Вакцина против ящура генотипа O/SEA/Mya-98 из штамма "О N2383/Приморский/2019" культуральная инактивированная эмульсионная Российский патент 2023 года по МПК A61K39/135 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, а именно к разработке вакцины против ящура генотипа O/SEA/Mya-98 из штамма «О №2383 /Приморский/ 2019» культуральной инактивированной эмульсионной.

Ящур остается серьезным препятствием на пути развития и сокращения бедности во всем развивающемся мире по многим причинам, включая стоимость мер борьбы, закрытие доступа к ценным глобальным рынкам животноводческой продукции, свободной от ящура, потери производства из-за снижения надоев молока, снижения прироста живой массы и неспособности зараженного скота выполнять тяга. Вирус ящура поражает множество парнокопытных животных, включая крупный рогатый скот, овец, коз, свиней, всех диких жвачных животных, с высокой заболеваемостью у взрослых животных. Высокая смертность может наблюдаться у молодых животных из-за миокардита.

Выделяют семь следующих серотипов вируса ящура: О, А, С, SAT-1, SAT-2, SAT-3 и Азия-1, при этом представители серотипа О является очень распространенными, что определяет актуальность изготовления вакцин для защиты от ящура данного серотипа.

Каждый серотип генетически разделен на различные топотипы, а иногда на отдельные генетические линии и даже сублинии. Различия между ними определяют при анализе нуклеотидной последовательности высоковариабельного гена 1D, который кодирует аминокислотную последовательность поверхностного белка VP₁ [1]. Учитывая, что возбудитель

ящура является РНК-содержащим вирусом, для него характерно образование большого количества мутаций во время репликации вирусного генома (преимущество в 5'-участке) и явление рекомбинации (преимущественно в 3'-участке). Именно по этой причине в пределах серотипов выделяют более 60 генетических линий и сублиний [2]. Восстановление после переболевания животным каким-либо одним серотипом не обеспечивает иммунную защиту против другого серотипа и даже некоторых других генетических линий [3].

Выявление генетических связей между различными изолятами и штаммами проводят с помощью нуклеотидного секвенирования, что дает возможность в условиях вспышки определить происхождение вируса. Антигенные характеристики вируса, связанные с появлением новых штаммов, важны для анализа вспышек и создания оптимальных вакцин [4, 6].

Серотип О вируса ящура разделен на 11 следующих топотипов: EAST AFRICA 1-4 (Восточная Африка) (ЕА-1-4), SOUTHEAST ASIA (Юго-Восточная Азия) (SEA), EUROPE-SOUTH AMERICA (Европа -Южная Америка) (EURO-SA), INDONESIA-1 и 2 (Индонезия-1 и 2) (ISA-1 и -2), CATHAY (Китай), MIDDLE EAST-SOUTH ASIA (ME-SA) (Ближний Восток -Южная Азия) и WEST AFRICA (Западная Африка) (WA). Такое высокое генетическое и антигенное разнообразие приводит к проблемам при специфической профилактики ящура при применении культуральных инактивированных противоящурных вакцин. В результате возникает необходимость создания новых средств специфической иммунопрофилактики в отношении вируса ящура серотипа О [5-12]. Представленное многообразие представителей серотипа О обусловлено высокой степенью изменчивости РНК-содержащих вирусов и активным перемещением данного возбудителя на территориях стран Азии, преимущественно Юго-Восточной, Центральной и Средней.

С целью недопущения возникновения ящура в хозяйствах Российской Федерации применяется комплекс мероприятий по борьбе и профилактике ящура, который направлен на предупреждение заноса вируса в страну, систематическую вакцинацию животных в буферной зоне, проведение мониторинга иммунного статуса крупного, мелкого рогатого скота и свиней.

Для иммунизации животных должна применяться вакцина, изготовленная из вируса, гомологичного полевым изолятам, что подтверждено исследованиями многих ученых [6, 7, 8, 9, 10, 11].

Данная инфекция продолжает оставаться экономически значимой проблемой. Цельновирионные вакцины на сегодняшний день в отношении ящура по-прежнему признаются наиболее эффективными, что крайне важно для борьбы с самым контагиозным заболеванием в мире [8, 9, 12, 13].

Для проведения эффективной кампании по вакцинации нужно наличие эффективной и безопасной вакцины, содержащей в качестве иммуногенной составляющей антиген вируса, соответствующей эпизоотическому распространяющемуся изоляту определенного генотипа. Создание подобных вакцин по-прежнему является крайне актуальной задачей. Достижение данной цели позволит эффективно применять вакцину в неблагополучных регионах и угрожаемой зоне для формирования иммунитета против конкретного генотипа вируса ящура с целью обеспечения ветеринарного благополучия [14, 15, 16].

На территории Российской Федерации вспышки ящура имеют спорадический характер и вызваны заносом возбудителя с территории сопредельных стран, так как отдельные регионы России граничат с эндемичными по ящуру странами Азии и подвержены очень высокой степени риска заноса инфекционного агента с территории данных государств. При торгово-экономических операциях имеются серьезные риски заноса изолятов вируса ящура на территорию Российской Федерации. Это может подорвать ветеринарное благополучие нашей страны по ящуру, исходя из этого, требуется заранее принимать меры по созданию безопасной и эффективной противоящурной вакцины.

В Российской Федерации вспышки ящура типа О регистрировались начиная с 2000 по 2021 гг. на территории Приморского, Хабаровского, Забайкальского краев, Амурской, Оренбургской областей, Республики Башкортостан. Вспышки болезни были вызваны вирусом ящура типа О и генотипов: O/SEA/Mya-98, O/ME-SA/PanAsia, O/ME-SA/Ind-2001.

В Юго-Восточной, Южной, Восточной Азии вспышки ящура генотипа O/SEA/Mya-98 имеют спорадический характер. Обнаружено, что в Монголии были выявлены изоляты вируса ящура, которые принадлежат к данному генотипу в 2004, 2010, 2015, 2017, 2018, 2019 гг.В нашей стране регистрировали вспышки ящура данного генотипа в 2010 году (изоляты O/Russia/Jul/2010 и O/Russia/Aug/2010), в 2019 году (изолят O/Primorskiy/RUS/2/2019). В настоящее время представители данного генотипа также циркулируют в странах Ю-В Азии. Следует отметить, что начиная с 2019 г. появились заметные изменения в нуклеотидном и аминокислотном составе изолятов вируса ящура данного генотипа. Данная генетическая модификация значительно отличается от своего предшественника (вакцинный штамм «О №2212/Приморский/2014») и, соответственно, прототипная вакцина против ящура не обеспечивает полной защиты от генотипа O/SEA/Mya-98. Исходя из анализа, наиболее актуальным претендентом для создания эффективной вакцины, которая будет обеспечивать защиту от ящура генотипа O/SEA/Mya-97 с учетом появившихся мутаций в геноме вируса, является штамм «О №2383/Приморский/2019».

Известны производственные штаммы вируса ящура серотипа О, которые применяются для производства средств специфической профилактики ящура:

- штамм «О/Тайвань/1997» (генотип O/CATHAY/CAM 94),

- штамм «О №2212/Приморский/2014» (генотип O/SEA/Mya-98),

- штамм «О/Приморский/2012» (генотип O/ME-SA/PanAsia),

- штамм «О/Саудовская Аравия/2008» (генотип О/ME-SA/PanAsia2),

- штамм «О/Забайкальский/2016» (генотип O/ME-SA/Ind-2001d).

