_γ3 человека; (d) генный сегмент C_γ1 человека; (c) генный сегмент C_γ2 человека; (d) генный сегмент C_γ4 человека; и (iv) 3’ регуляторную область (3’ РО) грызуна, причем вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина.

[0681] В типовом варианте осуществления 387 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304-386, дополнительно содержащая в геноме: сконструированный локус цепи каппа (κ) иммуноглобулина, который содержит: (1) вариабельную область цепи κ иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_κ человека и генный сегмент J_κ человека; и (2) константную область цепи κ иммуноглобулина, содержащую генный сегмент C_κ человека, причем вариабельная область цепи κ иммуноглобулина функционально связана с константной областью цепи κ иммуноглобулина.

[0682] В типовом варианте осуществления 388 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 387, отличающаяся тем, что сконструированный локус цепи κ иммуноглобулина дополнительно содержит интронный энхансер κ (E_κi) грызуна.

[0683] В типовом варианте осуществления 389 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 387, отличающаяся тем, что сконструированный локус цепи κ иммуноглобулина дополнительно содержит интронный энхансер κ (E_κi) человека.

[0684] В типовом варианте осуществления 390 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 387-389, отличающаяся тем, что сконструированный локус цепи κ иммуноглобулина дополнительно содержит 3’ энхансер κ (E_κ3') грызуна.

[0685] В типовом варианте осуществления 391 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 387-389, отличающаяся тем, что сконструированный локус цепи κ иммуноглобулина дополнительно содержит 3’ энхансер κ (E_κ3') человека.

[0686] В типовом варианте осуществления 392 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 387-391, отличающаяся тем, что сконструированная вариабельная область цепи κ иммуноглобулина содержит по меньшей мере 6 генных сегментов V_κ человека.

[0687] В типовом варианте осуществления 393 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 387 или варианту осуществления 392, отличающаяся тем, что сконструированная вариабельная область цепи κ иммуноглобулина содержит все генные сегменты J_κ человека.

[0688] В типовом варианте осуществления 394 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 387-393, отличающаяся тем, что сконструированный локус цепи κ иммуноглобулина расположен в эндогенном локусе цепи κ иммуноглобулина.

[0689] В типовом варианте осуществления 395 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 394, отличающийся тем, что сконструированный локус цепи κ иммуноглобулина замещает весь или часть эндогенного локуса цепи κ иммуноглобулина.

[0690] В типовом варианте осуществления 396 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 387-395, отличающаяся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса цепи κ иммуноглобулина.

[0691] В типовом варианте осуществления 397 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 387-395, отличающаяся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса цепи κ иммуноглобулина.

[0692] В типовом варианте осуществления 398 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304-397, дополнительно содержащая в геноме: сконструированный локус цепи лямбда (λ) иммуноглобулина, который содержит: генный сегмент V_λ человека, генный сегмент J_λ человека и генный сегмент C_λ человека, причем генный сегмент V_λ человека и генный сегмент J_λ человека функционально связаны с генным сегментом C_λ человека.

[0693] В типовом варианте осуществления 399 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 398, отличающаяся тем, что генный сегмент C_λ человека представляет собой генный сегмент C_λ1 человека.

[0694] В типовом варианте осуществления 400 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 399, отличающаяся тем, что генный сегмент J_λ человека представляет собой генный сегмент J_λ1 человека.

[0695] В типовом варианте осуществления 401 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 398, отличающаяся тем, что генный сегмент C_λ человека представляет собой генный сегмент C_λ2 человека.

[0696] В типовом варианте осуществления 402 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 401, отличающаяся тем, что генный сегмент J_λ человека представляет собой генный сегмент J_λ2 человека.

[0697] В типовом варианте осуществления 403 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 398, отличающаяся тем, что генный сегмент C_λ человека представляет собой генный сегмент C_λ3 человека.

[0698] В типовом варианте осуществления 404 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 403, отличающаяся тем, что генный сегмент J_λ человека представляет собой генный сегмент J_λ3 человека.

[0699] В типовом варианте осуществления 405 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 398, отличающаяся тем, что генный сегмент C_λ человека представляет собой генный сегмент C_λ6 человека.

[0700] В типовом варианте осуществления 406 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 405, отличающаяся тем, что генный сегмент J_λ человека представляет собой генный сегмент J_λ6 человека.

[0701] В типовом варианте осуществления 407 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 398, отличающаяся тем, что генный сегмент J_λ человека представляет собой генный сегмент J_λ7 человека.

[0702] В типовом варианте осуществления 408 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 398-407, отличающаяся тем, что сконструированный локус цепи λ иммуноглобулина содержит генный сегмент C_λ1 человека, генный сегмент C_λ2 человека, генный сегмент C_λ3 человека, генный сегмент C_λ6 человека и генный сегмент C_λ1 грызуна.

[0703] В типовом варианте осуществления 409 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 408, отличающаяся тем, что сконструированный локус цепи λ иммуноглобулина содержит генный сегмент J_λ1 человека, генный сегмент J_λ2 человека, генный сегмент J_λ3 человека, генный сегмент J_λ6 человека и генный сегмент J_λ7 человека.

[0704] В типовом варианте осуществления 410 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 409, отличающаяся тем, что сконструированный локус цепи λ содержит кластер генных сегментов J_λ1 - C_λ1 человека, кластер генных сегментов J_λ2 - C_λ2 человека, кластер генных сегментов J_λ3 - C_λ3 человека, кластер генных сегментов J_λ6 - C_λ6 человека и кластер генных сегментов J_λ7 человека - C_λ1 грызуна.

[0705] В типовом варианте осуществления 411 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 398-410, отличающаяся тем, что сконструированный локус цепи λ иммуноглобулина содержит по меньшей мере 7 генных сегментов V_λ человека.

[0706] В типовом варианте осуществления 412 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 398-411, отличающаяся тем, что сконструированный локус цепи λ иммуноглобулина дополнительно содержит энхансер 2.4 λ грызуна.

[0707] В типовом варианте осуществления 413 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 398-412, отличающаяся тем, что сконструированный локус цепи λ иммуноглобулина дополнительно содержит 3' энхансер λ грызуна.

[0708] В типовом варианте осуществления 414 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 398-413, отличающаяся тем, что сконструированный локус цепи λ иммуноглобулина дополнительно содержит энхансер 3.1 λ грызуна.

[0709] В типовом варианте осуществления 415 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 398–414, отличающаяся тем, что сконструированный локус цепи λ иммуноглобулина дополнительно содержит 3' энхансер λ человека.

[0710] В типовом варианте осуществления 416 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 398–415, отличающаяся тем, что сконструированный локус цепи λ иммуноглобулина расположен в эндогенном локусе цепи λ иммуноглобулина.

[0711] В типовом варианте осуществления 417 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 416, отличающаяся тем, что сконструированный локус цепи λ иммуноглобулина замещает весь или часть эндогенного локуса цепи λ иммуноглобулина.

[0712] В типовом варианте осуществления 418 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 398–417, отличающаяся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса цепи λ иммуноглобулина.

[0713] В типовом варианте осуществления 419 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 398–417, отличающаяся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса цепи λ иммуноглобулина.

[0714] В типовом варианте осуществления 420 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304–419, дополнительно содержащая в геноме локус неонатального Fc-рецептора (FcRn), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcRn, содержащий внеклеточный домен человека.

[0715] В типовом варианте осуществления 421 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 420, отличающаяся тем, что полипептид FcRn дополнительно содержит трансмембранный домен грызуна.

[0716] В типовом варианте осуществления 422 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 420, отличающаяся тем, что полипептид FcRn дополнительно содержит трансмембранный домен человека.

[0717] В типовом варианте осуществления 423 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 420–422, отличающаяся тем, что полипептид FcRn дополнительно содержит цитоплазматический домен грызуна.

[0718] В типовом варианте осуществления 424 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 420–422, отличающаяся тем, что полипептид FcRn дополнительно содержит цитоплазматический домен человека.

[0719] В типовом варианте осуществления 425 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 420–424, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcRn, расположена в эндогенном локусе FcRn грызуна.

[0720] В типовом варианте осуществления 426 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 425, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcRn, замещает весь или часть эндогенного гена FcRn грызуна.

[0721] В типовом варианте осуществления 427 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 420, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая внеклеточный домен FcRn, замещает эндогенную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую внеклеточный домен FcRn грызуна.

[0722] В типовом варианте осуществления 428 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 420–427, отличающаяся тем, что грызун не экспрессирует FcRn грызуна.

[0723] В типовом варианте осуществления 429 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 420–428, отличающаяся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса FcRn.

[0724] В типовом варианте осуществления 430 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 420–428, отличающаяся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса FcRn.

[0725] В типовом варианте осуществления 431 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 420–430, дополнительно содержащая в геноме сконструированный локус β-2-микроглобулина (β2M), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую человеческий или гуманизированный полипептид β-2-микроглобулина (β2M).

[0726] В типовом варианте осуществления 432 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 431, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая человеческий или гуманизированный полипептид β2M, расположена в эндогенном локусе β2M грызуна.

[0727] В типовом варианте осуществления 433 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 432, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая человеческий или гуманизированный полипептид β2M, замещает весь или часть эндогенного гена β2M грызуна.

[0728] В типовом варианте осуществления 434 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 431–433, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты содержит экзоны 2–4 гена β2M человека.

[0729] В типовом варианте осуществления 435 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 431–434, отличающаяся тем, что грызун не экспрессирует полипептид β2M грызуна.

[0730] В типовом варианте осуществления 436 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 431–435, отличающаяся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса β2M.

[0731] В типовом варианте осуществления 437 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 431–435, отличающаяся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса β2M.

[0732] В типовом варианте осуществления 438 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304–437, дополнительно содержащая в геноме сконструированный локус Fc-эпсилон-рецептора 1 альфа (FcεR1α), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcεR1α, содержащий внеклеточный домен человека.

[0733] В типовом варианте осуществления 439 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 438, отличающаяся тем, что полипептид FcεR1α дополнительно содержит трансмембранный домен грызуна.

[0734] В типовом варианте осуществления 440 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 438, отличающаяся тем, что полипептид FcεR1α дополнительно содержит трансмембранный домен человека.

[0735] В типовом варианте осуществления 441 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 438–440, отличающаяся тем, что полипептид FcεR1α дополнительно содержит цитоплазматический домен грызуна.

[0736] В типовом варианте осуществления 442 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 438–440, отличающаяся тем, что полипептид FcεR1α дополнительно содержит цитоплазматический домен человека.

[0737] В типовом варианте осуществления 443 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 438–442, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcεR1α, расположена в эндогенном локусе FcεR1α грызуна.

[0738] В типовом варианте осуществления 444 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 443, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcεR1α, замещает весь или часть эндогенного гена FcεR1α грызуна.

[0739] В типовом варианте осуществления 445 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 444, отличающаяся тем, что полипептид FcεR1α содержит внеклеточный домен человека, трансмембранный домен человека и цитоплазматический домен человека.

[0740] В типовом варианте осуществления 446 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 438, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая внеклеточный домен FcεR1α человека, замещает эндогенную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую внеклеточный домен FcεR1α грызуна.

[0741] В типовом варианте осуществления 447 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 438–446, отличающаяся тем, что грызун не экспрессирует FcεR1α грызуна.

[0742] В типовом варианте осуществления 448 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 438–447, отличающаяся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса FcεR1α.

[0743] В типовом варианте осуществления 449 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 438–447, отличающаяся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса FcεR1α.

[0744] В типовом варианте осуществления 450 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304–449, дополнительно содержащая в геноме сконструированный локус Fc-гамма-рецептора 1a (FcγR1a), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcγR1a, содержащий внеклеточный домен человека.

[0745] В типовом варианте осуществления 451 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 450, отличающаяся тем, что полипептид FcγR1a дополнительно содержит трансмембранный домен грызуна.

[0746] В типовом варианте осуществления 452 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 450, отличающаяся тем, что полипептид FcγR1a дополнительно содержит трансмембранный домен человека.

[0747] В типовом варианте осуществления 453 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 450–452, отличающаяся тем, что полипептид FcγR1a дополнительно содержит цитоплазматический домен грызуна.

[0748] В типовом варианте осуществления 454 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 450–452, отличающаяся тем, что полипептид FcγR1a дополнительно содержит цитоплазматический домен человека.

[0749] В типовом варианте осуществления 455 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 450–454, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγR1a, расположена в эндогенном локусе FcγR1a грызуна.

[0750] В типовом варианте осуществления 456 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 455, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγR1a, замещает весь или часть эндогенного гена FcγR1a грызуна.

[0751] В типовом варианте осуществления 457 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 450, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая внеклеточный домен FcγR1a человека, замещает эндогенную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую внеклеточный домен FcγR1a грызуна.

[0752] В типовом варианте осуществления 458 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 450–457, отличающаяся тем, что грызун не экспрессирует FcγR1a грызуна.

[0753] В типовом варианте осуществления 459 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 450–458, отличающаяся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса FcγR1a.

[0754] В типовом варианте осуществления 460 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 450–458, отличающаяся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса FcγR1a.

[0755] В типовом варианте осуществления 461 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304–460, дополнительно содержащая в геноме сконструированный локус Fc-гамма-рецептора 2a (FcγR2a), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcγR2a человека.

[0756] В типовом варианте осуществления 462 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 461, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγR2a, расположена в эндогенном локусе низкоаффинного FcγR грызуна.

[0757] В типовом варианте осуществления 463 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 462, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγR2a человека, замещает весь или часть эндогенного гена низкоаффинного FcγR грызуна.

[0758] В типовом варианте осуществления 464 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 461–463, отличающаяся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса FcγR2a.

[0759] В типовом варианте осуществления 465 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 461–463, отличающаяся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса FcγR2a.

[0760] В типовом варианте осуществления 466 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304–465, дополнительно содержащая в геноме сконструированный локус Fc-гамма-рецептора 2b (FcγR2b), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcγR2b человека.

[0761] В типовом варианте осуществления 467 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 466, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγR2b, расположена в эндогенном локусе низкоаффинного FcγR грызуна.

[0762] В типовом варианте осуществления 468 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 467, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγR2b человека, замещает весь или часть эндогенного гена низкоаффинного FcγR грызуна.

[0763] В типовом варианте осуществления 469 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 466–468, отличающаяся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса FcγR2b.

[0764] В типовом варианте осуществления 470 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 466–468, отличающаяся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса FcγR2b.

[0765] В типовом варианте осуществления 471 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304–470, дополнительно содержащая в геноме сконструированный локус Fc-гамма-рецептора 3a (FcγR3a), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcγR3a человека.

[0766] В типовом варианте осуществления 472 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 471, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγR3a, расположена в эндогенном локусе низкоаффинного FcγR грызуна.

[0767] В типовом варианте осуществления 473 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 472, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγR3a человека, замещает весь или часть эндогенного гена низкоаффинного FcγR грызуна.

[0768] В типовом варианте осуществления 474 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 471–473, отличающаяся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса FcγR3a.

[0769] В типовом варианте осуществления 475 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 471–473, отличающаяся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса FcγR3a.

[0770] В типовом варианте осуществления 476 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304–475, дополнительно содержащая в геноме сконструированный локус Fc-гамма-рецептора 3b (FcγR3b), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcγR3b человека.

[0771] В типовом варианте осуществления 477 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 476, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγR3b, расположена в эндогенном локусе низкоаффинного FcγR грызуна.

[0772] В типовом варианте осуществления 478 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 477, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγR3b человека, замещает весь или часть эндогенного гена низкоаффинного FcγR грызуна.

[0773] В типовом варианте осуществления 479 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 476–478, отличающаяся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса FcγR3b.

[0774] В типовом варианте осуществления 480 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 476–478, отличающаяся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса FcγR3b.

[0775] В типовом варианте осуществления 481 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304–480, дополнительно содержащая в геноме сконструированный локус Fc-гамма-рецептора 2c (FcγR2c), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcγR2c человека.

[0776] В типовом варианте осуществления 482 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 481, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγR2c, расположена в эндогенном локусе низкоаффинного FcγR грызуна.

[0777] В типовом варианте осуществления 483 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 482, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγR2c человека, замещает весь или часть эндогенного гена низкоаффинного FcγR грызуна.

[0778] В типовом варианте осуществления 484 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 481–483, отличающаяся тем, что грызун не экспрессирует FcγR2c грызуна.

[0779] В типовом варианте осуществления 485 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 481–484, отличающаяся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса FcγR2c.

[0780] В типовом варианте осуществления 486 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 481–484, отличающаяся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса FcγR2c.

[0781] В типовом варианте осуществления 487 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна, содержащая в геноме сконструированный локус неонатального Fc-рецептора (FcRn), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcRn, содержащий внеклеточный домен человека.

[0782] В типовом варианте осуществления 488 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 487, отличающаяся тем, что полипептид FcRn дополнительно содержит трансмембранный домен грызуна.

[0783] В типовом варианте осуществления 489 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 487, отличающаяся тем, что полипептид FcRn дополнительно содержит трансмембранный домен человека.

[0784] В типовом варианте осуществления 490 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 487–489, отличающаяся тем, что полипептид FcRn дополнительно содержит цитоплазматический домен грызуна.

[0785] В типовом варианте осуществления 491 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 487–489, отличающаяся тем, что полипептид FcRn дополнительно содержит цитоплазматический домен человека.

[0786] В типовом варианте осуществления 492 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 487–491, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcRn, расположена в эндогенном локусе FcRn грызуна.

[0787] В типовом варианте осуществления 493 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 492, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcRn, замещает весь или часть эндогенного гена FcRn грызуна.

[0788] В типовом варианте осуществления 494 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 493, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая внеклеточный домен FcRn человека, замещает эндогенную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую внеклеточный домен FcRn грызуна.

[0789] В типовом варианте осуществления 495 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 487–494, отличающаяся тем, что грызун не экспрессирует FcRn грызуна.

[0790] В типовом варианте осуществления 496 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 487–495, отличающаяся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса FcRn.

[0791] В типовом варианте осуществления 497 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 487–495, отличающаяся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса FcRn.

[0792] В типовом варианте осуществления 498 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 487–497, дополнительно содержащая в геноме сконструированный локус β-2-микроглобулина (β2M), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую человеческий или гуманизированный полипептид β-2-микроглобулина (β2M).

[0793] В типовом варианте осуществления 499 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 498, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая человеческий или гуманизированный полипептид β2M, расположена в эндогенном локусе β2M грызуна.

[0794] В типовом варианте осуществления 500 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 499, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая человеческий или гуманизированный полипептид β2M, замещает весь или часть эндогенного гена β2M грызуна.

[0795] В типовом варианте осуществления 501 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 498–500, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты содержит экзоны 2–4 гена β2M человека.

[0796] В типовом варианте осуществления 502 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 498–501, отличающаяся тем, что грызун не экспрессирует полипептид β2M грызуна.

[0797] В типовом варианте осуществления 503 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 498–502, отличающаяся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса β2M.

[0798] В типовом варианте осуществления 504 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 498–502, отличающаяся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса β2M.

[0799] В типовом варианте осуществления 505 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна, содержащая в геноме сконструированный локус Fc-эпсилон-рецептора 1 альфа (FcεR1α), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcεR1α, содержащий внеклеточный домен человека.

[0800] В типовом варианте осуществления 506 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 505, отличающаяся тем, что полипептид FcεR1α дополнительно содержит трансмембранный домен грызуна.

[0801] В типовом варианте осуществления 507 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 505, отличающаяся тем, что полипептид FcεR1α дополнительно содержит трансмембранный домен человека.

[0802] В типовом варианте осуществления 508 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 505–507, отличающаяся тем, что полипептид FcεR1α дополнительно содержит цитоплазматический домен грызуна.

[0803] В типовом варианте осуществления 509 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 505–507, отличающаяся тем, что полипептид FcεR1α дополнительно содержит цитоплазматический домен человека.

[0804] В типовом варианте осуществления 510 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 505–509, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcεR1α, расположена в эндогенном локусе FcεR1α грызуна.

[0805] В типовом варианте осуществления 511 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 510, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcεR1α, замещает весь или часть эндогенного гена FcεR1α грызуна.

[0806] В типовом варианте осуществления 512 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 511, отличающаяся тем, что полипептид FcεR1α содержит внеклеточный домен человека, трансмембранный домен человека и цитоплазматический домен человека.

[0807] В типовом варианте осуществления 513 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 505, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая внеклеточный домен FcεR1α человека, замещает эндогенную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую внеклеточный домен FcεR1α грызуна.

[0808] В типовом варианте осуществления 514 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 505–513, отличающаяся тем, что грызун не экспрессирует FcεR1α грызуна.

[0809] В типовом варианте осуществления 515 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 505–514, отличающаяся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса FcεR1α.

[0810] В типовом варианте осуществления 516 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 505–514, отличающаяся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса FcεR1α.

[0811] В типовом варианте осуществления 517 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304–516, отличающаяся тем, что грызун представляет собой мышь.

[0812] В типовом варианте осуществления 518 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по любому из вариантов осуществления 304–516, отличающаяся тем, что грызун представляет собой крысу.

[0813] В типовом варианте осуществления 519 в данном документе предложен способ создания грызуна, содержащего в своем геноме: сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H, генный сегмент D_H и генный сегмент J_H; и (ii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент C_H, кодирующий константный домен IgG, содержащий домен C_H1 человека, шарнирную область человека, домен C_H2 человека, домен C_H3 человека, трансмембранный домен IgG и цитоплазматический домен IgG, при этом способ включает модификацию генома грызуна так, чтобы он содержал сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H, генный сегмент D_H и генный сегмент J_H; и (ii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент C_H, кодирующий константный домен IgG, содержащий домен C_H1 человека, шарнирную область человека, домен C_H2 человека, домен C_H3 человека, трансмембранный домен IgG и цитоплазматический домен IgG, причем вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина так, чтобы грызун вырабатывал антитела IgG, содержащие вариабельные домены, полученные из генного сегмента V_H, генного сегмента D_H и генного сегмента J_H, и константные домены тяжелой цепи, полученные из модифицированного генного сегмента C_H.

[0814] В типовом варианте осуществления 520 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 519, отличающийся тем, что трансмембранный домен IgG представляет собой трансмембранный домен IgG грызуна.

[0815] В типовом варианте осуществления 521 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 519, отличающийся тем, что трансмембранный домен IgG представляет собой трансмембранный домен IgG человека.

[0816] В типовом варианте осуществления 522 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–521, отличающийся тем, что цитоплазматический домен IgG представляет собой цитоплазматический домен IgG грызуна.

