Вакцина против ящура генотипа SAT-1/X из штамма "SAT-1/Нигерия/2015" культуральная инактивированная сорбированная Российский патент 2023 года по МПК A61K39/135 C12N7/00 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, а именно к разработке вакцины против ящура генотипа SAT-1/X из штамма «SAT-1/Нигерия/2015» культуральной инактивированной сорбированной.

Самым контагиозным заболеванием млекопитающих животных является ящур. Данная болезнь вызывает серьезные экономические потери, которые связаны с затратами на ликвидацию болезни. Существует семь следующих серотипов вируса ящура: О, А, С, SAT-1, SAT-2, SAT-3 и Азия-1, при этом вирус серотипа SAT-1 является распространенным в странах всего Африканского континента и Ближнего Востока, что определяет актуальность изготовления вакцин против ящура данного серотипа.

Каждый серотип генетически разделен на различные топотипы, а иногда на отдельные генетические линии и даже сублинии. Различия между ними определяют при анализе нуклеотидной последовательности высоковариабельного гена 1D, который кодирует аминокислотную последовательность белка VP₁ [1]. Учитывая, что возбудитель ящура является РНК-содержащим вирусом, для него характерно образование большого количества мутаций во время репликации вирусного генома (преимущество в 5'-участке) и явление рекомбинации (преимущественно в 3'-участке).

Важность знания генетического разнообразия вируса ящура заключается в возможности тщательного анализа эпизоотической ситуации в конкретном регионе и детальном подборе подходящей вакцины, которая должна быть адаптирована именно к интересующему генотипу. Животные после переболевания каким-либо одним серотипом не имеют иммунную защиту против другого серотипа и даже некоторых других генетических линий [3]. Однако, вирусы ящура могут демонстрировать частичную перекрестную защиту в пределах одного серотипа [2].

Установление генетических связей между различными изолятами и штаммами проводят с помощью нуклеотидного секвенирования, что дает возможность в условиях вспышки определить происхождение вируса. Антигенные характеристики вируса, связанные с появлением новых штаммов, важны для характеристики вспышек и поиска оптимальных вакцинных препаратов [4, 6].

Для вируса ящура серотипа SAT-1 характерна высокая генетическая изменчивость, а именно он включает в себя следующие 13 топотипов: I (NORTHWEST ZIMBABWE, NWZ), II (SOUTHEAST ZIMBABWE, SEZ), III (WESTERN ZIMBABWE, WZ), IV (EAST AFRICA 1, EA-1), V, VI, VII (EAST AFRICA 2, EA-2), VIII (EAST AFRICA 3, EA-3), IX, X, XI, XII, XIII [5].

Такое высокое генетическое и антигенное разнообразие приводит к проблемам в специфической профилактике ящура при применении культуральных инактивированных противоящурных вакцин. В результате возникает необходимость создания средства специфической профилактики в отношении ящура серотипа SAT-1, а именно SAT-1/X.

По причине легкого и быстрого распространения возбудителя ящура данное заболевание может приобретать размах эпизоотий [12]. С целью недопущения возникновения болезни в хозяйствах Российской Федерации применяется система мероприятий по борьбе и профилактике ящура, которая направлена на предупреждение заноса вируса в страну, систематическую иммунизацию крупного и мелкого рогатого скота в буферной зоне, а также проведение мониторинга иммунного статуса привитых животных.

Для иммунизации животных должна применяться вакцина, изготовленная из вируса, гомологичного полевым изолятам [6, 7, 8, 9, 10, 11].

Возникающие в мире вспышки ящура демонстрируют, что данная инфекция продолжает оставаться значимой экономической проблемой во всем мире. Как представлено в литературных источниках наиболее эффективным способом реагирования на вспышки ящура в странах, свободных от болезней, по-прежнему остается использование вакцин [8, 9, 12, 13]. Для проведения эффективной кампании по вакцинации нужно наличие эффективной, безопасной вакцины, содержащей в качестве иммуногенной части антиген вируса, соответствующей эпизоотическому распространяющемуся изоляту определенного генотипа. Создание подобной вакцины является актуальной задачей. Достижение данной цели позволит эффективно применять вакцину в неблагополучном пункте и угрожаемой зоне для формирования иммунитета против конкретного генотипа вируса ящура.

