Вакцина против ящура генотипа O/ME-SA/PanAsia2из штамма "О N2356/Пакистан/2018" культуральная инактивированная сорбированная Российский патент 2023 года по МПК A61K39/135 C12N7/00 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, а именно к разработке вакцины против ящура генотипа О/ME-SA/PanAsia2^ANT-10 из штамма «О №2356/Пакистан/2018» культуральной инактивированной сорбированной.

Ящур представляет собой наиболее контагиозное заболевание млекопитающих и причиняет серьезные экономические потери для многих государств мира. Выделяют семь следующих серотипов вируса ящура: О, А, С, Азия-1 и SAT-1, SAT-2, SAT-3, при этом представители серотипа О является наиболее распространенными, что определяет актуальность изготовления вакцин для защиты от ящура данного серотипа [2].

Каждый серотип генетически разделен на различные топотипы, а иногда на отдельные генетические линии и даже сублинии. Различия между ними определяют при анализе нуклеотидной последовательности высоковариабельного гена 1D, который кодирует аминокислотную последовательность поверхностного белка VP₁ [1]. Учитывая, что возбудитель ящура является РНК-содержащим вирусом, для него характерно образование большого количества мутаций во время репликации вирусного генома (преимущество в 5'-участке) и явление рекомбинации (преимущественно в 3'-участке).

Важность знания генетического разнообразия вируса ящура заключается в возможности тщательного анализа эпизоотической ситуации в конкретном регионе и детальном подборе подходящей вакцины, которая должна быть адаптирована именно к интересующему генотипу. Переболевшие одним серотипом животные не имеют иммунной защиты против другого серотипа и даже некоторых других генетических линий [3]. Такие животные долго восстанавливаются, принося экономические потери хозяйству. Даже если животное не проявляет клинических признаков заболевания, оно может являться вирусоносителем, тем самым распространять заболевание в стаде.

Выявление генетических связей между различными изолятами и штаммами проводят с помощью нуклеотидного секвенирования, что дает возможность в условиях вспышки заболевания определить происхождение вируса. Антигенные характеристики вируса, связанные с появлением новых штаммов, важны для анализа вспышек и создания оптимальных вакцин для экстренного применения [4, 6].

Серотип О вируса ящура разделен на 11 следующих топотипов: EAST AFRICA 1-4 (Восточная Африка) (ЕА-1-4), SOUTHEAST ASIA (Юго-Восточная Азия) (SEA), EUROPE-SOUTH AMERICA (Европа-Южная Америка) (EURO-SA), INDONESIA-1 и 2 (Индонезия-1 и 2) (ISA-1 и -2), CATHAY (Китай), MIDDLE EAST-SOUTH ASIA (ME-SA) (Ближний Восток-Южная Азия) и WEST AFRICA (Западная Африка) (WA). Такое высокое генетическое и антигенное разнообразие приводит к проблемам при специфической профилактике ящура при применении культуральных инактивированных противоящурных вакцин. В результате возникает необходимость создания новых средств специфической иммунопрофилактики в отношении вируса ящура серотипа О [5-11].

Данное многообразие представителей серотипа О обусловлено высокой степенью изменчивости РНК-содержащего вируса и активным перемещением данного возбудителя по территории стран Азии.

По причине легкого и быстрого распространения возбудителя ящура данное заболевание может приобретать размах эпизоотий [12]. С целью недопущения возникновения болезни в хозяйствах Российской Федерации применяется комплекс мероприятий по борьбе и профилактике ящура, который направлен на предупреждение заноса вируса в страну, систематическую иммунизацию крупного и мелкого рогатого скота в буферной зоне, а также проведение мониторинга иммунного статуса привитых животных.

Для иммунизации животных должна применяться вакцина, изготовленная из вируса, гомологичного полевым изолятам, что подтверждено исследованиями многих авторов [6, 7, 8, 9, 10, 11].

Возникающие в мире вспышки ящура продолжают оставаться значимой экономической проблемой во всем мире. Наиболее эффективным способом реагирования на вспышки ящура в странах, свободных от болезней, на сегодняшний день - это использование цельновирионных вакцин. [8, 9, 12, 13].

Для проведения экстренной вакцинации нужно наличие эффективной и безопасной вакцины, содержащей антиген вируса, соответствующий эпизоотическому распространяющемуся изоляту определенного генотипа. Создание подобных вакцин по-прежнему является крайне актуальной задачей. Достижение данной цели позволит применять вакцину в неблагополучных регионах и угрожаемой зоне для формирования иммунитета против конкретного генотипа вируса ящура с целью обеспечения ветеринарного благополучия страны.

Критерии, определяющие успешное проведение экстренной вакцинации, включают в себя следующие характеристики: 1) содержит антиген вируса ящура с достаточным антигенным родством по отношению к изолятам, циркулирующим в очаге; 2) относится к требуемому виду среди разработанных вакцин; 3) характеризуется приемлемой безвредностью и эффективностью; 4) имеет соответствующий доступ, в том числе объем партий и своевременность их поставок [14].

На территории Российской Федерации вспышки ящура имеют спорадический характер и вызваны заносом возбудителя с территории сопредельных стран. Так как отдельные регионы России граничат с эндемичными по ящуру странами на территории Азии и подвержены очень высокой степени риска заноса инфекционного агента с территории данных государств. Усилились торгово-экономические связи со странами Азиатского континента, что создает серьезные риски заноса изолятов данного генотипа на территорию Российской Федерации, и может подорвать ветеринарное благополучие нашей страны по ящуру [15].

В Российской Федерации вспышки ящура типа О регистрировались начиная с 2000 по 2021 гг. на территории Приморского, Хабаровского, Забайкальского краев, Амурской, Оренбургской областей, Республики Башкирия. Вспышки болезни были вызваны вирусом ящура типа О и генотипов: O/SEA/Mya-98, O/ME-SA/PanAsia, O/ME-SA/Ind-2001.

Анализируя вспышки, которые регистрировались на территории Азии, обнаружено, что в Пакистане изоляты вируса ящура генотипа О/ME-SA/PanAsia2^ANT-10 были выделены в 2010, 2011, 2012, 2013, 2014, 2015, 2017, 2018, 2019, 2020, 2021 и особенно много в 2022 гг., в Афганистане - в 2010, 2011, 2012, 2014, 2016, 2017, 2018 и 2022 гг., в Бахрейне - в 2011, 2014 и 2022 гг., в Иране - в 2010, 2011, 2012, 2013, 2015, 2017, 2018, 2021, в Ираке - в 2011, 2022 гг., в Израиле - в 2011, 2012 и массового в 2022 гг. Аналогичная ситуация отмечается и в других странах Азии, что не может не настораживать. Это является опасным для нашей страны и требует создания средств диагностики и экстренной специфической профилактики ящура генотипа О/МЕ-SA/PanAsia2^ANT-10.

В настоящее время известны штаммы вируса ящура типа О, которые применяются для производства средств диагностики ящура:

- штамм вируса ящура O1 Манисса (генотип O/SEA/Mya-98);

- штамм вируса ящура О №1734/Приморский/2000 (генотип О/МЕ-SA/PanAsia),

- штамм вируса ящура О №2147/Приморский/12 (генотип O/ME-SA/PanAsia),

- штамм вируса ящура О №2212/Приморский/14 (генотип O/SEA/Mya-98),

- штамм вируса ящура О №2311/Забайкальский/2016 (генотип O/ME-SA/Ind-2001),

- штамм вируса ящура О №2047/Саудовская Аравия/2008 (генотип O/ME-SA/PanAsia2).

