СПОСОБ ПОДГОТОВКИ ТКАНИ МОЗГА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЛИКОЗАМИНОГЛИКАНОВ Российский патент 2000 года по МПК G01N33/48 G01N1/30 G01N1/28 

Изобретение относится к медицине, а именно к морфологии и может быть использовано для гистохимических исследований гликозаминогликанов (ГАГ) тканей.

В настоящее время для выявления ГАГ в тканях используют биохимические, гистохимические и электронно-гистохимические методы. Биохимические методы очень трудоемкие, сложные и дорогие, хотя и позволяют получить качественные и количественные результаты и выделить ГАГ в "чистом" виде, но не позволяют проследить взаимосвязь ГАГ с клеточными структурами и другими неклеточными компонентами (Слуцкий Л. И. Биохимия нормальной и патологически измененной соединительной ткани. Л. : Медицина, 1969. - 376 с.). Известные гистохимические методы (Луппа Х. Основы гистохимии. М.: Мир, 1980, с. 136-137.) определения ГАГ в тканях позволяют выявить их все, т.е. суммарно, но не позволяют разделить на классы и определить процентное соотношение разных классов ГАГ (гиалуроновая кислота, хондроитин, хондроитин-4-сульфат, хондроитин-6-сульфат, дерматан-сульфат, гепарин, гепаран-сульфат, кератан-сульфат) в ткани. Электронно-гистохимические методы (Гайер И. Электронная гистохимия. М. : Мир, 1974, с. 52-71) исследования ГАГ очень сложные, трудоемкие и дорогие, хотя они и позволяют не только выявить ГАГ, но изучить их расположение в цитоплазме клеток и межклеточном матриксе. Этот метод не позволяют дифференцировать ГАГ по классам.

Актуальной задачей исследователей остается разработка простого и широкодоступного способа подготовки тканей для выявления ГАГ, дифференцировки по классам, определения их процентного содержания, соотношения между собой и особенности локализации в межклеточном веществе тканей.

Прототипом изобретения является способ выявления ГАГ при окрашивании тканей альциановым синим (Луппа Х. Основы гистохимии. М.: Мир, 1980, с. 135-138. ). Этот способ позволяет определить присутствие сульфатированных и несульфатированных ГАГ в тканях, для этого используют 1%-ный раствор альцианового синего при pH 1,0 и pH 2,5.

Однако применение этого способа не позволяет отдифференцировать ГАГ по классам, отсутствует возможность получения процентного содержания ГАГ в тканях, не позволяет получить процентное соотношение разных классов ГАГ в тканях между собой и проследить особенности локализации разных классов ГАГ в ткани.

Целью изобретения является выявление и дифференцировка ГАГ по классам в тканях, определения их процентного содержания и соотношения между собой, выявления особенностей локализации разных классов ГАГ в ткани мозга, что позволяет упростить существующие методы, снизить себестоимость и повысить эффективность результатов.

Данная цель достигается способом подготовки тканей для определения ГАГ на денситометре путем окрашивания их, отличающийся тем, что стандартные гистологические срезы помещают на 30 минут в 0,35%-ный раствор альцианового синего с pH от 1,0 до 4,0 (с добавлением 0,9% NaCl в качестве электролита) и MgCl₂ с молярностью от 0,1 до 1,0 с ферментативным контролем и метилированием.

Способ подготовки ткани мозга для определения ГАГ и дифференцировки их по классам (гиалуроновая кислота, хондроитин, хондроитин-4-сульфат, хондроитин-6-сульфат, дерматан-сульфат, гепарин, гепаран-сульфат, кератан-сульфат) осуществляется следующим образом.

Ткань мозга забирается через 15-20 минут после смерти и помещается в замораживающий криостат, на котором получают стандартные срезы (в большом количестве), толщиной 10 мкм и переносят их на предметные стекла.

Затем 1-ю серию срезов окрашивают в 0,35%-ном растворе альцианового синего при pH 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5 и 4,0 (pH растворов до требуемых доводилась HCl, концентрация которых составляла - от 3,65% до 0,91% HCl) в течение 30 минут (все растворы красителя содержат также 0,9% NaCl в качестве электролита) при температуре 18-23^oC.

После этого 2-ю серию срезов помещают в 0,35%-ный раствор альцианового синего при pH от 1,0 до 4,0, но с добавлением MgCl₂, имеющим молярности от 0,1 до 1,0 MgCl₂ (0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9 и 1,0 MgCl₂ в каждом растворе с разными pH) на 30 минут при температуре 18-23^oC.