Одной из нескольких мер, которые могут быть применены для борьбы со вспышками ящура, является экстренная вакцинация. Критерии, которой включают в себя доступ следующие характеристики: 1) содержит штамм вируса ящура с достаточным антигенным родством по отношению к изолятам, циркулирующим в очаге; 2) относится к требуемому виду среди разработанных вакцин; 3) характеризуется приемлемой безвредностью и эффективностью; 4) имеет соответствующий доступ, в том числе объем партий и своевременность их поставок.

На территории многих стран Северной, Западной, Восточной, Центральной и Южной Африки, Ближнего Востока вспышки ящура генотипа SAT-1/X имеют спорадический характер. Так, торгово-экономические связи со странами Африканского континента, влекут за собой риски заноса изолятов данного генотипа на территорию Российской Федерации и соседние государства [14].

Анализируя вспышки, которые регистрировались на территории Африки, обнаружено, что были выявлены изоляты разных топотипов серотипа SAT-1, в частности, II (SAT-1 RV 11 37), III (SAT-1 ВОТ 1 68), IV (SAT-1 UGA BUFF 21 70), V (SAT-1 NIG 11 75), VI (SAT-1 SUD 3 76), VII (SAT-1 UGA 13 74), VIII (SAT-1 UGA 1 97), IX (SAT-1 ETH 3 2007), X (SAT-1/X), XI (SAT-1 TCH 1/72), XII (SAT-1/ANG/9/74), XIII (SAT 1 MOZP132010 В16). В последние годы, начиная с 2015 г. стали широко распространяться изоляты вируса ящура серотипа SAT-1 топотипа X. В частности, официально вспышки ящура генотипа SAT-1/X фиксировались в Нигерии, Камеруне. При этом есть высока вероятность нерегистрируемых случаев в отношении вируса ящура данного генотипа [15].

Известны производственные штаммы вируса ящура типа SAT-1, которые применяются или применялись в мире для производства средств специфической профилактики ящура:

- штамм «SAT-1 Т 155 71» (генотип SAT-1/I),

- штамм «SAT-1 RV 11 37» (генотип SAT-1/II),

- штамм «SAT-1 ВОТ 1 68» (генотип SAT-1/III),

- штамм «SAT-1 UGA BUFF 21 70» (генотип SAT-1/IV),

- штамм «SAT-1 NIG 11 75» (генотип SAT-1/V),

- штамм «SAT-1 SUD 3 76» (генотип SAT-1/VI),

- штамм «SAT-1 UGA 13 74» (генотип VII),

- штамм «SAT-1 UGA 1 97» (генотип VIII),

- штамм «SAT-1 ETH 3 2007» (генотип IX),

- штамм «SAT-1/Х» (генотип X),

- штамм «SAT-1 TCH 1/72» (генотип XI),

- штамм «SAT-1/ANG/9/74» (генотип XII),

- штамм «SAT 1 MOZP132010 В16» (генотип XIII).

Изолят «SAT-1/NIG/1/2015» вируса ящура был выделен от крупного рогатого скота на территории Федеративной Республики Нигерия в 2015 году и поступил в ФГБУ «ВНИИЗЖ» из Всемирной справочной лаборатории института Пирбрайта (the World Reference Laboratory for Foot-and-Mouth Disease, the Pirbright institute, Великобритания) для изучения и проведения научных исследований. Штамм «SAT-1/Нигерия/2015» был получен путем адаптации к репродукции в первично-трипсинизированной монослойной клеточной линии почки свиньи СП, в перевиваемых культурах клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH, IB-RS-2, ПСГК-30.

По результатам сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей выделенный штамм принадлежит к топотипу X, типа SAT-1 вируса ящура, который значительно отличается от производственных штаммов вируса ящура типа SAT-1 (фиг. 1) [16].

С увеличением торгово-экономических взаимоотношений между Россией и странами Африканского континента, в частности, Нигерии, Танзании, Кении и другими, возникает опасность распространения ящура данного генотипа в Российской Федерации и следовательно возникает проблема возможной экстренной профилактики данного заболевания для формирования иммунитета у восприимчивых животных. Таким образом, возникла необходимость разработать вакцину против ящура генотипа SAT-1/X из штамма «SAT-1/Нигерия/2015» культуральную инактивированную сорбированную для обеспечения биологической безопасности территории Российской Федерации и сопредельных государств.

