Применение антисмыслового олигонуклеотида 5'-AGCTATCTCCG-3' из гена глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы меланомы мышей в качестве противоопухолевого соединения Российский патент 2023 года по МПК C12N15/113 A61P35/00 A61K39/00 

Изобретение относится к области медицины, фундаментальным исследованиям в области биомедицинских технологий.

Основная проблема современных подходов в лечении рака методами химио- и лучевой терапии заключается в том, что раковые клетки быстро пролиферируют, клетки иммунной системы также способны к быстрому делению, причем клетки обоих типов повергаются токсическим воздействиям в ходе терапии, что может привести к выраженной иммуносупресии и гибели пациента. Перспективным в этом плане является таргетный подход, при котором непосредственно возможно заблокировать несколько каскадов биохимических реакций в раковой клетке и использовать его самостоятельно или в интервалах между курсами химио- и лучевой терапии.

Для борьбы с молекулярными дефектами, присутствующими в меланоме, были разработаны множественные таргетные методы лечения. К наиболее многообещающим из них относятся ингибиторы BRAF, вемурафениб и дабрафениб, которые были одобрены для лечения метастатических и неоперабельных меланом с мутацией BRAF в 2011 и 2013 годах соответственно. (Liang Cheng, Antonio Lopez- Beltran, Francesco Massari at al. Molecular testing for BRAF mutations to inform melanoma treatment decisions: a move toward precision medicine.2017, 24-38).

Исследование EORTC18071, рандомизированное исследование фазы III адъювантной терапии ипилимумабом, вводимым в дозе 10 мг / кг у пациентов с послеоперационной меланомой кожи III стадии, показало значительно более длительную ОВ в группе ипилимумаба, чем в группе плацебо. Однако адъювантное введение ипилимумаба в дозе 10 мг / кг было связано с высокой частотой токсичности, включая пять (1,1%) смертей, связанных с лечением. Испытание COMBI-AD, в котором пациенты с болезнью III стадии (меланома стадии IIIA с опухолевым отложением >1 мм в диаметре в пределах дозорного лимфатического узла (SLN)) были назначены либо на дабрафениб плюс траметиниб, либо на плацебо, показало значительно более длительный рецидив - свободная выживаемость (RFS) в группе лечения дабрафенибом и траметинибом (ОР 0,47; 95% ДИ от 0,39 до 0,58; р<0,001).

Испытание CheckMate238, в котором пациенты с болезнью III стадии (меланома стадии IIIA с опухолевыми отложениями >1 мм в диаметре в пределах SLN) получали ниволумаб в дозе 3 мг / кг или ипилимумаб в дозе 10 мг / кг, показало значительно более длительный RFS. и более благоприятный профиль токсичности в группе лечения ниволумабом (ОР 0,65; 97,56% ДИ, 0,51-0,83; р<0,001).

Впоследствии исследование EORTC1325 / KEYNOTE-054, в котором пациенты с болезнью III стадии (меланома стадии IIIA с опухолевыми отложениями >1 мм в диаметре в пределах СЛУ) получали пембролизумаб в дозе 200 мг / тело или плацебо, показало значительно более длительное лечение. RFS в группе лечения пембролизумабом (HR 0,57; 98,4% ДИ, 0,43-0,74; р<0,001).

Однако, хотя эти препараты очень эффективны примерно для половины пациентов с меланомой с мутацией BRAF, у большинства пациентов развивается вторичная резистентность в течение относительно короткого промежутка времени (Lauren Е. Devis, Sara С.Shalin, Alan J. Tackett. Current state of melanoma diagnosis and treatment. Cancer Bio & Ther. 2019, 1366-1379).