[0817] В типовом варианте осуществления 523 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–521, отличающийся тем, что цитоплазматический домен IgG представляет собой цитоплазматический домен IgG человека.

[0818] В типовом варианте осуществления 524 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–523, отличающийся тем, что домен C_H1 человека, шарнирная область человека, домен C_H2 человека и домен C_H3 человека представляют собой домены IgG1.

[0819] В типовом варианте осуществления 525 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 524, отличающийся тем, что домен IgG1 кодируется аллелем, выбранным из IGHG1*01, IGHG1*02, IGHG1*03, IGHG1*04 и IGHG1*05.

[0820] В типовом варианте осуществления 526 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–523, отличающийся тем, что домен C_H1 человека, шарнирная область человека, домен C_H2 человека и домен C_H3 человека представляют собой домены IgG2.

[0821] В типовом варианте осуществления 527 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 526, отличающийся тем, что домен IgG2 кодируется аллелем, выбранным из IGHG2*01, IGHG2*02, IGHG2*03, IGHG2*04, IGHG2*05 и IGHG2*06.

[0822] В типовом варианте осуществления 528 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–523, отличающийся тем, что домен C_H1 человека, шарнирная область человека, домен C_H2 человека и домен C_H3 человека представляют собой домены IgG3.

[0823] В типовом варианте осуществления 529 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 528, отличающийся тем, что домен IgG3 кодируется аллелем, выбранным из IGHG3*01, IGHG3*02, IGHG3*03, IGHG3*04, IGHG3*05, IGHG3*06, IGHG3*07, IGHG3*08, IGHG3*09, IGHG3*10, IGHG3*11, IGHG3*12, IGHG3*13, IGHG3*14, IGHG3*15, IGHG3*16, IGHG3*17, IGHG3*18 и IGHG3*19.

[0824] В типовом варианте осуществления 530 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–523, отличающийся тем, что домен C_H1 человека, шарнирная область человека, домен C_H2 человека и домен C_H3 человека представляют собой домены IgG4.

[0825] В типовом варианте осуществления 531 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 530, отличающийся тем, что домен IgG4 кодируется аллелем, выбранным из IGHG4*01, IGHG4*02, IGHG4*03 и IGHG4*04.

[0826] В типовом варианте осуществления 532 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 524–531, отличающийся тем, что генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 человека, шарнирную область человека, домен C_H2 человека и домен C_H3 человека, расположен в локусе эндогенного генного сегмента C_γ2a или C_γ2c.

[0827] В типовом варианте осуществления 533 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 532, отличающийся тем, что генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 человека, шарнирную область человека, домен C_H2 человека и домен C_H3 человека, замещает эндогенный генный сегмент C_γ2a или C_γ2c.

[0828] В типовом варианте осуществления 534 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 524–531, отличающийся тем, что генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 человека, шарнирную область человека, домен C_H2 человека и домен C_H3 человека, расположен в локусе эндогенного генного сегмента C_γ1.

[0829] В типовом варианте осуществления 535 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 534, отличающийся тем, что генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 человека, шарнирную область человека, домен C_H2 человека и домен C_H3 человека, замещает эндогенный генный сегмент C_γ1.

[0830] В типовом варианте осуществления 536 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 524–531, отличающийся тем, что генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 человека, шарнирную область человека, домен C_H2 человека и домен C_H3 человека, расположен в локусе эндогенного генного сегмента C_γ2b.

[0831] В типовом варианте осуществления 537 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 536, отличающийся тем, что генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 человека, шарнирную область человека, домен C_H2 человека и домен C_H3 человека, замещает эндогенный генный сегмент C_γ2b.

[0832] В типовом варианте осуществления 538 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 524–531, отличающийся тем, что генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 человека, шарнирную область человека, домен C_H2 человека и домен C_H3 человека, расположен в локусе эндогенного генного сегмента C_γ3.

[0833] В типовом варианте осуществления 539 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 538, отличающийся тем, что генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 человека, шарнирную область человека, домен C_H2 человека и домен C_H3 человека, замещает эндогенный генный сегмент C_γ3.

[0834] В типовом варианте осуществления 540 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–539, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_µ грызуна.

[0835] В типовом варианте осуществления 541 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–539, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_µ человека.

[0836] В типовом варианте осуществления 542 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–541, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_δ грызуна.

[0837] В типовом варианте осуществления 543 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–541, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_δ человека.

[0838] В типовом варианте осуществления 544 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–543, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_γ1 грызуна.

[0839] В типовом варианте осуществления 545 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–544, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_γ2a и/или C_γ2c грызуна.

[0840] В типовом варианте осуществления 546 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–545, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_γ2b грызуна.

[0841] В типовом варианте осуществления 547 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519-546, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_γ3 грызуна.

[0842] В типовом варианте осуществления 548 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519-547, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_ε грызуна.

[0843] В типовом варианте осуществления 549 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519-548, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_ε человека.

[0844] В типовом варианте осуществления 550 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–549, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_α грызуна.

[0845] В типовом варианте осуществления 551 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–549, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_α человека.

[0846] В типовом варианте осуществления 552 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–539, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина содержит генный сегмент C_μ человека, генный сегмент C_δ человека, генный сегмент C_γ3 человека и генный сегмент C_γ1 человека.

[0847] В типовом варианте осуществления 553 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 552, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_γ2 человека и генный сегмент C_γ4 человека.

[0848] В типовом варианте осуществления 554 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 552 или варианту осуществления 553, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_α человека.

[0849] В типовом варианте осуществления 555 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 552–554, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_ε человека.

[0850] В типовом варианте осуществления 556 в данном документе предложен способ создания грызуна, содержащего в своем геноме: сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H, генный сегмент D_H и генный сегмент J_H; и (ii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент C_H, кодирующий константный домен IgM, содержащий домен C_H1 человека, домен C_H2 человека, домен C_H3 человека, домен C_H4 человека, трансмембранный домен IgM человека и цитоплазматический домен IgM человека, при этом способ включает модификацию генома грызуна так, чтобы он содержал сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H, генный сегмент D_H и генный сегмент J_H; и (ii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент C_H, кодирующий константный домен IgM, содержащий домен C_H1 человека, домен C_H2 человека, домен C_H3 человека, домен C_H4 человека, трансмембранный домен IgM человека и цитоплазматический домен IgM человека, причем вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина так, чтобы грызун вырабатывал антитела IgM, содержащие вариабельные домены, полученные из генного сегмента V_H, генного сегмента D_H и генного сегмента J_H, и константные домены тяжелой цепи, полученные из генного сегмента C_H.

[0851] В типовом варианте осуществления 557 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 556, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_δ человека.

[0852] В типовом варианте осуществления 558 в данном документе предложен способ по вариантам осуществления 556 или 557, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_γ3 человека.

[0853] В типовом варианте осуществления 559 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 556–558, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_γ1 человека.

[0854] В типовом варианте осуществления 560 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 556–559, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_γ2 человека.

[0855] В типовом варианте осуществления 561 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 556–560, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_γ4 человека.

[0856] В типовом варианте осуществления 562 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 556–561, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина содержит генный сегмент C_μ человека, генный сегмент C_δ человека, генный сегмент C_γ3 человека и генный сегмент C_γ1 человека.

[0857] В типовом варианте осуществления 563 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 562, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_γ2 человека и генный сегмент C_γ4 человека.

[0858] В типовом варианте осуществления 564 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 562 или варианту осуществления 563, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_α человека.

[0859] В типовом варианте осуществления 565 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 562–564, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_ε человека.

[0860] В типовом варианте осуществления 566 в данном документе предложен способ создания грызуна, содержащего в своем геноме: сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H, генный сегмент D_H и генный сегмент J_H; и (ii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент C_H, кодирующий константный домен IgD, содержащий домен C_H1 человека, шарнирный домен H1 человека, шарнирный домен H2 человека, домен C_H2 человека, домен C_H3 человека, трансмембранный домен IgD человека и цитоплазматический домен IgD человека, при этом способ включает модификацию генома грызуна так, чтобы он содержал сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H, генный сегмент D_H и генный сегмент J_H; и (ii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент C_H, кодирующий константный домен IgD, содержащий домен C_H1 человека, шарнирный домен H1 человека, шарнирный домен H2 человека, домен C_H2 человека, домен C_H3 человека, трансмембранный домен IgD человека и цитоплазматический домен IgD человека, причем вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина так, чтобы грызун вырабатывал антитела IgD, содержащие вариабельные домены, полученные из генного сегмента V_H, генного сегмента D_H и генного сегмента J_H, и константные домены тяжелой цепи, полученные из модифицированного генного сегмента C_H.

[0861] В типовом варианте осуществления 567 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 566, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_µ человека.

[0862] В типовом варианте осуществления 568 в данном документе предложен способ по вариантам осуществления 566 или 567, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_γ3 человека.

[0863] В типовом варианте осуществления 569 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 566–568, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_γ1 человека.

[0864] В типовом варианте осуществления 570 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 566–569, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_γ2 человека.

[0865] В типовом варианте осуществления 571 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 566–570, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_γ4 человека.

[0866] В типовом варианте осуществления 572 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 566–571, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина содержит генный сегмент C_μ человека, генный сегмент C_δ человека, генный сегмент C_γ3 человека и генный сегмент C_γ1 человека.

[0867] В типовом варианте осуществления 573 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 572, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_γ2 человека и генный сегмент C_γ4 человека.

[0868] В типовом варианте осуществления 574 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 572 или варианту осуществления 573, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_α человека.

[0869] В типовом варианте осуществления 575 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 572–574, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент C_ε человека.

[0870] В типовом варианте осуществления 576 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–575, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит интронный энхансер (E_i) грызуна.

[0871] В типовом варианте осуществления 577 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–575, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит интронный энхансер (E_i) человека.

[0872] В типовом варианте осуществления 578 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–577, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит 3' регуляторную область (3' РО) грызуна.

[0873] В типовом варианте осуществления 579 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–577, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит 3' регуляторную область (3' РО) человека.

[0874] В типовом варианте осуществления 580 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–579, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит сайт переключения S_µ грызуна.

[0875] В типовом варианте осуществления 581 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–580, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит сайт переключения S_γ3 грызуна.

[0876] В типовом варианте осуществления 582 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–581, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит сайт переключения S_γ1 грызуна.

[0877] В типовом варианте осуществления 583 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519-582, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит сайт переключения S_γ2b грызуна.

[0878] В типовом варианте осуществления 584 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519-583, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит сайт переключения S_γ2a и/или S_γ2c грызуна.

[0879] В типовом варианте осуществления 585 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519-584, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит сайт переключения S_ε грызуна.

[0880] В типовом варианте осуществления 586 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519-585, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит сайт переключения S_α грызуна.

[0881] В типовом варианте осуществления 587 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–579, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит сайт переключения S_µ человека.

[0882] В типовом варианте осуществления 588 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–579 и 587, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит сайт переключения S_γ3 человека.

[0883] В типовом варианте осуществления 589 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–579 и 587–588, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит сайт переключения S_γ1 человека.

[0884] В типовом варианте осуществления 590 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–579 и 587-589, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит сайт переключения S_γ2 человека.

[0885] В типовом варианте осуществления 591 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–579 и 587-590, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит сайт переключения S_γ4 человека.

[0886] В типовом варианте осуществления 592 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–579 и 587–591, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит сайт переключения S_ε человека.

[0887] В типовом варианте осуществления 593 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–579 и 587–592, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит сайт переключения S_α человека.

[0888] В типовом варианте осуществления 594 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–593, отличающийся тем, что генный сегмент V_H представляет собой генный сегмент V_H грызуна, генный сегмент D_H представляет собой генный сегмент D_H грызуна, а генный сегмент J_H представляет собой генный сегмент J_H грызуна.

[0889] В типовом варианте осуществления 595 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 594, отличающийся тем, что генный сегмент V_H грызуна, генный сегмент D_H грызуна и генный сегмент J_H грызуна представляют собой эндогенные генные сегменты грызуна.

[0890] В типовом варианте осуществления 596 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–593, отличающийся тем, что генный сегмент V_H представляет собой генный сегмент V_H человека, генный сегмент D_H представляет собой генный сегмент D_H человека, а генный сегмент J_H представляет собой генный сегмент J_H человека.

[0891] В типовом варианте осуществления 597 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 596, отличающийся тем, что вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина содержит по меньшей мере 3 генных сегмента V_H человека.

[0892] В типовом варианте осуществления 598 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 596 или варианту осуществления 597, отличающийся тем, что вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина содержит все генные сегменты D_H человека.

[0893] В типовом варианте осуществления 599 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 596–598, отличающийся тем, что вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина содержит все генные сегменты J_H человека.

[0894] В типовом варианте осуществления 600 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 596–599, отличающийся тем, что в вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина отсутствует функциональный эндогенный ген Adam6 грызуна.

[0895] В типовом варианте осуществления 601 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 596–600, отличающийся тем, что геном зародышевой линии дополнительно содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую функциональный полипептид Adam6 грызуна, его функциональный ортолог, функциональный гомолог или функциональный фрагмент.

[0896] В типовом варианте осуществления 602 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 601, отличающийся тем, что происходит экспрессия функционального полипептида Adam6 грызуна, его функционального ортолога, функционального гомолога или функционального фрагмента.

[0897] В типовом варианте осуществления 603 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 601 или варианту осуществления 602, отличающийся тем, что нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид ADAM6 грызуна, его функциональный ортолог, функциональный гомолог или функциональный фрагмент, находится в той же хромосоме, что и вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина.

[0898] В типовом варианте осуществления 604 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 601–603, отличающийся тем, что нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид ADAM6 грызуна, его функциональный ортолог, функциональный гомолог или функциональный фрагмент, находится в сконструированном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина.

[0899] В типовом варианте осуществления 605 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 601-604, отличающийся тем, что нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид ADAM6 грызуна, его функциональный ортолог, функциональный гомолог или функциональный фрагмент, находится на месте псевдогена Adam6 человека.

[0900] В типовом варианте осуществления 606 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 601–605, отличающийся тем, что нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид ADAM6 грызуна, его функциональный ортолог, функциональный гомолог или функциональный фрагмент, замещает псевдоген Adam6 человека.

[0901] В типовом варианте осуществления 607 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 601–606, отличающийся тем, что нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид ADAM6 грызуна, его функциональный ортолог, функциональный гомолог или функциональный фрагмент, находится между первым генным сегментом V_H человека и вторым генным сегментом V_H человека.

[0902] В типовом варианте осуществления 608 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 607, отличающийся тем, что первый генный сегмент V_H человека представляет собой V_H1–2, а второй генный сегмент V_H человека представляет собой V_H6–1.

[0903] В типовом варианте осуществления 609 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 601–604, отличающийся тем, что нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид ADAM6 грызуна, его функциональный ортолог, функциональный гомолог или функциональный фрагмент, находится между генным сегментом V_H человека и генным сегментом D_H человека.

[0904] В типовом варианте осуществления 610 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–609, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина расположен в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина.

[0905] В типовом варианте осуществления 611 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 610, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина замещает весь или часть эндогенного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина.

[0906] В типовом варианте осуществления 612 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–611, отличающийся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина.

[0907] В типовом варианте осуществления 613 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–611, отличающийся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина.

[0908] В типовом варианте осуществления 614 в данном документе предложен способ создания грызуна, содержащего в своем геноме: сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H человека, генный сегмент D_H человека и генный сегмент J_H человека; (ii) интронный энхансер (E_i) грызуна; (iii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую:

(a) генный сегмент C_µ грызуна; (b) генный сегмент C_δ грызуна; (c) генный сегмент C_γ3 грызуна; (d) генный сегмент C_γ1 грызуна; (e) генный сегмент C_γ2b грызуна; (f) модифицированный генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 IgG1 человека, шарнирную область IgG1 человека, домен C_H2 IgG1 человека, домен C_H3 IgG1 человека, трансмембранный домен IgG2a грызуна и цитоплазматический домен IgG2a грызуна; (g) генный сегмент C_ε грызуна; и (h) генный сегмент C_α грызуна; и (iv) 3' регуляторную область (3' РО) грызуна, при этом способ включает модификацию генома грызуна так, чтобы он содержал сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H человека, генный сегмент D_H человека и генный сегмент J_H человека; (ii) интронный энхансер (E_i) грызуна; (iii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую: (a) генный сегмент C_µ грызуна; (b) генный сегмент C_δ грызуна; (c) генный сегмент C_γ3 грызуна; (d) генный сегмент C_γ1 грызуна; (e) генный сегмент C_γ2b грызуна; (f) модифицированный генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 IgG1 человека, шарнирную область IgG1 человека, домен C_H2 IgG1 человека, домен C_H3 IgG1 человека, трансмембранный домен IgG2a грызуна и цитоплазматический домен IgG2a грызуна; (g) генный сегмент C_ε грызуна; и (h) генный сегмент C_α грызуна; и (iv) 3' регуляторную область (3' РО) грызуна, причем вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина так, чтобы грызун вырабатывал антитела IgG, содержащие вариабельные домены, полученные из генного сегмента V_H человека, генного сегмента D_H человека и генного сегмента J_H человека, и константные домены тяжелой цепи, полученные из модифицированного генного сегмента C_H.

[0909] В типовом варианте осуществления 615 в данном документе предложен способ создания грызуна, содержащего в своем геноме: сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент VH человека, генный сегмент D_H человека и генный сегмент J_H человека; (ii) интронный энхансер (E_i) грызуна; (iii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую: (a) генный сегмент C_µ грызуна; (b) генный сегмент C_δ грызуна; (c) генный сегмент C_γ3 грызуна; (d) генный сегмент C_γ1 грызуна; (e) генный сегмент C_γ2b грызуна; (f) модифицированный генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 IgG1 человека, шарнирную область IgG1 человека, домен C_H2 IgG1 человека, домен C_H3 IgG1 человека, трансмембранный домен IgG1 человека и цитоплазматический домен IgG1 человека; (g) генный сегмент C_ε грызуна; и (h) генный сегмент C_α грызуна; и (iv) 3' регуляторную область (3' РО) грызуна, при этом способ включает модификацию генома грызуна так, чтобы он содержал сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент VH человека, генный сегмент D_H человека и генный сегмент J_H человека; (ii) интронный энхансер (E_i) грызуна; (iii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую: (a) генный сегмент C_µ грызуна; (b) генный сегмент C_δ грызуна; (c) генный сегмент C_γ3 грызуна; (d) генный сегмент C_γ1 грызуна; (e) генный сегмент C_γ2b грызуна; (f) модифицированный генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 IgG1 человека, шарнирную область IgG1 человека, домен C_H2 IgG1 человека, домен C_H3 IgG1 человека, трансмембранный домен IgG1 человека и цитоплазматический домен IgG1 человека; (g) генный сегмент C_ε грызуна; и (h) генный сегмент C_α грызуна; и (iv) 3' регуляторную область (3' РО) грызуна, причем вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина так, чтобы грызун вырабатывал антитела IgG, содержащие вариабельные домены, полученные из генного сегмента V_H человека, генного сегмента D_H человека и генного сегмента J_H человека, и константные домены тяжелой цепи, полученные из модифицированного генного сегмента C_H.

[0910] В типовом варианте осуществления 616 в данном документе предложен способ создания грызуна, содержащего в своем геноме: сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H человека, генный сегмент D_H человека и генный сегмент J_H человека; (ii) интронный энхансер (E_i) грызуна; (iii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую: (a) генный сегмент C_µ грызуна; (b) генный сегмент C_δ грызуна; (c) генный сегмент C_γ3 грызуна; (d) модифицированный генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 IgG4 человека, шарнирную область IgG4 человека, домен C_H2 IgG4 человека, домен C_H3 IgG4 человека, трансмембранный домен IgG1 грызуна и цитоплазматический домен IgG1 грызуна; (e) генный сегмент C_γ2b грызуна; (f) генный сегмент C_γ2a и/или C_γ2c грызуна; (g) генный сегмент C_ε грызуна; и (h) генный сегмент C_α грызуна; и (iv) 3' регуляторную область (3' РО) грызуна, при этом способ включает модификацию генома грызуна так, чтобы он содержал сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H человека, генный сегмент D_H человека и генный сегмент J_H человека; (ii) интронный энхансер (E_i) грызуна; (iii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую: (a) генный сегмент C_µ грызуна; (b) генный сегмент C_δ грызуна; (c) генный сегмент C_γ3 грызуна; (d) модифицированный генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 IgG4 человека, шарнирную область IgG4 человека, домен C_H2 IgG4 человека, домен C_H3 IgG4 человека, трансмембранный домен IgG1 грызуна и цитоплазматический домен IgG1 грызуна; (e) генный сегмент C_γ2b грызуна; (f) генный сегмент C_γ2a и/или C_γ2c грызуна; (g) генный сегмент C_ε грызуна; и (h) генный сегмент C_α грызуна; и (iv) 3' регуляторную область (3' РО) грызуна, причем вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина так, чтобы грызун вырабатывал антитела IgG, содержащие вариабельные домены, полученные из генного сегмента V_H человека, генного сегмента D_H человека и генного сегмента J_H человека, и константные домены тяжелой цепи, полученные из модифицированного генного сегмента C_H.

[0911] В типовом варианте осуществления 617 в данном документе предложен способ создания грызуна, содержащего в своем геноме: сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H человека, генный сегмент D_H человека и генный сегмент J_H человека; (ii) интронный энхансер (E_i) грызуна; (iii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую: (a) генный сегмент C_µ грызуна; (b) генный сегмент C_δ грызуна; (c) генный сегмент C_γ3 грызуна; (d) модифицированный генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 IgG4 человека, шарнирную область IgG4 человека, домен C_H2 IgG4 человека, домен C_H3 IgG4 человека, трансмембранный домен IgG4 человека и цитоплазматический домен IgG4 человека; (e) генный сегмент C_γ2b грызуна; (f) генный сегмент C_γ2a и/или C_γ2c грызуна; (g) генный сегмент C_ε грызуна; и (h) генный сегмент C_α грызуна; и (iv) 3' регуляторную область (3' РО) грызуна, при этом способ включает модификацию генома грызуна так, чтобы он содержал сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H человека, генный сегмент D_H человека и генный сегмент J_H человека; (ii) интронный энхансер (E_i) грызуна; (iii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую: (a) генный сегмент C_µ грызуна; (b) генный сегмент C_δ грызуна; (c) генный сегмент C_γ3 грызуна; (d) модифицированный генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 IgG4 человека, шарнирную область IgG4 человека, домен C_H2 IgG4 человека, домен C_H3 IgG4 человека, трансмембранный домен IgG4 человека и цитоплазматический домен IgG4 человека; (e) генный сегмент C_γ2b грызуна; (f) генный сегмент C_γ2a и/или C_γ2c грызуна; (g) генный сегмент C_ε грызуна; и (h) генный сегмент C_α грызуна; и (iv) 3' регуляторную область (3' РО) грызуна, причем вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина так, чтобы грызун вырабатывал антитела IgG, содержащие вариабельные домены, полученные из генного сегмента V_H человека, генного сегмента D_H человека и генного сегмента J_H человека, и константные домены тяжелой цепи, полученные из модифицированного генного сегмента C_H.

