Способ окрашивания триптаза-позитивных тучных клеток в микропрепаратах тканей c докрашиванием раствором Май-Грюнвальда Российский патент 2022 года по МПК G01N1/28 G01N1/30 G01N33/53 G01N33/577 

Изобретение относится к области клеточной биологии, цитологии, гистологии, позволяет при окрашивании в несколько этапов визуализировать как триптаза-негативные, так и триптаза-позитивные тучные клетки, в том числе метахроматически окрашенные.

Каждый орган обладает специализированными клеточными ансамблями тканей, которые используют для поддержания местного гомеостаза собственные регуляторные механизмы. В управлении клеточными кооперациями принимают активное участие тучные клетки (ТК), осуществляя мониторинг большинства ключевых параметров клеточного микроокружения. Уникальность ТК заключается в сочетании адаптированного сенсорного аппарата к информационно значимым сигналам интегративно-буферной метаболической среды и полифункционального эффекторного аппарата, представленного секретомом. Особое значение представляют собой специфические протеазы тучных клеток - триптаза и химаза, секреторные пути которых представляют собой различные варианты выведения веществ во внеклеточный матрикс с высокой избирательностью на внешние вызовы [Atiakshin D., Buchwalow I., Samoilova V., Tiemann M. Tryptase as a polyfunctional component of mast cells. Histochemistry and Cell Biology. 2018, 149(5), 461-477; Atiakshin D., Samoilova V., Buchwalow I., Boecker W., Tiemann M. Characterization of mast cell populations using different methods for their identification. Histochem Cell Biol. 2017; 147(6): 683-694].

На сегодняшний день возможности морфологического анализа популяции тучных клеток в светлопольной микроскопии с одновременной иммуногистохимической детекцией триптаза-позитивных тучных клеток ограничены.

Известна методика иммуногистохимической идентифицикации триптазы тучных клеток мышиными моноклональными антителами Anti-MastCellTryptaseantibody, AbCam, разведение не менее 1:2000, согласно стандартному протоколу [Buchwalow IB, Boöcker W. Immunohistochemistry: Basics and Methods. 1st ed. London: New York: Springer; ISBN 978-3-642-04609-4; 2010. URL: https://www.springer.com/gp/book/9783642046087 (дата обращения 10.02.2021)]. Гомологичные мышиные иммуноглобулины блокируются при предварительной инкубации срезов с неконъюгированными Fab-фрагментами Goatanti-mouseIgG, JacksonImmunoResearh, разведение не менее 1:13. Для светлопольной микроскопии связанные первичные антитела детектируются с помощью пероксидазы хрена AmpliStain™ HorseradishPeroxidaseconjugates (SDTGmbH, Baesweiler, Germany) в соответствии с инструкцией производителя. В дальнейшем ферментную метку визуализируют набором с 3,3'-диаминобензидином в качестве субстрата DABsubstratekit, VectorLaboratories, Burlingame, СА, USA). Срезы докрашивают гематоксилином Майера и эозином, далее заключают в монтажную среду.

Недостатки метода: идентифицируются только ТК содержащие гранулы с триптазой. При малой наполненности триптаза-позитивными гранулами ТК могут идентифицироваться как свободнолежащие гранулы или цитопласт. Невозможно визуализировать триптаза-негативные ТК.

Способ иммунофлуоресцентной детекции триптазы в тучных клетках включает несколько стадий [Buchwalow IB, Boöcker W. Immunohistochemistry: Basics and Methods. 1st ed. London: New York: Springer; 2010. URL: https://www.springer.com/gp/book/9783642046087 (дата обращения 10.02.2021) ISBN 978-3-642-04609-4]. Инкубация с первичными антителами к триптазе в разведении 1:2000 проводится в течение двенадцати часов при температуре +4°С. Связанные антитриптазные первичные антитела в рабочей концентрации 10 мг/мл PBS визуализируют с помощью козьих вторичных антител, конъюгированных с Су3, СуТМ3-conjugatedAffinPureGoatAntiMouseIgG и используют соответствующий набор фильтров. Ядра контрастируют неинтеркалирующим красителем DAPI, после чего срезы заключают в монтажную среду Vectashield (Vector Laboratories, Burlingame, США). Иммунофлуоресцентную маркировку выполняют в соответствии со стандартными протоколами.

Недостатки: метод позволяет выполнить анализ триптазного профиля ТК, однако визуализировать триптаза-негативные ТК с его помощью невозможно. Данная методика, рассчитанная на использование иммунофлуоресцентной микроскопии в темном поле с использованием специальных фильтров и подсветок на микроскопе. Соответственно невозможно использование ее в лабораториях не имеющих специального оборудования, в том числе и в патологоанатомических бюро, клинических гистологических лабораториях.