В качестве прототипа, был выбран способ исследования влияния полидатина на раковые клетки. Как известно, он вызывает сильное ингибирование роста раковых клеток параллельно с сильным снижением инвазивных свойств раковых клеток in vitro и in vivo. Полидатин напрямую ингибирует Г6ФД, ограничивающий фермент пентозофосфатного пути, вызывая окислительно-восстановительный дисбаланс, что приводит к остановке клеточного цикла и апоптозу. (Mele, L.; Paino, F.; Papaccio, F.; Regad, Т.; Boocock, D.; Stiuso, P.; Lombardi, A.; Liccardo, D.; Aquino, G.; Barbieri, A.; Arra, C.; Coveney, C.; La Noce, M.; Papaccio, G.; Garaglia, M.; Tirino, V.; Desiderio, V. A new inhibitor of glucose-6-phosphate dehydrogenase blocks pentose phosphate pathway and suppresses malignant proliferation and metastasis in vivo. Cell Death Dis, 2018, 9, 572).

Нормальные печени HL-7702, HCC и линии клеток рака печени HepG2 и SMMC-7721 были приобретены у компании АТСС (США). Все клетки культивировали в среде DMEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS; Thermo Fisher Scientific, США). Клетки хранили в увлажненном инкубаторе при 37°С с 5% CO₂. Полидатин был приобретен в компании Sigma (США).

Клетки HL-7702, HepG2 и SMMC-7721 высевали на 96-луночные планшеты при плотности 104 клеток / лунку и культивировали в течение 24 часов. Затем среду заменяли DMEM или той же средой, содержащей разные концентрации полидатина (1, 3, 10, 30 и 100 мкМ). После дополнительной инкубации в течение 24 или 48 часов в каждую лунку 96-луночных планшетов добавляли МТТ (Sigma) с последующей 4-часовой инкубацией. Затем среду удаляли и в каждую лунку добавляли 150 мкл ДМСО и инкубировали в течение 20 мин. Величины поглощения при 490 нм определяли с помощью ридера для микропланшетов (BioTek, США).

Опухоли были созданы путем подкожной инъекции 5 × 106 клеток HepG2 в бока мышей. Объемы опухоли оценивали по формуле: π / 6 × а2 × b, где а - короткая ось, a b - длинная ось опухоли. Когда опухоль достигала 120 мм3 примерно через 2 недели, мышей случайным образом разделяли на четыре группы, по 6 мышей в каждой группе. Мыши в контрольной группе получали ежедневные внутрибрюшинные (ip) инъекции 100 мкл фосфатно-солевого буфера, а мыши в других трех группах получали ежедневные внутрибрюшинные инъекции 100 мкл полидатина в дозах 25, 50 и 100 мг / кг. Объем опухоли у мышей nude измеряли каждые 4 дня после введения начальной дозы полидатина. За мышами внимательно наблюдали и взвешивали. После 20 дней лечения животных умерщвляли и собирали опухоли для дальнейшего анализа.

Недостатками этого метода является то, что полидатина следует избегать, если генетическая панель выявляет мутацию СНЕК2. Он влияет на пути / процессы, такие как передача сигналов Р53 и эстрогенов, а также оказывает неблагоприятное воздействие на СНЕК2 и связанные с ними состояния.

Задачей заявленного решения является подбор таргетной последовательности антисмыслового олигонуклеотида фермента глюкозо-6-фосфат дегидрогеназа (Г6ФД) и лечение меланомы.

Посталенная задача решается следующим образом.

Предлагаем применение антисмыслового олигонуклеотида 5'-AGCTATCTCCG-3' из гена глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы меланомы мышей в качестве противоопухолевого соединения, воздействующего на фермент пентозофосфатного пути глюкозо-6-фосфат дегидрогеназу, при лечении меланомы.

Серийные эксперименты с клеточной линией меланомы мышей Clone - М3, на которой используется ДНК-лекарство на основе нуклеиновой кислоты, избирательно действующий на раковые клетки меланомы с использованием короткого (11 нуклеотидов) одноцепочечного антисмыслового фрагмента ДНК гена пентозофосфатного пути глюкозо-6-фосфат дегидрогеназу (Г6ФД) меланомы мышей с последовательностью 5'-AGCTATCTCCG-3' в концентрации 30000 нг/мкл, инъекцией в 100 мкл. Изобретение снижает рост раковых клеток.

Общими с прототипом признаками являются:

- действие на фермент энергетического обмена петозофосфатного пути Г6ФД, который приводит к остановке клеточного цикла и апоптозу клеток.

Отличительными признаками являются:

- биологическая молекула, основанная на искусственном синтезе.