[0912] В типовом варианте осуществления 618 в данном документе предложен способ создания грызуна, содержащего в своем геноме: сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H человека, генный сегмент D_H человека и генный сегмент J_H человека; (ii) интронный энхансер (E_i) человека; (iii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую: (a) генный сегмент C_µ человека; (b) генный сегмент C_δ человека; (c) генный сегмент C_γ3 человека; (d) генный сегмент C_γ1 человека; и (iv) 3' регуляторную область (3' РО) грызуна, при этом способ включает модификацию генома грызуна так, чтобы он содержал сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H человека, генный сегмент D_H человека и генный сегмент J_H человека; (ii) интронный энхансер (E_i) человека; (iii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую: (a) генный сегмент C_µ человека; (b) генный сегмент C_δ человека; (c) генный сегмент C_γ3 человека; (d) генный сегмент C_γ1 человека; и (iv) 3' регуляторную область (3' РО) грызуна, причем вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина так, чтобы грызун вырабатывал антитела IgG, содержащие полностью человеческую тяжелую цепь.

[0913] В типовом варианте осуществления 619 в данном документе предложен способ создания грызуна, содержащего в своем геноме: сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H человека, генный сегмент D_H человека и генный сегмент J_H человека; (ii) интронный энхансер (E_i) человека; (iii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую: (a) генный сегмент C_µ человека; (b) генный сегмент C_δ человека; (c) генный сегмент C_γ3 человека; (d) генный сегмент C_γ1 человека; (c) генный сегмент C_γ2 человека; (d) генный сегмент C_γ4 человека; и (iv) 3' регуляторную область (3' РО) грызуна, при этом способ включает модификацию генома грызуна так, чтобы он содержал сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H человека, генный сегмент D_H человека и генный сегмент J_H человека; (ii) интронный энхансер (E_i) человека; (iii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую: (a) генный сегмент C_µ человека; (b) генный сегмент C_δ человека; (c) генный сегмент C_γ3 человека; (d) генный сегмент C_γ1 человека; (c) генный сегмент C_γ2 человека; (d) генный сегмент C_γ4 человека; и (iv) 3' регуляторную область (3' РО) грызуна, причем вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина так, чтобы грызун вырабатывал антитела IgG, содержащие полностью человеческую тяжелую цепь.

[0914] В типовом варианте осуществления 620 в данном документе предложен способ создания грызуна, содержащего в своем геноме: сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H грызуна, генный сегмент D_H грызуна и генный сегмент J_H грызуна; (ii) интронный энхансер (E_i) грызуна; (iii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую: (a) генный сегмент C_µ человека; (b) генный сегмент C_δ человека; (c) генный сегмент C_γ3 человека; (d) генный сегмент C_γ1 человека; и (iv) 3' регуляторную область (3' РО) грызуна, при этом способ включает модификацию генома грызуна так, чтобы он содержал сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H грызуна, генный сегмент D_H грызуна и генный сегмент J_H грызуна; (ii) интронный энхансер (E_i) грызуна; (iii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую: (a) генный сегмент C_µ человека; (b) генный сегмент C_δ человека; (c) генный сегмент C_γ3 человека; (d) генный сегмент C_γ1 человека; и (iv) 3’ регуляторную область (3' РО) грызуна, причем вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина так, чтобы грызун вырабатывал антитела IgG, содержащие тяжелую цепь, содержащую вариабельный домен грызуна и константный домен человека.

[0915] В типовом варианте осуществления 621 в данном документе предложен способ создания грызуна, содержащего в своем геноме: сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H грызуна, генный сегмент D_H грызуна и генный сегмент J_H грызуна; (ii) интронный энхансер (E_i) грызуна; (iii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую: (a) генный сегмент C_µ человека; (b) генный сегмент C_δ человека; (c) генный сегмент C_γ3 человека; (d) генный сегмент C_γ1 человека; (c) генный сегмент C_γ2 человека; (d) генный сегмент C_γ4 человека; и (iv) 3' регуляторную область (3' РО) грызуна, при этом способ включает модификацию генома грызуна так, чтобы он содержал сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H грызуна, генный сегмент D_H грызуна и генный сегмент J_H грызуна; (ii) интронный энхансер (E_i) грызуна; (iii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую: (a) генный сегмент C_µ человека; (b) генный сегмент C_δ человека; (c) генный сегмент C_γ3 человека; (d) генный сегмент C_γ1 человека; (c) генный сегмент C_γ2 человека; (d) генный сегмент C_γ4 человека; и (iv) 3' регуляторную область (3' РО) грызуна, причем вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина так, чтобы грызун вырабатывал антитела IgG, содержащие тяжелую цепь, содержащую вариабельный домен грызуна и константный домен человека.

[0916] В типовом варианте осуществления 622 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 614–621, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина расположен в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина.

[0917] В типовом варианте осуществления 623 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 622, отличающийся тем, что сконструированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина замещает весь или часть эндогенного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина.

[0918] В типовом варианте осуществления 624 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 614–623, отличающийся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина.

[0919] В типовом варианте осуществления 625 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 614–623, отличающийся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина.

[0920] В типовом варианте осуществления 626 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–625, дополнительно включающий модификацию генома грызуна так, чтобы он дополнительно содержал в геноме: сконструированный локус цепи каппа (κ) иммуноглобулина, который содержит: (1) вариабельную область цепи κ иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_κ человека и генный сегмент J_κ человека; и (2) константную область цепи κ иммуноглобулина, содержащую генный сегмент C_κ человека, причем вариабельная область цепи κ иммуноглобулина функционально связана с константной областью цепи κ иммуноглобулина так, чтобы грызун вырабатывал антитела, содержащие вариабельные домены легкой цепи, полученные из генного сегмента V_κ человека и генного сегмента J_κ человека, и константные домены легкой цепи, полученные из генного сегмента C_κ человека.

[0921] В типовом варианте осуществления 627 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 626, отличающийся тем, что сконструированный локус цепи κ иммуноглобулина дополнительно содержит интронный энхансер κ (E_κi) грызуна.

[0922] В типовом варианте осуществления 628 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 626, отличающийся тем, что сконструированный локус цепи κ иммуноглобулина дополнительно содержит интронный энхансер κ (E_κi) человека.

[0923] В типовом варианте осуществления 629 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 626–628, отличающийся тем, что сконструированный локус цепи κ иммуноглобулина дополнительно содержит 3' энхансер κ (E_κ3') грызуна.

[0924] В типовом варианте осуществления 630 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 626–628, отличающийся тем, что сконструированный локус цепи κ иммуноглобулина дополнительно содержит 3' энхансер κ (E_κ3') человека.

[0925] В типовом варианте осуществления 631 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 626–630, отличающийся тем, что вариабельная область цепи κ иммуноглобулина содержит по меньшей мере 6 генных сегментов V_κ человека.

[0926] В типовом варианте осуществления 632 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 626–631, отличающийся тем, что вариабельная область цепи κ иммуноглобулина содержит все генные сегменты J_κ человека.

[0927] В типовом варианте осуществления 633 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 626–632, отличающийся тем, что сконструированный локус цепи κ иммуноглобулина расположен в эндогенном локусе цепи κ иммуноглобулина.

[0928] В типовом варианте осуществления 634 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 633, отличающийся тем, что сконструированный локус цепи κ иммуноглобулина замещает весь или часть эндогенного локуса цепи κ иммуноглобулина.

[0929] В типовом варианте осуществления 635 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 626–634, отличающийся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса цепи κ иммуноглобулина.

[0930] В типовом варианте осуществления 636 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 626–634, отличающийся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса цепи κ иммуноглобулина.

[0931] В типовом варианте осуществления 637 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–636, дополнительно содержащий в геноме: сконструированный локус цепи лямбда (λ) иммуноглобулина, который содержит: генный сегмент V_λ человека, генный сегмент J_λ человека и генный сегмент C_λ человека, причем генный сегмент V_λ человека и генный сегмент J_λ человека функционально связаны с генным сегментом C_λ человека так, чтобы грызун вырабатывал антитела, содержащие вариабельные домены легкой цепи, полученные из генного сегмента V_λ человека и генного сегмента J_λ человека, и константные домены легкой цепи, полученные из генного сегмента C_λ человека.

[0932] В типовом варианте осуществления 638 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 637, отличающийся тем, что генный сегмент C_λ человека представляет собой генный сегмент C_λ1 человека.

[0933] В типовом варианте осуществления 639 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 638, отличающийся тем, что генный сегмент J_λ человека представляет собой генный сегмент J_λ1 человека.

[0934] В типовом варианте осуществления 640 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 637, отличающийся тем, что генный сегмент C_λ человека представляет собой генный сегмент C_λ2 человека.

[0935] В типовом варианте осуществления 641 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 640, отличающийся тем, что генный сегмент J_λ человека представляет собой генный сегмент J_λ2 человека.

[0936] В типовом варианте осуществления 642 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 637, отличающийся тем, что генный сегмент C_λ человека представляет собой генный сегмент C_λ3 человека.

[0937] В типовом варианте осуществления 643 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 642, отличающийся тем, что генный сегмент J_λ человека представляет собой генный сегмент J_λ3 человека.

[0938] В типовом варианте осуществления 644 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 637, отличающийся тем, что генный сегмент C_λ человека представляет собой генный сегмент C_λ6 человека.

[0939] В типовом варианте осуществления 645 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 644, отличающийся тем, что генный сегмент J_λ человека представляет собой генный сегмент J_λ6 человека.

[0940] В типовом варианте осуществления 646 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 637, отличающийся тем, что генный сегмент J_λ человека представляет собой генный сегмент J_λ7 человека.

[0941] В типовом варианте осуществления 647 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 637–646, отличающийся тем, что сконструированный локус цепи λ иммуноглобулина содержит генный сегмент C_λ1 человека, генный сегмент C_λ2 человека, генный сегмент C_λ3 человека, генный сегмент C_λ6 человека и генный сегмент C_λ1 грызуна.

[0942] В типовом варианте осуществления 648 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 647, отличающийся тем, что сконструированный локус цепи λ иммуноглобулина содержит генный сегмент J_λ1 человека, генный сегмент J_λ2 человека, генный сегмент J_λ3 человека, генный сегмент J_λ6 человека и генный сегмент J_λ7 человека.

[0943] В типовом варианте осуществления 649 в данном документе предложена ЭС-клетка грызуна по варианту осуществления 648, отличающаяся тем, что сконструированный локус цепи λ содержит кластер генных сегментов J_λ1 – C_λ1 человека, кластер генных сегментов J_λ2 – C_λ2 человека, кластер генных сегментов J_λ3 – C_λ3 человека, кластер генных сегментов J_λ6 – C_λ6 человека и кластер генных сегментов J_λ7 человека – C_λ1 грызуна.

[0944] В типовом варианте осуществления 650 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 637–649, отличающийся тем, что сконструированный локус цепи λ иммуноглобулина содержит по меньшей мере 7 генных сегментов V_λ человека.

[0945] В типовом варианте осуществления 651 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 637–650, отличающийся тем, что сконструированный локус цепи λ иммуноглобулина дополнительно содержит энхансер 2.4 λ грызуна.

[0946] В типовом варианте осуществления 652 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 637–651, отличающийся тем, что сконструированный локус цепи λ иммуноглобулина дополнительно содержит 3' энхансер λ грызуна.

[0947] В типовом варианте осуществления 653 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 637–652, отличающийся тем, что сконструированный локус цепи λ иммуноглобулина дополнительно содержит энхансер 3.1 λ грызуна.

[0948] В типовом варианте осуществления 654 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 637–653, отличающийся тем, что сконструированный локус цепи λ иммуноглобулина дополнительно содержит 3' энхансер λ человека.

[0949] В типовом варианте осуществления 655 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 637–654, отличающийся тем, что сконструированный локус цепи λ иммуноглобулина расположен в эндогенном локусе цепи λ иммуноглобулина.

[0950] В типовом варианте осуществления 656 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 655, отличающийся тем, что сконструированный локус цепи λ иммуноглобулина замещает весь или часть эндогенного локуса цепи λ иммуноглобулина.

[0951] В типовом варианте осуществления 657 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 637–656, отличающийся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса цепи λ иммуноглобулина.

[0952] В типовом варианте осуществления 658 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 637–656, отличающийся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса цепи λ иммуноглобулина.

[0953] В типовом варианте осуществления 659 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–658, дополнительно содержащий в геноме сконструированный локус неонатального Fc-рецептора (FcRn), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcRn, содержащий внеклеточный домен человека.

[0954] В типовом варианте осуществления 660 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 659, отличающийся тем, что полипептид FcRn дополнительно содержит трансмембранный домен грызуна.

[0955] В типовом варианте осуществления 661 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 659, отличающийся тем, что полипептид FcRn дополнительно содержит трансмембранный домен человека.

[0956] В типовом варианте осуществления 662 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 659–661, отличающийся тем, что полипептид FcRn дополнительно содержит цитоплазматический домен грызуна.

[0957] В типовом варианте осуществления 663 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 659–661, отличающийся тем, что полипептид FcRn дополнительно содержит цитоплазматический домен человека.

[0958] В типовом варианте осуществления 664 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 659–663, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcRn, расположена в эндогенном локусе FcRn грызуна.

[0959] В типовом варианте осуществления 665 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 664, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcRn, замещает весь или часть эндогенного гена FcRn грызуна.

[0960] В типовом варианте осуществления 666 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 665, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая внеклеточный домен FcRn, замещает эндогенную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую внеклеточный домен FcRn грызуна.

[0961] В типовом варианте осуществления 667 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 659–666, отличающийся тем, что грызун не экспрессирует FcRn грызуна.

[0962] В типовом варианте осуществления 668 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 659–667, отличающийся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса FcRn.

[0963] В типовом варианте осуществления 669 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 659–667, отличающийся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса FcRn.

[0964] В типовом варианте осуществления 670 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 659–669, дополнительно содержащий в геноме сконструированный локус β-2-микроглобулина (β2M), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую человеческий или гуманизированный полипептид β-2-микроглобулина (β2M).

[0965] В типовом варианте осуществления 671 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 670, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая человеческий или гуманизированный полипептид β2M, расположена в эндогенном локусе β2M грызуна.

[0966] В типовом варианте осуществления 672 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 671, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая человеческий или гуманизированный полипептид β2M, замещает весь или часть эндогенного гена β2M грызуна.

[0967] В типовом варианте осуществления 673 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 670–672, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты содержит экзоны 2–4 гена β2M человека.

[0968] В типовом варианте осуществления 674 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 670–673, отличающийся тем, что грызун не экспрессирует полипептид β2M грызуна.

[0969] В типовом варианте осуществления 675 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 560–674, отличающийся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса β2M.

[0970] В типовом варианте осуществления 676 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 560–674, отличающийся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса β2M.

[0971] В типовом варианте осуществления 677 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–676, дополнительно содержащий в геноме сконструированный локус Fc-эпсилон-рецептора 1 альфа (FcεR1α), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcεR1α, содержащий внеклеточный домен человека.

[0972] В типовом варианте осуществления 678 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 677, отличающийся тем, что полипептид FcεR1α дополнительно содержит трансмембранный домен грызуна.

[0973] В типовом варианте осуществления 679 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 677, отличающийся тем, что полипептид FcεR1α дополнительно содержит трансмембранный домен человека.

[0974] В типовом варианте осуществления 680 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 677–679, отличающийся тем, что полипептид FcεR1α дополнительно содержит цитоплазматический домен грызуна.

[0975] В типовом варианте осуществления 681 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 677–679, отличающийся тем, что полипептид FcεR1α дополнительно содержит цитоплазматический домен человека.

[0976] В типовом варианте осуществления 682 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 677–681, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcεR1α, расположена в эндогенном локусе FcεR1α грызуна.

[0977] В типовом варианте осуществления 683 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 682, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcεR1α, замещает весь или часть эндогенного гена FcεR1α грызуна.

[0978] В типовом варианте осуществления 684 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 683, отличающийся тем, что полипептид FcεR1α содержит внеклеточный домен человека, трансмембранный домен человека и цитоплазматический домен человека.

[0979] В типовом варианте осуществления 685 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 677, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая внеклеточный домен FcεR1α человека, замещает эндогенную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую внеклеточный домен FcεR1α грызуна.

[0980] В типовом варианте осуществления 686 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 677–685, отличающийся тем, что грызун не экспрессирует FcεR1α грызуна.

[0981] В типовом варианте осуществления 687 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 677–686, отличающийся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса FcεR1α.

[0982] В типовом варианте осуществления 688 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 677–686, отличающийся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса FcεR1α.

[0983] В типовом варианте осуществления 689 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–688, дополнительно содержащий в геноме сконструированный локус Fc-гамма-рецептора 1a (FcγR1a), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcγR1a, содержащий внеклеточный домен человека.

[0984] В типовом варианте осуществления 690 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 689, отличающийся тем, что полипептид FcγR1a дополнительно содержит трансмембранный домен грызуна.

[0985] В типовом варианте осуществления 691 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 689, отличающийся тем, что полипептид FcγR1a дополнительно содержит трансмембранный домен человека.

[0986] В типовом варианте осуществления 692 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 689–691, отличающийся тем, что полипептид FcγR1a дополнительно содержит цитоплазматический домен грызуна.

[0987] В типовом варианте осуществления 693 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 689–691, отличающийся тем, что полипептид FcγR1a дополнительно содержит цитоплазматический домен человека.

[0988] В типовом варианте осуществления 694 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 689–693, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγR1a, расположена в эндогенном локусе FcγR1a грызуна.

[0989] В типовом варианте осуществления 695 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 694, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγR1a, замещает весь или часть эндогенного гена FcγR1a грызуна.

[0990] В типовом варианте осуществления 696 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 689, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая внеклеточный домен FcγR1a человека, замещает эндогенную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую внеклеточный домен FcγR1a грызуна.

[0991] В типовом варианте осуществления 697 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 689–696, отличающийся тем, что грызун не экспрессирует FcγR1a грызуна.

[0992] В типовом варианте осуществления 698 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 689–697, отличающийся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса FcγR1a.

[0993] В типовом варианте осуществления 699 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 689-697, отличающийся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса FcγR1a.

[0994] В типовом варианте осуществления 700 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–699, дополнительно содержащий в геноме сконструированный локус Fc-гамма-рецептора 2a (FcγR2a), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcγR2a человека.

[0995] В типовом варианте осуществления 701 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 700, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγR2a, расположена в эндогенном локусе низкоаффинного FcγR грызуна.

[0996] В типовом варианте осуществления 702 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 701, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγR2a человека, замещает весь или часть эндогенного гена низкоаффинного FcγR грызуна.

[0997] В типовом варианте осуществления 703 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 700–702, отличающийся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса FcγR2a.

[0998] В типовом варианте осуществления 704 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 700–702, отличающийся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса FcγR2a.

[0999] В типовом варианте осуществления 705 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–704, дополнительно содержащий в геноме сконструированный локус Fc-гамма-рецептора 2b (FcγR2b), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcγR2b человека.

[0100] В типовом варианте осуществления 706 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 705, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγR2b, расположена в эндогенном локусе низкоаффинного FcγR грызуна.

[0101] В типовом варианте осуществления 707 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 706, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγR2b человека, замещает весь или часть эндогенного гена низкоаффинного FcγR грызуна.

[0102] В типовом варианте осуществления 708 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 705–707, отличающийся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса FcγR2b.

[0103] В типовом варианте осуществления 709 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 705–707, отличающийся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса FcγR2b.

[0104] В типовом варианте осуществления 710 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–709, дополнительно содержащий в геноме сконструированный локус Fc-гамма-рецептора 3a (FcγR3a), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcγR3a человека.

[0105] В типовом варианте осуществления 711 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 710, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγR3a, расположена в эндогенном локусе низкоаффинного FcγR грызуна.

[0106] В типовом варианте осуществления 712 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 711, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγR3a человека, замещает весь или часть эндогенного гена низкоаффинного FcγR грызуна.

[0107] В типовом варианте осуществления 713 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 710–712, отличающийся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса FcγR3a.

[0108] В типовом варианте осуществления 714 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 710–712, отличающийся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса FcγR3a.

[0109] В типовом варианте осуществления 715 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–714, дополнительно содержащий в геноме сконструированный локус Fc-гамма-рецептора 3b (FcγR3b), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcγR3b человека.

[01010] В типовом варианте осуществления 716 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 715, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγR3b, расположена в эндогенном локусе низкоаффинного FcγR грызуна.

[01011] В типовом варианте осуществления 717 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 716, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγR3b человека, замещает весь или часть эндогенного гена низкоаффинного FcγR грызуна.

[01012] В типовом варианте осуществления 718 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 715–717, отличающийся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса FcγR3b.

[01013] В типовом варианте осуществления 719 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 715–717, отличающийся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса FcγR3b.

[01014] В типовом варианте осуществления 720 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–719, дополнительно содержащий в геноме сконструированный локус Fc-гамма-рецептора 2c (FcγR2c), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcγR2c человека.

[01015] В типовом варианте осуществления 721 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 720, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγR2c, расположена в эндогенном локусе низкоаффинного FcγR грызуна.

[01016] В типовом варианте осуществления 722 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 721, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγR2c человека, замещает весь или часть эндогенного гена низкоаффинного FcγR грызуна.

[01017] В типовом варианте осуществления 723 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 720–722, отличающийся тем, что грызун не экспрессирует FcγR2c грызуна.

[01018] В типовом варианте осуществления 724 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 720–723, отличающийся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса FcγR2c.

[01019] В типовом варианте осуществления 725 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 720–723, отличающийся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса FcγR2c.