В 2018 г. на территории Исламской Республики Пакистан от крупного рогатого скота с клиническими признаками ящура был отобран патологический материал, который поступил в ФГБУ «ВНИИЗЖ». Изолят вируса ящура «О РК18/12», послуживший источником для получения штамма О №2356/Пакистан/2018, был адаптирован и выделен в культуре клеток IB-RS-2. По результатам сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей, выделенный изолят принадлежит к вирусу ящура типа О топотипа ME-SA генетической линии PanAsia2 новой сублинии ANT-10.

По результатам сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей выделенный штамм принадлежит к генотипу О/ME-SA/PanAsia2^ANT-10 вируса ящура, который значительно отличается от производственных штаммов вируса ящура серотипа О (Фиг. 1) [16].

Учитывая увеличение торгово-экономических взаимоотношений между Россией и странами Азии, в которых стабильно стали регистрировать вспышки ящура генотипа О/ME-SA/PanAsia2^ANT-10, возникает опасность возникновения ящура в Российской Федерации и особое значение приобретает проблема возможной экстренной профилактики данного заболевания для формирования иммунитета у восприимчивых животных. Таким образом, возникла необходимость разработать новую вакцину против ящура генотипа О/ME-SA/PanAsia2^ANT-10 из штамма «О №2356/Пакистан/2018» культуральную инактивированную сорбированную для обеспечения биологической безопасности и ветеринарного благополучия территории Российской Федерации, сопредельных государств и стран, эндемичных по ящуру, которые будут использовать данный препарат для профилактики этого особо опасного заболевания.

Наиболее близкой предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является вакцина инактивированная сорбированная против ящура серотипа О (штамм «О №2047/Саудовская Аравия/2008»), содержащая активное вещество в виде авирулентного и очищенного культурального антигенного материала из гомологичного возбудителю ящура штамма «О №2047/Саудовская Аравия/2008», полученного в чувствительной биологической системе, и целевые добавки в виде гидроксида алюминия и сапонина (адъювант): концентрация антигена (инактивированные 146S+75S компоненты вируса ящура) не менее 3,0 мкг/см³, содержание 10%-ного раствора гидроокиси алюминия - 30% по объему, концентрация сапонина - 1,5 мг/см³, добавка в виде поддерживающей среды - до 1,0 см³ (прототип).

В качестве чувствительной биологической системы для репродукции вируса ящура используют перевиваемую клеточную линию почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/2-17, в качестве поддерживающей среды применяют среду Игла MEM без внесения сыворотки, с добавлением ферментативного гидролизата мышц сухого, гидролизата белков крови сухого при рН среды 7,40-7,60.

Для инактивации вируса используют аминоэтилэтиленимин (АЭЭИ). При изготовлении сорбированной вакцины в качестве адъюванта служит гидроксид алюминия (Al(ОН)₃). Очистку вируссодержащей суспензии от балластных примесей осуществляют с применением полигексаметиленгуанидин гидрохлорида (ПГМГ).

Существенный недостаток вакцины-прототипа состоит в его очень низкой иммуногенной активности относительно штаммов/полевых изолятов вируса ящура генотипа О/ME-SA/PanAsia2^ANT-10, циркулирующих в странах Азии.

Для решения этой проблемы было создано настоящее изобретение, в которую входила разработка вакцины против ящура генотипа О/ME-SA/PanAsia2^ANT-10 из штамма «О №2356/Пакистан/2018» культуральной инактивированной сорбированной. Данная вакцина предполагает высокое содержание 146S полноценного иммуногенного компонента в дозе препарата.

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала инактивированных культуральных сорбированных вакцин для защиты животных против изолятов и штаммов вируса ящура серотипа О и, в частности, генотипа О/ME-SA/PanAsia2^ANT-10.

Указанный технический результат достигнут созданием вакцины против ящура генотипа О/ME-SA/PanAsia2^ANT-10 из штамма «О №2356/Пакистан/2018» культуральной инактивированной сорбированной, охарактеризованной следующей совокупностью признаков, отраженных ниже.

Разработанная вакцина в 1,0 см³ препарата содержит следующие основные компоненты: 1) активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из гомологичного возбудителю инфекции штамма «О №2356/Пакистан/2018» (генотип О/ME-SA/PanAsia2^ANT-10) вируса ящура, репродуцированного предпочтительно в перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, в количестве не менее 4,0 мкг; 2) гидроксид алюминия 10%-ный коллоидный раствор с содержанием 47% по объему (4,7% в пересчете на сухое вещество), 3) сапонин в количестве 1,8 мг, 4) поддерживающая среда - до 1,0 см³.

Штамм «О №2356/Пакистан/2018», который получен путем адаптации изолята «О РК18/12», депонирован во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) Федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), под регистрационным номером: №415 - деп / 22-49 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Штамм адаптирован к первично-трипсинизированным монослойным клеткам линии свиной почки (СП) и перевиваемым клеточным линиям из почки новорожденного сирийского хомячка (ВНК-21/SUSP/ARRIAH), почки свиньи (IB-RS-2) и почки сибирского горного козерога (ПСГК-30).

Для изготовления вакцины в качестве чувствительной биологической системы предпочтительно используют перевиваемую суспензионную культуру клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH, а в качестве поддерживающей среды применяют среду Игла DMEM без внесения сыворотки, но с добавлением гидролизата белков крови в количестве 7% от общего объема при рН среды 7,46-7,66. Инактивацию вируса проводят с использованием аминоэтилэтиленимина (АЭЭИ) с концентрацией 0,025% от объема вируссодержащей суспензии. Инактивированный вирус очищают от балластных примесей с помощью полигексаметиленгуанидина (ПГМГ), который вносят в суспензию до концентрации 0,015% от общего объема.

Авирулентный и очищенный антиген штамма «О №2356/Пакистан/2018» вируса ящура представляет собой суспензию, содержащую инактивированный 146S иммуногенный компонент вируса ящура. Концентрацию компонента в продукте оценивают с помощью количественного варианта реакции связывания комплемента (РСК) [18]. Для создания вакцины используют вирусный материал, содержащий в 1,0 см³ не менее 4,0 мкг инактивированных иммуногенных 146S частиц вируса ящура. Необходимую концентрацию иммуногенного компонента в вакцинном препарате обеспечивают благодаря концентрированию антигена с помощью сорбирования на поверхности коллоидных частиц гидроксида алюминия (Al(ОН)₃).

Вакцину против ящура из штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/ME-SA/PanAsia2^ANT-10 культуральную инактивированную сорбированную получают путем смешивания очищенного антигена и 10%-ной суспензии гидроксида алюминия в соотношении 53% на 47% по объему, соответственно. Для усиления иммунного ответа используют сапонин в концентрации 1,8 мг/см³. Полученная вакцина представляет собой суспензию, содержащую частицы не растворимого в воде гидроокиси алюминия, несущие на своей поверхности инактивированные вирионы вируса ящура (146S компонент), которые обеспечивают формирование иммунитета.

Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые спрашивается правовая охрана:

1. Вакцина против ящура генотипа О/ME-SA/PanAsia2^ANT-10 из штамма «О №2356/Пакистан/2018» культуральная инактивированная сорбированная.

2. Активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из гомологичного возбудителю заболевания штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/ME-SA/PanAsia2^ANT-10 вируса ящура в эффективном количестве.

