Способ определения окислительного потенциала клеток с применением бихроматометрии Российский патент 2023 года по МПК G01N3/00 G01N33/50 

Изобретение относится к медицине и биологии, касается оценки токсического влияния бактериальных липополисахаридов (ЛПС) на организм. Доказано, что изменение окислительно-восстановительных процессов в клетках лежат в основе гомеостаза организма при адаптации к патологическому состоянию при инфицировании различными бактериями [1]. В связи с этим, существует необходимость цитохимической оценки состояния клеток крови в организме при различных заболеваниях [2]. Бихроматная окисляемость отражает потребление кислорода клетками при химическом окислении сернокислым раствором бихромата калия- K2Cr2O7 (БХ) внутриклеточных субстратов-восстановителей [3]. Бихроматометрия протекает в сильно-кислой среде и при кипячении водного раствора редокс потенциал БХ равен Е=+1,33 [4]. При слабокислом, нейтральном, слабощелочном рН редокс-потенциал (стандартный электродный потенциал) раствора БХ равен Е=-0,12 [4]. БХ и хромат-ион H2CrO4 в нейтральной среде имеет степень окисления 6+, при взаимодействии с восстановителем его потенциал снижается до 3+с образованием гидроксокомплекса хрома [5]. При обработке растворами БХ биологических объектов, где рН=7,2, происходит восстановление степени окисления хромат-ион H2CrO4 - 6+ в 3+, с образованием гидроксокомплексов. При дублении (олификации) такие гидроксокомплексы агрегируют вещества в многоядерные (полиядерные) частицы посредством донорско-акцепторных связей функциональных групп различных полипептидов и других органических веществ [6, 9]. Так, в гидроксокомплексы хрома 3+включены длинные цепочки, чередующихся друг с другом гидроксогрупп и хрома, которые взаимодействуют с аминогруппами, сульфонатами, ароматическими аминами и др. [6 9, 712]. Сульфонаты образуют с аминами ароматические амины и сульфамиды, что приводит к сульфонатной дериватизации аминокислот и азотистых оснований [8 11]. 1,2-нафтохинон-4-сульфонат (1,2НХ4С) является изомером предшественника витамина К-1,4 нафтохинона и субстратом для выявления активности оксиредуктаз, образуя аддукты с белками и ДНК [9-12 14-17]. В водном растворе при рН=7,0 БХ не может окислить субстрат 1,2НХ4С по причине высокого содержания его восстановленных форм. Известно, что редокс-потенциал (Е) 1,2НХ4С при рН=1,0 равен Е=+0.628 В [13 6]. С применением упрощенного уравнения Эрнста редокс-потенциал пары окисленного и восстановленного 1,2НХ4С можно рассчитать Е=Е0-0,059×рН [14 7]. Таким образом, при рН=7,0 раствора редокс-потенциал 1,2НХ4С равен Е=+0,218 В. Тогда как, в клетках определен низкий редокс-потенциал <Е=-0,12 для следующих белковых компонентов: НАДН/НАД, НАФН/НАДФ, цистеин/цистин, цистеиновая кислота, глутатион восстановленный/окисленный, липоевая кислота и др. [15 8]. Поэтому для выявления окислительного потенциала клеток необходимы подходы для выявления активности таких восстановителей в водных растворах.

Известны индикаторные методы бихроматометрии основанные на применении различных редокс-индикаторов (дифениламин, дифениламиносульфокислота, фенилантраниловая кислота), в том числе хемилюминесцентных, а также внешних [3].

К недостаткам таких способов бихроматометрии относится химическая агрессивность используемых реагентов, что существенно затрудняет исследование окислительного потенциала клеток в цитологических и гистологических препаратах. Это обосновано тем, что для окисления субстрата редокс-потенциал окислителя должен быть выше, чем у восстановителя [5].

Наиболее близким к заявляемому способу относится метод цитологического флуоресцентного (ФЛ) исследования эритроцитов (Эр), который осуществляется путем окрашивания спиртовым раствором ализарина красного С (АКС) и водным раствором бихромата (БХ) мазков периферической крови [16 13]. В цитоплазме Эр выявляются флуоресцирующие гранулы, которые подсчитываются в препаратах периферической крови у интактных животных, при охлаждении, черепно-мозговой травме, ортостатическом вывешивании без воздействия эндотоксинов.

К недостатку этого способа относится структурная особенность молекулы АКС, где присутствуют карбонильные и гидроксильные (фенольные) группы, что затрудняет анализ причин окисления БХ внутриклеточными субстратами, который может взаимодействовать с фенолами АКС. Также, к недостатку этого способа [16 13], относится отсутствие водного раствора 1,2НХ4С, так как применяется раствор АКС в 96° этаноле. При этом известно, то, что в растворе этанола образуется хингидрон-межмолекулярный комплекс восстановленного и окисленного хинона [17 18]. Также в этом способе, окислительно-восстановительная реакция ароматических аминов выявляется с помощью оценки гранул ФХ только в цитоплазме Эр периферической крови [13]. Недостатком известного способа является, что с его помощью не изучаются кортикоциты коркового слоя надпочечников (Нп), головного мозга (Гм), легких (Лг).