[01020] В типовом варианте осуществления 726 в данном документе предложен способ создания грызуна, содержащего в геноме сконструированный локус неонатального Fc-рецептора (FcRn), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcRn, содержащий внеклеточный домен человека, при этом способ включает модификацию генома грызуна так, чтобы он содержал локус неонатального Fc-рецептора (FcRn), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcRn, содержащий внеклеточный домен человека,.

[01021] В типовом варианте осуществления 727 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 726, отличающийся тем, что полипептид FcRn дополнительно содержит трансмембранный домен грызуна.

[01022] В типовом варианте осуществления 728 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 726, отличающийся тем, что полипептид FcRn дополнительно содержит трансмембранный домен человека.

[01023] В типовом варианте осуществления 729 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 726–728, отличающийся тем, что полипептид FcRn дополнительно содержит цитоплазматический домен грызуна.

[01024] В типовом варианте осуществления 730 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 726–728, отличающийся тем, что полипептид FcRn дополнительно содержит цитоплазматический домен человека.

[01025] В типовом варианте осуществления 731 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 726–730, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcRn, расположена в эндогенном локусе FcRn грызуна.

[01026] В типовом варианте осуществления 732 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 731, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcRn, замещает весь или часть эндогенного гена FcRn грызуна.

[01027] В типовом варианте осуществления 733 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 732, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая внеклеточный домен FcRn человека, замещает эндогенную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую внеклеточный домен FcRn грызуна.

[01028] В типовом варианте осуществления 734 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 726–733, отличающийся тем, что грызун не экспрессирует FcRn грызуна.

[01029] В типовом варианте осуществления 735 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 726–734, отличающийся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса FcRn.

[01030] В типовом варианте осуществления 736 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 726–734, отличающийся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса FcRn.

[01031] В типовом варианте осуществления 737 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 726–736, дополнительно содержащий в геноме сконструированный локус β-2-микроглобулина (β2M), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую человеческий или гуманизированный полипептид β-2-микроглобулина (β2M).

[01032] В типовом варианте осуществления 738 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 737, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая человеческий или гуманизированный полипептид β2M, расположена в эндогенном локусе β2M грызуна.

[01033] В типовом варианте осуществления 739 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 738, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая человеческий или гуманизированный полипептид β2M, замещает весь или часть эндогенного гена β2M грызуна.

[01034] В типовом варианте осуществления 740 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 737–739, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты содержит экзоны 2–4 гена β2M человека.

[01035] В типовом варианте осуществления 741 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 737–740, отличающийся тем, что грызун не экспрессирует полипептид β2M грызуна.

[01036] В типовом варианте осуществления 742 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 737–741, отличающийся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса β2M.

[01037] В типовом варианте осуществления 743 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 737–741, отличающийся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса β2M.

[01038] В типовом варианте осуществления 744 в данном документе предложен способ создания грызуна, содержащего в геноме сконструированный локус Fc-эпсилон-рецептора 1 альфа (FcεR1α), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcεR1α, содержащий внеклеточный домен человека, при этом способ включает модификацию генома грызуна так, чтобы он содержал сконструированный локус FcεR1α, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcεR1α, содержащий внеклеточный домен человека,.

[01039] В типовом варианте осуществления 745 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 744, отличающийся тем, что полипептид FcεR1α дополнительно содержит трансмембранный домен грызуна.

[01040] В типовом варианте осуществления 746 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 744, отличающийся тем, что полипептид FcεR1α дополнительно содержит трансмембранный домен человека.

[01041] В типовом варианте осуществления 747 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 744–746, отличающийся тем, что полипептид FcεR1α дополнительно содержит цитоплазматический домен грызуна.

[01042] В типовом варианте осуществления 748 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 744–746, отличающийся тем, что полипептид FcεR1α дополнительно содержит цитоплазматический домен человека.

[01043] В типовом варианте осуществления 749 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 744–748, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcεR1α, расположена в эндогенном локусе FcγR1 грызуна.

[01044] В типовом варианте осуществления 750 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 749, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcεR1α, замещает весь или часть эндогенного гена FcεR1α грызуна.

[01045] В типовом варианте осуществления 751 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 750, отличающийся тем, что полипептид FcεR1α содержит внеклеточный домен человека, трансмембранный домен человека и цитоплазматический домен человека.

[01046] В типовом варианте осуществления 752 в данном документе предложен способ по варианту осуществления 744, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая внеклеточный домен FcεR1α человека, замещает эндогенную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую внеклеточный домен FcεR1α грызуна.

[01047] В типовом варианте осуществления 753 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 744–752, отличающийся тем, что грызун не экспрессирует FcεR1α грызуна.

[01048] В типовом варианте осуществления 754 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 744–753, отличающийся тем, что грызун является гетерозиготным в отношении сконструированного локуса FcεR1α.

[01049] В типовом варианте осуществления 755 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 744–753, отличающийся тем, что грызун является гомозиготным в отношении сконструированного локуса FcεR1α.

[01050] В типовом варианте осуществления 756 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–755, отличающийся тем, что грызун представляет собой мышь.

[01051] В типовом варианте осуществления 757 в данном документе предложен способ по любому из вариантов осуществления 519–755, отличающийся тем, что грызун представляет собой крысу.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Генетическое конструирование мышей, содержащих гуманизированные константные области иммуноглобулина

[01052] Данный пример иллюстрирует типовые способы конструирования ряда нацеленных векторов для вставки в геном отличного от человека животного, такого как грызун (например, мышь). Описанные в данном примере способы демонстрируют получение отличных от человека животных, чьи геномы содержат сконструированную константную область тяжелой цепи иммуноглобулина и/или сконструированную константную область легкой цепи (каппа или лямбда). В частности, данный пример демонстрирует конструкцию нацеленных векторов для конструирования константных областей тяжелой цепи иммуноглобулина так, чтобы отличные от человека животные экспрессировали и/или вырабатывали антитела, которые содержат тяжелые цепи иммуноглобулина, имеющие вариабельные домены человека и константные домены, которые являются человеческими, полностью или частично (например, содержат часть, принадлежащую человеку, и часть, принадлежащую грызуну). Также он демонстрирует конструкцию нацеленных векторов для конструирования константных областей легкой цепи иммуноглобулина так, чтобы отличные от человека животные экспрессировали и/или вырабатывали антитела, которые содержат легкие цепи иммуноглобулина, имеющие вариабельные домены человека и константные домены, которые являются человеческими, полностью или частично (например, содержат часть, принадлежащую человеку, и часть, принадлежащую грызуну). Кроме того, предполагается, что такие антитела образуют функциональные B-клеточные рецепторы на поверхности B-клеток в организме отличного от человека животного. Схематическое обобщение различных линий грызунов, содержащих выбранные сконструированные константные области тяжелой цепи иммуноглобулина, приведено на Фиг. 1A, а содержащих выбранные сконструированные константные области тяжелой цепи иммуноглобулина, приведено на Фиг. 2A. Для упрощения генные сегменты V_H человека не показаны; только небольшое число генных сегментов представлено схематически; полный репертуар возможных присутствующих генных V(D)J смотрите на imgt.org; в Lefranc, M.-P., Exp. Clin. Immunogenet., 18, 100-116 (2001); Lefranc, M.-P. и Lefranc, G., The Immunoglobulin FactsBook, Academic Press, London, 458 страниц (2001); патентах США №№ 8642835 и 8697940; или Macdonald et al. PNAS (2014) vol. 111 (14):5147-5152, которые все в полном объеме включены в данный документ посредством ссылки.

[01053] ДНК-конструкции и нацеленные векторы, содержащие последовательности, кодирующие константную область иммуноглобулина человека, для вставки в выбранные константные области иммуноглобулина грызунов, создавали из человеческих и мышиных бактериальных искусственных хромосом (BAC, англ. «bacterial artificial chromosome»), используя технологию VELOCIGENE® (смотрите, например, патент США № 6586251 и Valenzuela et al., 2003, Nature Biotech. 21(6):652-9; включенные в данный документ посредством ссылки) и методики молекулярной биологии, известные в данной области техники. Способы, описанные в данном примере можно использовать для применения любой кодирующей последовательности константной области иммуноглобулина человека или комбинации кодирующих последовательностей (или фрагментов последовательностей) при необходимости.

[01054] Нацеленную ДНК BAC использовали для электропорации мышиных ЭС-клеток для создания модифицированных ЭС-клеток для создания мышей, которые экспрессируют последовательности, кодирующие человеческую или химерную мышиную/человеческую константную область иммуноглобулина, как проиллюстрировано на Фиг. 1A и 2A. ЭС-клетки, содержащие соответствующие модификации, идентифицировали с помощью количественного анализа TAQMAN™ (смотрите, например, Lie and Petropoulos, 1998. Curr. Opin. Biotechnology 9:43-48, включенную в данный документ посредством ссылки). Разрабатывали специальные наборы праймеров и зонды для обнаружения вставки человеческих последовательностей (приобретение аллели, ПА) и удаления мышиных последовательностей (утрата аллели, УА).

[01055] Целевые ЭС-клетки использовали в качестве донорских ЭС-клеток и вносили в мышиный эмбрион на 8-клеточной стадии методом VELOCIMOUSE® (смотрите, например, патент США № 7294754 и Poueymirou et al. (2007) F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses Nature Biotech. 25(1):91-99). Мышей VELOCIMICE® (мышей F0, полностью полученных из донорских ЭС-клеток), независимо несущих модифицированную аллель, идентифицировали с помощью генотипирования, используя анализ модификации аллели, который позволяет обнаруживать наличие уникальных генных последовательностей, например, человеческих генных последовательностей. Отобранных гетерозиготных мышей, несущих модифицированную аллель, скрещивали до гомозиготности.

Пример 1.1: Генетическое конструирование мышей, содержащих человеческие вариабельные области тяжелой цепи и химерные или полностью человеческие константные области тяжелой цепи

[01056] Для создания грызунов, которых можно использовать для тестирования человеческих антител (например, для исследований фармакокинетики и доз терапевтических антител), применяли несколько подходов. В первом подходе создавали мышей, которые содержали человеческие вариабельные области тяжелой цепи и константные области тяжелой цепи, которые содержали химерные (последовательности, кодирующие C_H1-H-C_H2-C_H3 человека, и последовательности, кодирующие M1-M2 мыши) или полностью человеческие (последовательности, кодирующие C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2) генные сегменты константных областей тяжелой цепи. Таких мышей можно использовать, например, для тестирования терапевтических антител, совпадающих по изотипу с константным доменом иммуноглобулина (т. е. частью C_H1-H-C_H2-C_H3 константного домена), который кодируется модифицированным генным сегментом (например, тестирования антител IgG1 на мышах, содержащих генетически сконструированную константную область IgG1).

[01057] В одном примере создавали мышей, которые содержали последовательности человеческой вариабельной области тяжелой цепи и химерную последовательность константной области (C_H1-H-C_H2-C_H3 человека) человека – (M1-M2 мыши) мыши, причем кодирующая C_H1-H-C_H2-C_H3 последовательность IgG1 человека была функционально связана с кодирующей M1-M2 последовательностью IgG2a мыши в эндогенном локусе IgG2a (Фиг. 1A, мышиный локус 1). Вкратце, конструировали плазмиду, используя фрагмент ДНК, который содержал синтетический ген C_H1-H-C_H2-C_H3 IgG1 человека от Blue Heron и фланкировался областями, перекрывающимися с геном константной области IgG2a мыши. Полученную в результате плазмиду клонировали посредством нескольких этапов расщепления/лигирования/изотермической сборки CRIPSR-Cas9 для создания BAC-клона так, чтобы последовательность C_H1-H-C_H2-C_H3 IgG1 человека была функционально связана с последовательностями, кодирующими трансмембранный и цитоплазматический домены (т. е. экзонами M1 и M2) гена константной области IgG2a мыши. BAC-клон также содержал область переключения IgG2a мыши (Sγ2a) и область переключения IgE мыши (Sε), а также генный сегмент константной области IgE мыши. Этот клон посредством электропорации вносили в мышиные ЭС-клетки для создания модифицированных ЭС-клеток, которые можно было использовать для создания мышей, содержащих локус иммуноглобулина, проиллюстрированный на Фиг. 1A, локус 1, где последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая внеклеточную часть константного домена IgG1 человека, функционально связана с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей соединительную, трансмембранную и цитоплазматическую части константного домена IgG2a мыши в эндогенном локусе IgG2a мыши. Оставшиеся изотипические последовательности константной области тяжелой цепи были полностью мышиными. Мышиные ЭС-клетки, используемые для электропорации, содержали вариабельные генные сегменты тяжелой цепи человека (вариабельные генные сегменты V_H, D и J_H человека), функционально связанные с константной областью тяжелой цепи мыши, включая вставленную последовательность, кодирующую мышиный Adam6; смотрите, например, патенты США №№ 8642835 и 8697940, включенные в данный документ посредством ссылки.

[01058] В другом примере создавали мышей, которые содержали последовательности человеческой вариабельной области тяжелой цепи и полностью человеческую последовательность константной области IgG1 (C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 человека) в эндогенном локусе IgG2a мыши (Фиг. 1A, мышиный локус 2). Вкратце, человеческие последовательности M1-M2 амплифицировали, используя BAC-клон RP11-448n5 (Thermo Fisher Scientific) в качестве матрицы, и за несколько этапов генетического конструирования вносили в BAC-клон, используемый для создания мышиного локуса 1, описанного выше, вместо эндогенной последовательности M1-M2 IgG2a мыши. Полученный в результате BAC-клон для использования при внесении в ЭС-клетки содержал фрагмент ДНК, который содержал последовательности, кодирующие C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 IgG1 человека, области переключения IgG2a (Sγ2a) и IgE (Sε) мыши и генный сегмент константной области IgE мыши. Мыши, созданные из генетически модифицированных ЭС-клеток, содержали локус иммуноглобулина, проиллюстрированный на Фиг. 1A, локус 2, где последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая константный домен IgG1 человека, замещала последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую эндогенный константный домен IgG2a мыши в локусе эндогенного генного сегмента IgG2a мыши. Оставшиеся изотипические последовательности константной области тяжелой цепи были полностью мышиными. Мышиные ЭС-клетки, используемые в данном случае, содержали вариабельные генные сегменты тяжелой цепи человека (вариабельные генные сегменты V_H, D и J_H человека), функционально связанные с константной областью тяжелой цепи мыши, включая вставленную последовательность, кодирующую мышиный Adam6; смотрите, например, патенты США №№ 8642835 и 8697940, включенные в данный документ посредством ссылки.

[01059] В другом примере создавали мышей, которые содержали последовательности человеческой вариабельной области тяжелой цепи и химерную последовательность константной области (C_H1-H-C_H2-C_H3 человека) человека – (M1-M2 мыши) мыши, причем кодирующая C_H1-H-C_H2-C_H3 последовательность IgG4 человека была функционально связана с кодирующей M1-M2 последовательностью IgG1 мыши в эндогенном локусе IgG1 (Фиг. 1A, мышиный локус 3). Вкратце, используя BAC CTD-3034B12 (Thermo Fisher Scientific) в качестве матрицы, конструировали плазмиду, которая содержала фрагмент ДНК, кодирующий C_H1-H-C_H2-C_H3 IgG4 человека, фланкируемый областями, перекрывающимися с геном константной области IgG1 мыши. Полученную в результате плазмиду клонировали посредством нескольких этапов расщепления/лигирования/изотермической сборки CRIPSR-Cas9 в BMQ-263J18 (The Sanger Centre) для создания BAC-клона так, чтобы последовательность C_H1-H-C_H2-C_H3 IgG4 человека была функционально связана с последовательностями, кодирующими трансмембранный и цитоплазматический домены (т. е. экзонами M1 и M2) гена константной области IgG1 мыши. Этот BAC-клон также содержал область переключения IgG1 (Sγ1) мыши и генный сегмент константной области IgG2b мыши. Этот клон посредством электропорации вносили в мышиные ЭС-клетки для создания модифицированных ЭС-клеток для создания мышей, содержащих локус иммуноглобулина, проиллюстрированный на Фиг. 1A, локус 3, где последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая внеклеточную часть константного домена IgG4 человека, функционально связана с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей трансмембранную часть константного домена IgG1 мыши в локусе эндогенного генного сегмента IgG1 мыши. Оставшиеся изотипические последовательности константной области тяжелой цепи были полностью мышиными. Мышиные ЭС-клетки, используемые для электропорации, содержали вариабельные генные сегменты тяжелой цепи человека (вариабельные генные сегменты V_H, D и J_H человека), функционально связанные с константной областью тяжелой цепи мыши, включая вставленную последовательность, кодирующую мышиный Adam6; смотрите, например, патенты США №№ 8642835 и 8697940, включенные в данный документ посредством ссылки.

[01060] В другом примере создавали мышей, которые содержали последовательности человеческой вариабельной области тяжелой цепи и полностью человеческую последовательность константной области IgG4 (C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 человека) в эндогенном локусе IgG1 мыши (Фиг. 1A, мышиный локус 4). Вкратце, человеческие последовательности C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 амплифицировали, используя BAC-клон CTD-3034B12 (Thermo Fisher Scientific) в качестве матрицы, и за несколько этапов генетического конструирования вносили в BAC-клон BMQ-263J18 (The Sanger Centre) вместо эндогенной последовательности C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 IgG1 мыши. Полученный в результате BAC-клон для использования при внесении в ЭС-клетки содержал фрагмент ДНК, который содержал последовательности, кодирующие C_H1-H-C_H2-C_H3-M1-M2 IgG4 человека, и область переключения IgG1 (Sγ1) мыши и генный сегмент константной области IgG2b мыши. Мыши, созданные из генетически модифицированных ЭС-клеток, содержали локус иммуноглобулина, проиллюстрированный на Фиг. 1A, 4, где последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая константный домен IgG4 человека, замещала последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую эндогенный константный домен IgG1 мыши в локусе эндогенного генного сегмента IgG1 мыши. Оставшиеся изотипические последовательности константной области тяжелой цепи были полностью мышиными. Мышиные ЭС-клетки, используемые для электропорации, содержали вариабельные генные сегменты тяжелой цепи человека (вариабельные генные сегменты V_H, D и J_H человека), функционально связанные с константной областью тяжелой цепи мыши, включая вставленную последовательность, кодирующую мышиный Adam6; смотрите, например, патенты США №№ 8642835 и 8697940, включенные в данный документ посредством ссылки.

[01061] Также создавали мышей, которые содержали человеческую вариабельную область тяжелой цепи и константную область, содержащую полностью человеческие генные сегменты IgM, IgD, IgG3 и IgG1 в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина мыши (Фиг. 1A, мышиный 5).

[01062] Чтобы создать конструкцию для нацеливания на мышиные ЭС-клетки, которые содержали человеческие вариабельные области тяжелой цепи и человеческие константные области тяжелой цепи, сначала создавали конструкцию, которая содержала делецию целой константной области IgH мыши (IgM, IgD, IgG3, IgG1, IgG2b, IgG2a, IgE и IgA) между интронным энхансером (Eμ) и 3’ регуляторной областью (3’РО), которую после этого нацеливали на ЭС-клетки VELOCIMMUNE®.

[01063] Вкратце, BAC, обозначенную 3hVh BACvec, ранее описанную в Macdonald et al. PNAS (2014) vol. 111 (14):5147-5152 (включенной в данный документ посредством ссылки), модифицировали путем удаления 3’ гена IgM мыши из 3hVH с помощью бактериальной гомологичной рекомбинации (БГР) и замены кассеты отбора, и удаления 5’ плеча гомологии мыши. 3’ плечо гомологии мыши создавали путем двух БГР-модификаций BAC RP23-351j19 (Thermo Fisher Scientific), которые включали удаление генов IgG2b, IgG2a, IgE и IgA из 5’ конца RP23-351j19, и включение уникальных рестрикционных сайтов. Рестрикционный фрагмент этой второй конструкции лигировали в первую конструкцию для создания конечного LTVEC (MAID6022). MAID6022 содержал от 5’ к 3’: кассету EM7 hyg, IGHD/IGHJ человека, энхансер IgM мыши из BAC CT7-302a07, синтетический линкер, уникальный сайт I-CeuI, кассету lox2372-ub-neo-lox2372 с уникальным сайтом AscI, расположенным 5’ относительно 3’ сайта lox2372, 40,5 т. п. о. область локуса IgH мыши, начинающуюся в 3’ НТО гена IgA и заканчивающуюся ниже 3’ РО, и уникальный сайт PI-SceI.

[01064] Этот вектор обозначили MAID6022 (Фиг. 1B) и использовали для внесения последовательностей вариабельной области тяжелой цепи человека на следующем этапе конструирования.

[01065] После этого человеческую ДНК из BAC RP11-448n5 (Thermo Fisher Scientific) модифицировали путем БГР для обрезки 3’ конца BAC и вставки кассеты lox2372-ub-hyg-lox2372. Эта кассета содержала уникальный сайт AscI, расположенный 5’ относительно 3’ сайта lox2372. Соединение человеческая область-lox2372 находилось на 3,7 т. п. о. ниже сигнала полиА IgG1. Эту конструкцию обозначили VI694. 3’ плечо гомологии мыши получали из мышиной BAC RP23-351j19 Thermo Fisher Scientific посредством нескольких этапов БГР и лигировали в человеческую BAC. Полученный в результате BAC-клон содержал следующие последовательности, перечисленные в Таблице 1:

Таблица 1: Геномные координаты для нацеленного вектора, используемого для создания мышиного локуса 5 (MAID 6993)

Область Геномные координаты (мышь: GRCm38, или человек: GRCh38) т. п. о. 5’ плечо гомологии человека 14: 105888576 - 105862976 (- нить) ~ 33 Человек 14: 105862975-105732864 (- нить) ~ 130 3’ плечо гомологии мыши 12: 113215726 -113256185 (- нить) ~ 40,4

[01066] Полученный в результате нацеленный вектор электропорировали в ЭС-клетки, содержащие вариабельные генные сегменты тяжелой цепи человека, вставленную последовательность, кодирующую мышиный Adam6, и 170 т. п. о. делецию последовательности константной области тяжелой цепи мыши (смотрите Фиг. 1B). После внесения последовательностей константной области человека кассету отбора удаляли, используя рекомбиназу Cre. Варианты соединения различных последовательностей модифицированной аллели мышиного локуса 5 с Фиг. 1A перед удалением кассеты отбора приведены в Таблице 2 ниже.