3. Целевые добавки.

Существенные отличительные признаки предлагаемой вакцины заключаются в том, что в качестве активного вещества она содержит авирулентный очищенный антиген штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/ME-SA/PanAsia2^ANT-10 вируса ящура в эффективном количестве.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:

1. Авирулентный и очищенный антиген штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/ME-SA/PanAsia2^ANT-10 вируса ящура, полученный предпочтительно в суспензионной перевиваемой клеточной линии BHK-21/SUSP/ARRIAH и представляющий собой суспензию, содержащую 146S иммуногенный компонент вируса ящура в эффективном количестве.

2. Авирулентный и очищенный антиген штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/ME-SA/PanAsia2^ANT-10 вируса ящура, полученный предпочтительно в суспензионной перевиваемой культуре клеток BHK-21/SUSP/ARRIAH и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S иммуногенный компонент вируса ящура в количестве не менее 4,0 мкг в 1,0 см³ готового вакцинного препарата.

3. Из целевых добавок вакцина содержит адъювант.

4. Из целевых добавок вакцина содержит адъювант - гидроксид алюминия в комплексе с сапонином.

5. Вакцина содержит адъювант - гидроокись алюминия 4,7% в пересчете на сухой остаток в комплексе с сапонином в концентрации 1,8 мг в 1,0 см³ готового препарата.

6. Авирулентный и очищенный антиген штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/ME-SA/PanAsia2^ANT-10 вируса ящура, полученного предпочтительно в перевиваемой суспензионной клеточной линии BHK-21/SUSP/ARRIAH, адъювант - гидроксид алюминия и сапонин, добавка в готовом препарате в виде поддерживающей среды в следующих количествах: Авирулентный и очищенный антиген штамма

«О №2356/Пакистан/2018» генотипа O/ME-SA/PanAsia2^ANT-10 вируса ящура не менее 4,0 мкг/см³ Гидроокись алюминия 4,7% (в пересчете на сухое вещество) Сапонин 1,8 мг/см³ Поддерживающая среда до 1,0 см³

Предлагаемая вакцина против ящура из штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/ME-SA/PanAsia2^ANT-10 культуральная инактивированная сорбированная обладает высокой иммуногенной активностью и обеспечивает надежную защиту против изолятов вируса ящура генотипа О/ME-SA/PanAsia2^ANT-10, циркулирующих в странах Азии.

Достижение технического результата от использования изобретения обеспечивается тем, что в состав предлагаемой противоящурной вакцины в качестве активного вещества введен антиген штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/ME-SA/PanAsia2^ANT-10 вируса ящура, обладающий высокой иммуногенной активностью, создающий эффективную защиту восприимчивых животных против изолятов вируса ящура представленного генотипа, которые в последние годы вызывают вспышки заболевания в странах Азии.

Сущность изобретения отражена на графическом изображении:

Фиг. 1. - Дендрограмма, отражающая филогенетическое взаимоотношение штамма «О №2356/Пакистан/2018» вируса ящура с эпизоотическими штаммами серологического типа О. Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностей гена VP₁.

Сущность изобретения пояснена следующими перечнями последовательностей:

SEQ ID NO: 1 представляет последовательность нуклеотидов гена, кодирующего белок VP₁ штамма «О №2356/Пакистан/2018» вируса ящура генотипа О/ME-SA/PanAsia2^ANT-10;

SEQ ID NO: 2 представляет последовательность аминокислот белка VP₁ штамма «О №2356/Пакистан/2018» вируса ящура генотипа О/ME-SA/PanAsia2^ANT-10.

Штамм «О №2356/Пакистан/2018» вируса ящура характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки

Штамм «О №2356/Пакистан/2018» вируса ящура относится к семейству Picornaviridae, роду Aphthovirus, типу О и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона иксаэдрическая, размер 23-24 нм. Вирион состоит из молекулы РНК, заключенной в белковую оболочку. Белковая оболочка состоит из 32 капсомеров, расположенных в кубической симметрии.

Антигенные свойства

По своим антигенным свойствам штамм «О №2356/Пакистан/2018» вируса ящура относится к генотипу О/ME-SA/PanAsia2^ANT-10. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной сывороткой. Вирус не проявляет гемагглютинирующей активности. У переболевших животных в сыворотке крови образуются типоспецифические антитела, выявляемые в иммуноферментном анализе (ИФА) и реакции микронейтрализации (РМН).

Антигенное родство (r₁) штамма «О №2356/Пакистан/2018» вируса ящура изучено в его перекрестном исследовании в РМН с референтными, моновалентными сыворотками, полученными на производственные штаммы вируса ящура:

- штамм вируса ящура «O1 Манисса» (генотип O/SEA/Mya-98);

- штамм вируса ящура «О №1734/Приморский/2000» (генотип О/МЕ-SA/PanAsia),

- штамм вируса ящура «О №2147/Приморский/12» (генотип O/ME-SA/PanAsia),

- штамм вируса ящура «О №2212/Приморский/14» (генотип O/SEA/Mya-98),

- штамм вируса ящура «О №2311/Забайкальский/2016» (генотип O/ME-SA/Ind-2001),

- штамм вируса ящура «О №2047/Саудовская Аравия/2008» (генотип О/МЕ-SA/PanAsia2).

Титр референтных сывороток крови, полученных путем иммунизации КРС моновалентными вакцинами из производственных штаммов вируса ящура типа О, против 10² ТЦД₅₀ гомологичного и гетерологичного вируса определяли в РМН при перекрестном титровании, рассчитывая значения с использованием уравнения линейной регрессии, и выражали в lg. Значение r₁ определяли, как антилогарифм разности lg титров сыворотки против гетерологичного и гомологичного вируса ящура [4].

Значение r₁ в РМН интерпретировали:

при ≥0,3 - исследуемый и производственный штаммы вируса ящура являются родственными;

при <0,3 - исследуемый образец штамма вируса ящура значительно отличается от производственного штамма.

Показатели антигенного родства при изучении штамма «О №2356/Пакистан/2018» составили r₁ от 0,14 до 0,26, что свидетельствует об отсутствии антигенного родства штамма «О №2356/Пакистан/2018» в отношении производственных штаммов вируса ящура (таблица 1).

Гено- и хемотаксономическая характеристики

Штамм «О №2356/Пакистан/2018» вируса ящура является РНК-содержащим вирусом с положительной цепью с молекулярной массой 8,08×10⁶ Д. Нуклеиновая кислота представлена одноцепочной линейной молекулой молекулярной массой 2,8×10⁶ Д. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую из четырех основных белков VP₁, VP₂, VP₃ и VP₄. Липопротеидная оболочка отсутствует.

Основным антигенным белком является VP₁. В вирионе содержится приблизительно 31,5% РНК и 68,5% белка. Вирионная РНК является инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Предшественники, в свою очередь, расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса. Одним из 8 неструктурных полипептидов, накапливающихся в инфицированных клетках, является фермент РНК-зависимая РНК-полимераза, участвующая в репликации вирусной РНК.

Методом нуклеотидного секвенирования по Сенгеру была определена первичная структура гена 1D и соответствующего ему белку VP₁ штамма «О №2356/Пакистан/2018» вируса ящура. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей показал, что штамм «О №2356/Пакистан/2018» вируса ящура принадлежит к генотипу О/ME-SA/PanAsia2^ANT-10 (Фиг. 1).