Широко известен способ окрашивания по Май-Грюнвальду для дифференциального окрашивания форменных элементов крови [найдено в интернет http://labx.narod.ru/documents/okraska_po_maj_gryunvaldu.html, дата обращения 02.02.2021]. Существует несколько вариантов техники исполнения. Согласно инструкции производителя ООО «ЭргоПродашкн» (Россия) мазки просушивают на воздухе в течение 5 минут. Затем погружают в раствор Май-Грюнвальда на 5 минут, обрабатывают рабочим раствором Гимзы в течение 15 минут и промывают под проточной водой в течение 5-30 секунд. Затем мазки просушивают на воздухе.

Согласно инструкции производителя ООО «Минимед» (Россия) мазки погружают на 10-15 минут в разведенный раствор Май-Грюнвальда, далее промывают фосфатным буфером или водой, высушивают. Ядра клеток красно-фиолетовые/розовые, цитоплазма базофилов от голубой до темно-синей, цитоплазма эозинофилов от бледно-красной до розовой, полихроматофильная цитоплазма от серой до фиолетовой, ацидофильные гранулы - оранжевые, нейтрофильные гранулы темно-коричневые/розовые, базофильные гранулы темно-фиолетовые, азурофильные гранулы от пурпурных до пурпурно-фиолетовых. При окрашивании срезов красителем Май-Грюнвальд ТК приобретают метахроматическую фиолетовую окраску.

Сведений об использовании красителя Май-Грюнвальда для анализа триптазного профиля тучных клеток в доступной литературе мы не обнаружили.

Методики иммуногистохимического окрашивания, с докрашиванием гематоксилином Майера и эозином, а так же окрашивание по Май-Грюнвальду, не позволяют объективно оценить уровень экспрессии триптазы в популяции тучных клеток.

Технический результат - идентификация общей популяции тучных клеток в светлопольной микроскопии с одновременной иммуногистохимической детекцией триптаза-позитивных тучных клеток, объективная характеристика функциональной активности ТК (фиг. 1).

Способ позволяет визуализировать биогенез и секреторные пути триптазы ТК, цитотопографию ее гранул и их направленную миграцию от ядра к плазматической мембране (фиг. 2).

Технический результат достигают окрашиванием микропрепаратов в два этапа, при этом на втором этапе вместо стандартного докрашивания гематоксилином Майера используют окраску по Май-Грюнвальду.

На первом этапе проводят иммуногистохимическую детекцию триптазы согласно стандартному подходу [Buchwalow IB, Boöcker W. Immunohistochemistry: Basics and Methods. 1st ed. London: New York: Springer; 2010. URL: https://www.springer.com/gp/book/9783642046087 (дата обращения 10.02.2021) ISBN 978-3-642-04609-4]. Срезы депарафинизируют и инкубируют с моноклональными антителами в течение двенадцать часов. Затем наносят вторичные антитела которые выявляют реагентом согласно инструкции производителя. В результате при завершении первого этапа методики на микропрепаратах визуализируют только триптаза-позитивные ТК, отдельно лежащие гранулы триптазы либо фрагменты цитоплазмы.

На втором этапе срезы докрашивают для выявления метахромазии клеток раствором Май-Грюнвальда по предложенным нами модифицированным протоколам.

Второй этап окрашивания осуществляют следующим образом.

На срезы ткани, промытые в дистиллированной воде, после иммуногистохимического окрашивания, незамедлительно, не допуская высыхания препарата после первого этапа окрашивания, наносят 1,5-2 мл раствора Май-Грюнвальда, оставляют на 5 минут.

Промывают в 0,4-0,8% растворе ледяной уксусной кислоты, не менее 5 погружений, под контролем микроскопа.

Последующие этапы окраски осуществляют согласно стандартам, рекомендованным производителем, а именно: обезвоживают в трех спиртах посменно: 1 спирт - не более минуты, 2 спирт - не более 2-х минут, 3 спирт - не более 3-х минут; просветляют в трех порциях О-Ксилола не более, чем по 3 минуты; наносят на препарат монтажную среду; покрывают препарат покровным стеклом.

В процессе отработки технологии окрашивания нами установлено, что без этапа промывания препарата в 0,4-0,8% ледяной уксусной кислоте специфического окрашивания на метахромазию получить невозможно.

Использованный методический прием сочетания иммуногистохимического и гистохимического протоколов окрашивания позволяет провести одновременную идентификацию популяции тучных клеток с визуализацией триптаза-позитивных ТК.

Таким образом, методика двойного окрашивания позволяет проводить количественный анализ триптаза-негативных и триптаза-позитивных тучных клеток. В свою очередь, в зависимости от количества триптаза-содержащих гранул ТК можно разделить на несколько групп: ТК с единичными гранулами; ТК с гранулами, занимающими 1/3, 2/3 либо весь объем цитоплазмы клетки. Это способствует более полному изучению популяции ТК в разных органах и тканях.