Наиболее близкой предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является вакцина инактивированная сорбированная против ящура серотипа SAT-1 (штамм «SAT-1 RV 11 37»), содержащая активное вещество в виде авирулентного и очищенного культурального антигенного материала из гомологичного возбудителю ящура штамма «SAT-1 RV 11 37», полученного в чувствительной биологической системе, и целевые добавки в виде гидроксида алюминия и сапонина (адъювант): концентрация антигена (инактивированные 146S+75S компоненты вируса ящура) не менее 3,0 мкг/см³, содержание 10% раствора гидроокиси алюминия - 40% по объему, добавка в виде поддерживающей среды - до 1,0 см³ (прототип).

В качестве чувствительной биологической системы для репродукции вируса ящура используют перевиваемую суспензионную клеточную линию почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/2-17, в качестве поддерживающей среды применяют среду Игла MEM без внесения сыворотки, с добавлением ферментативного гидролизата мышц сухого, гидролизата белков крови сухого при рН среды 7,40-7,60.

Для инактивации вируса используют аминоэтилэтиленимин (АЭЭИ). При изготовлении сорбированной вакцины в качестве адъюванта служит гидрооксид алюминия (Al(ОН)₃). Очистку вируссодержащей суспензии от балластных примесей осуществляют с применением полигексаметиленгуанидин гидрохлорида (ПГМГ).

Авирулентный и очищенный инактивированный антигенный материал из штамма вируса ящура серотипа SAT-1 представляет собой суспензию, состоящую из 146S+75S компонентов вируса ящура, то есть не только полных иммуногенных частиц, но и «пустых» капсидов.

Существенный недостаток вакцины-прототипа заключается в составе антигена, а именно, наличие кроме 146S частиц еще и 75S компонента. По данным некоторых исследователей, в частности, Verlinden Y. (2005), «пустые» капсиды являются результатом неуспешной сборки вириона, либо временным вместилищем пентамеров и не является основным иммуногенным компонентом вакцинных препаратов.

Существенный недостаток вакцины-прототипа состоит в его очень низкой иммуногенной активности относительно штаммов/полевых изолятов вируса ящура генотипа SAT-1/X, циркулирующих в странах Африки по причине принадлежности штамма «SAT-1 RV 11 37» к генотипу SAT-1/II. Кроме того, данный штамм был получен более 40 лет назад.

Для решения этой проблемы было создано настоящее изобретение, в которое входила разработка вакцины против ящура генотипа SAT-1/Х из штамма «SAT-1/Нигерия/2015» культуральной инактивированной сорбированной. Данная вакцина предполагает высокое содержание преимущественно 146S иммуногенного компонента в дозе.

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала инактивированных культуральных сорбированных вакцин для экстренной защиты животных против изолятов и штаммов вируса ящура серотипа SAT-1 и, в частности, генотипа SAT-1/Х.

Указанный технический результат достигнут созданием вакцины против ящура генотипа SAT-1/Х из штамма «SAT-1/Нигерия/2015» культуральной инактивированной сорбированной, охарактеризованной следующей совокупностью признаков, отраженных ниже.

Разработанная вакцина в 1,0 см³ препарата содержит следующие основные компоненты: 1) активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из гомологичного возбудителю инфекции штамма «SAT-1/Нигерия/2015» (генотип SAT-1/Х) вируса ящура, репродуцированного предпочтительно в перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, в количестве не менее 4,0 мкг; 2) гидроксид алюминия 10%-ный коллоидный раствор с содержанием 45% по объему (4,5% в пересчете на сухое вещество), 3) сапонин в количестве 1,5 мг, 4) поддерживающая среда - до 1,0 см³.

Штамм «SAT-1/Нигерия/2015», который получен путем адаптации изолята «SAT-1/NIG/1/2015», депонирован во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) Федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), под регистрационным номером: №414 - деп / 22-48 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Штамм адаптирован к первично-трипсинизированным монослойным клеткам линии свиной почки (СП) и перевиваемым клеточным линиям из почки новорожденного сирийского хомячка (ВНК-21/SUSP/ARRIAH), почки свиньи (IB-RS-2) и почки сибирского горного козерога (ПСГК-30).