Физические свойства

Масса вириона составляет 8,4×10^-18 г. Коэффициент седиментации полных вирусных частиц - 146S. Плавучая плотность в градиенте сахарозы 1,45 г/см³.

Устойчивость к внешним факторам

Штамм «О №2356/Пакистан/2018» вируса ящура устойчив к детергентам и органическим растворителям, таким как эфир, хлороформ, фреон, ацетон. Наиболее стабилен при рН 7,46-7,66. Сдвиги рН как в кислую, так и в щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Штамм чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, γ-облучению, высоким температурам (выше 38°С). Устойчив к низким температурам. Оптимальная температура хранения вируса не выше минус 70°С.

Дополнительные признаки и свойства

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.

Патогенность - патогенен для домашних и диких парнокопытных животных.

Вирулентность - вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.

Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 5 пассажей (срок наблюдения) на перевиваемых культурах.

Биотехнологические характеристики

Штамм «О №2356/Пакистан/2018» вируса ящура репродуцируется в следующих перевиваемых клеточных линиях: почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), почки свиньи (IB-RS-2), почки сирийского хомяка (ВНК-21), почки новорожденного сирийского хомячка (BHK-21/SUSP/ARRIAH).

При испытании проведено 5 последовательных пассажей штамма «О №2356/Пакистан/2018» вируса ящура в перевиваемых культурах клеток IB-RS-2, ПСГК-30, ВНК-21. Биологические свойства характеризовали путем определения инфекционной активности возбудителя ящура каждого пассажа в перевиваемой культуре клеток IB-RS-2 и на естественно восприимчивых животных - крупном рогатом скоте (КРС) и свиньях.

Для снижения эпизоотической опасности возникновения ящура, вызванного генотипом О/ME-SA/PanAsia2^ANT-10, и предотвращения возникновения новых очагов болезни важна своевременная вакцинопрофилактика, что требует разработки новой безопасной и эффективной вакцины.

Получена безопасная и эффективная вакцина против ящура генотипа О/ME-SA/PanAsia2^ANT-10 из штамма «О №2356/Пакистан/2018» культуральная инактивированная сорбированная.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. Генетическая характеристика штамма «О №2356/Пакистан/2018» вируса ящура по данным ПЦР и нуклеотидного секвенирования.

Проведенные исследования заключались в изучении первичной структуры гена 1D (белок VP₁) (639 н.о.) штамма «О №2356/Пакистан/2018» вируса ящура методом нуклеотидного секвенирования методом Сенгера и определении положения данного штамма на филогенетическом древе вируса ящура серотипа О. Метод основан на определении первичной структуры гена 1D (белок VP₁) испытуемого изолята/штамма с последующим анализом филогенетического родства с другими изолятами вируса ящура серотипа О.

Провели сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей гена 1D, кодирующего белок VP₁ вируса ящура вакцинного штамма «О №2356/Пакистан/2018» с другими изолятами и штаммами. Последовательность нуклеотидов гена белка VP₁ штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/ME-SA/PanAsia2^ANT-10 вируса ящура представлена SEQ ID NO: 1. Последовательность аминокислот ID-гена, кодирующего белок VP₁ штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/ME-SA/PanAsia2^ANT-10 вируса ящура отражена на SEQ ID NO: 2.

Провели филогенетический анализ штамма «О №2356/Пакистан/2018». Филогенетическое дерево выведено с использованием программы MEGA6 и алгоритма Neighbor-Joining [20]. Процент повторяющихся ветвей, в которых связанные таксоны сгруппированы вместе в тесте начальной загрузки (увеличили со стандартных 100 до 500 повторов для высокой степени достоверности), показан рядом с ветвями [21, 22]. Эволюционные расстояния были рассчитаны с использованием метода Maximum Composite Likelihood [23] и выражены в единицах количества замен оснований на сайт.Этот анализ включал 28 нуклеотидных последовательностей, в том числе последовательность ID-гена штамма «О №2356/Пакистан/2018» вируса ящура. Все позиции, содержащие пробелы и отсутствующие данные, были удалены (вариант полного удаления). В окончательном наборе данных было всего 639 позиций. Эволюционный анализ проводился в MEGA 6 [24].

В результате проведенной работы по сравнению полных нуклеотидных последовательностей гена 1D (белок VP₁) штамма «О №2356/Пакистан/2018» и других изолятов/штаммов вируса ящура серотипа О определено положение исследуемого штамма на филогенетическом древе (фиг. 1).

Таким образом, исследуемый штамм «О №2356/Пакистан/2018» относится к генотипу О/ME-SA/PanAsia2^ANT-10, что подтверждают данные нуклеотидного и аминокислотного анализа.

Пример 2. Адаптация штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/ME-SA/PanAsia2^ANT-10 к перевиваемой монослойной культуре клеток почки сибирского горного козерога ПСГК-30.

Для заражения перевиваемой монослойной культуры клеток почки сибирского горного козерога ПСГК-30 использовали 10%-ную афтозную суспензию вируса ящура, полученную из афт КРС (2 пассаж). Посевная концентрация клеток составляла 0,18-0,20 млн кл./см³, доза заражения вирусом - 0,001 ТЦД₅₀/кл. По результатам исследования репродукция вируса ящура штамма «О №2356/Пакистан/2018» проходила при специфическом разрушении монослоя на 90-100% за 12-13 ч. В течение 6 последовательных пассажей отмечали рост значений титра инфекционной активности вируса от 5,65±0,10 до 7,52±0,10 lg ТЦД₅₀/см³.

Максимальное значение титра инфекционной активности вируса было достигнуто на этапе 6 пассажа (7,52±0,10 lg ТЦД₅₀/см³). Концентрация 146S частиц с 1-го по 6-й пассажи изменялась с 0,41±0,02 до 1,05±0,04 мкг/см³. При этом наибольшее количество 146S компонента отмечали на этапе 6 пассажа (1,05±0,04 мкг/см³). Степень достоверности (R²) результатов исследования в количественном варианте ОТ-ПЦР-РВ колебалась от 98,69 до 99,97%. Таким образом, на протяжении 6-и последовательных пассажей была успешно проведена адаптация штамма «О №2356/Пакистан/2018» вируса ящура к перевиваемой монослойной клеточной линии ПСГК-30.

Пример 3. Изучение условий монослойного культивирования вируса ящура штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа O/ME-SA/PanAsia2^ANT-10 в промышленных масштабах.

В процессе промышленного культивирования штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа O/ME-SA/PanAsia2^ANT-10 вируса ящура в перевиваемой монослойной культуре клеток ПСГК-30 осуществляли подбор оптимальных условий культивирования вируса по поддерживающей среде, температурному фактору и дозе заражения исследуемым вирусом клеток.

На первом этапе исследования оценивали влияние состава поддерживающей среды на репродукцию штамма «О №2356/Пакистан/2018» вируса ящура в монослойной культуре клеток ПСГК-30 в масштабах производства (на этапе с 5-го на 6-ой пассажи). Для сравнения применяли три среды с добавлением 2,0% фетальной сыворотки крови телят: 1) среда Игла DMEM; 2) среда RPMI-1640; 3) раствор Хэнкса. Посевная концентрация клеток составляла 0,18-0,20 млн кл./см³, доза заражения вирусом - 0,1000-0,0001 ТЦД₅₀/кл. Культивирование вируса осуществляли при температурах 35±0,2 - 38±0,2°С до разрушения клеточного монослоя на 95-100% в течение 12-18 ч. Результаты репродукции штамма «О №2356/Пакистан/2018» вируса ящура с поддерживающими средами разного состава отражены в таблице 2.