Таблица 2: Варианты соединения генетически модифицированной аллели мышиного локуса 5

Соединение Последовательность SEQ ID NO: 5’ плечо гомологии человека/ген IgM человека TGGGACTCAGGTTGGGTGCGTCTGATGGAGTAACTGAGCC
TGGGGGCTTGGGGAGCCACATTTGGACGAGATGCCTGAAC 1 Последовательность гена IgG1 человека/AgeI/5’ lox2372 TAACAGAGAATGGAGAATGGCGATGACTTCTACCAAGC ACCGGTATAACTTCGTATAAGGTATCCTATACGAAGTTAT 2 AscI/3’ lox2372/XhoI/3’ последовательность мыши GGCGCGCCATAACTTCGTATAAGGTATCCTATACGAAGTTATCTCGAG
AGGTGGCAGTCATGGAGATGGTGGGGTACAGGGTGGGGGC 3

Обычным шрифтом представлены мышиные последовательности, жирным шрифтом представлены человеческие последовательности, сайты рестрикционных ферментов/последовательности векторов подчеркнуты, а сайты loxp выделены курсивом.

[0100] Мыши, созданные из генетически модифицированных ЭС-клеток, содержали локус иммуноглобулина, проиллюстрированный на Фиг. 1A, 5, где последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая генные сегменты константной области IgM, IgD, IgG3, IgG1 человека, замещала последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую эндогенные генные сегменты константной области тяжелой цепи мыши в эндогенном локусе константной области тяжелой цепи мыши.

[0101] Также создавали мышей, которые содержали дополнительные последовательности константной области тяжелой цепи человека, такие как последовательности IgM, IgD, IgG3, IgG1, IgG2 и IgG4 человека, в эндогенном локусе тяжелой цепи. Эти мыши, проиллюстрированные на Фиг. 1A, мышиный локус 6, содержали человеческую вариабельную область тяжелой цепи и полностью человеческие последовательности IgM, IgD, IgG3, IgG1, IgG2 и IgG4 в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина мыши.

[0102] Вкратце, 42,9 т. п. о. человеческой последовательности ДНК, содержащей последовательности IgG2 и IgG4, получали из человеческой BAC CTD-3034B12 (Thermo Fisher Scientific) и модифицировали посредством нескольких этапов бактериальной гомологичной рекомбинации, расщепления и лигирования для добавления 5’ и 3’ плеч гомологии человека. Геномные координаты для полученного в результате BAC-клона перечислены в Таблице 3 ниже.

Таблица 3: Геномные координаты для нацеленного вектора, используемого для создания мышиного локуса 6 (MAID 20168)

Область Геномные координаты (мышь: GRCm38, или человек: GRCh38) т. п. о. 5’ плечо гомологии человека 14:105732663 – 105751156 (- нить) ~ 18,5 Ген IGG2 и IGG4 человека 14: 105614742 – 105657695 (- нить) ~ 42,9 3’ плечо гомологии мыши 12:113215726 – 113256185 (- нить) ~ 40,4

[01067] Полученный в результате нацеленный вектор электропорировали в ЭС-клетки, содержащие генные сегменты вариабельных областей тяжелой цепи человека и константной области тяжелой цепи IgM, IgD, IgG3 и IgG1 человека мышиного локуса 5, описанного выше (смотрите Фиг. 1C). Различные варианты соединения полученной в результате аллели описаны в Таблице 4 ниже. Кассету отбора удаляли, используя рекомбиназу Cre.

Таблица 4: Варианты соединения генетически модифицированной аллели мышиного локуса 6

Соединение Последовательность SEQ ID NO: 5’ плечо гомологии человека/Mre1/ген IGG2 человека TCTGTGCCTAGTTAACAGAGAATGGAGAATGGCGATGACTTCTACCAAGC CGCCGGCG ACTCATCACCAAGGGGAAGATGCTCAATCATTCATGAGGGATCTGCCCCC 4 Ген IGG4 человека/Age1/5’ lox2372 ATGCTCTTTATCTTATTAACTAAGGTGTCGTAACCAGTTCAAAGTGGAATT ACCGGT
ATAACTTCGTATAAGGTATCCTATACGAAGTTAT 5 3’ lox2372/Not1/3’ РО мыши ATAACTTCGTATAAGGTATCCTATACGAAGTTAT
CTCGAGGCGGCCGC AGGTGGCAGTCATGGAGATGGTGGGGTACAGGGTGGGGGCAGGGGCACTC 6

Обычным шрифтом представлены мышиные последовательности, жирным шрифтом представлены человеческие последовательности, сайты рестрикционных ферментов/последовательности векторов подчеркнуты, а сайты loxp выделены курсивом.

[01068] Мыши, созданные из генетически модифицированных ЭС-клеток, содержали локус иммуноглобулина, проиллюстрированный на Фиг. 1A, 6, где последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая генные сегменты константной области IgM, IgD, IgG3, IgG1, IgG2 и IgG4 человека, замещала последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую эндогенные генные сегменты константной области тяжелой цепи мыши в эндогенном локусе константной области тяжелой цепи мыши.

[01069] Все генетически модифицированные ЭС-клетки, содержащие человеческие вариабельные области тяжелой цепи и химерные или полностью человеческие константные области тяжелой цепи, в этом примере использовали для создания генетически модифицированных мышей, используя описанный выше метод VELOCIMOUSE®.

Пример 1.2: Генетическое конструирование мышей, содержащих мышиные вариабельные области тяжелой цепи и человеческие константные области тяжелой цепи

[01070] Чтобы создать конструкцию для нацеливания на мышиные ЭС-клетки, которые содержали мышиные вариабельные области тяжелой цепи и человеческие константные области тяжелой цепи, сначала создавали конструкцию, которая содержала делецию целой константной области IgH мыши (IgM, IgD, IgG3, IgG1, IgG2b, IgG2a, IgE и IgA) между интронным энхансером (Eμ) и 3’ регуляторной областью (3’РО).

[01071] Вкратце, 5,2 т. п. о. 5’ плечо гомологии мыши амплифицировали методом ПЦР из BAC-клона BMQ-451A16 (The Sanger Centre) и клонировали, используя изотермическую сборку, в плазмиду с точкой начала репликации R6K и кассетой lox2372-ub-neo. Полученная в результате плазмида содержит от 5’ к 3’: 392 п. о. R6K ori, уникальный сайт I-CeuI, 5,2 т. п. о. область локуса IgH мыши, включая DQ52, JH1-4 и Eµ, уникальный сайт NotI, кассету lox2372-ub-neo и уникальный сайт AscI. Эту плазмиду расщепляли, а фрагмент I-CeuI-AscI плазмиды лигировали в вектор, полученный из мышиного BAC-клона RP23-351j19 (Thermo Fisher Scientific), который содержал от 5’ к 3’: уникальный сайт I-CeuI, кассету lox2372-ub-hyg-lox2372 с уникальным сайтом AscI, расположенным 5’ относительно 3’ сайта lox2372, 40,5 т. п. о. область локуса IgH мыши, начинающуюся в 3’ НТО гена IgA и заканчивающуюся ниже 3’ РО, уникальный сайт PI-SceI и кассету устойчивости к спектиномицину (Spec). Полученный в результате вектор содержал от 5’ к 3’: уникальный сайт I-CeuI, 5,2 т. п. о. 5’ плечо гомологии мыши (включая DQ52, JH1-4 и Eµ), уникальный сайт NotI, кассету lox2372-ub-neo-lox2372, 40,5 т. п. о. 3’ плечо гомологии мыши (включая 3’РО IgH), уникальный сайт PI-SceI и кассету Spec. Этот вектор (проиллюстрированный как MAID6577 на Фиг. 1D) использовали для внесения последовательностей вариабельной области тяжелой цепи человека на следующем этапе конструирования, а также для электропорации в мышиные ЭС-клетки для создания ЭС-клеток с делецией целой константной области IgH мыши.

[01072] На следующем этапе конструирования человеческий BAC-клон RP11-448n5 модифицировали с помощью БГР для замещения 5,3 т. п. о. человеческой вставки плюс кассета CM кассетой lox2372-ub-hyg-lox2372. Эта кассета содержала уникальный сайт AscI, расположенный 5’ относительно 3’ сайта lox2372. Соединение человеческая область-lox2372 находилось на 3,7 т. п. о. ниже сигнала полиА IgG1. Эту конструкцию обозначили VI694. После этого VI694 модифицировали с помощью БГР для замещения 34,3 т. п. о. человеческой вставки кассетой CM и уникальным сайтом NotI site. Соединение NotI-человеческая последовательность находилось 3’ относительно Eµ и 5’ относительно области переключения IgM (Sµ). Эту конструкцию обозначили VI695. 131,7 т. п. о. фрагмент NotI-AscI из VI695 (человеческая вставка и кассета lox2372-ub-hyg) лигировали в MAID6577, чтобы получить конечный нацеленный вектор MAID6739 (мышиный локус 7 на Фиг. 1A). MAID6739 содержит от 5’ к 3’: уникальный сайт I-CeuI, 5,2 т. п. о. 5’ плечо гомологии мыши (включая DQ52, JH1-4 и Eµ), уникальный сайт NotI, 130 т. п. о. область локуса константного гена IgH человека (включая гены IgM, IgD, IgG3 и IgG1), кассету lox2372-ub-hyg-lox2372, a 40,5 т. п. о. 3’ плечо гомологии мыши (с началом в 3’ НТО IgA и концом в 3’ от 3’ РО), уникальный сайт PI-SceI и кассету Spec. Геномные координаты для нацеленного вектора приведены в Таблице 5, а соединительные последовательности модифицированной аллели перечислены в Таблице 6.

Таблица 5: Геномные координаты для нацеленного вектора, используемого для создания мышиного локуса 7 (MAID 6739)

Область Геномные координаты (мышь: GRCm38, или человек: GRCh38) т. п. о. 5’ плечо гомологии мыши Chr12: 113432184 – 113426948 (- нить) ~ 5,2 Область IgHC человека Chr14: 105861617 – 105732663 (- нить) ~ 130 3’ плечо гомологии мыши Chr12: 113256185 – 113215726 (- нить) ~ 40,5

Таблица 6: Варианты соединения генетически модифицированной аллели мышиного локуса 7

Соединение Последовательность SEQ ID NO 5’ плечо мыши/IgHC человека TTAAATGAATGCAATTATCTAGACTTATTTCAGTTGAACATGCTGGTTGG
GCGGCCGC
TGGCATAAGAGAAAACTCAATCAGATAGTGCTGAAGACAGGACTGTGGAG 7 IgHC человека/5’ lox2372 TCTGTGCCTAGTTAACAGAGAATGGAGAATGGCGATGACTTCTACCAAGC
ACCGGT
ATAACTTCGTATAAGGTATCCTATACGAAGTTAT 8 3’ lox2372/3’ плечо мыши ATAACTTCGTATAAGGTATCCTATACGAAGTTAT
CTCGAG
AGGTGGCAGTCATGGAGATGGTGGGGTACAGGGTGGGGGCAGGGGCACTC 9

Обычным шрифтом представлены мышиные последовательности, жирным шрифтом представлены человеческие последовательности, сайты рестрикционных ферментов/последовательности векторов подчеркнуты, а сайты loxp выделены курсивом.

[01073] Полученный в результате нацеленный вектор электропорировали в мышиные ЭС-клетки, которые содержали делецию целой константной области IgH мыши (MAID 6577), чтобы вставить генные сегменты IgM, IgD, IgG3 и IgG1. Кассету отбора удаляли с помощью рекомбиназы Cre.

[01074] Мыши, созданные из генетически модифицированных ЭС-клеток, содержали локус иммуноглобулина, проиллюстрированный на Фиг. 1A, 7, где последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая генные сегменты константной области IgM, IgD, IgG3, IgG1 человека, замещала последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую эндогенные генные сегменты константной области тяжелой цепи мыши в эндогенном локусе константной области тяжелой цепи мыши.

[01075] После создания ЭС-клеток и мышей, содержащих мышиный локус, проиллюстрированные на Фиг. 1A, локус 7, создавали мышей, которые содержали дополнительные последовательности константной области тяжелой цепи человека, такие как последовательности IgM, IgD, IgG3, IgG1, IgG2 и IgG4 человека, в эндогенном локусе тяжелой цепи. Эти мыши, проиллюстрированные на Фиг. 1A, локус 8, содержали мышиную вариабельную область тяжелой цепи и полностью человеческие генные сегменты IgM, IgD, IgG3, IgG1, IgG2 и IgG4 в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина мыши. Для создания этих мышей использовали те же нацеленные векторы и протоколы, которые описаны выше, для конструирования мышиного локуса 6, как проиллюстрировано на Фиг. 1E.

[01076] Все генетически модифицированные ЭС-клетки, содержащие мышиные вариабельные области тяжелой цепи и химерные или человеческие константные области тяжелой цепи, в этом примере использовали для создания генетически модифицированных мышей, используя описанный выше метод VELOCIMOUSE®.

Пример 1.3: Генетическое конструирование мышей, содержащих человеческие константные области легкой цепи

[01077] Генетически сконструированных мышей, содержащих человеческие константные области легкой цепи, создавали следующим образом.

[01078] Сначала для создания мыши, содержащей константную область легкой цепи каппа человека, синтезировали 0,5 т. п. о. человеческого гена IGKC с помощью BlueHeron, который содержал геномную последовательность нуклеиновой кислоты от 5’ НТО в дистальном конце гена IGKC до 3’ конца ниже хвоста полиА. Кассету отбора loxP-Ub-Neo-loxP добавляли в 3’ конец этой последовательности. Использовали технологии CRISPR/Cas9 и изотермической сборки для внесения последовательности IGKC человека в мышиную BAC BMQ-126m16 (The Sanger Centre). После этого 5’ кассету CM и мышиные IgKJ удаляли путем БГР, используя кассету отбора spec. Геномные координаты полученного в результате BAC-клона приведены в Таблице 7, а соединительные последовательности модифицированной аллели перечислены в Таблице 8.

Таблица 7: Геномные координаты для нацеленного вектора, используемого для создания мышей, содержащих IgKC человека

Область Геномные координаты (мышь: GRCm38, или человек: GRCh38) т. п. о. 5’ плечо гомологии мыши 6:70724056 – 70726317 (+ нить) ~ 2,3 Человеческий ген (5’ НТО–полиА) 2:88 857 079-88 857 800 (- нить) ~ 0,7 3’ плечо гомологии мыши 6:70727061 – 70756817 (+ нить) ~ 29,7

Таблица 8: Варианты соединения генетически модифицированной мышиной аллели, содержащей IgKC человека

Соединение Последовательность SEQ ID NO: 5’ НТО мыши/5’ НТО человека AAACAACAAGATTGTATATATGTGCATCCTGGCCCCATTGTTCCTTATCT GGGATAAGCATGCTGTTTTCTGTCTGTCCCTAACATGCCCTGTGATTATC 10 человек/5’ loxp TCTGTTGTTTTACCAACTACTCAATTTCTCTTATAAGGGACTAAATATGTACCGGT
ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT 11 3’ loxp/I-CeuI/3’ НТО мыши ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT
GTCGACCTCGAG
AATCCACCACACTTAAAGGATAAATAAAACCCTCCACTTGCCCTGGTTGGCTGTCCACTA 12

Обычным шрифтом представлены мышиные последовательности, жирным шрифтом представлены человеческие последовательности, сайты рестрикционных ферментов/последовательности векторов подчеркнуты, а сайты loxp выделены курсивом.

[01079] Как показано на Фиг. 2B, полученный в результате нацеленный вектор, содержащий последовательность области IgKC человека, электропорировали в ЭС-клетки, содержащие локус иммуноглобулина с генными сегментами вариабельной области легкой цепи каппа, функционально связанными с мышиной константной областью каппа (смотрите, например, Macdonald et al. PNAS (2014) vol. 111 (14):5147-5152, включенную в данный документ посредством ссылки). Кассету отбора удаляли, используя рекомбиназу Cre. Генетически модифицированные ЭС-клетки использовали для создания генетически модифицированных мышей, используя описанный выше метод VELOCIMOUSE®.

[01080] И наконец, в другом примере, мышь, содержащая последовательности константной области лямбда человека, описана в US 15/803513, поданной 3 ноября 2017 г. (Опубликованной как US 2008/0125043), в полном объеме включенной в данный документ посредством ссылки.

Пример 1.4: Создание мышей, содержащих константные области тяжелой и легкой цепи человека

[01081] Мышей, несущих сконструированную константную область тяжелой цепи, например, содержащую полностью человеческие или химерные последовательности константной области тяжелой цепи в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина мыши, описанных, например, в примерах 1.1–1.2, скрещивают с мышами, содержащими последовательность константной области IgK человека и/или последовательность константной области IgL человека, описанными в примере 1.3. Скрещивание проводят с помощью стандартных методик, известных в данной области техники. Проводят скрининг линий мышей, несущих необходимые сконструированные локусы, в отношении наличия последовательностей константной области тяжелой цепи человека или последовательностей константной области легкой цепи человека. Таким образом, мышей, содержащих человеческие последовательности генного сегмента вариабельной области тяжелой цепи и человеческие или химерные человеческие/мышиные последовательности константной области тяжелой цепи в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина, скрещивают с мышами, содержащими человеческие последовательности генного сегмента вариабельной области легкой цепи каппа и человеческие последовательности константной области легкой цепи каппа и/или человеческие последовательности генного сегмента вариабельной области легкой цепи лямбда и человеческие последовательности константной области легкой цепи лямбда, описанные в этом примере.

Пример 2: Мышиные модели для исследований фармакокинетики и дозирования человеческих терапевтических средств

[01082] Мышиное антитело против человеческих антител (MAHA), иммунный ответ, вырабатываемый мышами против человеческого антитела, может приводить к быстрому выведению из циркуляции человеческих моноклональных антител, которые вводят для экспериментов по фармакокинетике и/или эффективности. Чтобы провести более релевантные исследования ФК и дозирования полностью человеческих антител на мышиных моделях, мышей, содержащих константные области IgH человека, описанных в примере 1 выше, тестировали в отношении способности «обходить» ответ MAHA. Мыши, гетерозиготные в отношении константных областей IgH человека, демонстрировали нормальное развитие B-клеток, экспрессировали IgM/IgD человека и мыши и демонстрировали интактное аллельное исключение.

[01083] В одном примере, мышей, гомозиготных в отношении вариабельной области тяжелой цепи человека и гетерозиготных в отношении генных сегментов константной области IgM, IgD, IgG3 и IgG1 человека, как проиллюстрировано на Фиг. 1A, локус 5, тестировали в отношении снижения ответа MAHA. Для этих экспериментов всех мышей содержали и скрещивали в стерильном помещении в Regeneron Pharmaceuticals. Наивных контрольных мышей VELOCIMMUNE® (возраст - 16 недель, самцы, n = 2) и наивных мышей hVs, hIgM, hIgD, hIgG3 и hIgG1 (локус 5 на Фиг. 1A, возраст - 20 недель, самцы, n = 4) умерщвляли и получали образцы крови и тканей селезенки. Ткани селезенки лизировали в лизисном буфере ACK с последующей промывкой средой RPMI с 5 % ФБС. Кровь собирали в пробирки для отделения сыворотки (BD, кат. № 365956), а сыворотку собирали в соответствии с инструкциями производителя. Нормальную человеческую сыворотку (Quidel, кат. № A113) использовали в качестве положительного контроля для ELISA.

[01084] Анализ на общие антитела IgM человека проводили, используя ELISA, следующим образом. Планшеты покрывали на ночь при 4 градусах C 2 мкг/мл кроличьего антитела против IgM человека (Jackson ImmunoResearch, кат. № 309-005-095), промывали, блокировали 1 % БСА в ФСБ-Т. Стандарт IgM человека ChromPure (Jackson ImmunoResearch, кат. № 009-000-012) серийно разводили от 600 нг/мл до 0,823 нг/мл в ФСБ-Т и добавляли в лунки. Лунки инкубировали с разведенными образцами сыворотки, промывали и инкубировали с HRP-конъюгированным антителом против IgM человека (Jackson ImmunoResearch, № 309-035-095). Планшеты промывали и обрабатывали набором реагентов для ТМБ-субстрата Opt EIA (BD кат. № 555214). Реакцию останавливали добавлением 1 Н серной кислоты и измеряли ОП с коррекцией на холостой опыт на 450 нм с помощью микропланшетного ридера Molecular Devices Spectramax M5 и программного обеспечения SoftMax Pro. Данные анализировали, используя программное обеспечение Prism. Представленные данные соответствуют двум повторностям. Кроме того, проводили ELISA для IgG1 человека и IgG3 человека в соответствии с инструкциями производителя (Invitrogen, кат. № BMS2092 и BMS2094, соответственно). Результаты для изотипа Ig, показанные на Фиг. 3A, демонстрируют, что внесенные изотипы константной области тяжелой цепи человека экспрессировались в сыворотке генетически модифицированных мышей мышиного локуса 5.

[01085] Для экспериментов методом проточной цитометрии 1x10⁶ клеток инкубировали с антителом против мышиного CD16/CD32 (2.4G2, BD) на льду в течение 10 минут. После этого клетки метили в течение 30 минут на льду следующей панелью антител: антитело против мышиного CD3, конъюгированное с FITC (17A2, BD), A700-CD19 (1D3, BD), Pe-Cy7-IgM (11/41, eBioscience), PerCP-Cy5.5-IgD (11-26c.2a, BioLegend), антитело против человеческого IgD, конъюгированное с PE (IA6-2, BioLegend), и BV421-IgM (G20-127, BD). После окрашивания клетки промывали и фиксировали в 2 % формальдегиде. Сбор данных проводили на проточном цитометре BD LSRFortessa, а их анализ проводили с помощью программного обеспечения FlowJo. Графики количества B-клеток (CD19+) строили для hIgM в сравнении с mIgM и hIgD в сравнении с mIgD, чтобы проиллюстрировать использование аллелей и наличие аллельного исключения (Фиг. 3B).