Изолят «O/Primorskiy/RUS/2/2019» вируса ящура был выделен из патологического материала от крупного рогатого скота на территории села Григорьевка Михайловского района Приморского края Российской Федерации в 2019 году. При проведении научных исследований в ФГБУ «ВНИИЗЖ» путем адаптации к репродукции в первично-трипсинизированной монослойной клеточной линии почки свиньи СП, в перевиваемых культурах клеток BNK-21/SUSP/ARRIAH, IB-RS-2, ПСГК-30 был охарактеризован и получил название - штамм «О №2383/Приморский/2019» серотипа О.

По результатам сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей выделенный штамм принадлежит к генотипу O/SEA/Mya-98 вируса ящура, который значительно отличается от производственных штаммов вируса ящура серотипа О (Фиг. 1).

По причине значительного увеличения торгово-экономических взаимоотношений между Россией и странами Азии, в которых стабильно регистрируют вспышки ящура генотипа O/SEA/Mya-98, возникает опасность новых случаев возникновения ящура в Российской Федерации и особое значение приобретает проблема возможной экстренной профилактики данного заболевания для формирования иммунитета у восприимчивых животных. Таким образом, возникла необходимость разработать вакцину против ящура генотипа O/SEA/Mya-98 из штамма «О №2383/Приморский/2019» культуральную инактивированную эмульсионную для обеспечения биологической безопасности и ветеринарного благополучия территории Российской Федерации, сопредельных государств и стран, эндемичных по ящуру, которые будут использовать данный препарат для профилактики заболевания.

Наиболее близкой предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является вакцина инактивированная эмульсионная против ящура серотипа О (штамм «О №2212/Приморский/2014», генотип O/SEA/Mya-98) [17], содержащая активное вещество в виде авирулентного и очищенного культурального антигенного материала из гомологичного возбудителю ящура штамма «О №2212/Приморский/2014», полученного в чувствительной биологической системе, и целевые добавки в виде масляного адъюванта Montanide ISA-206 VG («Seppic», P. Франция): концентрация антигена (инактивированные 146S+75S компоненты вируса ящура) не менее 3,0 мкг/см³, содержание масляного адъюванта Montanide ISA-206 VG - 50% по массе, добавка в виде поддерживающей среды - до 1,0 см³ (прототип).

В качестве чувствительной биологической системы для репродукции вируса ящура используют перевиваемую клеточную линию почки новорожденного сирийского хомячка BHK-21/2-17, в качестве поддерживающей среды применяют среду Игла DMEM без внесения сыворотки, с добавлением ферментативного гидролизата мышц сухого, гидролизата белков крови сухого при рН среды 7,45-7,65.

Для инактивации вируса используют аминоэтилэтиленимин (АЭЭИ). При изготовлении эмульсионной вакцины в качестве адъюванта служит масляный адъювант Montanide ISA-206 VG («Seppic», P. Франция). Очистку вируссодержащей суспензии от балластных примесей осуществляют с применением полигексаметиленгуанидин гидрохлорида (ПГМГ).

Существенный недостаток вакцины-прототипа состоит в его низкой иммуногенной активности относительно появившихся штаммов/изолятов вируса ящура генотипа O/SEA/Mya-98.

Для решения указанной проблемы было создано настоящее изобретение, в которое входила разработка вакцины против ящура генотипа O/SEA/Mya-98 из штамма «О №2383/Приморский/2019» культуральной инактивированной эмульсионной. Данная вакцина предполагает высокое содержание 146S иммуногенного компонента в дозе препарата [19, 20].

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала противоящурных инактивированных культуральных эмульсионных вакцин для защиты животных против изолятов и штаммов вируса ящура серотипа О и, в частности, генотипа O/SEA/Mya-98.

Указанный технический результат достигнут созданием вакцины против ящура генотипа O/SEA/Mya-98 из штамма «О №2383/Приморский/2019» культуральной инактивированной эмульсионной, охарактеризованной следующей совокупностью признаков, отраженных ниже.

Разработанная вакцина в 1,0 см³ препарата содержит следующие основные компоненты: 1) активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из гомологичного возбудителю инфекции штамма «О №2383/Приморский/2019» (генотип O/SEA/Mya-98) вируса ящура, репродуцированного в перевиваемой суспензионной клеточной линии BHK-21/SUSP/ARRIAH, в количестве не менее 4,0 мкг; 2) масляный адъювант Montanide ISA-71 R VG, обеспечивающий усиление иммунного ответа у животных с содержанием 70% по массе, 3) поддерживающая среда -до 1,0 см³.

Штамм вируса ящура штамма «О №2383/Приморский/2019» (генотип O/SEA/Mya-98) депонирован во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вирусов ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ», под регистрационным номером: №419 - деп / 22-53 -ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Штамм адаптирован к первично-трипсинизированным монослойным клеткам линии свиной почки (СП) и перевиваемым клеточным линиям из почки новорожденного сирийского хомячка (BHK-21/SUSP/ARRIAH), почки свиньи (IB-RS-2) и почки сибирского горного козерога (ПСГК-30).

Для изготовления вакцины в качестве чувствительной биологической системы предпочтительно используют перевиваемую суспензионную культуру клеток BHK-21/SUSP/ARRIAH, а в качестве поддерживающей среды применяют среду Хэнкса без внесения сыворотки, но с добавлением гидролизата белков крови в количестве 5,0% от общего объема при рН среды 7,45-7,65. Инактивацию вируса проводят с использованием аминоэтилэтиленимина (АЭЭИ) с концентрацией 0,034% от объема вируссодержащей суспензии. Инактивированный вирус очищают от балластных примесей с помощью полигексаметиленгуанидина (ПГМГ), который вносят в суспензию до концентрации 0,014%) от общего объема.

Авирулентный и очищенный антиген штамма «О №2383/Приморский/2019» (генотип O/SEA/Mya-98) вируса ящура представляет собой суспензию, содержащую инактивированный 146S иммуногенный компонент вируса ящура. Концентрацию компонента в продукте оценивают с помощью количественного варианта реакции связывания комплемента (РСК) [18, 19].

Для создания вакцины используют вирусный материал, содержащий в 1,0 см³ не менее 4,0 мкг инактивированных иммуногенных 146S частиц вируса ящура. Заявленную концентрацию иммуногенного компонента в вакцинном препарате обеспечивают благодаря концентрированию антигена с помощью установки тангенциальной фильтрации Centramate 500S Pall.

Вакцину против ящура генотипа O/SEA/Mya-98 из штамма «О №2383/Приморский/2019» культуральную инактивированную эмульсионную получают путем смешивания очищенного антигена и масляного адъюванта Montanide ISA-71 R VG в соотношении 30% на 70% по массе, соответственно. Полученная вакцина представляет собой стабильную эмульсию белого или бледно-розового цвета, содержащую инактивированный 146S компонент вируса ящура, который обеспечивают формирование специфического иммунитета.

Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые спрашивается правовая охрана:

1. Вакцина против ящура генотипа O/SEA/Mya-98 из штамма «О №2383/Приморский/2019» культуральная инактивированная эмульсионная.

2. Активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из гомологичного возбудителю заболевания штамма «О №2383/Приморский/2019» генотипа O/SEA/Mya-98 вируса ящура в эффективном количестве.

3. Целевые добавки.

Существенные отличительные признаки предлагаемой вакцины заключаются в том, что в качестве активного вещества она содержит авирулентный очищенный антиген штамма «О №2383/Приморский/2019» генотипа O/SEA/Mya-98 вируса ящура в эффективном количестве.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:

1. Авирулентный и очищенный антиген штамма «О №2383/Приморский/2019» генотипа O/SEA/Mya-98 вируса ящура, полученный предпочтительно в суспензионной перевиваемой клеточной линии BHK-21/SUSP/ARRIAH и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S иммуногенный компонент вируса ящура в эффективном количестве.