Для изготовления вакцины в качестве чувствительной биологической системы предпочтительно используют перевиваемую суспензионную культуру клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH, а в качестве поддерживающей среды применяют среду Игла DMEM без внесения сыворотки, но с добавлением гидролизата белков крови в количестве 5% от общего объема при рН среды 7,45-7,65. Инактивацию вируса проводят с использованием аминоэтилэтиленимина (АЭЭИ) с концентрацией 0,025% от объема вируссодержащей суспензии. Инактивированный вирус очищают от балластных примесей с помощью полигексаметиленгуанидина (ПГМГ), который вносят в суспензию до концентрации 0,012% от общего объема.

Авирулентный и очищенный антиген штамма «SAT-1/Нигерия/2015» вируса ящура представляет собой суспензию, содержащую преимущественно инактивированный 146S иммуногенный компонент вируса ящура. Концентрацию компонента в продукте оценивают с помощью количественного варианта реакции связывания комплемента (РСК) [18]. Для приготовления вакцины используют вирусный материал, содержащий в 1,0 см³ не менее 4,0 мкг инактивированных иммуногенных 146S частиц вируса ящура. Необходимую концентрацию иммуногенного компонента в вакцинном препарате обеспечивают благодаря концентрированию антигена с помощью сорбирования на поверхности коллоидных частиц гидроксида алюминия (Al(ОН)₃).

Вакцину против ящура из штамма «SAT-1/Нигерия/2015» генотипа SAT-1/Х культуральную инактивированную сорбированную получают путем смешивания очищенного антигена и 10%-ной суспензии гидроксида алюминия в соотношении 55% на 45% по объему, соответственно. Для усиления иммунного ответа используют сапонин в концентрации 1,5 мг/см³. Полученная вакцина представляет собой суспензию, содержащую частицы не растворимого в воде гидроокиси алюминия, несущие на своей поверхности инактивированные вирионы вируса ящура, которые обеспечивают формирование иммунитета.

Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые спрашивается правовая охрана:

1. Вакцина против ящура генотипа SAT-1/Х из штамма «SAT-1/Нигерия/2015» культуральная инактивированная сорбированная.

2. Активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из гомологичного возбудителю заболевания штамма «SAT-1/Нигерия/2015» генотипа SAT-1/X вируса ящура в эффективном количестве.

3. Целевые добавки.

Существенные отличительные признаки предлагаемой вакцины заключаются в том, что в качестве активного вещества она содержит авирулентный очищенный антиген штамма «SAT-1/Нигерия/2015» генотипа SAT-1/Х вируса ящура в эффективном количестве.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:

1. Авирулентный и очищенный антиген штамма «SAT-1/Нигерия/2015» генотипа SAT-1/X вируса ящура, полученный предпочтительно в суспензионной перевиваемой клеточной линии BHK-21/SUSP/ARRIAH и представляющий собой суспензию, содержащую 146S иммуногенный компонент вируса ящура в эффективном количестве.

2. Авирулентный и очищенный антиген штамма «SAT-1/Нигерия/2015» генотипа SAT-1/Х вируса ящура, полученный предпочтительно в суспензионной перевиваемой культуре клеток BHK-21/SUSP/ARRIAH и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S иммуногенный компонент вируса ящура в количестве не менее 4,0 мкг в 1,0 см³ готового вакцинного препарата.

3. Из целевых добавок вакцина содержит адъювант.

4. Из целевых добавок вакцина содержит адъювант - гидроксид алюминия в комплексе с сапонином.

5. Вакцина содержит адъювант - гидроокись алюминия 4,5% в пересчете на сухой остаток в комплексе с сапонином в концентрации 1,5 мг в 1,0 см³ готового препарата.