Совокупность признаков изобретения обеспечивает изобретательский уровень технического решения. Сформулирована концепция создания противомеланомной мази и опубликована в журнале Molecules (Laikova, K.V.; Oberemok, V.V.; Krasnodubets, A.M.; Gal'chinsky, N.V.; Useinov, R.Z.; Novikov, I.A.; Temirova, Z.Z.; Gorlov, M.V.; Shved, N.A.; Kumeiko, V.V.; Makalish, T.P.; Bessalova, E.Y.; Fomochkina, I.I.; Esin, A.S.; Volkov, M.E.; Kubyshkin, A.V. Advances in the Understanding of Skin Cancer: Ultraviolet Radiation, Mutations, and Antisense Oligonucleotides as Anticancer Drugs. Molecules 2019, 24, 1516). Выявлено, что немодифицированные ДНК и РНК по своей природе нестабильны, так как подвергаются воздействию повсеместно экспрессирующихся нуклеаз. Для применения олигонуклеотидов в качестве антисмысловых препаратов, планируется их модифицировать таким образом, чтобы сохранить или улучшить их способность комплементарно связываться с РНК, повысить устойчивость к расщеплению нуклеазами, обеспечить распределение в тканях и доставить в тот же клеточный компартмент, где находятся РНК-мишени.

Перспективной представляется блокировка с использованием АСО глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФД) пентозофосфатного цикла, в котором образуется НАДФН и материал для синтеза ДНК. Главные потребители НАДФН - антиоксидантные ферменты, устраняющие активные формы кислорода. Производится этот восстановитель в реакции, катализируемой Г6ФД. Без этого фермента клетки, в том числе и раковые, не смогут синтезировать нуклеиновые кислоты и бороться с окислительным стрессом. Если клетки и не погибнут, то быстро расти и делиться точно не смогут.

Способ осуществляют следующим образом.

В исследовании использовались раковые клетки линии меланомы мыши Clone-М3. Клетки культивировали в питательной среде DMEM F-12 с добавлением 1% антибиотиков пенициллина / стрептомицина, 1% пировиноградной кислоты и 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS). Трансплантацию клеток проводили с использованием фосфатно-солевого буфера Дульбекко (DPBS) и трипсинизации с последующей нейтрализацией трипсина приготовленной питательной средой.

Определение клеточного индекса проводили в 6 повторностях из экспериментов, проведенных в реальном времени в течение 24 часов в xCELLigence RTCA DP Analyzer (ACEA Biosciences, США). Для эксперимента 6000 клеток добавляли в каждую лунку анализатора RTCA DP.

Сравнительное исследование было проведено на мышах BALB / с. Животные были разделены на 3 группы по 5 особей в каждой. Каждой группе пересаживали клетки меланомы. Первую группу (контроль) лечили 0,9% NaCl; вторая группа (OligoAll) получала контрольный олигонуклеотид в концентрации 30 000 нг / мкл; а третью группу (Hush-11) лечили экспериментальным антисмысловым олигонуклеотидом (5'-AGC-TAT-CTC-CG-3') в концентрации 30 000 нг / мкл. Все инъекции фосфоротиоатных олигонуклеотидов производились на расстоянии 1-1,5 см от участка от края опухоли. Объем инъекции составлял 100 мкл.

Для эксперимента были отобраны пятнадцать мышей (12-18 г) от инбредной неиммуносупрессивной линии мышей BALB / с.

Подготовку клеток для трансплантации мышам проводили следующим образом: клетки удаляли и подсчитывали, а затем центрифугировали. Полученный осадок (2 × 10⁵ клеток) ресуспендировали в 500 мкл раствора Хэнкса. Аликвоты приготовленной суспензии клеток меланомы вводили подкожно в межлопаточную область с иглой шприца в горизонтальном положении.

На 14-16-е сутки после введения суспензии клеток рака, опухолевая ткань начала расти. Опухоли были круглыми, мясистыми, темно-синего цвета.

Пример конкретного осуществления способа.