2. Авирулентный и очищенный антиген штамма «О №2383/Приморский/2019» генотипа O/SEA/Mya-98 вируса ящура, полученный предпочтительно в суспензионной перевиваемой культуре клеток BHK-21/SUSP/ARRIAH и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S иммуногенный компонент вируса ящура в количестве не менее 4,0 мкг в 1,0 см³ готового вакцинного препарата.

3. Из целевых добавок вакцина содержит масляный адъювант Montanide ISA-71 R VG.

4. Вакцина содержит масляный адъювант Montanide ISA-71 R VG в количестве 70% (по массе) в 1,0 см³ готового препарата.

5. Авирулентный и очищенный антиген штамма «О №23 83/Приморский/2019» генотипа O/SEA/Mya-98 вируса ящура, полученного предпочтительно в перевиваемой суспензионной клеточной линии BHK-21/SUSP/ARRIAH, масляный адъювант Montanide ISA-71 R VG, добавка в готовом препарате в виде поддерживающей среды в следующих количествах:

Авирулентный и очищенный антиген штамма «О №2383/Приморский/2019» генотипа не менее 4,0 мкг/см³ O/SEA/Mya-98 вируса ящура Масляный адъювант Montanide ISA-71 R VG 70% (по массе) Поддерживающая среда до 1,0 см³

Предлагаемая вакцина против ящура из штамма «О №2383/Приморский/2019» генотипа O/SEA/Mya-98 культуральная инактивированная эмульсионная обладает высокой иммуногенной активностью и обеспечивает надежную защиту против изолятов вируса ящура генотипа O/SEA/Mya-98.

Достижение технического результата от использования изобретения обеспечивается тем, что в состав предлагаемой противоящурной эмульсионной вакцины в качестве активного вещества введен антиген штамма «О №2383/Приморский/2019» генотипа O/SEA/Mya-98 вируса ящура, обладающий высокой иммуногенной активностью, создающий эффективную защиту восприимчивых животных против изолятов вируса ящура представленного генотипа, которые в последние годы вызывают вспышки в мире.

Сущность изобретения отражена на графическом изображении:

Фиг. 1. - Дендрограмма, отражающая филогенетическое взаимоотношение штамма «О №2383/Приморский/2019» вируса ящура с эпизоотическими штаммами серологического типа О. Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностей гена VP₁.

Сущность изобретения пояснена следующими перечнями последовательностей:

SEQ ID NO: 1 представляет последовательность нуклеотидов гена, кодирующего белок VP₁ штамма «О №2383/Приморский/2019» вируса ящура генотипа O/SEA/Mya-98;

SEQ ID NO: 2 представляет последовательность аминокислот белка VP₁ штамма «О №2383/Приморский/2019» вируса ящура генотипа O/SEA/Mya-98.

Штамм «О №2383/Приморский/2019» вируса ящура характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки

Штамм «О №2383/Приморский/2019» вируса ящура серотипа О относится к отряду Picornavirales, семейству Picornaviridae, роду Aphthovirus, виду Foot-and-Mouth Disease virus и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона иксаэдрическая, размер 25 нм. Вирион состоит из молекулы одноцепочечной положительно заряженной молекулы РНК и 60 копий полипептида, каждый из которых представлен протеинами VP₄, VP₂, VP₃, VP₁.

Антигенные свойства

По антигенным свойствам штамм «О №2383/Приморский/2019» вируса ящура относится к серотипу О. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. У переболевших животных в сыворотке крови образуются типоспецифические антитела, выявляемые в иммуноферментном анализе и реакции микронейтрализации (РМН).

Методом нуклеотидного секвенирования была определена первичная структура 1D-гена белка VP₁ штамма «О №2383/Приморский/2019» вируса ящура. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей показал, что штамм «О №2383/Приморский/2019» вируса ящура принадлежит к генотипу O/SEA/Mya-98 (Фиг. 1).

Антигенное родство (r₁) штамма «О №2383/Приморский/2019» вируса ящура изучено в РМН, в перекрестном исследовании штамма со специфическими сыворотками, полученными на следующие производственные штаммы вируса ящура:

- штамм «О/Тайвань/1997» (генотип O/CATHAY/CAM 94),

- штамм «О №2212/Приморский/2014» (генотип O/SEA/Mya-98),

- штамм «О/Приморский/2012» (генотип O/ME-SA/PanAsia),

- штамм «О/Саудовская Аравия/2008» (генотип O/ME-SA/PanAsia2),

- штамм «О/Забайкальский/2016» (генотип O/ME-SA/Ind-2001d).

Титр референтных сывороток крови КРС, полученных путем иммунизации животных моновалентными вакцинами из производственных штаммов вируса ящура серотипа О, против 10² ТЦД₅₀ гомологичного и гетерологичного вируса определяли в РМН при перекрестном титровании, рассчитывая значения с использованием уравнения линейной регрессии, и выражали в lg. Значение r₁ определяли, как антилогарифм разности lg титров сыворотки против гетерологичного и гомологичного вируса [19, 20].

Значение r₁ в РМН интерпретировали следующим образом:

при ≥0,3 - исследуемый и производственный штаммы вируса ящура являются родственными;

при <0,3 - исследуемый образец штамма вируса ящура значительно отличается от производственного штамма.

Максимальное родство отмечается при значении r₁ в РМН, стремящимся к 1,0.

Показатели антигенного родства при изучении штамма «О №2383/Приморский/2019» составили r₁ от 0,07 до 0,31, что свидетельствует об отсутствии явного антигенного родства с производственными штаммами вируса ящура серотипа О. Полученные следующие данные r₁ для штаммов:

- штамм «О/Тайвань/1997» (генотип O/CATHAY/CAM 94) - 0,07, - штамм «О №2212/Приморский/2014» (генотип O/SEA/Mya-98) - 0,31, - штамм «О/Приморский/2012» (генотип O/ME-SA/PanAsia) - 0,22, - штамм «О/Саудовская Аравия/2008» (генотип 0/ME-SA/PanAsia2) - 0,17, - штамм «О/Забайкальский/2016» (генотип O/ME-SA/Ind-2001d) - 0,27.

По данным антигенного родства штамм «О №2212/Приморский/2014»

(генотип O/SEA/Mya-98) являются родственным штамму «О №2383/Приморский/2019», значение r₁ составляет 0,31. Хотя они относятся к одному генотипу O/SEA/Mya-98, при филогенетическом анализе (фиг. 1) штамм «О №2383/Приморский/2019» схож по нуклеотидным последовательностям со штаммом «О №2212/Приморский/2014» только на 67%, иными словами, степень различия между ними составила 33%. Данный факт обуславливает необходимость создания вакцины из штамма «О №2383/Приморский/2019», который в отличии от первоначального варианта распространен в настоящее время в мире.

Гено- и хемотаксономическая характеристики

Штамм «О №2383/Приморский/2019» вируса ящура является РНК(+) -содержащим вирусом с молекулярной массой 8,08×10⁶ Д. Нуклеиновая кислота представлена одноцепочной линейной молекулой молекулярной массой 2,8×10⁶ Д. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую из четырех основных белков VP₁, VP₂, VP₃ и VP₄. Липопротеидная оболочка отсутствует.

Основным антигенным белком является VP₁. В вирионе содержится приблизительно 31,5% РНК и 68,5% белка. Вирусная РНК является инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Предшественники, в свою очередь, расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса. Из 8 неструктурных полипептидов, накапливающихся в инфицированных клетках, выделяют РНК-зависимую РНК-полимеразу (3D-ген), участвующую в репликации РНК для сборки вирионов.