6. Авирулентный и очищенный антиген штамма «SAT-1/Нигерия/2015» генотипа SAT-1/Х вируса ящура, полученного предпочтительно в перевиваемой суспензионной клеточной линии BHK-21/SUSP/ARRIAH, адъювант - гидроксид алюминия и сапонин, добавка в готовом препарате в виде поддерживающей среды в следующих количествах:

Авирулентный и очищенный антиген штамма «SAT-1/Нигерия/2015» генотипа SAT-1/Х вируса ящура не менее 4,0 мкг/см³ Гидроокись алюминия 4,5% (в пересчете на сухое вещество) Сапонин 1,5 мг/см³ Поддерживающая среда до 1,0 см³

Предлагаемая вакцина против ящура из штамма «SAT-1/Нигерия/2015» генотипа SAT-1/Х культуральная инактивированная сорбированная обладает высокой иммуногенной активностью и обеспечивает надежную защиту против изолятов вируса ящура генотипа SAT-1/Х, циркулирующего в странах Восточной Африки и соседних государствах.

Достижение технического результата от использования изобретения обеспечивается тем, что в состав предлагаемой противоящурной вакцины в качестве активного вещества введен антиген штамма «SAT-1/Нигерия/2015» генотипа SAT-1/Х вируса ящура, обладающий высокой иммуногенной активностью, создающий эффективную защиту восприимчивых животных против изолятов вируса ящура представленного генотипа, которые в последние годы вызывают вспышки заболевания в странах Африки.

Сущность изобретения отражена на графическом изображении:

Фиг. 1. Дендрограмма, отражающая филогенетическое взаимоотношение штамма «SAT-1/Нигерия/2015» вируса ящура с эпизоотическими штаммами серологического типа SAT-1. Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностей гена VP₁.

Сущность изобретения пояснена следующими перечнями последовательностей:

SEQ ID NO:1 представляет последовательность нуклеотидов гена белка VP₁ штамма «SAT-1/Нигерия/2015» вируса ящура генотипа SAT-1/X;

SEQ ID NO:2 представляет последовательность аминокислот гена белка VP₁ штамма «SAT-1/Нигерия/2015» вируса ящура генотипа SAT-1/X.

Штамм «SAT-1/Нигерия/2015» вируса ящура характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки

Штамм «SAT-1/Нигерия/2015» вируса ящура серотипа SAT-1 относится к отряду Picornavirales, семейству Picornaviridae, роду Aphthovirus, виду Foot-and-Mouth Disease virus и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона иксаэдрическая, размер 24-25 нм. Вирион состоит из молекулы одноцепочечной положительно заряженной молекулы РНК, заключенной в белковую оболочку. 146S компонент состоит из молекулы РНК, заключенной в полипептидный комплекс, состоящий из 60 копий структурных белков VP₄, VP₂, VP₃, VP₁.

Антигенные свойства

По антигенным свойствам штамм «SAT-1/Нигерия/2015» вируса ящура относится к серотипу SAT-1/Х. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой, не проявляет гемагглютинирующей активности. У переболевших животных в сыворотке крови образуются типоспецифические антитела, выявляемые в иммуноферментном анализе (ИФА) и реакции микронейтрализации (РМН).

Методом нуклеотидного секвенирования была определена первичная структура 1D-гена белка VP₁ штамма «SAT-1/Нигерия/2015» вируса ящура. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей показал, что штамм «SAT-1/Нигерия/2015» вируса ящура принадлежит к генотипу SAT-1/Х (Фиг. 1).

Антигенное родство (r₁) штамма «SAT-1/Нигерия/2015» вируса ящура изучено в перекрестном исследовании штамма со специфическими сыворотками, полученными на следующие производственные штаммы вируса ящура:

- штамм «SAT-1 Т 155 71» (генотип SAT-1/I),

- штамм «SAT-1 RV 11 37» (генотип SAT-1/II),

- штамм «SAT-1 ВОТ 1 68» (генотип SAT-1/III),

- штамм «SAT-1 UGA BUFF 21 70» (генотип SAT-1/IV),

- штамм «SAT-1 NIG 11 75» (генотип SAT-1/V),

- штамм «SAT-1 SUD 3 76» (генотип SAT-1/VI),

- штамм «SAT-1 UGA 13 74» (генотип VII),

- штамм «SAT-1 UGA 1 97» (генотип VIII),

- штамм «SAT-1 ETH 3 2007» (генотип IX),

- штамм «SAT-1/Х» (генотип X),

- штамм «SAT-1 TCH 1/72» (генотип XI),

- штамм «SAT-1/ANG/9/74» (генотип XII),

- штамм «SAT 1 MOZP132010 В16» (генотип XIII) в РМН.