Затем 3-я серия срезов обрабатывается тестикулярной гиалуронидазой (другую часть срезов - обрабатывают бактериальной гиалуронидазой). Срезы обрабатываются в растворе, состоящем из 0,6 мг/мл тестикулярной гиалуронидазы в 0,1 н. фосфатном буфере (pH 6,0), в течение 4-6 часов при температуре 37^oC. (Ферменты разводят на физиологическом растворе. Для этого в 100 мл дистилированной воды растворяют 0,85 г хлористого натрия, а затем добавляют 30 мл ферментного препарата с учетом того, что для гиалуронидазы оптимальная концентрация NaCl лежит между 0,07 - 0,17 М).

Далее 4-я часть срезов инкубируется в течение 6 - 15 часов при температуре 37^oC, в растворе, содержащим 15 ед. бактериальной гиалуронидазы в 1 мл 0,3%-ного раствора хлористого натрия.

Затем эти срезы окрашивают в течение 1,5 часа в 0,35%-ном растворе альцианового синего при pH от 1,0 до 4,0 с MgCl₂ (во всех красителях), имеющим молярности - 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9 и 1,0 MgCl₂ при температуре 18-23^oC (В этих сериях - срезы ткани мозга окрашиваются при разных pH и молярностях MgCl₂ - см. указанные выше).

Пятая часть срезов мозга переносится в метиловый спирт для метилирования (Луппа Х. , 1980, с. 185-187.). Срезы мозга помещают на 4 часа при 60^oC в метиловый спирт, содержащий 0,1 г-экв соляной кислоты (1 мл соляной кислоты с уд. весом 1,19 в 99 мл метанола). Затем срезы переносят в 70%-ный этанол на 10-20 минут при температуре 18-23^oC, после чего помещают в воду на 1-5 минут при той же температуре.

Затем срезы окрашивают в 0,35%-ном растворе альцианового синего при pH от 1,0 до 4,0 с MgCl₂ (во всех красителях), имеющим молярности - 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9 и 1,0 (В этой серии - срезы ткани мозга также окрашиваются при разных pH и молярностях MgCl₂ - см. указанные выше).

Шестая часть срезов мозга обрабатывается пепсином и трипсином для удаления белков. Инкубацию гистологических срезов мозга осуществляют в 0,5%-ном растворе пепсина в 0,1 н. HCl (раствор имеет pH 1,2) в течение 5-30 минут при температуре 37^oC. Другую серию срезов помещают в 0,3%-ный раствор трипсина в воде при pH 8,0 в течение 1-23 часов при температуре 37^oC. Затем все гистологические срезы промывают водой в течение 5-30 минут при температуре 18-23^oC, после этого их окрашивают в течение 30 минут в 0,35%-ном растворе альцианового синего при разных его pH и разных молярностях MgCl₂ (см. выше).

В седьмой серии - срезы мозга инкубировали с пепсином и трипсином (см. выше), промывали водой, потом обрабатывали тестикулярной гиалуронидазой (см. выше) и окрашивали в течение 1 часа в 0,35%-ном растворе альцианового синего при разных pH и разных молярностях MgCl₂ (см. выше).

Все окрашенные срезы мозга промывают в воде - 5 минут, обезвоживают по стандартной методике в ряду спиртов возрастающей концентрации, помещают в ксилол и заливают в бальзам.

Затем проводят денситометрические исследования всех окрашенных срезов, которые анализируются на анализаторе фореграмм - АФ-1. Анализ осуществляется следующим образом. Серия резов размещается по одной линии на сканирующем столике между лучом проходящего света и анализатора. На экране монитора результат сканирования гистологических срезов мозга представлен графически с указанием процентного содержания и соотношения исследуемого вещества.

Пример. Ткань мозга забирается через 15 минут после смерти и помещается в криостат, на котором получают стандартные срезы (в большом количестве), толщиной 10 мкм и переносят их на предметные стекла.

Затем срезы окрашивают в 0,35%-ном растворе альцианового синего при pH 1,0 (концентрация раствора HCl - 3,65%) в течение 30 минут (раствор красителя содержат также 0,9% NaCl в качестве электролита) при температуре 18^oC.

После этого другая часть срезов помещается в 0,35%-ный раствор альцианового синего при pH 1,0, но с добавлением MgCl₂, имеющим молярность - 0,1 М MgCl₂ на 30 минут при температуре 18^oC.