Окрашенные по предложенной методике препараты изучали на микроскопе ZEISS Axio Imager.A2 с системой фотодокументирования изображений. Работа выполнена на базе НИИ экспериментальной биологии и медицины ФГБОУ ВО ВГМУ им. Н.Н. Бурденко Минздрава России в строгом соответствии с Конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других целей (г. Страсбург, Франция, 1986), приказом Минздравсоцразвития РФ от 23.08.2010 №708н «Об утверждении Правил лабораторной практики», приказом Минздрава СССР №755 от 12 августа 1977 года «О мерах по дальнейшему совершенствованию форм работы с использованием лабораторных животных».

Установлено, что детекция триптаза-позитивных ТК с докрашиванием раствором Май-Грюнвальда позволяет визуализировать триптаза-позитивные и триптаза-негативные ТК, метахроматично окрашенные ТК и ТК, содержащие триптазу (фиг. 1). Количество триптаза-позитивных гранул в тучных клетках может существенно различаться - от единичных до полного заполнения цитоплазмы (фиг. 2). Триптаза-позитивные тучные клетки контактируют с гранулярным лейкоцитом, а также располагаются вблизи клеток фибробластического дифферона и солокализуются с нейтрофильными гранулоцитами и фибробластом.

Метод позволяет повысить точность оценки триптазного профиля популяции тучных клеток с учетом цитотопографии гранул с триптазой и их направленной миграции от ядра к плазматической мембране при использовании светлопольной микроскопии, а также интерпретировать иммуномодулирующие свойства тучных клеток благодаря оценке их солокализации с определенными лейкоцитами в специфическом тканевом микроокружении.

Использование светлопольной микроскопии, позволяет прибегать к предложенной методике большому количеству лабораторий.

Описание к фигурам.

Фиг. 1. Гистотопография тучных клеток. Фиксация - 10% нейтральный формалин. Масштабный отрезок: 50 мкм. Иммуногистохимическое окрашивание на триптазу тучных клеток (ТК) с докрашиванием раствором Май-Грюнвальда. А - участок скопления триптаза-позитивных ТК, коричневое окрашивание; Б - участок скопления метахроматично окрашенных в розово-фиолетовый цвет ТК, не содержащих триптазу.

1 - Тучные клетки, содержащие гранулы триптазы имеют коричневое окрашивание, интенсивность которого увеличивается при увеличении числа гранул с триптазой в клетке.

2 - Тучные клетки не содержащие триптазу, при окрашивании приобретают имеют розово-фиолетовый оттенок

Фиг. 2. Типы тучных клеток с различным уровнем экспрессии триптазы. Фиксация -10% нейтральный формалин. Иммуногистохимическое окрашивание на триптазу ТК с докрашиванием по Май-Грюнвальду.

1 - Тучные клетки, содержащие гранулы триптазы, имеют коричневое окрашивание, интенсивность которого увеличивается при увеличении числа гранул с триптазой в клетке.

2 - Тучные клетки, не содержащие гранул с триптазой при окрашивании приобретают розово-фиолетовый оттенок

3 - Ядро тучной клетки, окрашено в синий цвет

4 - Тучная клетка, не содержащая гранул с тритазой

5 - Тучная клетка в которой триптаза-позитивные гранулы, имеющие коричневое окрашивание, занимают около трети объема цитоплазмы

6 - Тучная клетка, в которой триптаза-позитивные гранулы занимают практически весь объем цитоплазмы.

Изобретение относится к медицине, а именно к клеточной биологии, цитологии, гистологии, и может быть использовано для окрашивания триптаза-позитивных тучных клеток в микропрепаратах тканей с докрашиванием раствором Май-Грюнвальда. Проводят депарафинизацию срезов и их окрашивание иммуногистохимическим методом с использованием моноклональных антител, нанесением вторичных антител, выявляемых реагентом, с последующим гистохимическим окрашиванием раствором Май-Грюнвальда. После иммуногистохимического окрашивания, не допуская высыхания препарата, на него наносят 1,5-2 мл раствора Май-Грюнвальда, оставляют на 5 минут, после чего погружают в 0,4-0,8% раствор ледяной уксусной кислоты не менее 5 раз. Способ обеспечивает возможность иденификации общей популяции тучных клеток в светлопольной микроскопии с одновременной иммуногистохимической детекцией триптаза-позитивных тучных клеток, объективной характеристикой функциональной активности тучных клеток, за счет объективной оценки уровня экспрессии триптазы в популяции тучных клеток благодаря заявленному способу окрашивания тканей. 2 ил.

Способ окрашивания триптаза-позитивных тучных клеток в микропрепаратах тканей с докрашиванием раствором Май-Грюнвальда, включающий депарафинизацию срезов и их окрашивание иммуногистохимическим методом с использованием моноклональных антител, нанесением вторичных антител, выявляемых реагентом, с последующим гистохимическим окрашиванием раствором Май-Грюнвальда, отличающийся тем, что после иммуногистохимического окрашивания, не допуская высыхания препарата на него наносят 1,5-2 мл раствора Май-Грюнвальда, оставляют на 5 минут, после чего погружают в 0,4-0,8% раствор ледяной уксусной кислоты не менее 5 раз.