Техническим результатом заявляемого способа является цитохимическая оценка реакции окисления БХ внутриклеточных субстратов с низким редокс-потенциалом (менее Е=-0,12 Мв) в водном растворе при рН=7.0, в результате которой степень окисления хромата иона 6+восстанавливается до 3+ с образованием гидроксокомплекса хрома, включающего гранулы флуорохрома (Фх). С помощью заявленного способа возможно прогнозирование степени олификации гидроксокомплексов хрома 3+ в клетках различных органов, что позволяет оценить в них уровень обмена веществ по включению производных сульфоновых кислот (цистеиновая кислота, таурин), сульфамидов, производных никотиновой кислоты (пиколинаты и др.) и других ароматических аминов, аминокислот в физиологических пределах значений рН.

Отличием заявленного способа является выявление при микроскопии гистологических препаратов, окрашенных БХ, флуоресцирующих агрегатов гидроксокомплексов хрома 3+, как в Эр периферической крови, так и в ядрах клеток паренхимы различных органов.

Уровень техники заявляемого способа заключается в выявлении в клетках веществ с редокс потенциалом менее Е=-0,12 В путем восстановления степени окисления гидроксокомплексов хрома от 6+ к 3+, которое сопровождается формированием флуоресцирующих гранул, содержащих ароматические амины и др., с возможностью их количественного учета с применением микроскопии. Наличие таких гранул позволяет учитывать содержание гидроксокомплексов переходных металлов в клетках при формировании взаимодействия ароматических веществ и их таутомерию.

Задача способа оценить с помощью гистохимического исследования число флуоресцирующих гранул красителя в цитоплазме Эр и ядре клеток различных органов, что позволяет оценить состояние организма при различных заболеваниях. Существо заявленного способа, заключается в оценке бихроматной окисляемости внутриклеточных восстановителей с применением флуоресцентной микроскопии микропрепаратов крови и тканей органов интактных и животных с эндотоксинемией (троекратное введение бактериального липополисахарида в дозе 33,33 мкг/кг), а именно, подсчитывается количество флуоресцирующих гранул гидроксокомплексов, которые образуются в цитоплазме и ядре клеток при гистохимическом окрашивании.

Признаки, используемые для осуществления необходимых условий выполнения заявляемого способа: мазки периферической крови и кусочки тканей органов интактных и животных с эндотоксинемией фиксируются в 96° этиловом спирте в течении 24 часов, затем образцы тканей промываются в хлороформе и заливаются в парафин, после чего изготавливаются гистологические препараты тканей, мазки крови и микропрепараты окрашивается в течение 5 мин в 5% растворе 1,2-нафтохинон-4-сульфоната (1,2НХ4С) на основе 96 этилового спирта, перемещаются в 5% раствор 1,2 НХ4С на основе бидистиллированной воды на 5 мин, промываются бидистиллированной водой в течении 20 сек, перемещаются в 5% насыщенный раствор бихромата в бидистиллированной воде на 2 мин, вновь промываются в бидистиллированной воде 20 сек, сушатся на воздухе, после чего покрываются нефлуоресцирующим иммерсионным маслом, готовые микропрепараты просматриваются с помощью флуоресцентного микроскопа при увеличении ×1000, волна возбуждения 615 нм, подсчитывается флуоресцирующих эритроцитов и ядер клеток в 30 полях зрения, в качестве контрольных препаратов используются мазки крови и гистологические срезы, фиксированные в парах формальдегида, что исключает свечение клеток.