Физические свойства

Масса вириона составляет 8,4×10^-18 г. Плавучая плотность в градиенте плотности сахарозы составляет 1,44 г/см³.

Устойчивость к внешним факторам

Штамм «О №2383/Приморский/2019» вируса ящура устойчив к эфиру, хлороформу, и ацетону. Наиболее стабилен при рН 7,45-7,65. Сдвиги рН в кислую и сильно щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, γ-облучению, высоким температурам (выше 37,9°С).

Дополнительные признаки и свойства

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.

Патогенность - патогенен для парнокопытных животных.

Вирулентность - вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.

Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 5 пассажей (срок наблюдения) на перевиваемых культурах.

Биотехнологические характеристики

Штамм «О №2383/Приморский/2019» вируса ящура репродуцируется в перевиваемых культурах клеток: почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), почки свиньи (IB-RS-2), почки сирийского хомячка (BHK-21).

При испытании было проведено 5 последовательных пассажей штамма «О №2383/Приморский/2019» вируса ящура в перевиваемых культурах клеток ПСГК-30, BHK-21, IB-RS-2. Биологические свойства характеризовали путем определения инфекционной активности вируса каждого пассажа в перевиваемой клеточной линии IB-RS-2 и на естественно восприимчивых животных - крупном рогатом скоте (КРС) и свиньях.

Для снижения эпизоотической опасности возникновения ящура, вызванного генотипом O/SEA/Mya-98, и предотвращения возникновения новых очагов болезни важна своевременная вакцинопрофилактика, что требует разработки новой безопасной и эффективной вакцины.

Получена безопасная и эффективная вакцина против ящура генотипа O/SEA/Mya-98 из штамма «О №2383/Приморский/2019» культуральная инактивированная эмульсионная.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. Генетическая характеристика штамма «О №2383/Приморский/2019» вируса ящура по данным ПЦР и нуклеотидного секвенирования.

Проводили анализ первичной структуры гена 1D (белок VP₁) (639 н.о.) штамма «О №2383/Приморский/2019» вируса ящура методом нуклеотидного секвенирования методом Сенгера и определении положения данного штамма на филогенетическом древе вируса ящура серотипа О. Метод основан на определении первичной структуры гена 1D (белок VP₁) испытуемого изолята / штамма с последующим анализом филогенетического родства с другими изолятами (19 представителей) вируса ящура серотипа О.

Было необходимо провести сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей гена 1D, кодирующего белок VP₁ вируса ящура вакцинного штамма «О №2383/Приморский/2019» с другими изолятами и штаммами. Последовательность нуклеотидов гена белка VP₁ штамма «О №2383/Приморский/2019» генотипа O/SEA/Mya-98 вируса ящура представлена SEQ ID NO: 1. Последовательность аминокислот 1D-гена, кодирующего белок VP₁ штамма «О №2383/Приморский/2019» генотипа O/SEA/Mya-98 вируса ящура отражена на SEQ ID NO: 2.

Осуществлен филогенетический анализ для штамма «О №2383/Приморский/2019». Филогенетическое дерево выведено с использованием программы MEGA6 и алгоритма Neighbor-Joining. Процент повторяющихся ветвей, в которых связанные таксоны сгруппированы вместе в тесте начальной загрузки (увеличили со стандартных 100 до 400 повторов для высокой степени достоверности), показан рядом с ветвями [20, 21]. Эволюционные расстояния были рассчитаны с использованием метода Maximum Composite Likelihood [22] и выражены в единицах количества замен оснований на сайт. Этот анализ включал 19 нуклеотидных последовательностей, в том числе последовательность 1D-гена штамма «О №2383/Приморский/2019» вируса ящура. Все позиции, содержащие пробелы и отсутствующие данные, были удалены (вариант полного удаления). В окончательном наборе данных было всего 639 позиций. Эволюционный анализ проводился в MEGA 6 [23, 24].

В результате проведенной работы по сравнению полных нуклеотидных последовательностей гена 1D (белок VP₁) штамма «О №2383/Приморский/2019» и других изолятов / штаммов вируса ящура серотипа О определено положение исследуемого штамма на филогенетическом древе (фиг. 1).

Таким образом, исследуемый штамм «О №2383/Приморский/2019» относится к генотипу O/SEA/Mya-98, что подтверждают данные нуклеотидного и аминокислотного анализа.

Пример 2. Адаптация штамма «О №2383/Приморский/2019» генотипа O/SEA/Mya-98 к перевиваемой монослойной культуре клеток почки сибирского горного козерога ПСГК-30.

Для заражения перевиваемой монослойной культуры клеток почки сибирского горного козерога ПСГК-30 использовали 10%-ную афтозную суспензию вируса ящура, полученную из афт свиньи (2 пассаж). Посевная концентрация клеток составляла 0,20-0,25 млн кл./см³, доза заражения вирусом - 0,001 ТЦД₅₀/кл. По результатам исследования репродукция вируса ящура штамма «О №2383/Приморский/2019» проходила при специфическом разрушении монослоя на 90-100% за 18-20 ч. В течение 6 последовательных пассажей отмечали рост значений титра инфекционной активности вируса от 6,00±0,10 до 7,50±0,10 lg ТЦД₅₀/см³.

Максимальное значение титра инфекционной активности вируса было достигнуто на этапе 6 пассажа (7,50±0,10 lg ТЦД₅₀/см³). Концентрация 146S частиц с 1 по 6 пассажи изменялась с 0,41±0,02 до 1,02±0,02 мкг/см³. При этом наибольшее количество 146S компонента отмечали на этапе 6 пассажа (1,02±0,02 мкг/см³). Степень достоверности (R²) результатов исследования в количественном варианте ОТ-ПЦР-РВ колебалась от 96,58 до 99,79%. Таким образом, на протяжении 6-ти последовательных пассажей была успешно проведена адаптация штамма «О №2383/Приморский/2019» вируса ящура к перевиваемой монослойной клеточной линии ПСГК-30.

Пример 3. Изучение условий монослойного культивирования вируса ящура штамма «О №2383/Приморский/2019» генотипа O/SEA/Mya-98 в промышленных масштабах.

В процессе промышленного культивирования штамма «О №2383/Приморский/2019» генотипа O/SEA/Mya-98 вируса ящура в перевиваемой монослойной культуре клеток ПСГК-30 осуществляли подбор оптимальных условий культивирования вируса по поддерживающей среде, температурному фактору и дозе заражения исследуемым вирусом клеток.

На первом этапе исследования оценивали влияние состава поддерживающей среды на репродукцию штамма «О №2383/Приморский/2019» вируса ящура в монослойной культуре клеток ПСГК-30 в масштабах производства (на этапе с 5-го на 6-ой пассажи). Для сравнения применяли три среды с добавлением 2,0% фетальной сыворотки крови телят: 1) среда Игла DMEM; 2) среда RPMI-1640; 3) раствор Хэнкса. Посевная концентрация клеток составляла 0,20 млн кл./см³, доза заражения вирусом - 0,1000-0,0001 ТЦД₅₀/кл. Культивирование вируса осуществляли при температурах 35±0,2 - 38±0,2°С до разрушения клеточного монослоя не менее 85%. Результаты репродукции штамма «О №2383/Приморский/2019» вируса ящура с поддерживающими средами разного состава отражены в таблице 1.