Из данных таблицы видно, что при репродукции штамма «О №2356/Пакистан/2018» вируса ящура в монослойной культуре клеток ПСГК-30 с применением поддерживающих сред разного состава, оптимальной является среда Игла DMEM, позволяющая за 12-13 ч достичь специфического разрушения клеточного монослоя на 95-100% с накоплением в полученной суспензии 146S компонента в количестве 1,05±0,04 мкг/см³ и титром инфекционной активности 7,52±0,10 lg ТЦД₅₀/см³. При использовании среды RPMI-1640 и раствора Хэнкса показатели репродукции вируса были ниже.

На следующем этапе изучения условий монослойного культивирования штамма «О №2356/Пакистан/2018» вируса ящура в культуре клеток ПСГК-30 в условиях производства оценивали влияние на процесс репродукции вируса температурного фактора. Для этого культивирование вируса проводили в среде Игла DMEM с 2% сыворотки КРС при следующих температурах: 35,0±0,2; 36,0±0,2; 37,0±0,2; 38,0±0,2°С. Доза заражения культуры клеток вирусом ящура составляла 0,010-0,001 ТЦД₅₀/кл. Культивирование вируса осуществляли до разрушения клеточного монослоя на 80-100% в течение 12-27 ч (таблица 2). По итогам исследования выявили, что для полной репродукции штамма «О №2356/Пакистан/2018» вируса ящура в монослойной культуре клеток ПСГК-30 оптимальной является температура среды 37,0±0,02°С, при которой за 12-13 ч развитие ЦПД достигало 95-100% с накоплением 146S частиц, равным 1,05±0,04 мкг/см³ и титром инфекционной активности вируса 7,52±0,10 lg ТЦД₅₀/см³.

Оценивали влияние дозы заражения монослоя клеток линии ПСГК-30 штаммом «О №2356/Пакистан/2018» при культивировании в масштабах производства. Для этого использовали разные дозы вируса: 0,10-0,01; 0,010-0,001; 0,0010-0,0001 ТЦД₅₀/кл. В качестве поддерживающей среды применяли среду Игла MEM с 2% сыворотки крови КРС. Репродукцию вируса проводили при температуре 37,0±0,2°С в течение 12-27 ч до специфического разрушения клеток на 90-100%. По итогам культивирования определяли концентрацию 146S компонента и титр инфекционной активности вируса ящура. Как следует из данных таблицы 2, наибольшее накопление 146S компонента вируса достигалось при дозе заражения 0,1-0,01 ТЦД₅₀/кл. и составило 1,05±0,04 мкг/см³ с титром инфекционной активности вируса 7,52±0,10 lg ТЦД₅₀/см³.

Таким образом, проведено изучение условий монослойного культивирования штамма «О №2356/Пакистан/2018» вируса ящура в культуре клеток ПСГК-30 в промышленных масштабах. В результате исследования определены следующие оптимальные параметры репродукции штамма «О №2356/Пакистан/2018» вируса ящура в монослойной клеточной линии ПСГК-30: 1) поддерживающая среда - среда Игла DMEM; 2) температурный режим культивирования - 37,0±0,02°С; 3) доза заражения вирусом - 0,01-0,001 ТЦД₅₀/кл.

Пример 4. Изучение условий суспензионного культивирования штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа O/ME-SA/PanAsia2^ANT-10 вируса ящура в промышленных масштабах.

При промышленном культивирования штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа O/ME-SA/PanAsia2^ANT-10 вируса ящура в перевиваемой суспензионной культуре клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH проводили поиск оптимальных параметров для успешной репродукции возбудителя ящура, используя разные концентрации клеток, температурные условия и дозу заражения вирусом.

На первом этапе работы определяли влияние посевной концентрации клеток линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH в суспензии на репродукцию штамма «О №2356/Пакистан/2018» вируса ящура в промышленных масштабах. Для анализа подготовили суспензии со следующими концентрации клеток: 2,5; 3,0; 3,5; 4,0 млн кл./см³. Водородный показатель рН поддерживали в диапазоне 7,46-7,66. Температура культивирования вируса составляла 37,0±0,02°С, доза заражения вирусом - 0,10-0,01 ТЦД₅₀/кл. Репродукцию вируса проводили до специфической гибели клеток на 95-100%, которая осуществлялась в течение 9-11 ч. Результаты суспензионного культивирования штамма «О №2356/Пакистан/2018» вируса ящура в суспензии с разными концентрациями клеток представлены в таблице 3.

Как следует из таблицы 3, при культивировании вируса ящура штамма «О №2356/Пакистан/2018» в суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH с разными концентрациями клеток, определили, что накопление 146S компонента в суспензии с концентрацией клеток 2,5 млн кл./см³ составило 1,41±0,02 мкг/см³, с концентрацией 3,0 млн кл./см³ - 1,79±0,02 мкг/см³, с концентрацией 3,5 млн кл./см³ - 2,02±0,03 мкг/см³, и с концентрацией 4,0 млн кл./см³ - 2,32±0,02 мкг/см³. Как следует из полученных данных для репродукции штамма «О №2356/Пакистан/2018» вируса ящура оптимальной является концентрация клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH в суспензии, равная 4,0 млн кл./см³. Значение титра инфекционной активности вируса при этом составило 10,05±0,10 lg ТЦД₅₀/см³. Большая концентрация клеток позволяла получить такой же выход продукта с небольшим увеличением. С экономической точки зрения, таким образом, для репродукции штамма «О №2356/Пакистан/2018» вируса ящура оптимально использовать суспензию клеток линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH с концентрацией 4,0 млн кл./см³.

На следующем этапе работы исследовали влияние температурного фактора на репродукцию штамма «О №2356/Пакистан/2018» вируса ящура в суспензионной культуре клеток линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH в промышленных масштабах. Для этого репродукцию вируса проводили при следующих температурных условиях: 35,0±0,2; 36,0±0,2; 37,0±0,2; 38,0±0,2°С. Доза заражения культуры клеток вирусом составляла 0,10-0,01 ТЦД₅₀/кл. Водородный показатель рН вирусной суспензии поддерживали в диапазоне 7,46-7,66. Культивирование вируса проводили до ЦПД, равного не менее 80% (приоритет отдавали полной специфической деструкции клеток), в течение 9-22 ч. По результатам анализа определили, что для полной репродукции штамма «О №2356/Пакистан/2018» вируса ящура в суспензионной культуре клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH оптимальной является температура среды 37,0±0,02°С, при которой в течение 9-11 ч наблюдается специфическая гибель клеток на 95-100% с высоким накоплением 146S компонента (2,32±0,02 мкг/см³) и титром инфекционной активности вируса 10,05±0,10 lg ТЦД₅₀/см³.

В ходе работы по изучению условий суспензионного культивирования штамма «О №2356/Пакистан/2018» вируса ящура в промышленных масштабах с применением культуры клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH оценивали влияние дозы заражения клеток. Для этого клеточные суспензии заражали вирусом в разных дозах: 0,10-0,01; 0,01-0,001; 0,001-0,0001 ТЦД₅₀/кл. Репродукцию вируса осуществляли при температуре 37,0±0,2°С в течение 9-26 ч до цитопатического действия, равного не менее 90%. По итогам культивирования определяли концентрацию 146S частиц и титр инфекционной активности вируса ящура. Как видно из данных таблицы 3, наибольшее накопление 146S компонента отмечали при дозе заражения 0,010-0,001 ТЦД₅₀/кл. (2,32±0,02 мкг/см³) с титром инфекционной активности вируса, равным 10,05±0,10 lg ТЦД₅₀/см³.