Пример использования изобретения. Способ применили для исследования состояния клеток крови и органов животных (белые крысы Wistar, самцы весом 250 грамм) без введения препаратов - 1 группа, при внутримышечном введении эндотоксина (липополисахарид, ЛПС, пирогенал) в дозе 33,33 мкг/кг на 1, 3, 4 сутки эксперимента -2 группа и 3 группа животных изучается на 6 день после троекратного внутримышечного введения пирогенала в дозе 33,33 мкг/кг на 1, 3, 4 сутки эксперимента. Для воспроизведения эндотоксинемии животным вводили фармакопейную форму ЛПС раствор пирогенала (р-р для в/м введ. амп., 100 мкг, 1 мл, "МЕДГАМАЛ" ФГБУ "НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи" Минздрава России). Общую анестезию проводили с помощью внутримышечного введения золетила 100 в дозе 20 мг/кг («Virbac» Франция), после чего осуществлялась вивисекция с целью забора периферической крови из сердца и органов. Из периферической крови изготавливались мазки на предметных стеклах. Для гистохимического исследования тканей надпочечников, легких, головного мозга кусочки органов фиксировались в 96° этиловом спирте в течение 24 ч, после чего материал промывали в хлороформе и заливали в парафин. На микротоме изготавливали срезы толщиной 5 мкм, помещали на предметные стекла с адгезивным покрытием, депарафинировали. Окраску проводили согласно заявляемому способу с использованием 1,2Н4С (ЛенРеактив, Россия) и бихромата калия (ЛенРеактив, Россия). Обработанные мазки крови и гистологические срезы просматривали под флуоресцентным микроскопом Zeiss Scope A1 (Zeiss, Германия) при возбуждающей длине волны 470 нм, 510-590 нм, 615 нм. Оценка выхода эмиссии флуоресценции осуществлялась при длине волны красного (630-760 нм) спектра.

Контроль специфичности флуоресценции (Фл) клеток, осуществляется при гистохимической окраске мазков крови и микропрепаратов тканей органов животных раствором БХ без включения 1,2 НХ4С и параллельно раствором, содержащим 1,2 НХ4С без БХ. Свечение клеток в таких препаратах отсутствовало при всех используемых диапазонах возбуждающей длины волны (360, 470, 510-590, 615 нм). Также не обнаружено свечения клеток при фиксации в парах формалина мазков крови, окрашенных 1,2НХ4С. При окрашивании мазков крови и препаратов с помощью заявленного способа кортикоцитов надпочечников интактных животных (1 группа) обнаружена Фл ядер клеток в большом количестве при длине волны возбуждения 615 нм и эмиссии 630-760 нм, при других диапазонах длин волн свечения клеток не выявлено. В мозговом веществе надпочечников флуоресцировали единичные клетки. На 4 (2 группа), 6 день (3 группа) после введения ЛПС обнаружено достоверное снижение количества флуоресцирующих кортикоцитов надпочечников (табл. 1).

При исследовании препаратов крови, окрашенных 1,2 НХ4С с БХ, в цитоплазме эритроцитов выявлены флуоресцирующие гранулы. Эритроциты по степени флуоресценции разделены на 5 типов: 1 тип - без флуоресценции, 2 тип - разрозненная (1-5 гранул) гранулярная Фл цитоплазмы, 3 тип - флуоресцирующая разрозненная гранулярная окраска части периферии (тора) цитоплазмы, центральная часть клетки не окрашена, 4 тип - периферия цитоплазмы (тор) содержит флуоресцирующие крупные гранулы не менее 0,5 мкм в диаметре, 5 тип - полностью флуоресцирующие клетки. Количественная оценка цитохимической реакции проводится при подсчете среднего цитохимического коэффициента по пятибалльной системе, изложенном в известном способе [13]. Определено снижение СЦК Эр у периферической крови животным при введении ЛПС, что отражает изменение содержания восстановителей, выявляемых с помощью цитохимической хроматометрии (табл. 1).

При исследовании с помощью заявленного способа ядер клеток нервной ткани промежуточного мозга таламуса и гипоталамуса, а так же легких выявляется небольшая Фл клеток. У интактных животных они единичны (1-4) в гистологических срезах ГМ и легких. Фл нейронов отсутствует, в мозговых оболочках, кровеносных сосудах базальной поверхности промежуточного мозга и его поверхностных слоях, предлежащих к гипоталамусу отмечается свечение ядер клеток, диаметром 4-6 мкм. На 4 день после введения пирогенала (2 группа) отмечается существенное повышение количества флуоресцирующих ядер клеток в тканях легких и головного мозга (мозговые оболочки, кровеносные сосуды, поверхностные слои базальной части промежуточного мозга, предлежащей к гипоталамусу), которое значимо снижется на 6 день эксперимента- 3 группа (табл. 1). В легких выявляется слабая Фл стенки кровеносных сосудов артерий и вен. Технически результат заявленного способа заключается в том, что с помощью цитохимической бихроматометрии демонстрируется участие редокс-потенциала восстановителей, которые локализуются в ядрах кортикоцитов надпочечников, промежуточного мозга, легких, и принимают участие в регуляции окислительного стресса с помощью легкоокисляемых субстратов при введении ЛПС в организм и рН реагентов водного раствора бихромата и 1,2НХ4С равным 7,0.

Источники информации:

1. Мартинович Г.Г., Черенкевич С.Н. Окислительно-восстановительные процессы в клетках: Монография. - Мн.: БГУ, 2008. - с. 159.

2. Alekseeva I.V., Abramova A.Yu., Kozlov A.Yu., Koplik E.V., Pertsov A.S., Lyadov D.A., Nikenina E.V., Pertsov S.S. Bull. Exp.Biol. Med. 2019; Vol. 167, №5. - p. 624-627.