Из данных таблицы видно, что при репродукции штамма «О №2383/Приморский/2019» вируса ящура в монослойной культуре клеток ПСГК-30 с применением поддерживающих сред разного состава, оптимальной является среда Хэнкса, позволяющая за 18-20 ч достичь специфического разрушения клеточного монослоя на 95-100% с накоплением в полученной суспензии 146S компонента в количестве 1,02±0,02 мкг/см³ и титром инфекционной активности 7,50±0,10 lg ТЦД₅₀/см³. При использовании среды RPMI-1640 и Игла DMEM показатели репродукции вируса были ниже.

На следующем этапе изучения условий монослойного культивирования штамма «О №2383/Приморский/2019» вируса ящура в культуре клеток ПСГК-30 в условиях производства оценивали влияние на процесс репродукции вируса температурного фактора. Для этого культивирование вируса проводили в среде Игла DMEM с 2% сыворотки КРС при следующих температурах: 35,0±0,2; 36,0±0,2; 37,0±0,2; 38,0±0,2°С. Доза заражения культуры клеток вирусом ящура составляла 0,010-0,001 ТЦД50/КЛ. Культивирование вируса осуществляли до разрушения клеточного монослоя на 85-100% в течение 18-28 ч (табл. 1). По итогам исследования выявили, что для полной репродукции штамма «О №2383/Приморский/2019» вируса ящура в монослойной культуре клеток ПСГК-30 оптимальной является температура среды 37,0±0,02°С, при которой за 18-20 ч развитие ЦПД достигало 95-100% с накоплением 146S частиц, равным 1,02±0,02 мкг/см³ и титром инфекционной активности вируса 7,50±0,10 lg ТЦД₅₀/см³.

Оценивали влияние дозы заражения монослоя клеток линии ПСГК-30 штаммом «О №2383/Приморский/2019» при культивировании в масштабах производства. Для этого использовали разные дозы вируса: 0,10-0,01; 0,010-0,001; 0,0010-0,0001 ТЦД₅₀/кл. В качестве поддерживающей среды применяли среду Игла MEM с 2% сыворотки крови КРС. Репродукцию вируса проводили при температуре 37,0±0,2°С в течение 18-32 ч до специфического разрушения клеток на 85-100%). По итогам культивирования определяли концентрацию 146S компонента и титр инфекционной активности вируса ящура. Как следует из данных таблицы 1, наибольшее накопление 146S компонента вируса достигалось при дозе заражения 0,01-0,001 ТЦД₅₀/кл. и составило 1,02±0,02 мкг/см³ с титром инфекционной активности вируса 7,50±0,10 lg ТЦД₅₀/см³.

Таким образом, проведено изучение условий монослойного культивирования штамма «О №2383/Приморский/2019» вируса ящура в культуре клеток ПСГК-30 в промышленных масштабах. В результате исследования определены следующие оптимальные параметры репродукции штамма «О №2383/Приморский/2019» вируса ящура в монослойной клеточной линии ПСГК-30: 1) поддерживающая среда - среда Хэнкса; 2) температурный режим культивирования - 37,0±0,02°С; 3) доза заражения вирусом - 0,01-0,001 ТЦД₅₀/кл.

Пример 4. Изучение условий суспензионного культивирования штамма «О №2383/Приморский/2019» генотипа O/SEA/Mya-98 вируса ящура в промышленных масштабах.

При промышленном культивирования штамма «О №2383/Приморский/2019» генотипа O/SEA/Mya-98 вируса ящура в перевиваемой суспензионной культуре клеток BHK-21/SUSP/ARRIAH проводили поиск оптимальных параметров для успешной репродукции возбудителя ящура, используя разные концентрации клеток, температурные условия и дозу заражения вирусом.

На первом этапе работы определяли влияние посевной концентрации клеток линии BHK-21/SUSP/ARRIAH в суспензии на репродукцию штамма «О №2383/Приморский/2019» вируса ящура в промышленных масштабах. Для анализа подготовили суспензии со следующими концентрации клеток: 2,5; 3,0; 3,5; 4,0 млн кл./см³. Водородный показатель рН поддерживали в диапазоне 7,45-7,65. Температура культивирования вируса составляла 37,0±0,02°С, доза заражения вирусом - 0,010-0,001 ТЦД₅₀/кл. Репродукцию вируса проводили до специфической гибели клеток на 95-100%, которая осуществлялась в течение 11-23 ч. Результаты суспензионного культивирования штамма «О №2383/Приморский/2019» вируса ящура в суспензии с разными концентрациями клеток представлены в таблице 2.

Как следует из таблицы 2, при культивировании вируса ящура штамма «О №2383/Приморский/2019» в суспензионной клеточной линии BHK-21/SUSP/ARRIAH с разными концентрациями клеток, определили, что накопление 146S компонента в суспензии с концентрацией клеток 2,5 млн кл./см³ составило 0,75±0,02 мкг/см³, с концентрацией 3,0 млн кл./см³ -1,10±0,02 мкг/см³, с концентрацией 3,5 млн кл./см³ - 1,59±0,02 мкг/см³, и с концентрацией 4,0 млн кл./см³ - 1,65±0,02 мкг/см³. Как следует из полученных данных для репродукции штамма «О №2383/Приморский/2019» вируса ящура достаточной является концентрация клеток BHK-21/SUSP/ARRIAH в суспензии, равная 3,5 млн кл./см³ (при концентрации 4,0 млн кл./см³ концентрация незначительно выше, но затраты на производство по количеству клеток выше, исходя из этого, экономически целесообразно использовать концентрацию клеток, равную 3,5 млн кл./см³). Значение титра инфекционной активности вируса при этом составило 9,25±0,10 lg ТЦД₅₀/см³.

На следующем этапе работы исследовали влияние температурного фактора на репродукцию штамма «О №2383/Приморский/2019» вируса ящура в суспензионной культуре клеток линии BHK-21/SUSP/ARRIAH в промышленных масштабах. Для этого репродукцию вируса проводили при следующих температурных условиях: 35,0±0,2; 36,0±0,2; 37,0±0,2; 38,0±0,2°С. Доза заражения культуры клеток вирусом составляла 0,010-0,001 ТЦД₅₀/кл. Водородный показатель рН вирусной суспензии поддерживали в диапазоне 7,45-7,65. Культивирование вируса проводили до ЦПД, равного не менее 80% (приоритет отдавали полной специфической деструкции клеток), в течение 11-23 ч. По результатам анализа определили, что для полной репродукции штамма «О №2383/Приморский/2019» вируса ящура в суспензионной культуре клеток BHK-21/SUSP/ARRIAH оптимальной является температура среды 37,0±0,02°С, при которой в течение 13-14 ч наблюдается специфическая гибель клеток на 95-100%) с высоким накоплением 146S компонента (1,59±0,02 мкг/см³) и титром инфекционной активности вируса 9,25±0,10 lg ТЦД₅₀/см³.

В ходе работы по изучению условий суспензионного культивирования штамма «О №2383/Приморский/2019» вируса ящура в промышленных масштабах с применением культуры клеток BHK-21/SUSP/ARRIAH оценивали влияние дозы заражения клеток. Для этого клеточные суспензии заражали вирусом в разных дозах: 0,10-0,01; 0,01-0,001; 0,001-0,0001 ТЦД₅₀/кл. Репродукцию вируса осуществляли при температуре 37,0±0,2°С в течение 11-22 ч до цитопатического действия, равного не менее 90%». По итогам культивирования определяли концентрацию 146S частиц и титр инфекционной активности вируса ящура. Как видно из данных таблицы 2, наибольшее накопление 146S компонента отмечали при дозе заражения 0,010-0,001 ТЦД₅₀/кл. (1,59±0,02 мкг/см³) с титром инфекционной активности вируса, равным 9,25±0,10 lg ТЦД₅₀/см³.