Затем часть срезов обрабатывается тестикулярной гиалуронидазой (другую часть срезов - обрабатывают бактериальной гиалуронидазой). Срезы обрабатываются в растворе, состоящем из 0,6 мг/мл тестикулярной гиалуронидазы в 0,1 н. фосфатном буфере (pH 6,0), в течение 4 часов при температуре 37^oC. (Ферменты разводят на физиологическом растворе. Для этого в 100 мл дистиллированной воды растворяют 0,85 г хлористого натрия, а затем добавляют 30 мл ферментного препарата).

Другая часть срезов инкубируется в течение 6 часов при температуре 37^oC, в растворе, содержащем 15 ед. бактериальной гиалуронидазы в 1 мл 0,3%-ного раствора хлористого натрия.

Затем срезы окрашивают в течение 1,5 часа в 0,35%-ном растворе альцианового синего при pH 1,0 с 0,1 М MgCl₂ при температуре 18^oC.

Другая часть срезов мозга переносится в метиловый спирт для метилирования. Срезы мозга помещают на 4 часа при 60^oC в метиловый спирт, содержащий 0,1 г-экв соляной кислоты (1 мл соляной кислоты с уд. весом 1,19 в 99 мл метанола). Затем срезы переносят в 70%-ный этанол на 20 минут при температуре 18^oC, после чего помещают в воду на 5 минут при той же температуре.

Затем срезы окрашивают в 0,35%-ном растворе альцианового синего при pH 1,0 с 0,1 М MgCl₂.

Следующая часть срезов мозга обрабатывается пепсином и трипсином для удаления белков. Инкубацию гистологических срезов мозга осуществляют в 0,5%-ном растворе пепсина в 0,1 н. HCl (раствор имеет pH 1,2) в течение 30 минут при температуре 37^oC. Другую серию срезов помещают в 0,3%-ный раствор трипсина в воде при pH 8,0 на 1 час при температуре 37^oC. Затем все гистологические срезы промывают водой в течение 30 минут при температуре 18^oC, после этого их окрашивают в течение 30 минут в 0,35%-ном растворе альцианового синего при pH 1,0 с 0,1 М MgCl₂.

В следующей серии - срезы мозга инкубировали с пепсином и трипсином (см. выше), промывали водой, потом обрабатывали тестикулярной гиалуронидазой (см. выше) и окрашивали в течение 1 часа в 0,35%-ном растворе альцианового синего при pH 1,0 с 0,1 М MgCl₂.

Все окрашенные срезы мозга промывают в воде - 5 минут, обезвоживают по стандартной методике в ряду спиртов возрастающей концентрации, помещают в ксилол и заливают в бальзам.

Затем проводят денситометрические исследования всех окрашенных срезов, которые анализируются на анализаторе фореграмм - АФ-1.

Первоначально проводят дифференцировку сульфатированных и не сульфатированных ГАГ, при этом выявляют интенсивное голубое окрашивание межклеточного матрикса при pH 1,0 - 4,0, которое исчезает при pH 2,5 - 4,0 - после обработки бактериальной и тестикулярной гиалуронидазой.

Таким образом, можно предположить наличие в ткани гиалуроновой кислоты, хондроитин-4-сульфата и хондроитин-6-сульфата.

При pH 1,0 наблюдается умеренное окрашивание в голубой цвет межклеточного матрикса. После обработки трипсином интенсивность окраски увеличивается, что свидетельствует о возможном присутствии сульфатированных ГАГ (гепаран-сульфат, гепарин, кератан-сульфат).

Затем проводят дифференцировку ГАГ между гиалуроновой кислотой и хондроитин-сульфатами. Срезы перед окрашиванием обрабатываются метанолом, связывающим сульфатные группы.

Было показано, что основное вещество содержит ГК, т. к. оно окрашивается в голубой цвет после обработки метанолом. В волокнистых структурах голубое окрашивание исчезало, что позволяет отметить в них содержание хондроитин-сульфатов.

Далее проводят дифференцировку сульфатированных ГАГ. Голубое окрашивание волокнистых структур обнаруживается только после предварительной обработки препаратов трипсином при окраске их альциановым синим при 0,2 М и 0,4 М раствора MgCl₂ и постепенно нарастает в 0,8 М и 1,0 М растворе MgCl₂. На срезах межклеточное вещество ткани мозга при pH 0,2 М MgCl₂ слабо окрашивалось альциановым синим в голубой цвет по сравнению с 1,0 М MgCl₂.