Таким образом, проведено изучение трех параметров суспензионного культивирования штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/ME-SA/PanAsia2^ANT-10 вируса ящура в суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH в промышленных масштабах. Выявлены оптимальные условия репродукции штамма «О №2356/Пакистан/2018» в суспензионной культуре клеток ВНК-21: 1) концентрация клеток перед заражением - 4,0 млн кл./см³; 2) температурный режим культивирования - 37,0±0,02°С; 3) доза заражения вирусом - 0,010-0,001 ТЦД₅₀/кл.

Пример 5. Инактивация суспензии вируса ящура штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/ME-SA/PanAsia2^ANT-10.

По окончании цикла репродукции вируса ящура, не прекращая процесс термостатирования (37,0±0,02°С), в вируссодержащую суспензию добавляли подкисленный раствор аминоэтилэтиленимина (АЭЭИ) с рН, равным 8,3-8,4. Конечная концентрация АЭЭИ в вируссодержащей суспензии должна быть равной 0,025%. Инактивацию инфекционной активности вируса ящура штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/ME-SA/PanAsia2^ANT-10 проводили в течение 12 часов при температуре 37,0±0,1°С и рН 7,46-7,66 с периодическим перемешиванием.

Для определения времени полной инактивации после добавления 1,2-АЭЭИ каждый час производили отбор проб. Полученные образцы проверяли на наличие инфекционной активности вируса ящура в первичной культуре клеток почки свиньи СП. Результаты представлены в таблице 4, из данных которой видно, что полная инактивация вируса ящура штамма «О №2356/Пакистан/2018», репродуцированного в культиваторах, произошла через 6 часов после внесения 1,2-АЭЭИ.

Готовые вирусные инактивированные суспензии исследовали в РСК для оценки содержания в них компонентов вируса. Концентрация 146S компонента составила 2,24±0,02 мкг/см³, a 146S+75S компонента -3,06±0,02 мкг/см³.

Пример 6. Подбор условий очистки суспензии вируса ящура штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/ME-SA/PanAsia2^ANT-10.

Суспензию вируса ящура штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа O/ME-SA/PanAsia 2^ANT-10, полученную при репродукции в суспензионной клеточной линии BHK-21/SUSP/ARRIAH, подвергали инактивации и очистке. Для получения очищенного антигена вируса ящура использовали полигексаметиленгуанидин (ПГМГ) с концентрациями 0,010, 0,015 и 0,020%. До и после процесса очистки антигена вируса ящура штамма «О №2356/Пакистан/2018» в количественном варианте РСК определяли концентрацию общего вирусного белка и иммуногенных компонентов. Результаты анализа отражены в таблице 5, из которой следует, что в результате очистки антигена вируса ящура штамма «О №2356/Пакистан/2018» с помощью ПГМГ в концентрации 0,010% отмечали снижение концентрации балластного белка на 10%, иммуногенных компонентов - на 2%. При использовании ПГМГ в концентрации 0,015% наблюдали снижение количества балластного белка на 40%, 146S компонента - на 3,6%. Применяя ПГМГ в концентрации 0,020% содержание балластного белка уменьшалось на 60%, а иммуногенных компонентов - на 23%. Таким образом, исследуя условия очистки антигена штамма «О №2356/Пакистан/2018», пришли к выводу о том, что для получения очищенного продукта оптимально использовать ПГМГ с концентрацией 0,015%.

Пример 7. Подбор условий концентрирования суспензии антигена штамма «О №2356/Пакистан/2018» вируса ящура генотипа О/ME-SA/PanAsia2^ANT-10.

Культуральную инактивированною суспензию штамма «О №2356/Пакистан/2018», полученную с применением суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, подвергали концентрированию в 5 раз по объему. Для увеличения концентрации иммуногенных компонентов антигена вируса ящура использовали следующие приемы: 1) добавление полиэтиленгликоля (ПЭГ-6000) с концентрацией 50% к антигену в соотношении 1:4, с экспозицией 4 ч; 2) добавление полиэтиленгликоля (ПЭГ-6000) с концентрацией 50% к антигену в соотношении 1:4, с экспозицией 12 ч; 3) концентрирование с помощью установки тангенциальной фильтрации Centramate 500S Pall в течение 6 ч при рабочем давлении на фильтр 2,2-2,6 атм.

До и после процесса концентрирования суспензии антигена вируса ящура штамма «О №2356/Пакистан/2018» определяли концентрацию общего вирусного белка и иммуногенных компонентов в количественном варианте РСК. Результаты исследований представлены в таблице 6, из которой видно, что при концентрировании антигена штамма «О №2356/Пакистан/2018» вируса ящура с помощью ПЭГ-6000 в течение 4 ч отмечали увеличение содержания компонентов по сравнению с исходными значениями (до концентрирования) в 3,8 раз. Используя тот же полимер, но повышая время воздействия до 12 ч, увеличили концентрацию компонентов вируса в 4,2 раз. Применяя метод сорбирования с помощью тангенциальной фильтрации, удалось увеличить количество иммуногенных компонентов антигена штамма «О №2356/Пакистан/2018» вируса ящура в суспензии в 4,95 раз. Таким образом, технология тангенциальной фильтрации позволила получить антиген штамма «О №2356/Пакистан/2018» с высокой концентрацией вирусных белков.

Пример 8. Подбор адъюванта и соотношения антиген-адъювант.

Для изготовления противоящурной моновалентной сорбированной вакцины из антигена штамма «О №2356/Пакистан/2018» в качестве адъюванта была выбран гидроксид алюминия в комплексе с сапонином. При изготовлении данного вакцинного препарата использовали 4,7% гидроокиси алюминия в пересчете на сухое вещество и сапонин в количестве 1,8 мг.Соотношение антигена штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/ME-SA/PanAsia2^ANT-10 вируса ящура с адъювантом гидроксид алюминия в комплексе с сапонином составляет 53% на 47%, соответственно.

Пример 9. Компоновка вакцины против ящура из штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/ME-SA/PanAsia2^ANT-10 культуральной инактивированной сорбированной.

Из полученного концентрата антигена вируса ящура штамма «О №2356/Пакистан/2018» изготовили вакцину против ящура генотипа О/ME-SA/PanAsia2^ANT-10 культуральную инактивированную сорбированную с применением в качестве адъювантов гидроксида алюминия и сапонина. Количество 146S иммуногенного компонента в 1,0 см³ антигена составило 10,69±0,07 мкг/см³ (таблица 6).

Пример 10. Иммунизация животных вакциной против ящура из штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/ME-SA/PanAsia2^ANT-10 культуральной инактивированной сорбированной.

Из полученной вакцины против ящура из штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/ME-SA/PanAsia2^ANT-10 культуральной инактивированной сорбированной (предлагаемое изобретение) был приготовлен ряд разведений для КРС с 4-х кратным шагом. 15 голов КРС разделили на 3 группы по 5 голов в каждой, 2 головы без вакцинации оставили для контроля вируса. Иммунизирующая доза составляла 2,0 см³. Первую группу КРС (№№1-5) иммунизировали вакциной без разведения, вторую группу КРС (№№6-10) привили вакциной, разведенной 1/4, третья группа КРС (№№11-15) - вакциной, разведенной 1/16. Препарат вводили внутримышечно в среднюю треть шеи.