[01086] Молекулярную массу антител в сыворотке, полученной от нескольких версий мышей, гетерозиготных в отношении константной области иммуноглобулина человека (например, мышей с локусом 1, 4, 6 и 8, проиллюстрированных на Фиг. 1A), анализировали методом вестерн-блоттинга. Образцы проводили через 4–12 % Трис-глициновый гель (Invitrogen), переносили на мембрану, блокировали в течение ночи при 4 градусах C, а после этого проводили обнаружение антител, используя HRP-конъюгированные антитела против IgG человека (Thermo, № 31412) и HRP-конъюгированные антитела против IgG мыши (Thermo, 31439), и обрабатывали реагентами для обнаружения для вестерн-блоттинга ELC (GE Health Care, № RPN2106). Вестерн-блоттинг показал, что молекулярная масса антител, содержащих константную область иммуноглобулина человека, обнаруженных с помощью антитела против IgG человека в сыворотке гетерозиготных в отношении константной области Ig человека мышей, была сходной с молекулярной массой антител в нормальной человеческой сыворотке (данные не приведены). Молекулярная масса антител, содержащих константную область иммуноглобулина мыши, обнаруженных с помощью антитела против IgG мыши в сыворотке гетерозиготных в отношении константной области Ig человека мышей, также была сходной в сравнении с молекулярной массой антител в мышиной сыворотке дикого типа и обратно-химерными мышами VELOCIMMUNE® (данные не приведены).

[01087] При тестировании в отношении ответов MAHA против релевантного по изотипу антитела, мыши, гетерозиготные в отношении hIgM, hIgD, hIgG3 и hIgG1 (локус 5), демонстрировали ответы MAHA, сравнимые с контрольными мышами (данные не приведены).

[01088] В другом примере мышей, гомозиготных в отношении вариабельной области тяжелой цепи человека и гетерозиготных в отношении константных областей IgM, IgD, IgG3, IgG1, IgG2 и IgG4 человека, как проиллюстрировано на Фиг. 1A, локус 6, или гомозиготных в отношении вариабельной области тяжелой цепи мыши и гетерозиготных в отношении константных областей IgM, IgD, IgG3, IgG1, IgG2 и IgG4 человека, как проиллюстрировано на Фиг. 1A, локус 8, тестировали в отношении снижения ответа MAHA. Для этих экспериментов всех мышей содержали и скрещивали в специальном стерильном помещении в Regeneron Pharmaceuticals. Мыши, содержащие как (1) вариабельную область тяжелой цепи мыши и константную область тяжелой цепи человека (mVs-hFC; мышиный локус 8 на Фиг. 1A), так и (2) вариабельную область тяжелой цепи человека и константную область тяжелой цепи человека (hVs-hFC; мышиный локус 6 на Фиг. 1A), были гомозиготными в отношении вариабельной области мыши или человека, соответственно, и гетерозиготными в отношении константной области тяжелой цепи человека. Мыши VELOCIMMUNE® (hVs-mFc; смотрите патенты США №№ 8642835 и 8697940, включенные в данный документ посредством ссылки) были гомозиготными в отношении вариабельной области тяжелой цепи человека и гомозиготными в отношении константной области тяжелой цепи мыши. У наивных контрольный мышей ДТ (возраст - 15 недель, самки, n = 6); мышей hVs-mFc (возраст - 14 недель, самцы, n = 5); мышей hVs-hFc: вариабельные области человека, мышей hIgM, hIgD, hIgG3, hIgG1, hIgG2 и hIgG4 (возраст - 11 недель, самцы, n = 6); и mVs-hFc: вариабельные области мыши, мышей hIgM, hIgD, hIgG3, hIgG1, hIgG2 и hIgG4 (возраст - 11 недель, самки, n = 6) брали кровь перед инъекцией антител, чтобы определить концентрации изотипов антител в сыворотке (Фиг. 3C) и исходные мышиные титры против человеческих антител (Фиг. 3D, сутки 0). Кровь собирали в пробирки для отделения сыворотки (BD, кат. № 365956), а сыворотку собирали в соответствии с инструкциями производителя. Полностью человеческое антитело IgG4 вводили подкожно в концентрации 1 мг/кг, разведенным в ФСБ Дульбекко. У мышей брали кровь через 7 суток, 15 суток, 22 суток и 34 суток после инъекции для теста на MAHA (Фиг. 3D; приведены данные только для 34 суток).

[01089] Измерения ELISA общего количества изотипа антитела (IgM мыши, общего IgG человека, IgM человека и IgG1 человека, и IgG4 человека) проводили в соответствии с инструкциями производителя (Invitrogen, mIgM: 88-50470-88, общий mIgG: 88-50400-88, hIgM: 8850620-88, hIgG1: 88-50560-22, hIgG4: 88-50590-22). Обобщенные характеристики для большинства мышей приведены на Фиг. 3C (некоторые данные не приведены). В целом, наблюдали сходные сывороточные уровни для IgM и IgG мыши между мышами с гуманизированным Fc и мышами дикого типа, а уровни hIgM, hIgG1 и hIgG4 были сходными между двумя версиями мышей с гуманизированной константной областью тяжелой цепи (mVs-hFc: локус 8 и hVs-hFc: локус 6).

[01090] Для исследований MAHA гетерозиготным мышам проводили одну подкожную инъекцию антитела hIgG4, после чего проводили ELISA на MAHA, как описано ниже. Планшеты Maxisorb (Nunc, кат. № 430341) покрывали на ночь при 4 градусах C антителом IgG4 человека в дозе 1 мкг/мл, блокировали и инкубировали в течение ночи с разведенными образцами сыворотки, с последующей инкубацией с HRP-конъюгированным антителом против IgG мыши (Jackson ImmunoResearch, код № 115-035-164) в течение 1 ч при комнатной температуре. Планшеты обрабатывали набором реагентов для ТМБ-субстрата Opt EIA (BD, кат. № 555214). Реакцию останавливали добавлением 1 Н серной кислоты и измеряли ОП на 450 нм с помощью микропланшетного ридера Molecular Devices Spectramax M5 и программного обеспечения SoftMax Pro. Данные анализировали, используя программное обеспечение Prism.

[01091] Как показано на Фиг. 3D, мыши с гуманизированными вариабельными областями IgH и константными областями IgH (hVs-hIgM-hIgD-hIgG3-hIgG1-hIgG2-hIgG4; локус 6) имеют существенно меньшие титры MAHA против полностью человеческого антитела IgG4 на 34 сутки после инъекции по сравнению с любыми из остальных трех вариантов тестируемых мышей. Снижение ответов MAHA также наблюдали у других мышей (например, других мышей, проиллюстрированных на Фиг. 1A), содержащих человеческие вариабельные области тяжелой цепи и химерную мышиную-человеческую (когда вводимое антитело было таким же, как и гуманизированный константный ген) или полностью человеческую константную область тяжелой цепи (данные не приведены).

[01092] Концентрацию введенного антитела, сохранявшуюся в сыворотке, определяли методом ELISA на 0 сутки, 2 сутки, 7 сутки, 15 сутки, 22 сутки и 34 сутки для тех же мышей, которые описаны на Фиг. 3D выше. Планшеты Maxisorb (Nunc, кат. № 430341) покрывали на ночь при 4 градусах C 1 мкг/мл антигена, блокировали БСА в ФСБ и инкубировали с разведенными образцами сыворотки, с последующей инкубацией с HRP-конъюгированным антителом против IgG человека (Jackson ImmunoResearch, код № 109-035-098) в течение 1 ч при комнатной температуре. Планшеты обрабатывали набором реагентов для ТМБ-субстрата Opt EIA (BD, кат. № 555214). Реакцию останавливали добавлением 1 Н серной кислоты и измеряли ОП на 450 нм с помощью микропланшетного ридера Molecular Devices Spectramax M5 и программного обеспечения SoftMax Pro. Данные анализировали, используя программное обеспечение Prism. Концентрацию определяли, используя вводимое антитело в качестве стандарта.

[01093] У мышей, которые имели сильный ответ MAHA, наблюдалось более быстрое выведение вводимого антитела по сравнению с мышами без ответа MAHA (Фиг. 3E). Число мышей, которые имели ответ MAHA, для каждого генотипа было следующим: 5 из 6 мышей с mVs-hFc, 0 из 6 мышей с hVs-hFC, 4 из 5 мышей с hVs-mFc и 4 из 6 мышей с mVs-mFc. Мыши без ответа MAHA все еще имели обнаруживаемые уровни вводимого антитела в сыворотке на 34 сутки.

Пример 3: Мыши, содержащие гуманизированный неонатальный Fc-рецептор (FcRn) в качестве in vivo модели для исследования рециклинга человеческих антител

[01094] Мышиный локус FcRn, расположенный в мышиной хромосоме 7, гуманизировали путем конструирования уникальных нацеленных векторов из ДНК человеческих и мышиных бактериальных искусственных хромосом (BAC), используя технологию VELOCIGENE® (смотрите, например, патент США № 6586251 и Valenzuela et al. (2003)), High-throughput engineering of the mouse genome couple with high-resolution expression analysis. Nat. Biotech. 21(6): 652-659, включенные в данный документ посредством ссылки). ДНК из мышиной BAC RP23-19D22 (Invitrogen-Thermo Fisher) модифицировали путем гомологичной рекомбинации, чтобы удалить 8,3 т. п. о. мышиной геномной ДНК, кодирующей внеклеточную часть мышиного FcRn и после этого вставить 11,5 т. п. о. соответствующей последовательности человеческого FcRn. Таким образом, мышиные экзоны, кодирующие домены альфа 1, альфа 2 и альфа 3 (экзоны 3, 4 и 5) гена FcRn мыши, замещали человеческими экзонами, кодирующими домены альфа 1, альфа 2 и альфа 3 (экзоны 3, 4 и 5) гена FcRn человека (смотрите Фиг. 4). Полученный в результате ген FcRn содержал мышиный экзон 1 (некодирующий экзон), мышиный экзон 2 (содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую сигнальный пептид), человеческие экзоны 3–6, мышиные экзоны 6 и 7 (кодирующие трансмембранный и цитоплазматический домены).

[01095] В частности, чтобы создать мышей с гуманизированным FcRn, большой нацеленный вектор, используемый при конструировании химерного гена, содержал последовательности нуклеиновой кислоты, перечисленные в Таблице 9 ниже. Кассету LoxP-Ub-Neo-LoxP вставляли в интрон 5 вектора.

Таблица 9: Геномные координаты для ДНК большого нацеленного вектора FcRn

Область Геномные координаты (мышь: GRCm38, или человек: GRCh38) т. п. о. 5’ плечо гомологии мыши 7: 45 165 536-45 102 749 (- нить) ~ 63 Человеческая область (эктодомен) 19: 49513756 – 49525253 (+ нить) ~ 11,5 3’ плечо гомологии мыши 7: 45094477 – 44974225 ~ 120

[01096] Нацеленную ДНК BAC использовали для электропорации мышиных ЭС-клеток, содержащих делецию в экзонах мышиного FcRn, для создания модифицированных ЭС-клеток для создания мышей, которые экспрессируют гуманизированный FcRn (Фиг. 4). ЭС-клетки, содержащие вставки последовательностей экзонов человеческого FcRn, идентифицировали с помощью количественного анализа TAQMAN™ (смотрите, например, Lie and Petropoulos, 1998. Curr. Opin. Biotechnology 9:43-48, включенную в данный документ посредством ссылки). Разрабатывали специальные наборы праймеров и зонды для обнаружения вставки человеческих последовательностей (приобретение аллели, ПА) и удаления мышиных последовательностей (утрата аллели, УА) (не показано).

[01097] Кассету отбора можно удалять методами, известными специалисту в данной области техники. Например, ЭС-клетки, несущие гуманизированный локус FcRn, можно трансфицировать конструкцией, которая экспрессирует Cre, чтобы удалить кассету flox. Необязательно, кассету отбора можно удалять путем скрещивания с мышами, которые экспрессируют рекомбиназу Cre. Необязательно, кассету отбора оставляют у мышей. Варианты соединения аллели гуманизированного FcRn перед удалением кассеты отбора представлены в Таблице 10 ниже.

Таблица 10: Варианты соединения аллели гуманизированного FcRn

Соединение Последовательность SEQ ID NO: мышь/человек (интрон 2) CTTTCTGGGTGTCTGTCCCCTTCTCTCTGGAGGATCATGGCACTTCAGAT
CTGTCCCCTCTCTCTGAATCTGTCCCCCTCCCTCCATAATAGATTCTTCT 13 человек/5’ loxp (интрон 5) TCTCCCCACTGCACTGGCACAGCCCCGCCTTGCCGCTGCTGATCCATTGCCGGTGTGACC
CGGGCTCGATAACTATAACGGTCCTAAGGTAGCGACTCGAG
ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT 14 3’ loxp/мышь (интрон 5) ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT
CCTAGGTTGGAGCTC
GTGTGAGAGGGGAGAGCAGAGGTGAGTCTGTGCCATGGGATACTTGTGGCG 15

Выделенные жирным последовательности представляют человеческую ДНК, подчеркнутые последовательности представляют сайты рестрикционных ферментов, выделенные курсивом последовательности представляют последовательности сайтов loxP.

[01098] Целевые ЭС-клетки, описанные выше, использовали в качестве донорских ЭС-клеток и вносили в мышиный эмбрион на 8-клеточной стадии методом VELOCIMOUSE® (смотрите, например, патент США № 7294754 и Poueymirou et al. (2007) F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses Nature Biotech. 25(1):91-99). Мышей VELOCIMICE® (мышей F0, полностью полученных из донорских ЭС-клеток), независимо несущих гуманизированный FcRn, идентифицировали с помощью генотипирования, используя анализ модификации аллели (смотрите выше), который позволяет обнаруживать наличие уникальных генных последовательностей FcRn человека. Гетерозиготных мышей, несущих химерный ген FcRn, скрещивали до гомозиготности.

[01099] Ниже приведена последовательность полученного в результате химерного белка FcRn, экспрессируемого генетически модифицированными мышами (SEQ ID NO:16) с выделенными курсивом доменами альфа 1, 2 и 3 и сигнальным пептидом и выделенным жирным шрифтом и подчеркиванием трансмембранным доменом. Зрелый химерный белок начинается в аминокислоте 22 последовательности, приведенной ниже, а границы последовательностей мыши – человека и человека – мыши обозначены звездочкой (*). В качестве справочной информации ниже в Таблице 11 приведены номера доступа Genbank для последовательностей белка и мРНК человека и мыши.

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ХИМЕРНОГО БЕЛКА (SEQ ID NO:16)

MGMPLPWALS LLLVLLPQTW GS*ESHLSLLY HLTAVSSPAP GTPAFWVSGW LGPQQYLSYN SLRGEAEPCG AWVWENQVSW YWEKETTDLR IKEKLFLEAF KALGGKGPYT LQGLLGCELG PDNTSVPTAK FALNGEEFMN FDLKQGTWGG DWPEALAISQ RWQQQDKAAN KELTFLLFSC PHRLREHLER GRGNLEWKEP PSMRLKARPS SPGFSVLTCS AFSFYPPELQ LRFLRNGLAA GTGQGDFGPN SDGSFHASSS LTVKSGDEHH YCCIVQHAGL AQPLRVEL*DS SARSSVPVVG IVLGLLLVVV AIAGGVLLWG RMRSGLPAPW LSLSGDDSGD LLPGGNLPPE AEPQGANAFP ATS

Таблица 11: Номера доступа Genbank для FcRn (FCGRT)

Вид Белок мРНК мышь NP_034319 NM_010189 человек NP_001129491 NM_001136019

[01100] Мышей, содержащих химерный ген FcRn, скрещивали с мышами, содержащими гуманизированный ген B2M в эндогенном локусе B2M мыши (Фиг. 5), подробно описанными в публикации заявки на патент США № 2013/0111617, в полном объеме включенной в данный документ посредством ссылки. Мышей скрещивали до гомозиготности в обоих локусах.

[01101] Для обнаружения экспрессии химерного FcRn и гуманизированного B2M мышей умерщвляли и получали ткани селезенки. После обработки лизисным буфером ACK (Gibco) ткани селезенки диссоциировали, клетки центрифугировали, промывали, помещали в планшеты, фиксировали фиксирующим буфером IC (eBioscience) и пермеабилизировали буфером, содержащим Fc-блок (BD), чтобы подготовить к окрашиванию. Чтобы обнаружить FcRn, клетки окрашивали внутрилабораторным первичным антителом против FcRn человека или первичным антителом против FcRn мыши (R&D AF6775) с последующим окрашиванием соответствующим вторичным антителом (ThermoFisher 1885920 или ThermoFisher 1915848). Клетки промывали и анализировали образцы на приборе FACS LSRFortessa X-20 (BD). Чтобы обнаружить B2M, клетки окрашивали PE-меченным антителом против B2M мыши (BioLegend, клон A16041A) или PE-меченным антителом против B2M человека (BioLegend, клон 2M2). Клетки промывали и анализировали образцы на приборе FACS LSRFortessa X-20 (BD).

[01102] Гуманизированные мыши FcRn/B2M экспрессировали обнаруживаемые уровни химерного белка (данные не приведены). Однако, поскольку человеческий FcRn не может связывать мышиный IgG, определили, что мыши, гомозиготные в отношении человеческого FcRn и гуманизированного B2M, демонстрировали существенно сниженные уровни мышиного IgG в крови (данные не приведены). Гуманизированные мыши FcRn/B2M экспрессировали гуманизированный белок B2M (данные не приведены).

[01103] Известно, что мышиный FcRn связывает человеческий Ig с более высокой аффинностью, чем человеческий FcRn. Чтобы исследовать, демонстрировали ли мыши, экспрессирующие химерный мышиный/человеческий FcRn, свойства рециклинга человеческих антител, сходные с наблюдаемыми у человека, трем животным из мышей дикого типа и мышей, гомозиготных в отношении химерного FcRn и гуманизированного B2M, описанных выше, подкожно вводили человеческое антитело IgG4 в дозе 1 мг/кг и измеряли уровни лекарственного антитела в сыворотке через 6 часов, 1, 2, 3, 8, 10, 14, 22 и 30 суток после инъекции, используя иммуноанализ Gyros. Как показано на Фиг. 6, мыши, гомозиготные в отношении химерного FcRn (FcRn hu/hu) и гуманизированного B2M (B2M hu/hu), демонстрировали более быстрое выведение антитела, чем мыши дикого типа, которые не экспрессировали человеческие белки. Следовательно, мыши, экспрессирующие химерный FcRn и гуманизированный B2M, служат в качестве модели для исследования рециклинга человеческих терапевтических антител, который больше похож на человеческий, и, следовательно, служат прекрасной моделью для исследования фармакокинетического и фармакодинамического профиля терапевтического средства.

Пример 4: Мыши, содержащие гуманизированные высоко- и низкоаффинные Fc-гамма-рецепторы и человеческие константные области тяжелой цепи иммуноглобулина

[01104] Создавали гуманизированных мышей, содержащих высоко- и низкоаффинные Fcγ-рецепторы и гуманизированные константные области. Для этих экспериментов мышей, содержащих высокоаффинные Fcγ-рецепторы и низкоаффинные Fcγ-рецепторы (создание этих мышей описано в патентах США №№ 8658154; 9056130; 8658853; 8883496; 9687566; 9089599; 9221894 и 9474255, которые в полном объеме включены в данный документ посредством ссылки), комбинировали с мышами, содержащими человеческие константные области тяжелой цепи (например, мышиный локус 7 на Фиг. 1A), путем скрещивания или перенацеливания ЭС-клеток в соответствии с методиками, известными в данной области техники. Полученных в результате мышей скрещивали до гомозиготности. Различные типовые варианты осуществления описанных в данном документе гуманизированных локусов представлены на Фиг. 7.

[01105] После завершения генного нацеливания проводили скрининг ЭС-клеток или генетически модифицированных отличных от человека животных для подтверждения успешного включения представляющей интерес экзогенной нуклеотидной последовательности или экспрессии экзогенного полипептида. Специалистам в данной области техники известны многочисленные методики, которые включают (но не ограничиваются этим) саузерн-блоттинг, ПЦР длинных фрагментов, количественную ПЦР (например, ПЦР в режиме реального времени с использованием TAQMAN), флуоресцентную гибридизацию in situ , нозерн-блоттинг, проточную цитометрию, вестерн-блоттинг, иммуноцитохимию, иммуногистохимию и т. д. Например, мышей, несущих представляющую интерес генетическую модификацию, т. е. человеческий высокоаффинный FcgR и низкоаффинный FcgR и человеческие константные области тяжелой цепи, можно идентифицировать путем скрининга в отношении приобретения человеческой аллели, используя анализ модификации аллели, описанный в Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech. 21(6):652-659. Специалистам в данной области техники известны другие методы анализа, которые позволяют идентифицировать нуклеотидные или аминокислотные последовательности у генетически модифицированных животных.

[01106] После завершения скрещивания или перенацеливания ЭС-клеток, как описано на Фиг. 7, изучали характеристики полученных в результате мышей. Для этих экспериментов всех мышей содержали и скрещивали в специальном стерильном помещении в Regeneron Pharmaceuticals. Наивных контрольных мышей ДТ (возраст - 26–36 недель, самцы и самки, n = 2) и наивных мышей, содержащих высоко- и низкоаффинный hFcgR, hIgM, hIgD, hIgG3 и hIgG1 (локус 7 на Фиг. 1A, возраст - 19–22 недель, самцы и самки, n = 5), умерщвляли и получали образцы крови и тканей селезенки. Красные кровяные клетки из крови и селезенки лизировали в лизисном буфере ACK с последующей промывкой средой RPMI с 5 % ФБС. Кровь также собирали в пробирки для отделения сыворотки (BD, кат. № 365956), а сыворотку собирали в соответствии с инструкциями производителя. Нормальную человеческую сыворотку (Quidel, кат. № A113) использовали в качестве положительного контроля для ELISA.