Таким образом, проведено изучение трех параметров суспензионного культивирования штамма «О №2383/Приморский/2019» генотипа O/SEA/Mya-98 вируса ящура в суспензионной клеточной линии BHK-21/SUSP/ARRIAH в промышленных масштабах. Выявлены оптимальные условия репродукции штамма «О №2383/Приморский/2019» в суспензионной культуре клеток BHK-21/SUSP/ARRIAH: 1) концентрация клеток перед заражением - 3,5 млн кл./см³; 2) температурный режим культивирования -37,0±0,02°С; 3) доза заражения вирусом - 0,010-0,001 ТЦД₅₀/кл.

Пример 5. Инактивация суспензии вируса ящура штамма «О №2383/Приморский/2019» генотипа O/SEA/Mya-98.

По окончании цикла репродукции вируса ящура, не прекращая процесс термостатирования (37,0±0,02°С), в вируссодержащую суспензию добавляли подкисленный раствор аминоэтилэтиленимина (АЭЭИ) с рН, равным 8,2-8,5. Конечная концентрация АЭЭИ в вируссодержащей суспензии должна быть равной 0,034%. Инактивацию инфекционной активности вируса ящура штамма «О №2383/Приморский/2019» генотипа O/SEA/Mya-98 проводили в течение 12 часов при температуре 37,0±0,1°С и рН 7,45-7,65 с периодическим перемешиванием.

Для определения времени полной инактивации после добавления 1,2-АЭЭИ каждый час производили отбор проб. Полученные образцы проверяли на наличие инфекционной активности вируса ящура в первичной культуре клеток почки свиньи СП. Результаты представлены в таблице 3, из данных которой видно, что полная инактивация вируса ящура штамма «О №2383/Приморский/2019», репродуцированного в культиваторах, произошла через 6 часов после внесения 1,2-АЭЭИ.

Готовые вирусные инактивированные суспензии исследовали в РСК для оценки содержания в них компонентов вируса. Концентрация 146S компонента составила 1,55±0,02 мкг/см³, a 146S+75S компонента - 2,04±0,02 мкг/см³.

Пример 6. Подбор условий очистки суспензии вируса ящура штамма «О №2383/Приморский/2019» генотипа O/SEA/Mya-98.

Суспензию вируса ящура штамма «О №2383/Приморский/2019» генотипа O/SEA/Mya-98, полученную при репродукции в суспензионной клеточной линии BHK-21/SUSP/ARRIAH, подвергали инактивации и очистке. Для получения очищенного антигена вируса ящура использовали полигексаметиленгуанидин (ПГМГ) с концентрациями 0,010, 0,014 и 0,018%. До и после процесса очистки антигена вируса ящура штамма «О №2383/Приморский/2019» в количественном варианте РСК определяли концентрацию общего вирусного белка и иммуногенных компонентов. Результаты анализа отражены в таблице 4, из которой следует, что в результате очистки антигена вируса ящура штамма «О №2383/Приморский/2019» с помощью ПГМГ в концентрации 0,010% отмечали снижение концентрации балластного белка на 12%, иммуногенных компонентов - на 2%. При использовании ПГМГ в концентрации 0,014% наблюдали снижение количества балластного белка на 38%, 146S компонента - на 3,2%. Применяя ПГМГ в концентрации 0,018% содержание балластного белка уменьшалось на 45%, а иммуногенных компонентов - на 24%.

Таким образом, исследуя условия очистки антигена штамма «О №2383/Приморский/2019», пришли к выводу о том, что для получения очищенного продукта оптимально использовать ПГМГ с концентрацией 0,014%.

Пример 7. Подбор условий концентрирования суспензии антигена штамма «О №2383/Приморский/2019» вируса ящура генотипа O/SEA/Mya-98.

Культуральную инактивированною суспензию штамма «О №2383/Приморский/2019», полученную с применением суспензионной клеточной линии BHK-21/SUSP/ARRIAH, подвергали концентрированию в 5 раз по объему. Для увеличения концентрации иммуногенных компонентов антигена вируса ящура использовали следующие приемы: 1) добавление полиэтиленгликоля (ПЭГ-6000) с концентрацией 50% к антигену в соотношении 1:4, с экспозицией 4 ч; 2) добавление полиэтиленгликоля (ПЭГ-6000) с концентрацией 50% к антигену в соотношении 1:4, с экспозицией 12 ч; 3) концентрирование с помощью установки тангенциальной фильтрации Centramate 500S Pall в течение 6 ч при рабочем давлении на фильтр 2,2-2,3 атм.

До и после процесса концентрирования суспензии антигена вируса ящура штамма «О №2383/Приморский/2019» определяли концентрацию общего вирусного белка и иммуногенных компонентов в количественном варианте РСК. Результаты исследований представлены в таблице 5, из которой видно, что при концентрировании антигена штамма «О №2383/Приморский/2019» вируса ящура с помощью ПЭГ-6000 в течение 4 ч отмечали увеличение содержания компонентов по сравнению с исходными значениями (до концентрирования) в 3,5 раз. Используя тот же полимер, но повышая время воздействия до 12 ч, увеличили концентрацию компонентов вируса в 3,9 раз. Применяя метод концентрирования с помощью тангенциальной фильтрации, удалось увеличить количество иммуногенных компонентов антигена штамма «О №2383/Приморский/2019» вируса ящура в суспензии в 4,9 раз. Таким образом, технология танценциальной фильтрации позволила получить антиген штамма «О №2383/Приморский/2019» с высокой концентрацией структурных вирусных белков.

Пример 8. Подбор адъюванта и соотношения антиген-адъювант.

Для изготовления противоящурной моновалентной эмульсионной вакцины из антигена штамма «О №2383/Приморский/2019» в качестве адъюванта была выбран гидроксид алюминия в комплексе с сапонином. При изготовлении данного вакцинного препарата использовали масляный адъювант Montanide ISA-71 R VG в количестве 70% по массе.

Пример 9. Компоновка вакцины против ящура из штамма «О №2383/Приморский/2019» генотипа O/SEA/Mya-98 культуральной инактивированной эмульсионной.

Из полученного концентрата антигена вируса ящура штамма «О №2383/Приморский/2019» изготовили вакцину против ящура генотипа O/SEA/Mya-98 культуральную инактивированную эмульсионную с применением в качестве адъювантов гидроксида алюминия и сапонина. Количество 146S иммуногенного компонента в 1,0 см³ антигена составило 7,35±0,02 мкг/см³ (таблица 5).

Пример 10. Иммунизация животных вакциной против ящура из штамма «О №2383/Приморский/2019» генотипа O/SEA/Mya-98 культуральной инактивированной эмульсионной.

Из полученной вакцины против ящура из штамма «О №2383/Приморский/2019» генотипа O/SEA/Mya-98 культуральной инактивированной эмульсионной (предлагаемое изобретение) был приготовлен ряд разведений для свиней с 5-ти кратным шагом. 15 голов свиней разделили на 3 группы по 5 голов в каждой. Иммунизирующая доза составляла 2,0 см³. Первую группу животных (№№ 1-5) иммунизировали вакциной без разведения, вторую группу свиней (№№ 6-10) привили вакциной, разведенной 1/5, третья группа животных (№№ 11-15) - вакциной, разведенной 1/25. Препарат вводили внутримышечно в среднюю треть шеи. В качестве контроля вируса оставили 2 головы без вакцинации.

Пример 11. Исследование сывороток крови вакцинированных животных на наличие антител к неструктурным белкам вируса ящура.