После этого осуществляется дифференцировка сульфатированных ГАГ в ткани мозга, для чего препараты сначала обрабатываются пепсином, а затем тестикулярной гиалуронидазой, и окрашиваются альциановым синим. Голубое окрашивание в межклеточных структурах позволяет сделать вывод о присутствии в них сульфатированных ГАГ, устойчивых к действию гиалуронидазы. На экране денситометра наблюдается кривая с указанием процентного содержания исследуемого вещества - гиалуроновая кислота - 48,5%, хондроитин-4-сульфат - 17,7%, хондроитин-6-сульфат - 13,5%, гепарин и гепаран-сульфат - 20,3%. Полученные данные были подтверждены биохимическими и электрофоретическими исследованиями.

Альциановый синий 8 GS (8 GX) образует с полианионами сильноокрашенные нерастворимые в воде пигменты. Специфичность окрашивания альциановым синим можно контролировать. При этом играют роль три следующих фактора: условия окрашивания, предварительная химическая и ферментативная обработка. Так, при длительном окрашивании (4-12 часов) выявляются почти все компоненты ткани, тогда как при менее длительном (около 30 минут) удается более или менее специфично выявить ГАГ эпителиального и соединительно-тканного происхождения. Различия между сульфатированными и несульфатированными ГАГ наиболее надежно устанавливаются при определенных значениях pH раствора красителя и при добавлении электролитов. Использование раствора красителя с pH 1,0 позволяет выявить лишь кислые ГАГ с сульфатными и сульфоновыми группами, тогда как при pH 2,0 и более выявляются главным образом протеогликаны, содержащие группы уроновой кислоты. Протеогликаны, содержащие сульфатированные и карбоксильные группы, связывают альциановый синий при более низких концентрациях электролитов (концентрация MgCl₂ ниже 0,3 М), тогда как при концентрациях MgCl₂ 0,8 М и выше окрашиваются исключительно протеогликаны, содержащие SO₄-группы. И наконец, в присутствии электролитов (HCl, NaCl, KCl) окрашивание альциановым синим усиливается. Влияние электролитов на связывание альцианового синего свидетельствует в пользу ведущей роли электростатических сил при связывании альцианового синего с субстратом.

При метилировании срезов ткани в течение 6 часов полностью снимается ее базофилия. Базофилия цитоплазмы, обусловленная COOH-группами и РНК, снимается через 30 минут, а базофилия, обусловленная присутствием сульфатированных ГАГ - через 4 часа.

Окрашивание, присутствующее в контрольных срезах и отсутствующее в срезах, обработанных гиалуронидазой, свидетельствует о наличии гиалуроновой кислоты и хондроитинсульфатов.

Часто применяют два вида гиалуронидазы: тестикулярную и бактериальную. Бактериальная действует на гиалуроновую кислоту, тестикулярная обладает более широким спектром действия и расщепляет хондроитин-4,6-сульфаты (на дерматансульфаты, кератансульфаты и гепарин ни одна гиалуронидаза не действует). При длительном воздействии (24-48 часов) тестикулярная гиалуронидаза может вызывать также гидролиз муко- и гликопротеидов.

Переваривание гиалуронидазой может усиливать или вызывать предварительное окисление некоторых структур уксусной кислотой. Добавление NaCl усиливает активность фермента.

Предлагаемый способ подготовки ткани мозга для определения гликозаминогликанов не требует дорогого оборудования и реактивов, обладает по сравнению с прототипом следующими преимуществами: позволяет подготовить ткани таким образом, что по изменению ее окрашивания в межклеточном пространстве можно определить разные классы ГАГ и выявить их локализацию, определить их процентное содержание и соотношение разных классов ГАГ между собой.

Способ может быть использован в медицине, а именно в морфологии для гистохимических исследований гликозаминогликанов тканей. С помощью денситометра проводят дифференцировку гликозаминогликанов по классам, с предварительным окрашиванием гистологических срезов стандартной толщины альциановым синим при рН от 1,0 до 4,0 с добавлением в качестве электролитов растворов NaCl с концентрацией 0,9% и MgCl₂ с молярностью от 0,1 до 1,0 с ферментативным контролем и метилированием. Способ позволяет выявить и дифференцировать гликозаминогликаны по классам в тканях, определить их процентное содержание и соотношение между собой, выявить особенности локализации разных классов гликозаминогликанов в ткани мозга, что позволяет упростить существующие методы, снизить себестоимость и повысить эффективность результатов.

Способ подготовки ткани мозга для определения гликозаминогликанов, путем окрашивания тканей альциановым синим, отличающийся тем, что стандартные гистологические срезы помещают на 30 мин в 0,35% раствор альцианового синего с pH от 1,0 до 4,0 затем добавляют в качестве электролитов растворы 0,9% NaCl и 0,1 - 1,0 M MgCl₂, проводят ферментативный контроль, метилирование и денситометрический анализ.