3. Алексеев B.H. Количественный анализ.- M.: Химия, 1972.

4. Бабко А.К., Пятницкий И.В. Количественный анализ. 2 изд., пер. и доп. - М.: "Высшая школа", 1962. - 508 с.

5. Шульц М.М., Писаревский А.М., Полозова И.П. Окислительный потенциал. Теория и практика. - Л.: Химия. 1984].

6 9. Sudesh Vasdev, Vicki Gill Antioxidants in the treatment of hypertension Angiol 2005; 14(2). - p. 60-73.

7. Elbashir A.A., Ahmed A.A., Ahmed Sh. M.A., Aboul-Enein H.Y. l,2-Naphthoquinone-4-Sulphonic Acid Sodium Salt (NQS) as an Analytical Reagent for the Determination of Pharmaceutical Amine by Spectrophotometry, Applied Spectroscopy Reviews. 2012; 47:3. - p. 219-232.

8. Павлов H.H. Неорганическая химия. Учеб. для технол. спец. вузов. - М.: Высш. шк., 1986. - 336 с.

9. Способ флуоресцентной цитохимической оценки содержания биогенных аминов в эритроцитах Зиновьев С.В., Плехова Н.Г., Радьков И.В., Лаптев В.В. Патент RU 2709212 С1. 2018, Бюл. №35.

10. Yoshito Kumagai, Yasuhiro Shinkai, Takashi Miura, Arthur K. Cho The Chemical Biology of Naphthoquinones and Its Environmental Implications Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 2012; 52(1). - p. 221-247.

11. Kim S.Y., Mori Т., Chek M.F., Furuya S., Matsumoto K., Yajima Т., Ogura Т., Hakoshima T. Structural insights into vesicle amine transport-1 (VAT-1) as a member of the NADPH-dependent quinone oxidoreductase family. Sci Rep. 2021;11(1). - p. 2120.

12. Soares AG, Muscara MN, Costa SKP. Molecular mechanism and health effects of 1,2-Naphtoquinone. EXCLI J. 2020; 1. - p. 707-717.

13. Окислительно-восстановительное титрование: [учеб.-метод. пособие] / [сост. А.Л. Подкорытов, Л.К. Неудачина, С.А. Штин; М-во образования и науки. Рос. Федерации, Урал. федер. ун-т]. - Екатеринбург: Изд-во Урал, ун-та, 2015 - 64 с

14. By W. Mansfield Clark. Oxidation-reduction potentials of organic systems. The Williams & Wilkins Co., 428 East Preston St., Baltimore 2, Md., 1960. - 584 pp.

15. Неницеску К.Д. Органическая химия. 1963; II том,. Изд-во: М.: иностранной литературы, 1963 г. - 1048 с.

16. Shevchenko N., Zaitsev V., Walcarius A. Bifunctionalized mesoporous silicas for Cr(VI) reduction and concomitant Cr(III) immobilization Cr(III) binding to sulfonate groups Environ Sci Technol. 2008; 42(18). - 6922-8.

17. Физическая химия. Под ред. акад. Никольского Б.П. Л.: Химия, 1987. - 880 с.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу определения окислительного потенциала клеток с применением бихроматометрии. Способ предусматривает определение окислительного потенциала клеток крови и тканей различных органов с приготовлением гистологических препаратов крови и органов животных, и с их окрашиванием в течение 5 мин в 5% растворе 1,2-нафтохинон-4-сульфоната (1,2 НХ4С) на основе 96° этилового спирта. Изобретение эффективно для оценки токсического влияния бактериальных липополисахаридов (ЛПС) на организм. 1 табл., 1 пр.

Способ определения окислительного потенциала клеток с применением бихроматометрии, включающий определение окислительного потенциала клеток крови и тканей различных органов на гистологических препаратах, отличающийся тем, что микропрепараты окрашиваются в течение 5 мин в 5% растворе 1,2-нафтохинон-4-сульфоната (1,2 НХ4С) на основе 96° этилового спирта, перемещаются в его 5% раствор на основе бидистиллированной воды на 5 мин, промываются ею в течение 20 с, перемещаются в 5% насыщенный раствор бихромата калия в бидистиллированной воде на 2 мин, вновь промываются в бидистиллированной воде 20 с, сушатся на воздухе, после чего покрываются нефлуоресцирующим иммерсионным маслом и просматриваются под флуоресцентным микроскопом при увеличении ×1000 и волне возбуждения 615 нм, для подсчета флуоресцирующих клеток в 30 полях зрения в качестве контрольных препаратов используются мазки крови и гистологические срезы, фиксированные в парах формальдегида, что исключает свечение клеток.