Пример 11. Исследование сывороток крови вакцинированных животных на наличие антител к неструктурным белкам вируса ящура.

Сыворотки крови от КРС, полученные до иммунизации животных, через 14 суток после иммунизации, исследовали на наличие антител к неструктурным белкам вируса ящура с помощью блокирующего варианта иммуноферментного анализа (ИФА) в соответствии с рекомендациями OIE (МЭБ) [3]. Тестирование полученных сывороток проводили с использованием тест-системы для ИФА «Prio CHECK^®FMDV NSP ELISA for in vitro detection of antibodies against Foot and Mouth Disease Virus in serum of cattle, sheep and pigs» (Prionics Lelystad B.V., Нидерланды). Полученные результаты исследований отражены в таблице 7, из которой видно, что сыворотки крови животных не содержали антител к неструктурным белкам вируса ящура (значения PI для сывороток крови КРС<50%).

Пример 12. Оценка авирулентности и безвредности вакцины против ящура из штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/ME-SA/PanAsia2^ANT-10 культуральной инактивированной сорбированной.

Для определения авирулентности вакцины (предлагаемое изобретение) на КРС отобранную пробу вакцинного препарата вводили внутрикожно по 0,1 см³. В исследовании использовали КРС массой 250-300 кг. В течение 10 суток наблюдения животные остались клинически здоровыми, и при патологоанатомическом исследовании не было обнаружено изменений, характерных для ящура. Это свидетельствовало об отсутствии вирулентных свойств разработанной вакцины.

Контроль безвредности продукта (предлагаемое изобретение) на КРС проводили путем внутримышечного введения вакцины в дозе 6,0 см³ (тройная доза по 2,0 см³). Срок наблюдения также составлял 10 суток. Следует отметить, что после иммунизации температура тела животного может повышаться до 41,4°С и удерживаться на этом уровне в течение 1-2 суток, что не выходит за рамки нормы после введения вакцинного препарата.

По результатам исследований вакцина против ящура из штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/ME-SA/PanAsia2^ANT-10 культуральная инактивированная сорбированная (предлагаемое изобретение) была признана безвредной, все животные в период наблюдения оставались клинически здоровыми, при патологоанатомическом анализе некроза тканей на месте введения вакцины не обнаружено.

Пример 13. Изучение иммуногенных свойств вакцины против ящура из штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/ME-SA/PanAsia2^ANT-10 культуральной инактивированной сорбированной по способности индуцирования вируснейтрализующих антител у естественно восприимчивых животных.

На 21 сутки после введения вакцины (предлагаемое изобретение) против ящура из штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/ME-SA/PanAsia2^ANT-10 культуральной инактивированной сорбированной у КРС отбирали кровь и проводили исследование полученных сывороток крови в реакции микронейтрализации [3]. Выявлено, что у КРС, иммунизированных вакциной в цельной дозе (5 голов), средние значения титра антител составили 9,31±0,21 log₂ SN₅₀, с разведением 1/4 (5 голов) - 5,50±0,33 log₂ SN₅₀, с разведением 1/16 (5 голов) - 3,81±0,22 log₂ SN₅₀. (таблица 8). Полученные данные реакции микронейтрализации свидетельствуют о том, что после введения вакцины в цельном виде обеспечивается формирование гуморального иммунитета с защитными титрами штаммоспецифических антител (5,5 и более log₂ SN₅₀), что соответствует требованиям международных стандартов [3].

Пример 14. Изучение защитной способности вакцины против ящура из штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/ME-SA/PanAsia2^ANT-10 культуральной инактивированной сорбированной на естественно восприимчивых видах животных методом контрольного заражения.

Крупный рогатый скот, иммунизированный в количестве 15 голов, вакциной в цельном виде и в разведениях, заражали контрольным штаммом «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/ME-SA/PanAsia2^ANT-10 вируса ящура, адаптированного к этим животным в слизистую оболочку языка в дозе 10^4,0 ИД₅₀/0,20 см³ (в две точки по 0,10±0,05 см³). Спустя 7 суток после заражения всех животных подвергли эвтаназии и провели патологоанатомический осмотр. Защищенными от ящура считали животных, у которых на конечностях отсутствовали поражения. Первичные афты не учитывали.

Результаты контрольного заражения представлены в таблице 8, из которой следует, что вакцина (предлагаемое изобретение) против ящура из штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/ME-SA/PanAsia2^ANT-10 культуральная инактивированная сорбированная в цельном виде, а также в разведениях 1/4 и 1/16, введенная в однократной дозе (2,0 см³) защищает КРС от заражения гомологичным штаммом всех животных (5 из 5 голов).

По результатам контрольного заражения было установлено, что в прививном объеме данной вакцины содержится 32 ПД₅₀ и 0,0625 ИмД₅₀ для КРС.

Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о том, что вакцина против ящура генотипа О/ME-SA/PanAsia2^ANT-10 из штамма «О №2356/Пакистан/2018» культуральная инактивированная сорбированная, воплощающая предлагаемое изобретение, предназначена как экспериментальная резервная для использования в сельском хозяйстве, а именно в ветеринарной вирусологии и биотехнологии; подтверждена возможность осуществления представленного; вакцина, изготовленная из штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/ME-SA/PanAsia2^ANT-10 в соответствии с предлагаемым изобретением, обладает высокой иммуногенной активностью и способна обеспечить эффективную защиту восприимчивых животных против эпизоотического штамма вируса ящура серотипа О, генотипа О/ME-SA/PanAsia2^ANT-10, циркулирующего в странах Азии.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Вакцина против ящура генотипа О/ME-SA/PanAsia2^ANT-10 из штамма «О №2356/Пакистан/2018» культуральная инактивированная сорбированная»:

1. Ящур. Меры профилактики. URL: http://89.rospotrebnadzor.ru/directions/epid_nadzor/146902 (Дата обращения: 08.10.2022).

2. Опасность болезни ящура. URL: https://vet.astrobl.ru/press-release/opasnost-bolezni-yashchura (Дата обращения: 18.10.2022).

3. OIE. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals - 24th Ed. - Paris, 2015 - Vol. 1, Chapter 2.1.5. - P. 166-169.

4. Бурдов A.H., Дудников А.И., Малярец П.В. и др. Ящур. - М.: Агропромиздат, 1990. - 320 с.

5. Пономарев А.П., Узюмов В.Л., Груздев К.Н. Вирус ящура: структура, биологические и физико-химические свойства. - Владимир: Фолиант, 2006. - 250 с.

6. Aspects of emergency vaccination against foot-and-mouth disease / P. Barnett, J.M/ Garland, R.P. Kitching [et. al.] // Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. - October 2002. - V. 25. - P. 345-364.

7. Brown F. A brief history of FMD and its casual agent. FMD: Control Strateies: Proc. Jnt. Symp.2-5. June 2002, Lyons, France. - Paris, 2003. - p. 13-21.

8. Vaccination against foot-and-mouth disease virus confers complete clinical protection in 7 days and partial protection in 4 days: Use in emergency outbreak response / T.G. William, J.M. Pachecoa, T. Doel [et. al.] // Vaccine. - December 2005. - V. 23. - P. 5775-5782.

9. Aspects of emergency vaccination against foot-and-mouth disease / P. Barnett, J.M/ Garland, R.P. Kitching [et. al.] // Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. - October 2002. - V. 25. - P. 345-364.