Последовательность примененного антисмыслового фрагмента из гена Г6ФД меланомы мышей была следующей: 5'-AGCTATCTCCG-3' - Hush-11; контрольный олигонуклеотид: 5'-ААААААААААА-3'.

Наши эксперименты продемонстрировали эффективность АСО Hush-11, которая привела к значительному снижению клеточного индекса раковых клеток в культуре клеток линии мышиной меланомы. Наиболее выраженный эффект наблюдался через 6 часов после начала эксперимента, когда клеточный индекс культуры, обработанной Hush-11, составлял 0,35±0,02; в течение 6 часов это значение резко снизилось до 0,18±0,02. В контрольной группе индекс клеток составил 0,52±0,03 через 6 часов; через 12 часов он достиг плато роста со значением 0,48±0,03. Среднее снижение клеточного индекса через 12 часов в группе, обработанной Hush-11, составило 11% по сравнению с контрольной группой. Случайный олигонуклеотид OligoA11 не показал значительного влияния на рост меланомы по сравнению с контрольной группой.

Чтобы оценить эффект Hush-11 в более реалистичных условиях, мышам прививали меланому с последующими инъекциями препарата в организм мыши. В ходе эксперимента было обнаружено уменьшение размера опухоли в ответ на использование Hush-11. В среднем размер опухоли уменьшался на 15% в сутки в группе, получавшей Hush-11 в течение 7 дней, тогда как в контрольной группе размер опухоли увеличивался на 6% в день. Средний размер опухоли в группах в начале эксперимента составлял 0,29±0,04 см²; на 7-е сутки эксперимента наблюдались достоверные различия между средней площадью опухоли контрольной группы (0,35±0,06 см²) и группы, получавшей Hush-11 (0,15±0,05 см²) (р<0,05). Интересной особенностью, которую мы также отметили, было отсутствие роста опухоли в месте инъекции Hush-11 (опухоль продолжала расти в направлении, противоположном месту инъекции). Случайный олигонуклеотид OligoA11 не проявил какого-либо значительного влияния на рост меланомы по сравнению с контролем (0,4±0,11 см²).

На 7-е сутки площадь опухоли в группе Hush-11 уменьшилась на 51%; в контрольной группе он увеличился на 20,7% по сравнению с первым днем эксперимента.

Когда лечение Hush-11 было прекращено на 8-е сутки, площадь опухоли у этих животных достигла размера такового в контроле через 2 суток, что доказывает, что Hush-11 подавлял агрессивный рост клеток меланомы.

Результаты иммуногистологического исследования на маркер Bcl-2 показали, что в поле зрения для экспериментальной группы было обнаружено 11,8±0,84 клеток, что на 40,67% больше, чем для контрольной группы, где 7±0,47 клеток были обнаружены в поле зрения, поле зрения (р<0,01). Для маркера FAS в поле зрения для экспериментальной группы было обнаружено 10,2±1,06 клеток, что на 64,7% больше, чем для контрольной группы, где в поле зрения было обнаружено 3,6±0,45 клеток (р<0,01). Отмечен интересный факт, что в группе Hush-11 наблюдалось в 2,5 раза меньше амитозов по сравнению с контрольной группой (р<0,05). Также следует отметить вакуолизацию ядер в опухолевых клетках, расположенных рядом с сосудами, и наличие признаков клеточной дистрофии.

Преимущество заявленного решения состоит в том, что синтез ДНК становится все более недорогим, а комбинация азотистых оснований в каждом отдельном ДНК-олигонуклеотиде уникальна и обеспечивает безопасность для нецелевых клеток.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложено применение антисмыслового олигонуклеотида 5'-AGCTATCTCCG-3' из гена глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы меланомы мышей в качестве противоопухолевого соединения, воздействующего на фермент пентозофосфатного пути глюкозо-6-фосфат дегидрогеназу, при лечении меланомы. Изобретение обеспечивает уменьшение размера опухоли у животных. 1 пр.

Применение антисмыслового олигонуклеотида 5'-AGCTATCTCCG-3' из гена глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы меланомы мышей в качестве противоопухолевого соединения, воздействующего на фермент пентозофосфатного пути глюкозо-6-фосфат дегидрогеназу, при лечении меланомы.