Титр референтных сывороток крови КРС, полученных путем иммунизации животных моновалентными вакцинами из производственных штаммов вируса ящура серотипа SAT-1, против 10² ТЦД₅₀ гомологичного и гетерологичного вируса определяли в РМН при перекрестном титровании, рассчитывая значения с использованием уравнения линейной регрессии, и выражали в lg. Значение r₁ определяли, как антилогарифм разности lg титров сыворотки против гетерологичного и гомологичного вируса [17, 18, 19].

Значение r₁ в РМН интерпретировали следующим образом:

при ≥ 0,3 - исследуемый и производственный штаммы вируса ящура являются близкородственными;

при < 0,3 - исследуемый образец штамма вируса ящура отличается от производственного штамма.

Показатели антигенного родства при изучении штамма «SAT-1/Нигерия/2015» составили r₁ 0,01 - 0,32, что свидетельствует об отсутствии антигенного родства с производственными штаммами вируса ящура серотипа SAT-1 (таблица 1). Следует заметить, что родство между штаммами «SAT-1/Х» и «SAT-1/Нигерия/2015», относящихся к генотипу SAT-1/Х, составляет всего 0,32, исходя из этого, они имеют родство, но оно незначительное, отличия существенные. Штамм «SAT-1/Х» был выделен в 1980 году и не соответствует эпизоотическим изолятам, выделенным при вспышках ящура на Африканском континенте в более поздний период. Это является основанием для создания вакцины на основе штамма «SAT-1/Нигерия/2015».

Гено- и хемотаксономическая характеристики

Штамм «SAT-1/Нигерия/2015» вируса ящура является РНК-содержащим вирусом с молекулярной массой 7×10⁶ Д. Нуклеиновая кислота представлена одноцепочной линейной молекулой молекулярной массой 2,8×10⁶ Д. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую только из четырех основных белков VP₁, VP₂, VP₃ и VP₄.

Основным антигенным белком является VP₁. В вирионе содержится 31,5% РНК и 68,5% белка. Вирусная РНК является положительно заряженной инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Предшественники, в свою очередь, расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса. Из 8 неструктурных полипептидов, накапливающихся в инфицированных клетках, особое значение имеет белок - РНК-зависимая РНК-полимераза (кодируется 3D-геном), необходимая для репликации вирусной РНК.

Физические свойства

Масса вириона составляет 8,4×10^-18 г. Плавучая плотность 1,45 г/см³.

Устойчивость к внешним факторам

Штамм «SAT-1/Нигерия/2015» вируса ящура устойчив к эфиру, хлороформу, фреону, ацетону. Наиболее стабилен при рН 7,35-7,70. Сдвиги рН как в кислую, так и в щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, γ-облучению, высоким температурам (выше 38,2°С).

Дополнительные признаки и свойства

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.

Патогенность - патогенен для парнокопытных животных.

Вирулентность - вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.

Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 5 пассажей (срок наблюдения) на перевиваемых культурах.

Биотехнологические характеристики

Штамм «SAT-1/Нигерия/2015» вируса ящура репродуцируется в перевиваемых культурах клеток: почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), почки свиньи (IB-RS-2), почки сирийского хомячка (ВНК-21).

При испытании было проведено 5 последовательных пассажей штамма «SAT-1/Нигерия/2015» вируса ящура в перевиваемых культурах клеток ПСГК-30, ВНК-21, IB-RS-2. Биологические свойства характеризовали путем определения инфекционной активности вируса каждого пассажа в перевиваемой клеточной линии IB-RS-2 и на естественно восприимчивых животных - крупном рогатом скоте (КРС) и свиньях.

Исходя из полученных данных, можно утверждать, что штамм «SAT-1/Нигерия/2015» вируса ящура по антигенному и иммунологическому спектрам является оригинальным вариантом вируса ящура генотипа SAT-1/Х.

Для снижения эпизоотической опасности возникновения ящура, вызванного генотипом SAT-1/Х, и предотвращения возникновения новых очагов болезни важна своевременная вакцинопрофилактика, что требует разработки высокоиммуногенной и эффективной вакцины.