Сыворотки крови от свиней, полученные до иммунизации и через 14 суток после иммунизации, исследовали на наличие антител к неструктурным белкам вируса ящура с помощью блокирующего варианта иммуноферментного анализа (ИФА) в соответствии с рекомендациями OIE (МЭБ) [3]. Тестирование полученных сывороток проводили с использованием тест-системы для ИФА «Prio CHECK^®FMDV NSP ELISA for in vitro detection of antibodies against Foot and Mouth Disease Virus in serum of cattle, sheep and pigs» (Prionics Lelystad B.V., Нидерланды). Полученные результаты исследований отражены в таблице 6, из которой видно, что сыворотки крови животных не содержали антител к неструктурным белкам вируса ящура (значения PI для сывороток крови свиней <50%).

Пример 12. Оценка аеирулентности и безвредности вакцины против ящура из штамма «О №2383/Приморский/2019» генотипа O/SEA/Mya-98 культуральной инактивированной эмульсионной (предлагаемое изобретение).

Для определения авирулентности вакцины для свиней отобранную пробу вакцинного препарата вводили внутрикожно по 0,1 см³. В исследовании использовали свиней массой 30-40 кг. В течение 10 суток наблюдения животные остались клинически здоровыми, и при патологоанатомическом исследовании не было обнаружено изменений, характерных для ящура. Это свидетельствовало об отсутствии вирулентных свойств разработанной вакцины.

Контроль безвредности продукта на животных проводили путем внутримышечного введения вакцины в дозе 6,0 см³ (тройная доза по 2,0 см³). Срок наблюдения также составлял 10 суток. Следует отметить, что после иммунизации температура тела животного может повышаться до 41,5°С и удерживаться на этом уровне в течение 1-2 суток, что не выходит за рамки нормы после введения вакцинного препарата.

По результатам исследований вакцина против ящура из штамма «О №2383/Приморский/2019» генотипа O/SEA/Mya-98 культуральная инактивированная эмульсионная (предлагаемое изобретение) была признана безвредной, все животные в период наблюдения оставались клинически здоровыми, при патологоанатомическом анализе некроза тканей на месте введения вакцины не обнаружено.

Пример 13. Изучение иммуногенных свойств вакцины против ящура из штамма «О №2383/Приморский/2019» генотипа O/SEA/Mya-98 культуральной инактивированной эмульсионной (предлагаемое изобретение) по способности индуцирования вируснейтрализующих антител у естественно восприимчивых животных.

На 21 сутки после введения вакцины против ящура из штамма «О №2383/Приморский/2019» генотипа O/SEA/Mya-98 культуральной инактивированной эмульсионной (предлагаемое изобретение) у свиней отбирали кровь и проводили исследование полученных сывороток крови в реакции микронейтрализации [3]. Выявлено, что у свиней, иммунизированных вакциной в цельной дозе (5 голов), средние значения титра антител составили 7,85±0,22 log₂ SN₅₀, с разведением 1/5 (5 голов) - 4,75±0,18 log₂ SN₅₀, с разведением 1/25 (5 голов) - 3,50±0,31 log₂SN₅₀. (табл. 7). Полученные данные реакции микронейтрализации свидетельствуют о том, что после введения вакцины в цельном виде обеспечивается формирование гуморального иммунитета с защитными титрами штаммоспецифических антител (5,5 и более log₂SN₅₀), что соответствует требованиям международных стандартов [3].

Пример 14. Контрольное заражение естественно восприимчивых животных. Изучение защитной способности вакцины против ящура из штамма «О №2383/Приморский/2019» генотипа O/SEA/Mya-98 культуральной инактивированной эмульсионной (предлагаемое изобретение) на естественно восприимчивых видах животных.

Свиньи, иммунизированные в количестве 15 голов, вакциной в цельном виде и в разведениях, заражали контрольным штаммом «О №2383/Приморский/2019» генотипа O/SEA/Mya-98 вируса ящура, адаптированного к этим животным в дозе 10^4,0 ИД₅₀/0,20 см³ (в две точки по 0,10±0,05 см³). Спустя 7 суток после заражения всех животных подвергли эвтаназии и провели патологоанатомический осмотр. Защищенными от ящура считали животных, у которых на конечностях отсутствовали поражения. Первичные афты не учитывали.

Результаты контрольного заражения представлены в таблице 7, из которой следует, что вакцина против ящура из штамма «О №2383/Приморский/2019» генотипа O/SEA/Mya-98 культуральная инактивированная эмульсионная (предлагаемое изобретение) в цельном виде, а также в разведениях 1/5 и 1/25, введенная в однократной дозе (2,0 см³) защищает свиней от заражения гомологичным штаммом всех животных (5 из 5 голов).

По результатам контрольного заражения было установлено, что в прививном объеме данной вакцины содержится 40,516 ПД₅₀ и 0,049 ИМД₅₀ для свиней.

Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о том, что вакцина против ящура генотипа O/SEA/Mya-98 из штамма «О №2383/Приморский/2019» культуральная инактивированная эмульсионная, воплощающая предлагаемое изобретение, предназначена как резервная для использования в сельском хозяйстве, а именно в ветеринарной вирусологии и биотехнологии; подтверждена возможность осуществления представленного; вакцина, изготовленная из штамма «О №2383/Приморский/2019» генотипа O/SEA/Mya-98 в соответствии с предлагаемым изобретением, обладает высокой иммуногенной активностью и способна обеспечить эффективную защиту восприимчивых животных против эпизоотического штамма вируса ящура серотипа О, генотипа O/SEA/Mya-98.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Вакцина против ящура генотипа O/SEA/Mya-98 из штамма «О №2383/Приморский/2019» культуральная инактивированная эмульсионная»:

1. Ящур. Меры профилактики. URL: http://89.rospotrebnadzor.ru/directions/epid_nadzor/146902 (Дата обращения: 13.02.2023).

2. Опасность болезни ящура. URL: https://vet.astrobl.ru/press-release/opasnost-bolezni-yashchura (Дата обращения: 01.02.2023).

3. OIE. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals -24th Ed.-Paris, 2015-Vol. 1, Chapter 2.1.5. - P. 166-169.

4. Бурдов А.Н., Дудников А.И., Малярец П.В. и др. Ящур. -М.: Агропромиздат, 1990. - 320 с.

5. Пономарев А.П., Узюмов В Л., Груздев К.Н. Вирус ящура: структура, биологические и физико-химические свойства. - Владимир: Фолиант, 2006. - 250 с.

6. Aspects of emergency vaccination against foot-and-mouth disease / P. Barnett, J.M/ Garland, R.P. Kitching [et.al.] // Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. - October 2002. - V. 25. - P. 345-364.

7. Brown F. A brief history of FMD and its casual agent. FMD: Control Strateies: Proc. Jnt. Symp.2-5. June 2002, Lyons, France. - Paris, 2003. - p. 13-21.

8. Vaccination against foot-and-mouth disease virus confers complete clinical protection in 7 days and partial protection in 4 days: Use in emergency outbreak response / T.G. William, J. M. Pachecoa, T. Doel [et.al.] // Vaccine. -December 2005. - V. 23. - P. 5775-5782.

9. Aspects of emergency vaccination against foot-and-mouth disease / P. Barnett, J.M / Garland, R.P. Kitching [et.al.] // Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. - October 2002. - V. 25. - P. 345-364.

10. Barnett P.V. A review of emergency foot-and-mouth disease (FMD) vaccines / Vaccine. - February 2002. - V. 20. - P. 1505-1514.