10. Barnett P.V. A review of emergency foot-and-mouth disease (FMD) vaccines / Vaccine. - February 2002. - V. 20. - P. 1505-1514.

11. Официальный сайт The FAO World Reference Laboratory for Foot-and-Mouth Disease - URL: http://www.wrlfmd.org/ref_labs/fmd_ref_lab_reports.htm (Дата обращения 12.11.2022).

12. Salt I.S. Emergency vaccination of pigs against foot-and-mouth disease: protection against disease and reduction in contact transmission / Vaccine. - April 1998. - V. 16. - P. 746-754.

13. Рахманов A.M. Современная эпизоотическая ситуация в мире по ящуру и меры ее контроля // Ветеринарная медицина мiжвiд. тем. наук. Харкiв, 2013. - С. 37-38.

14. Longjam N., Тауо Т. Antigenic variation of Foot and Mouth Disease Virus // Vet. World. - 2011. - Vol. 4(10). - P. 475-479.

15. Мельник P.H., Хаустова H.B., Мельник H.B., Самуйленко А.Я., Гринь С.А., Святенко М.С., Литенкова И.Ю. Антигенная вариабельность вируса ящура серотипа А и обоснование необходимости получения новых актуальных производственных штаммов / Ветеринария и кормление. - 2019. - №3. - С. 29-31.

16. Paton D.J., Sumption K.J., Charleston В. Options for control of foot-and-mouth disease: knowledge, capability and policy / Phil. Trans. R. Soc. В (2009) 364. - P. 2657-2667.

17. Barnett P.V. A review of emergency foot-and-mouth disease (FMD) vaccines / Vaccine. - February 2002. - V. 20. - P. 1505-1514.

18. Методические рекомендации по определению концентрации 146S, 75S, 12S компонентов вакцинных штаммов культурального вируса ящура в реакции связывания комплемента (РСК) / ФГБУ «ВНИИЗЖ». - Утв. 21.09.17.

19. Методические указания по определению антигенного соответствия между эпизоотическими изолятами и производственными штаммами вируса ящура в перекрестной реакции микронейтрализации: утв. Россельхознадзором 13.09.2017 / ФГБУ «ВНИИЗЖ». - Владимир: 2017. - 24 с.

20. Saitou N. and Nei М. (1987). The neighbor-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees. Molecular Biology and Evolution 4: 406-42.

21. Felsenstein J. (1985). Confidence limits on phylogenies: An approach using the bootstrap. Evolution 39: 783-791.

22. Tamura K., Nei M., and Kumar S. (2004). Prospects for inferring very large phylogenies by using the neighbor-joining method. Proceedings of the National Academy of Sciences (USA) 101: 11030-11035.

23. Kumar S., Stecher G., Li M., Knyaz C., and Tamura K. (2018). MEGA 6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis across computing platforms. Molecular Biology and Evolution 35: 1547-1549.

24. Barnett P. Aspects of emergency vaccination against foot-and-mouth disease / P. Barnett, J.M/ Garland, R.P. Kitching [et. al.] // Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. - 2002. - V. 25. - P. 345-364.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="Vaccine FMDV

genotype O ME-SA PanAsia2 ANT-10 xml.xml" softwareName="WIPO

Sequence" softwareVersion="2.1.2" productionDate="2023-01-04">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-01-04</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>480</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-01-04</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">ФГБУ &quot;Федеральный центр охраны

здоровья животных&quot; (ФГБУ &quot;ВНИИЗЖ&quot;)</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>FGBI &quot;ARRIAH&quot;</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Доронин Максим

Игоревич</InventorName>

<InventorNameLatin>Doronin Maksim Igorevich </InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Вакцина против ящура генотипа

O/ME-SA/PanAsia2ANT-10 из штамма «О №2356/Пакистан/2018»

культуральная инактивированная сорбированная</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>2</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>639</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..639</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q1">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>accacctccgcaggtgagtcggctgaccccgtgactgccactgttgaga

actacggtggcaaaacacaggtccagagacgccagcacacggacgtctcgttcatattggacagatttgt

gaaagtaacaccaaaagaccaaattaatgtgttggatctgatgcaaacccctgcccacactttggtgggt

gcactcctccgcaccgccacctactacttcgctgatttagaggtggcagtgaaacacgaggggaacctca

cttgggtcccgaatggggcacccgaggcagcgttggacaacaccaccaatccaacggcttaccacaaggc

accgctcactcgtctcgcactgccctacacggcaccacaccgtgttttggctaccgtttacaacgggaac

tgcaagtacggcgagagccacgtaaccaatgtgagaggtgatctgcaagtgttggcccaaaaggcagcga

gggcgttgcctacgtccttcaactacggtgccatcaaagctacccgggtgaccgagttgctttaccgcat

gaagagggctgaaacatactgcccccgacctcttctggccatccacccgggtgaagcaagacacaaacaa

aagatagtggcacctgtaaaacaactcctg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>213</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..213</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>TTSAGESADPVTATVENYGGKTQVQRRQHTDVSFILDRFVKVTPKDQIN

VLDLMQTPAHTLVGALLRTATYYFADLEVAVKHEGNLTWVPNGAPEAALDNTTNPTAYHKAPLTRLALPY

TAPHRVLATVYNGNCKYGESHVTNVRGDLQVLAQKAARALPTSFNYGAIKATRVTELLYRMKRAETYCPR

PLLAIHPGEARHKQKIVAPVKQLL</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии. Предложена вакцина против ящура культуральная инактивированная сорбированная. Вакцина содержит авирулентный и очищенный концентрированный антиген штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/ME-SA/PanAsia2^ANT-10, полученный в суспензионной перевиваемой клеточной линии из почки новорожденного сирийского хомячка BHK-21/SUSP/ARRIAH, представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S иммуногенный компонент вируса ящура, адъювант гидроксид алюминия и сапонин в эффективных соотношениях. Вакцина обладает высокой иммуногенностью, является абсолютно безопасной и способна обеспечить эффективную защиту от гомологичного возбудителя инфекции, циркулирующего в странах Азии. 2 з.п. ф-лы, 1 ил., 8 табл., 14 пр.

1. Вакцина против ящура культуральная инактивированная сорбированная, содержащая активное вещество и адъювант, отличающаяся тем, что в качестве активного вещества она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал гомологичного возбудителю инфекции штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа O/ME-SA/PanAsia2^ANT-10, депонированного во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) Федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), под регистрационным номером: №415 - деп / 22-49 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ», репродуцированного в перевиваемой суспензионной клеточной линии почки новорожденного сирийского хомячка BHK-21/SUSP/ARRIAH, в количестве не менее 4,0 мкг; в качестве адъюванта гидроксид алюминия 10%-ный коллоидный раствор с содержанием 47% по объему 4,7% в пересчете на сухое вещество в комплексе с сапонином в количестве 1,8 мг и поддерживающую среду до 1,0 см³.

2. Вакцина по п. 1, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа O/ME-SA/PanAsia2^ANT-10, полученный в чувствительной биологической системе и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S иммуногенный компонент вируса ящура генотипа O/ME-SA/PanAsia2^ANT-10.

3. Вакцина по п. 1, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из гомологичного возбудителю инфекции штамма «О №2356/Пакистан/2018» генотипа О/МЕ-SA/PanAsia2^ANT-10 и адъювант гидроксид алюминия в комплексе с сапонином, в эффективном соотношении: 53% и 47%, соответственно.