[01107] Анализ на общие антитела IgM человека проводили, используя ELISA, следующим образом. Планшеты покрывали на ночь при 4 градусах C 2 мкг/мл ослиного антитела против IgM человека (Jackson ImmunoResearch, кат. № 709-005-073), промывали, блокировали 1 % БСА в ФСБ-Т. Стандарт IgM человека ChromPure (Jackson ImmunoResearch, кат. № 009-000-012) серийно разводили от 500 нг/мл до 0,49 нг/мл в ФСБ-Т и добавляли в лунки. Лунки инкубировали с разведенными образцами сыворотки, промывали и инкубировали с HRP-конъюгированным антителом против IgM человека (Jackson ImmunoResearch, № 009-035-073). Планшеты промывали и обрабатывали набором реагентов для ТМБ-субстрата Opt EIA (BD кат. № 555214). Реакцию останавливали добавлением 1 Н серной кислоты и измеряли ОП с коррекцией на холостой опыт на 450 нм с помощью микропланшетного ридера Molecular Devices Spectramax M5 и программного обеспечения SoftMax Pro. Данные анализировали, используя программное обеспечение Prism. Представленные данные соответствуют двум повторностям. Кроме того, проводили ELISA для IgG1 человека и IgG3 человека в соответствии с инструкциями производителя (Invitrogen, кат. № BMS2092 и BMS2094, соответственно). (Фиг. 8C)

[01108] Для экспериментов методом проточной цитометрии 1x10⁶ клеток окрашивали фиксируемым красителем для определения жизнеспособности eFluor 455UV (ThermoFisher, кат. № 65-0868-14) и после промывания инкубировали с антителом против мышиного CD16/CD32 (2.4G2, BD) на льду в течение 10 минут. После этого клетки метили в течение 30 минут на льду следующей панелью антител: антитело против мышиного CD3, конъюгированное с FITC (17A2, BD), A700-CD19 (1D3, BD), Pe-Cy7-IgM (11/41, eBioscience), PerCP-Cy5.5-IgD (11-26c.2a, BioLegend), антитело против человеческого IgD, конъюгированное с PE (IA6-2, BioLegend), и BV421-IgM (G20-127, BD). После окрашивания клетки промывали и фиксировали в 2 % формальдегиде. Сбор данных проводили на проточном цитометре BD LSRFortessa, а их анализ проводили с помощью программного обеспечения FlowJo. B-клетки (CD19+), зрелые B-клетки (CD19+ IgD-выс. IgM-сред.), переходные/незрелые B-клетки (CD19+ IgD-сред. IgM-выс.). (Фиг. 8A и 8B).

[01109] Как обобщено на Фиг. 8A, 8B и 8C, наблюдается существенное повышение поверхностной экспрессии человеческого IgM и человеческого IgD в B-клетках мышей, содержащих гуманизированные высоко- и низкоаффинные Fcγ-рецепторы и гуманизированные IgM, IgD, IgG3 и IgG1. Кроме того, эти мыши демонстрировали нормальную B-клеточную популяцию в селезенке и нормальные уровни антител в сыворотке. Эти мыши, которые демонстрируют точную гуманизацию высоко- и низкоаффинного hFCγR и гуманизацию константных областей тяжелой цепи, представляют новую модель для исследования эффекторной функции человеческих Fc-рецепторов.

Пример 5: Мыши, содержащие гуманизированный Fcε-эпсилон рецептор (FcεRα), для изучения взаимодействия человеческого антитела IgE

[01110] Белок FcεR состоит из одной α-субъединицы, β-субъединицы и двух γ-субъединиц. Внеклеточная честь α-субъединицы, FcεRIα, содержит два иммуноглобулин-подобных домена и связывает IgE с высокой аффинностью даже в отсутствие других субъединиц. Соответственно, в нижеизложенной стратегии проводили гуманизацию FcεRIα, α-субъединицы FcεR.

[01111] Мышиный локус FcεRIα, расположенный в мышиной хромосоме 1, гуманизировали путем конструирования уникальных нацеленных векторов из ДНК человеческих и мышиных бактериальных искусственных хромосом (BAC), используя технологию VELOCIGENE® (смотрите, например, патент США № 6586251 и Valenzuela et al. (2003)), High-throughput engineering of the mouse genome couple with high-resolution expression analysis. Nat. Biotech. 21(6): 652-659, включенные в данный документ посредством ссылки). ДНК из мышиной BAC RP23-332i14 (Invitrogen-Thermo Fisher) модифицировали путем гомологичной рекомбинации, чтобы удалить 5,7 т. п. о. мышиной геномной ДНК, кодирующей кодирующую область мышиного FcεRIα, и после этого вставить 6,1 т. п. о. кодирующей последовательности человеческого FcεRIα и человеческой 3’ нетранслируемой области из BAC CTD-3064h17 (Invitrogen-Thermo Fisher) (Фиг. 9). Таким образом, часть мышиного кодирующего экзона 1, кодирующего экзона 2, кодирующего экзона 3, кодирующего экзона 4 и кодирующего экзона 5 FcεRIα мыши замещали частью человеческого кодирующего экзона 1, кодирующего экзона 2, кодирующего экзона 3, кодирующего экзона 4 и кодирующего экзона 5 гена FcεRIα человека. Полученный в результате химерный ген FcεRIα содержал химерный мышиный/человеческий экзон 1 (содержащий мышиный промотор и 5’ НТО), человеческие кодирующие экзоны 2–5 до стоп-кодона, человеческие 3’ НТО и полиА, за которыми идут мышиные 3’ НТО и полиА. Экзоны 1 (частично) и 2 химерного гена кодируют сигнальный пептид, экзоны 3 и 4 кодируют два Ig-подобных домена FcεRIα, которые, как считается, взаимодействуют с IgE, а экзон 5 кодирует цитоплазматический и трансмембранный домены белка (смотрите Фиг. 9).

[01112] В частности, чтобы создать мышей с гуманизированным FcεRIα, большой нацеленный вектор, используемый при конструировании химерного гена, содержал последовательности нуклеиновой кислоты, перечисленные в Таблице 12 ниже. Самоудаляющуюся кассету устойчивости к неомицину вставляли 3’ относительно последнего кодирующего экзона.

Таблица 12: Геномные координаты для ДНК большого нацеленного вектора FcεRIα

Область Геномные координаты (мышь: GRCm38, или человек: GRCh38) т. п. о. 5’ плечо гомологии мыши 1: 173309806-173227174 (- нить) ~ 82,6 Человеческий ген (ATG–полиА) 1: 159302358 – 159308425 (+ нить) ~ 6,1 3’ плечо гомологии мыши 1: 173221426-173138062 (- нить) ~ 83,4

[01113] Нацеленную ДНК BAC использовали для электропорации мышиных ЭС-клеток, содержащих делецию в экзонах мышиного FcεRIα, для создания модифицированных ЭС-клеток для создания мышей, которые экспрессируют гуманизированный FcεRIα (Фиг. 9). ЭС-клетки, содержащие вставки последовательностей экзонов человеческого FcεRIα, идентифицировали с помощью количественного анализа TAQMAN™ (смотрите, например, Lie and Petropoulos, 1998. Curr. Opin. Biotechnology 9:43-48, включенную в данный документ посредством ссылки). Разрабатывали специальные наборы праймеров и зонды для обнаружения вставки человеческих последовательностей (приобретение аллели, ПА) и удаления мышиных последовательностей (утрата аллели, УА) (не показано).

[01114] Варианты соединения аллели гуманизированного FcεRIα перед удалением кассеты отбора представлены в Таблице 13 ниже.

Таблица 13: Варианты соединения аллели гуманизированного FcεRIα

Соединение Последовательность SEQ ID NO: 5’ НТО мыши/ATG человека TTTTCGAAGCCATAGCTCTCTGGTGCAGTTAGCACCTGAAGGTGCAGGGGCG
ATGAAGAAGATGGCTCCTGCCATGGAATCCCCTACTCTACTGTGTGTAGCCT 17 человек/5’ loxp TCTTCTTCAGCTTACTAAATATGAACTTTCAGTTCTTGGCAGAATCAGGG
CTCGAG
ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT 18 3’ loxp/I-CeuI/3’ НТО мыши ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT
GCTAGGTAACTATAACGGTCCTAAGGTAGCGAGCTAGC
CCTCAATAGCTTCTCCACTGTCAAAGGCCACTCATGTGATCCCTAGAAAA 19

Выделенные жирным последовательности представляют человеческую ДНК, подчеркнутые последовательности представляют сайты рестрикционных ферментов, выделенные курсивом последовательности представляют последовательности сайтов loxP.

[01115] Целевые ЭС-клетки, описанные выше, использовали в качестве донорских ЭС-клеток и вносили в мышиный эмбрион на 8-клеточной стадии методом VELOCIMOUSE® (смотрите, например, патент США № 7294754 и Poueymirou et al. (2007) F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses Nature Biotech. 25(1):91-99). Мышей VELOCIMICE® (мышей F0, полностью полученных из донорских ЭС-клеток), независимо несущих гуманизированный FcεRIα, идентифицировали с помощью генотипирования, используя анализ модификации аллели (смотрите выше), который позволяет обнаруживать наличие уникальных генных последовательностей FcεRIα человека. Гетерозиготных мышей, несущих химерный ген FcεRIα, скрещивали до гомозиготности.

[01116] Полученный в результате белок FcεRIα, экспрессируемый мышами, является полностью человеческим, а ниже приведена последовательность человеческого белка FcεRIα, экспрессируемого генетически модифицированными мышами (SEQ ID NO:20) с выделенными курсивом Ig-подобными доменами и сигнальным пептидом и выделенным жирным шрифтом и подчеркиванием трансмембранным доменом. Зрелый белок начинается в аминокислоте 26 последовательности, приведенной ниже. В качестве справочной информации ниже в Таблице 14 приведены номера доступа Genbank для последовательностей белка и мРНК человека и мыши.

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО БЕЛКА (SEQ ID NO:20)

MAPAMESPTL LCVALLFFAP DGVLAVPQKP KVSLNPPWNR IFKGENVTLT CNGNNFFEVS STKWFHNGSL SEETNSSLNI VNAKFEDSGE YKCQHQQVNE SEPVYLEVFS DWLLLQASAE VVMEGQPLFL RCHGWRNWDV YKVIYYKDGE ALKYWYENHN ISITNATVED SGTYYCTGKV WQLDYESEPL NITVIKAPRE KYWLQFFIPL LVVILFAVDT GLFISTQQQV TFLLKIKRTR KGFRLLNPHP

KPNPKNN

Таблица 14: Номера доступа Genbank для FCER1A

Вид Белок мРНК Мышь NP_034314 NM_010184 Человек NP_001992 NM_002001

[01117] Чтобы подтвердить экспрессию гуманизированного FcεRIα на поверхности базофилов селезенки мышей с гуманизированным FcεRIα, мышей дикого типа (ДТ) или гомозиготных в отношении гуманизированного FcεRIα мышей умерщвляли, получали ткани селезенки и готовили суспензии из одиночных клеток после лизиса красных кровяных клеток (Sigma). После этого клетки окрашивали маркером в отношении живых/мертвых клеток, блокировали Fc-блоком с последующим окрашиванием одной из двух смесей антител: (1) смесь 1: антитело против мышиного CD49b (PECy7-конъюгированное, клон EBioscience DX5), против мышиного TCRβ (APC-конъюгированное, клон BD H57-597), против мышиного B220 (BUV395-конъюгированное, клон BD RA3-682) и против мышиного FcεRIα (eFluor 450-конъюгированное, клон EBioscience MAR-1), или (2) смесь 2: антитело против мышиного CD49b (PECy7-конъюгированное, клон EBioscience DX5), против мышиного TCRβ (APC-конъюгированное, клон BD H57-597), против мышиного B220 (BUV395-конъюгированное, клон BD RA3-682) и против мышиного FcεRIα (eFluor 450-конъюгированное, клон EBioscience AER-37(CRA1)). Данные по клеткам получали с помощью прибора LSRFortessa и анализировали с помощью программного обеспечения FlowJo. Базофилы идентифицировали как TCRβ- B220- CD49b+ FcεRIα+. На графиках FACS на Фиг. 10 показана популяция TCRβ- B220- с указанной стрелками популяцией базофилов. Эта популяция положительна в отношении мышиного FcεRIα только у мышей ДТ и положительной в отношении человеческого FcεRIα только у мышей с гуманизированным FcεRIα. На графиках проиллюстрирована количественная оценка человеческих или мышиных базофилов FceR1α+ в виде процента живых клеток в селезенке 5 мышей каждого генотипа (Фиг. 10).

[01118] Мышей с гуманизированным FcεRIα подтверждали в модели пассивной кожной анафилаксии (ПКА). На 1 сутки группам ДТ или гуманизированных мышей проводили интрадермальную инъекцию коктейля из двух аллерген-специфических человеческих антител IgE или нерелевантного антитела IgG (отрицательный контроль) в правое и левое ухо, соответственно, таким образом, обеспечивая возможность связывания аллерген-специфического IgE с FcεR на тучных клетках. Через двадцать четыре часа мышей стимулировали внутривенной (в/в) инъекцией 1 мкг аллергена, разведенного в 0,5 % красителя Эванса синего. Через один час после стимуляции аллергеном мышей умерщвляли, краситель Эванса синий экстрагировали из ушной ткани и оценивали спектрофотометрическим методом, используя стандартную кривую. Затем уши сушили и взвешивали. Результаты демонстрируют экстравазацию красителя Эванса синего в ткани, количественно выраженную в нг Эванса синего/мг ткани, в качестве показателя локальной дегрануляции тучных клеток. Данные, приведенные на Фиг. 11, демонстрируют, что человеческий аллерген-специфический IgE может опосредовать локальный анафилактический ответ у мышей с гуманизированным FcεRIα, но не у мышей ДТ.

[01119] Мышей с гуманизированным FcεRIα также подтверждали в модели пассивной системной анафилаксии (ПСА). На 1 сутки группам мышей с гуманизированным FcεRIα проводили внутривенную (в/в) инъекцию коктейля из двух аллерген-специфических человеческих антител IgE или нерелевантного антитела IgG (отрицательный контроль), обеспечивая возможность системного связывания аллерген-специфического IgE с FcεR1-экспрессирующими клетками. Через двадцать четыре часа для всех мышей проводили измерения исходной внутренней температуры с последующей в/в инъекцией 1 мкг аллергена. После этого измерения внутренней температуры проводили для всех мышей через 30, 60, 120 и 240 минут после стимуляции аллергеном и рассчитывали изменения внутренней температуры относительно исходной температуры в каждый момент времени. Снижение внутренней температуры является показателем системной анафилаксии. Данные, приведенные на Фиг. 12, демонстрируют, что человеческий аллерген-специфический IgE может опосредовать системный анафилактический ответ у мышей с гуманизированным FcεRIα, определяемый по существенному снижению внутренней температуры через 30–60 минут после стимуляции.

Пример 6: Основные мыши для изучения взаимодействий человеческих Fc-рецепторов и эффективности человеческих терапевтических антител

[01120] Чтобы получить лучшую модель для изучения полностью человеческих моноклональных антител в мышиной модели эффекторной функции человеческих Fc-рецепторов, мышей A (гуманизированный hβ2M; смотрите пример 3), мышей B (hFCER1A; смотрите пример 5), мышей C (hFCRN; смотрите пример 3), мышей D (hFCGR1), мышей E (hFCGR2/3) и мышей F (mVs, hIgM, hIgD, IgG3 и IgG1; мышиный локус 7 на Фиг. 1A) или, в альтернативном варианте, мышей F’ (hVs, hIgM, hIgD, IgG3 и IgG1; мышиный локус 5 на Фиг. 1A), проиллюстрированных на Фиг. 13, комбинируют путем скрещивания или перенацеливания ЭС-клеток в соответствии с методиками, описанными в данном документе и известными в данной области техники. Полученные в результате мыши могут быть гетерозиготными или гомозиготными в отношении любых или всех из этих генов. Различные типовые варианты осуществления описанных в данном документе гуманизированных локусов проиллюстрированы на Фиг. 13. Других мышей с человеческими константными областями тяжелой цепи, проиллюстрированными на Фиг. 1A, можно скрещивать с оставшимися мышами (мышами A–E) на Фиг. 13. Таким образом, мышей A (гуманизированный hb2M; смотрите пример 3), мышей B (hFCER1A; смотрите пример 5), мышей C (hFCRN; смотрите пример 3), мышей D (hFCGR1), мышей E (hFCGR2/3) и мышей (mVs, hIgM, hIgD, IgG3, IgG1, IgG2 и IgG4; мышиный локус 8 на Фиг. 1A) или, в альтернативном варианте, мышей (hVs, hIgM, hIgD, IgG3 IgG1, IgG2 и IgG4; мышиный локус 6 на Фиг. 1A) комбинируют путем скрещивания или перенацеливания ЭС-клеток в соответствии с методиками, описанными в данном документе и известными в данной области техники. Их также можно скрещивать до получения мышей с легкой цепью, проиллюстрированной на Фиг. 2A.Дополнительные человеческие константные области иммуноглобулина добавляют с помощью методик генетического конструирования, описанных в примере 1 и известных в данной области техники.

Включение путем ссылки

Все публикации, патенты и заявки на патенты, упоминаемые в данном документе, в полном объеме включены в данный документ посредством ссылки в той же мере, как если бы каждая отдельная публикация, патент или заявка на патент были специально и индивидуально указаны как включенные посредством ссылки. В случае противоречий, данная заявка, включая любые определения в данном документе, имеет приоритет.

Эквиваленты

Специалистам в данной области станет понятно или они смогут установить, используя лишь рутинные эксперименты, существование многочисленных эквивалентов конкретных вариантов осуществления изобретения, описанного в данном документе. Подразумевается, что такие эквиваленты охвачены нижеприведенной формулой изобретения.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> REGENERON PHARMACEUTICALS, INC.

<120> ГУМАНИЗИРОВАННЫЕ ГРЫЗУНЫ ДЛЯ ТЕСТИРОВАНИЯ ТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ

АГЕНТОВ

<130> RPB-01925 (28744-01925)

<140>

<141>

<150> 62/689628

<151> 2018-06-25

<150> 62/648197

<151> 26.03.2018

<160> 20

<170> PatentIn, версия 3.5

<210> 1

<211> 80

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности:

Синтетический

олигонуклеотид»

<400> 1

tgggactcag gttgggtgcg tctgatggag taactgagcc tgggggcttg gggagccaca

60

tttggacgag atgcctgaac

80

<210> 2

<211> 78

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности:

Синтетический

олигонуклеотид»

<400> 2

taacagagaa tggagaatgg cgatgacttc taccaagcac cggtataact tcgtataagg

60

tatcctatac gaagttat

78

<210> 3

<211> 88

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности:

Синтетический

олигонуклеотид»

<400> 3

ggcgcgccat aacttcgtat aaggtatcct atacgaagtt atctcgagag gtggcagtca

60

tggagatggt ggggtacagg gtgggggc

88

<210> 4

<211> 108

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности:

Синтетический

полинуклеотид»

<400> 4

tctgtgccta gttaacagag aatggagaat ggcgatgact tctaccaagc cgccggcgac

60

tcatcaccaa ggggaagatg ctcaatcatt catgagggat ctgccccc

108

<210> 5

<211> 91

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности:

Синтетический

олигонуклеотид»

<400> 5

atgctcttta tcttattaac taaggtgtcg taaccagttc aaagtggaat taccggtata

60

acttcgtata aggtatccta tacgaagtta t

91

<210> 6

<211> 98

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности:

Синтетический

олигонуклеотид»

<400> 6

ataacttcgt ataaggtatc ctatacgaag ttatctcgag gcggccgcag gtggcagtca

60

tggagatggt ggggtacagg gtgggggcag gggcactc

98

<210> 7

<211> 108

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности:

Синтетический

полинуклеотид»

<400> 7

ttaaatgaat gcaattatct agacttattt cagttgaaca tgctggttgg gcggccgctg

60

gcataagaga aaactcaatc agatagtgct gaagacagga ctgtggag

108

<210> 8

<211> 90

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности:

Синтетический

олигонуклеотид»

<400> 8

tctgtgccta gttaacagag aatggagaat ggcgatgact tctaccaagc accggtataa

60

cttcgtataa ggtatcctat acgaagttat

90

<210> 9

<211> 90

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности:

Синтетический

олигонуклеотид»

<400> 9

ataacttcgt ataaggtatc ctatacgaag ttatctcgag aggtggcagt catggagatg

60

gtggggtaca gggtgggggc aggggcactc

90

<210> 10

<211> 100

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности:

Синтетический

полинуклеотид»

<400> 10

aaacaacaag attgtatata tgtgcatcct ggccccattg ttccttatct gggataagca

60

tgctgttttc tgtctgtccc taacatgccc tgtgattatc

100

<210> 11

<211> 90

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности:

Синтетический

олигонуклеотид»

<400> 11

tctgttgttt taccaactac tcaatttctc ttataaggga ctaaatatgt accggtataa

60

cttcgtataa tgtatgctat acgaagttat

90

<210> 12

<211> 106

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности:

Синтетический

полинуклеотид»

<400> 12

ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttatgtcgac ctcgagaatc caccacactt

60

aaaggataaa taaaaccctc cacttgccct ggttggctgt ccacta

106

<210> 13

<211> 100

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности:

Синтетический

полинуклеотид»

<400> 13

ctttctgggt gtctgtcccc ttctctctgg aggatcatgg cacttcagat ctgtcccctc

60

tctctgaatc tgtccccctc cctccataat agattcttct

100

<210> 14

<211> 135

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности:

Синтетический

полинуклеотид»

<400> 14

tctccccact gcactggcac agccccgcct tgccgctgct gatccattgc cggtgtgacc

60

cgggctcgat aactataacg gtcctaaggt agcgactcga gataacttcg tataatgtat

120

gctatacgaa gttat

135

<210> 15

<211> 100

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности:

Синтетический

полинуклеотид»

<400> 15

ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttatcctagg ttggagctcg tgtgagaggg

60

gagagcagag gtgagtctgt gccatgggat acttgtggcg

100

<210> 16

<211> 363

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности:

Синтетический

полипептид»