11. Официальный сайт The FAO World Reference Laboratory for Foot-and-Mouth Disease - URL: http://www.wrlfmd.org/ref_labs/fmd_ref_lab_reports.htm (Дата обращения 02.02.2023).

12. Salt I.S. Emergency vaccination of pigs against foot-and-mouth disease: protection against disease and reduction in contact transmission / Vaccine. - April 1998. - V. 16. - P. 746-754.

13. Рахманов A.M. Современная эпизоотическая ситуация в мире по ящуру и меры ее контроля // Ветеринарная медицина мiжвiд. тем. наук. Харкiв, 2013. - С. 37-38.

14. Longjam N., Тауо Т. Antigenic variation of Foot and Mouth Disease Virus // Vet. World. - 2011. - Vol. 4(10). - P. 475-479.

15. Мельник Р.Н., Хаустова Н.В., Мельник Н.В., Самуйленко А.Я., Гринь С.А., Святенко М.С., Литенкова И.Ю. Антигенная вариабельность вируса ящура серотипа А и обоснование необходимости получения новых актуальных производственных штаммов/ Ветеринария и кормление. - 2019. -№3. - С. 29-31.

16. Paton D.J., Sumption K.J., Charleston В. Options for control of foot-and-mouth disease: knowledge, capability and policy/ Phil. Trans. R. Soc. В (2009) 364. - P. 2657-2667.

17. Патент RU 2 665 849 Вакцина инактивированная эмульсионная против ящура типа О / Лозовой Дмитрий Анатольевич, Михалишин Дмитрий Валерьевич, Стариков Вячеслав Алексеевич, Борисов Алексей Валерьевич, Доронин Максим Игоревич, заявка: 2017144155, 2017.12.15, опубликовано: 2018.09.04.

18. Методические рекомендации по определению концентрации 146S, 75S, 12S компонентов вакцинных штаммов культурального вируса ящура в реакции связывания комплемента (РСК) / ФГБУ «ВНИИЗЖ». - Утв. 21.09.17.

19. Методические указания по определению антигенного соответствия между эпизоотическими изолятами и производственными штаммами вируса ящура в перекрестной реакции микронейтрализации: утв. Россельхознадзором 13.09.2017 / ФГБУ «ВНИИЗЖ». - Владимир: 2017. - 24 с.

20. Saitou N. and Nei М. (1987). The neighbor-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees. Molecular Biology and Evolution 4:406-42.

21. Felsenstein J. (1985). Confidence limits on phylogenies: An approach using the bootstrap. Evolution 39:783-791.

22. Tamura K., Nei M., and Kumar S. (2004). Prospects for inferring very large phylogenies by using the neighbor-joining method. Proceedings of the National Academy of Sciences (USA) 101:11030-11035.

23. Kumar S., Stecher G., Li M., Knyaz C., and Tamura K. (2018). MEGA 6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis across computing platforms. Molecular Biology and Evolution 35:1547-1549.

24. Barnett P. Aspects of emergency vaccination against foot-and-mouth disease / P. Barnett, J.M / Garland, R.P. Kitching [et.al.] // Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. - 2002. - V. 25. - P. 345-364.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="Mya-98.xml"

softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.1.2"

productionDate="2023-03-23">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-03-23</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>496</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-03-23</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">ФГБУ &quot;Федеральный центр охраны

здоровья животных&quot; (ФГБУ &quot;ВНИИЗЖ&quot;)</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>FGBI &quot;ARRIAH&quot;</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Доронин Максим

Игоревич</InventorName>

<InventorNameLatin>Doronin Maksim Igorevich </InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Вакцина против ящура генотипа

O/SEA/Mya-98 из штамма «О №2383/Приморский/2019» культуральная

инактивированная эмульсионная</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>2</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>639</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..639</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q1">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>accacctccacaggtgagtcagctgaccccgtgaccgccactgttgaaa

actacggcggtgagacacaggtccagaggcgccaacacacggacgtctcattcattttggacagatttgt

aaaagtgacgccaaaagaccaaattaatgtactggacctgatgcaaacccccgctcacactctggtggga

gcgctccttcgtactgccacttactatttcgctgacttagaagtggcagtgaaatacgagggaaacctca

cttgggtcccgaatggggcgcctgaaaacgcgttggataacaccaccaacccaacggcataccacaaggc

accactcacccggcttgcattgccgtacacggcaccacaacgtgtgttggcaaccgtttacaacgggaac

tgcaagtacggtgatggttcggtgaccaacataagaggtgacctacaagtgttggcccagaaggcggcga

gaacgctgcctacctccttcaactacggtgccatcaaagctactcgggtgactgaactgctttaccgcat

gaagagggctgagacgtactgcccccggcctcttttggccattcacccgaacgaggccagacacaaacag

aagattgtggcacctgtgaagcagctcctg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>213</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..213</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>TTSTGESADPVTATVENYGGETQVQRRQHTDVSFILDRFVKVTPKDQIN

VLDLMQTPAHTLVGALLRTATYYFADLEVAVKYEGNLTWVPNGAPENALDNTTNPTAYHKAPLTRLALPY

TAPQRVLATVYNGNCKYGDGSVTNIRGDLQVLAQKAARTLPTSFNYGAIKATRVTELLYRMKRAETYCPR

PLLAIHPNEARHKQKIVAPVKQLL</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии. Описана вакцина против ящура генотипа O/SEA/Mya-98 из штамма «О №2383/Приморский/2019» культуральная инактивированная эмульсионная. Вакцина содержит авирулентный и очищенный концентрированный антиген штамма «О №2383/Приморский/2019» генотипа O/SEA/Mya-98, полученный в суспензионной перевиваемой клеточной линии из почки новорожденного сирийского хомячка (BHK-21/SUSP/ARRIAH), представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S иммуногенный компонент вируса ящура, масляный адъювант Montanide ISA-71 R VG в эффективных соотношениях. Вакцина обладает высокой иммуногенностью, является абсолютно безопасной и способна обеспечить эффективную защиту от гомологичного возбудителя инфекции, циркулирующего в странах Азии. Учитывая заметное усиление в последние годы торгово-экономических отношений Российской Федерации и стран Азиатского континента, созданная вакцина является актуальной для обеспечения биологической безопасности нашей страны и в целом ветеринарного благополучия по ящуру в отношении генотипа O/SEA/Mya-98 в мире. 2 з.п. ф-лы, 1 ил., 7 табл., 14 пр.

1. Вакцина против ящура генотипа O/SEA/Mya-98 из штамма «О №2383/Приморский/2019» культуральная инактивированная эмульсионная, содержащая активное вещество и адъювант, отличающаяся тем, что состоит из активного вещества в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из гомологичного возбудителю инфекции штамма «О №2383/Приморский/2019» генотипа O/SEA/Mya-98, депонированного во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вирусов ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ», под регистрационным номером: № 419 - деп / 22-53 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ»; репродуцированного в перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, в количестве не менее 4,0 мкг; из масляного адъюванта Montanide ISA-71 R VG с содержанием 70% по массе и поддерживающей среды - до 1,0 см³.

2. Вакцина по п. 1, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из гомологичного возбудителю инфекции штамма «О №2383/Приморский/2019» генотипа O/SEA/Mya-98, полученный в чувствительной биологической системе и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S иммуногенный компонент вируса ящура серотипа О.

3. Вакцина по п. 2, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из гомологичного возбудителю инфекции штамма «О №2383/Приморский/2019» генотипа O/SEA/Mya-98, полученный в перевиваемой суспензионной клеточной линии почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/SUSP/ARRIAH и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S иммуногенный компонент вируса ящура серотипа О.