<400> 16

Met Gly Met Pro Leu Pro Trp Ala Leu Ser Leu Leu Leu Val Leu Leu

1 5 10 15

Pro Gln Thr Trp Gly Ser Glu Ser His Leu Ser Leu Leu Tyr His Leu

20 25 30

Thr Ala Val Ser Ser Pro Ala Pro Gly Thr Pro Ala Phe Trp Val Ser

35 40 45

Gly Trp Leu Gly Pro Gln Gln Tyr Leu Ser Tyr Asn Ser Leu Arg Gly

50 55 60

Glu Ala Glu Pro Cys Gly Ala Trp Val Trp Glu Asn Gln Val Ser Trp

65 70 75 80

Tyr Trp Glu Lys Glu Thr Thr Asp Leu Arg Ile Lys Glu Lys Leu Phe

85 90 95

Leu Glu Ala Phe Lys Ala Leu Gly Gly Lys Gly Pro Tyr Thr Leu Gln

100 105 110

Gly Leu Leu Gly Cys Glu Leu Gly Pro Asp Asn Thr Ser Val Pro Thr

115 120 125

Ala Lys Phe Ala Leu Asn Gly Glu Glu Phe Met Asn Phe Asp Leu Lys

130 135 140

Gln Gly Thr Trp Gly Gly Asp Trp Pro Glu Ala Leu Ala Ile Ser Gln

145 150 155 160

Arg Trp Gln Gln Gln Asp Lys Ala Ala Asn Lys Glu Leu Thr Phe Leu

165 170 175

Leu Phe Ser Cys Pro His Arg Leu Arg Glu His Leu Glu Arg Gly Arg

180 185 190

Gly Asn Leu Glu Trp Lys Glu Pro Pro Ser Met Arg Leu Lys Ala Arg

195 200 205

Pro Ser Ser Pro Gly Phe Ser Val Leu Thr Cys Ser Ala Phe Ser Phe

210 215 220

Tyr Pro Pro Glu Leu Gln Leu Arg Phe Leu Arg Asn Gly Leu Ala Ala

225 230 235 240

Gly Thr Gly Gln Gly Asp Phe Gly Pro Asn Ser Asp Gly Ser Phe His

245 250 255

Ala Ser Ser Ser Leu Thr Val Lys Ser Gly Asp Glu His His Tyr Cys

260 265 270

Cys Ile Val Gln His Ala Gly Leu Ala Gln Pro Leu Arg Val Glu Leu

275 280 285

Asp Ser Ser Ala Arg Ser Ser Val Pro Val Val Gly Ile Val Leu Gly

290 295 300

Leu Leu Leu Val Val Val Ala Ile Ala Gly Gly Val Leu Leu Trp Gly

305 310 315 320

Arg Met Arg Ser Gly Leu Pro Ala Pro Trp Leu Ser Leu Ser Gly Asp

325 330 335

Asp Ser Gly Asp Leu Leu Pro Gly Gly Asn Leu Pro Pro Glu Ala Glu

340 345 350

Pro Gln Gly Ala Asn Ala Phe Pro Ala Thr Ser

355 360

<210> 17

<211> 104

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности:

Синтетический

полинуклеотид»

<400> 17

ttttcgaagc catagctctc tggtgcagtt agcacctgaa ggtgcagggg cgatgaagaa

60

gatggctcct gccatggaat cccctactct actgtgtgta gcct

104

<210> 18

<211> 90

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности:

Синтетический

олигонуклеотид»

<400> 18

tcttcttcag cttactaaat atgaactttc agttcttggc agaatcaggg ctcgagataa

60

cttcgtataa tgtatgctat acgaagttat

90

<210> 19

<211> 122

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности:

Синтетический

полинуклеотид»

<400> 19

ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttatgctagg taactataac ggtcctaagg

60

tagcgagcta gccctcaata gcttctccac tgtcaaaggc cactcatgtg atccctagaa

120

aa

122

<210> 20

<211> 257

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 20

Met Ala Pro Ala Met Glu Ser Pro Thr Leu Leu Cys Val Ala Leu Leu

1 5 10 15

Phe Phe Ala Pro Asp Gly Val Leu Ala Val Pro Gln Lys Pro Lys Val

20 25 30

Ser Leu Asn Pro Pro Trp Asn Arg Ile Phe Lys Gly Glu Asn Val Thr

35 40 45

Leu Thr Cys Asn Gly Asn Asn Phe Phe Glu Val Ser Ser Thr Lys Trp

50 55 60

Phe His Asn Gly Ser Leu Ser Glu Glu Thr Asn Ser Ser Leu Asn Ile

65 70 75 80

Val Asn Ala Lys Phe Glu Asp Ser Gly Glu Tyr Lys Cys Gln His Gln

85 90 95

Gln Val Asn Glu Ser Glu Pro Val Tyr Leu Glu Val Phe Ser Asp Trp

100 105 110

Leu Leu Leu Gln Ala Ser Ala Glu Val Val Met Glu Gly Gln Pro Leu

115 120 125

Phe Leu Arg Cys His Gly Trp Arg Asn Trp Asp Val Tyr Lys Val Ile

130 135 140

Tyr Tyr Lys Asp Gly Glu Ala Leu Lys Tyr Trp Tyr Glu Asn His Asn

145 150 155 160

Ile Ser Ile Thr Asn Ala Thr Val Glu Asp Ser Gly Thr Tyr Tyr Cys

165 170 175

Thr Gly Lys Val Trp Gln Leu Asp Tyr Glu Ser Glu Pro Leu Asn Ile

180 185 190

Thr Val Ile Lys Ala Pro Arg Glu Lys Tyr Trp Leu Gln Phe Phe Ile

195 200 205

Pro Leu Leu Val Val Ile Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly Leu Phe Ile

210 215 220

Ser Thr Gln Gln Gln Val Thr Phe Leu Leu Lys Ile Lys Arg Thr Arg

225 230 235 240

Lys Gly Phe Arg Leu Leu Asn Pro His Pro Lys Pro Asn Pro Lys Asn

245 250 255

Asn

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу использования генетически модифицированной мыши для определения терапевтического эффекта человеческого антитела, включающему введение человеческого антитела мыши. Указанная мышь содержит в своем геноме локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую один или более генный сегмент C_H, при этом константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит: генный сегмент С_γ2 человека, генный сегмент С_γ3 человека, генный сегмент С_μ человека или грызуна, генный сегмент С_δ человека или грызуна, генный сегмент С_ε человека или грызуна и/или генный сегмент С_α человека или грызуна. Изобретение эффективно для проведения доклинического тестирования комплексных терапевтических агентов. 27 з.п. ф-лы, 13 ил., 14 табл., 6 пр.

1. Способ использования генетически модифицированной мыши для определения терапевтического эффекта человеческого антитела, включающий введение человеческого антитела мыши, содержащей в своем геноме:

локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит:

(i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина; и

(ii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую один или более генный сегмент C_H, содержащий:

(a) генный сегмент C_H, кодирующий константный домен IgG, содержащий домен C_H1 IgG1 человека, шарнирную область IgG1 человека, домен C_H2 IgG1 человека, домен C_H3 IgG1 человека, трансмембранный домен IgG и цитоплазматический домен IgG; и/или

(b) генный сегмент C_H , кодирующий константный домен IgG, содержащий домен C_H1 IgG4 человека, шарнирную область IgG4 человека, домен C_H2 IgG4 человека, домен C_H3 IgG2 человека, трансмембранный домен IgG и цитоплазматический домен IgG, и, необязательно,

при этом константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит: генный сегмент С_γ2 человека, генный сегмент С_γ3 человека, генный сегмент С_μ человека или грызуна, генный сегмент С_δ человека или грызуна, генный сегмент С_ε человека или грызуна и/или генный сегмент С_α человека или грызуна,

причем вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина для вырабатывания мышью антител IgG, содержащих вариабельные домены, полученные из вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина, и константные домены тяжелой цепи, полученные из одного или более генных сегментов C_H,

причем вводимое человеческое антитело содержит домен С_Н1 человека, домен С_Н2 человека и домен С_Н3 человека изотипа человека, который присущ константной области тяжелой цепи иммуноглобулина мыши; и

определение терапевтической эффективности введенного человеческого антитела.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что трансмембранный домен IgG, кодируемый одним или более генными сегментами C_H, представляет собой трансмембранный домен IgG грызуна или человека.

3. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что цитоплазматический домен IgG, кодируемый одним или более генными сегментами C_H, представляет собой цитоплазматический домен IgG грызуна или человека.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что

(a) домен IgG1 кодируется аллелем, выбранным из IGHG1*01, IGHG1*02, IGHG1*03, IGHG1*04 и IGHG1*05;

(b) домен IgG4 кодируется аллелем, выбранным из IGHG4*01, IGHG4*02, IGHG4*03 и IGHG4*04;

(c) генный сегмент С_γ2 представляет собой аллель, выбранный из IGHG2*01, IGHG2*02, IGHG2*03, IGHG2*04, IGHG2*05 и IGHG2*06;

(с) генный сегмент С_γ3 представляет собой аллель, выбранный из IGHG3*01, IGHG3*02, IGHG3*03, IGHG3*04, IGHG3*05, IGHG3*06, IGHG3*07, IGHG3*08, IGHG3*09, IGHG3*10, IGHG3*11, IGHG3*12, IGHG3*13, IGHG3*14, IGHG3*15, IGHG3*16, IGHG3*17, IGHG3*18 и IGHG3*19,

и при этом константный домен тяжелой цепи человеческого антитела кодируется той же аллелью.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что

(a) один из генных сегментов C_H расположен в локусе эндогенного генного сегмента C_γ2a или C_γ2c и, необязательно, замещает эндогенный генный сегмент С_γ2а или С_γ2с;

(b) один из генных сегментов C_H расположен в локусе эндогенного генного сегмента C_γ1 и, необязательно, замещает эндогенный генный сегмент C_γ1;

(c) один из генных сегментов C_H расположен в локусе эндогенного генного сегмента C_γ3 и, необязательно, замещает эндогенный генный сегмент C_γ3; и/или

(d) один из генных сегментов C_H расположен в локусе эндогенного генного сегмента C_γ2b и, необязательно, замещает эндогенный генный сегмент C_γ2b.

6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина содержит генный сегмент С_μ человека, генный сегмент С_δ человека, генный сегмент С_γ3 человека и генный сегмент C_γ1 человека.

7. Способ по п. 6, отличающийся тем, что константная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит генный сегмент С_γ2 человека и генный сегмент С_γ4 человека.

8. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит интронный энхансер (E_i) грызуна или человека и/или 3' регуляторную область (3' РО) грызуна или человека.

9. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что локус тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит сайт переключения S_μ грызуна или человека, сайт переключения S_γ3 грызуна или человека, сайт переключения S_γ1 грызуна или человека, сайт переключения S_γ2b грызуна, сайт переключения S_γ2a грызуна, сайт переключения S_γ2c грызуна, сайт переключения S_γ2 человека, сайт переключения S_γ4 человека, сайт переключения S_ε грызуна или человека и/или сайт переключения S_α грызуна или человека.

10. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина содержит генный сегмент V_H грызуна, генный сегмент D_H грызуна и генный сегмент J_H грызуна, необязательно, при этом генный сегмент V_H грызуна, генный сегмент D_H грызуна и генный сегмент J_H грызуна представляют собой эндогенные генные сегменты мыши.

11. Способ по любому из пп. 1-9, отличающийся тем, что вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина содержит генный сегмент V_H человека, генный сегмент D_H человека и генный сегмент J_H человека.

12. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что локус тяжелой цепи иммуноглобулина расположен в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина, необязательно, при этом локус тяжелой цепи иммуноглобулина замещает весь или часть эндогенного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина.

13. Способ по п. 1, отличающийся тем, что генетически модифицированная мышь содержит в своем геноме:

эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит:

(i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H человека, генный сегмент D_H человека и генный сегмент J_H человека;

(ii) интронный энхансер (E_i) грызуна;

(iii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую:

(a) генный сегмент С_μ грызуна;

(b) генный сегмент С_δ грызуна;

(c) генный сегмент С_γ3 грызуна;

(d) генный сегмент C_γ1 грызуна;

(e) генный сегмент С_γ2b грызуна;

(f) модифицированный генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 IgG1 человека, шарнирную область IgG1 человека, домен C_H2 IgG1 человека, домен C_H3 IgG1 человека, трансмембранный домен IgG2a грызуна и цитоплазматический домен IgG2a грызуна;

(g) генный сегмент С_ε грызуна; и

(h) генный сегмент С_α грызуна; и

(iv) 3' регуляторную область (3' РО) грызуна,

причем вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина для вырабатывания мышью антител IgG, содержащих вариабельные домены, полученные из генного сегмента V_H человека, генного сегмента D_H человека и генного сегмента J_H человека, и константные домены тяжелой цепи, полученные из модифицированного генного сегмента C_H.

14. Способ по п. 1, отличающийся тем, что генетически модифицированная мышь содержит в своем геноме:

эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит:

(i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H человека, генный сегмент D_H человека и генный сегмент J_H человека;

(ii) интронный энхансер (E_i) грызуна;

(iii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую:

(a) генный сегмент С_μ грызуна;

(b) генный сегмент C_δ грызуна;

(c) генный сегмент С_γ3 грызуна;

(d) генный сегмент C_γ1 грызуна;

(e) генный сегмент C_γ2b грызуна;

(f) модифицированный генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 IgG1 человека, шарнирную область IgG1 человека, домен C_H2 IgG1 человека, домен C_H3 IgG1 человека, трансмембранный домен IgG1 человека и цитоплазматический домен IgG1 человека;

(g) генный сегмент С_ε грызуна; и

(h) генный сегмент С_α грызуна; и

(iv) 3' регуляторную область (3' РО) грызуна,

причем вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина для вырабатывания мышью антител IgG, содержащих вариабельные домены, полученные из генного сегмента V_H человека, генного сегмента D_H человека и генного сегмента J_H человека, и константные домены тяжелой цепи, полученные из модифицированного генного сегмента C_H.

15. Способ по п. 1, отличающийся тем, что генетически модифицированная мышь содержит в геноме:

эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит:

(i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H человека, генный сегмент D_H человека и генный сегмент J_H человека;

(ii) интронный энхансер (E_i) грызуна;

(iii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую:

(a) генный сегмент С_μ грызуна;

(b) генный сегмент С_δ грызуна;

(c) генный сегмент С_γ3 грызуна;

(d) модифицированный генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 IgG4 человека, шарнирную область IgG4 человека, домен C_H2 IgG4 человека, домен C_H3 IgG4 человека, трансмембранный домен IgG1 грызуна и цитоплазматический домен IgG1 грызуна;

(e) генный сегмент C_γ2b грызуна;

(f) генный сегмент С_γ2а и/или С_γ2с грызуна;

(g) генный сегмент С_ε грызуна; и

(h) генный сегмент С_α грызуна; и

(iv) 3' регуляторную область (3' РО) грызуна,

причем вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина для вырабатывания мышью антител IgG, содержащих вариабельные домены, полученные из генного сегмента V_H человека, генного сегмента D_H человека и генного сегмента J_H человека, и константные домены тяжелой цепи, полученные из модифицированного генного сегмента C_H.

16. Способ по п. 1, отличающийся тем, что генетически модифицированная мышь содержит в своем геноме:

эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит:

(i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H человека, генный сегмент D_H человека и генный сегмент J_H человека;

(ii) интронный энхансер (E_i) грызуна;

(iii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую:

(a) генный сегмент С_μ грызуна;

(b) генный сегмент С_δ грызуна;

(c) генный сегмент С_γ3 грызуна;

(d) модифицированный генный сегмент C_H, кодирующий домен C_H1 IgG4 человека, шарнирную область IgG4 человека, домен C_H2 IgG4 человека, домен C_H3 IgG4 человека, трансмембранный домен IgG4 человека и цитоплазматический домен IgG4 человека;

(e) генный сегмент С_γ2b грызуна;

(f) генный сегмент С_γ2а и/или С_γ2с грызуна;

(g) генный сегмент С_ε грызуна; и

(h) генный сегмент С_α грызуна; и

(iv) 3' регуляторную область (3' РО) грызуна,

причем вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина для вырабатывания мышью антител IgG, содержащих вариабельные домены, полученные из генного сегмента V_H человека, генного сегмента D_H человека и генного сегмента J_H человека, и константные домены тяжелой цепи, полученные из модифицированного генного сегмента C_H.

17. Способ по п. 1, отличающийся тем, что генетически модифицированная мышь содержит в своем геноме:

эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит:

(i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H человека, генный сегмент D_H человека и генный сегмент J_H человека;

(ii) интронный энхансер (E_i) человека;

(iii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую:

(a) генный сегмент С_μ человека;

(b) генный сегмент С_δ человека;

(c) генный сегмент С_γ3 человека; и

(d) генный сегмент C_γ1 человека; и

(iv) 3' регуляторную область (3' РО) грызуна,

причем вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина для вырабатывания мышью антител IgG, содержащих полностью человеческую тяжелую цепь.

18. Способ по п. 1, отличающийся тем, что генетически модифицированная мышь содержит в своем геноме:

эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит:

(i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H человека, генный сегмент D_H человека и генный сегмент J_H человека;

(ii) интронный энхансер (E_i) человека;

(iii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую:

(a) генный сегмент С_μ человека;

(b) генный сегмент С_δ человека;

(c) генный сегмент С_γ3 человека;

(d) генный сегмент C_γ1 человека;

(e) генный сегмент С_γ2 человека; и

(f) генный сегмент С_γ4 человека; и

(iv) 3' регуляторную область (3' РО) грызуна,

причем вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина для вырабатывания мышью антител IgG, содержащих полностью человеческую тяжелую цепь.

19. Способ по п. 1, отличающийся тем, что генетически модифицированная мышь содержит в своем геноме:

эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит:

(i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H грызуна, генный сегмент D_H грызуна и генный сегмент J_H грызуна;

(ii) интронный энхансер (E_i) грызуна;

(iii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую:

(a) генный сегмент С_μ человека;

(b) генный сегмент С_δ человека;

(c) генный сегмент С_γ3 человека; и

(d) генный сегмент C_γ1 человека; и

(iv) 3' регуляторную область (3' РО) грызуна,

причем вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина для вырабатывания мышью антител IgG, содержащих тяжелую цепь, содержащую вариабельный домен грызуна и константный домен человека.

20. Способ по п. 1, отличающийся тем, что генетически модифицированная мышь содержит в своем геноме:

эндогенный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит:

(i) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_H грызуна, генный сегмент D_H грызуна и генный сегмент J_H грызуна;

(ii) интронный энхансер (E_i) грызуна;

(iii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую:

(a) генный сегмент С_μ человека;

(b) генный сегмент С_δ человека;

(c) генный сегмент С_γ3 человека;

(d) генный сегмент C_γ1 человека;

(e) генный сегмент С_γ2 человека; и

(f) генный сегмент С_γ4 человека; и

(iv) 3' регуляторную область (3' РО) грызуна,

причем вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина для вырабатывания мышью антител IgG, содержащих тяжелую цепь, содержащую вариабельный домен грызуна и константный домен человека.

21. Способ по любому из пп. 1-20, отличающийся тем, что генетически модифицированная мышь дополнительно содержит в своем геноме:

локус цепи каппа (κ) иммуноглобулина, который содержит:

(1) вариабельную область цепи κ иммуноглобулина, содержащую генный сегмент V_κ человека и генный сегмент J_κ человека; и

(2) константную область цепи κ иммуноглобулина, содержащую генный сегмент С_κ человека,

причем вариабельная область цепи κ иммуноглобулина функционально связана с константной областью цепи κ иммуноглобулина для вырабатывания мышью антител, содержащих вариабельные домены легкой цепи, полученные из генного сегмента V_κ человека и генного сегмента J_κ человека, и константные домены легкой цепи, полученные из генного сегмента С_κ человека,

при этом тестируемое человеческое антитело содержит легкую цепь κ.

22. Способ по п. 21, отличающийся тем, что локус цепи κ иммуноглобулина расположен в эндогенном локусе цепи κ иммуноглобулина, и, необязательно, при этом локус цепи κ иммуноглобулина замещает весь или часть эндогенного локуса цепи κ иммуноглобулина.

23. Способ по любому из пп. 1-20, отличающийся тем, что генетически модифицированная мышь дополнительно содержит в своем геноме:

локус цепи лямбда (λ) иммуноглобулина, который содержит:

генный сегмент V_λ человека, генный сегмент J_λ человека и генный сегмент С_λ человека,

причем генный сегмент V_λ человека и генный сегмент J_λ человека функционально связаны с генным сегментом С_λ человека для вырабатывания мышью антител, содержащих вариабельные домены легкой цепи, полученные из генного сегмента V_λ человека и генного сегмента J_λ человека, и константные домены легкой цепи, полученные из генного сегмента С_λ человека,

при этом тестируемое человеческое антитело содержит легкую цепь λ.

24. Способ по п. 23, отличающийся тем, что локус цепи λ иммуноглобулина расположен в эндогенном локусе цепи λ иммуноглобулина, и, необязательно, при этом локус цепи λ иммуноглобулина замещает весь или часть эндогенного локуса цепи λ иммуноглобулина.

25. Способ по любому из пп. 1-24, отличающийся тем, что генетически модифицированная мышь дополнительно содержит в своем геноме:

(a) локус неонатального Fc-рецептора (FcRn), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcRn, содержащий внеклеточный домен человека, трансмембранный домен человека или грызуна и цитоплазматический домен человека или грызуна, необязательно, при этом последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcRn, расположена в эндогенном локусе FcRn грызуна;

(b) локус β-2-микроглобулина (β2М), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую человеческий или гуманизированный полипептид β-2-микроглобулина (β2М), необязательно, при этом последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая человеческий или гуманизированный полипептид β2М, расположена в эндогенном локусе β2М грызуна;

(c) локус Fc-эпсилон-рецептора 1 альфа (FcεR1α), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcεR1α, содержащий внеклеточный домен человека, трансмембранный домен человека или грызуна и цитоплазматический домен человека или грызуна, необязательно, при этом последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcεR1α, расположена в эндогенном локусе FcεR1α грызуна;

(d) локус Fc-гамма-рецептора 1а (FcγR1a), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcγR1a, содержащий внеклеточный домен человека, трансмембранный домен человека или грызуна и цитоплазматический домен человека или грызуна, необязательно, при этом последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγR1a, расположена в эндогенном локусе FcγR1a грызуна;

(e) локус Fc-гамма-рецептора 2а (FcγR2a), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcγR2a человека, необязательно, при этом последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγR2a, расположена в эндогенном локусе FcγR2a грызуна;

(f) локус Fc-гамма-рецептора 3a (FcγR3a), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcγR3a человека, необязательно, при этом последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγR3a, расположена в эндогенном локусе низкоаффинного FcγR грызуна;

(g) локус Fc-гамма-рецептора 3b (FcγR3b), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcγR3b человека, необязательно, при этом последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγR3b, расположена в эндогенном локусе низкоаффинного FcγR грызуна; и/или

(h) локус Fc-гамма-рецептора 2с (FcγR2c), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид FcγR2c человека, необязательно, при этом последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид FcγR2c, расположена в эндогенном локусе низкоаффинного FcγR грызуна.

26. Способ по любому из пп. 1-25, дополнительно включающий определение одного или более фармакокинетических свойств вводимого человеческого антитела.

27. Способ по любому из пп. 1-25, дополнительно включающий введение некоторого количества доз человеческого антитела и определение терапевтической эффективности, безопасности и/или переносимости каждой дозы человеческого антитела.

28. Способ по любому из пп. 1-25, дополнительно включающий определение иммунного ответа, вырабатываемого мышью против человеческого антитела.