Получена высокоиммуногенная и эффективная вакцина против ящура генотипа SAT-1/Х из штамма «SAT-1/Нигерия/2015» культуральная инактивированная сорбированная.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. Генетическая характеристика штамма «SAT-1/Нигерия/2015» вируса ящура по данным ПЦР и нуклеотидного секвенирования.

Проведенные исследования заключались в изучении первичной структуры гена 1D (белок VP₁) (663 н.о.) штамма «SAT-1/Нигерия/2015» вируса ящура методом нуклеотидного секвенирования методом Сенгера и определении положения данного штамма на филогенетическом древе вируса ящура серотипа О. Метод основан на определении первичной структуры гена 1D (белок VP₁) испытуемого изолята/штамма с последующим анализом филогенетического родства с другими изолятами вируса ящура серотипа SAT-1.

Провели сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей гена 1D, кодирующего белок VP₁ вируса ящура вакцинного штамма «SAT-1/Нигерия/2015» с другими изолятами и штаммами. Последовательность нуклеотидов гена белка VP штамма «SAT-1/Нигерия/2015» генотипа SAT-1/Х вируса ящура представлена SEQ ID NO:1. Последовательность аминокислот 1D-гена, кодирующего белок VP₁ штамма «SAT-1/Нигерия/2015» генотипа SAT-1/X вируса ящура отражена на SEQ ID NO:2.

Проведен филогенетический анализ штамма «SAT-1/Нигерия/2015». Филогенетическое дерево выведено с использованием программы MEGA6 и алгоритма Neighbor-Joining [20]. Процент повторяющихся ветвей, в которых связанные таксоны сгруппированы вместе в тесте начальной загрузки (200 повторов), показан рядом с ветвями [21, 22]. Эволюционные расстояния были рассчитаны с использованием метода Maximum Composite Likelihood [23] и выражены в единицах количества замен оснований на сайт. Этот анализ включал 14 нуклеотидных последовательностей, в том числе последовательность 1D-гена штамма «SAT-1/Нигерия/2015» вируса ящура. Все позиции, содержащие пробелы и отсутствующие данные, были удалены (вариант полного удаления). В окончательном наборе данных было всего 663 позиций. Эволюционный анализ проводился в MEGA 6 [24].

В результате проведенной работы по сравнению полных нуклеотидных последовательностей гена 1D (белок VP1) штамма «SAT-1/Нигерия/2015» и других изолятов/штаммов вируса ящура серотипа SAT-1/Х определено положение исследуемого штамма на филогенетическом древе (фиг. 1).

По результатам всего анализа делаем вывод, что исследуемый штамм «SAT-1/Нигерия/2015» относится к генотипу SAT-1/X, что подтверждают данные нуклеотидного и аминокислотного анализа.

Пример 2. Адаптация штамма «SAT-1/Нигерия/2015» к перевиваемой монослойной культуре клеток почки сибирского горного козерога ПСГК-30.

Для заражения перевиваемой монослойной культуры клеток почки сибирского горного козерога ПСГК-30 использовали 10%-ную афтозную суспензию вируса ящура, полученную из афт КРС (2 пассаж). Посевная концентрация клеток составляла 0,20-0,25 млн кл./см³, доза заражения вирусом - 0,001 ТЦД₅₀/кл. По результатам исследования репродукция вируса ящура штамма «SAT-1/Нигерия/2015» проходила при специфическом разрушении монослоя на 90-100% за 18-20 ч. В течение 6 последовательных пассажей отмечали рост значений титра инфекционной активности вируса от 6,14±0,12 до 7,62±0,12 lg ТЦД₅₀/см³.

Максимальное значение титра инфекционной активности вируса было достигнуто на этапе 6 пассажа (7,62±0,12 lg ТЦД₅₀/см³). Концентрация 146S частиц с 1 по 6 пассажи изменялась с 0,27±0,03 до 1,10±0,03 мкг/см3. При этом наибольшее количество 146S компонента отмечали на этапе 6 пассажа (1,10±0,03 мкг/см³). Степень достоверности (R²) результатов исследования в количественном варианте ОТ-ПЦР-РВ колебалась от 96,97 до 99,85%). Таким образом, на протяжении 6-ти последовательных пассажей была успешно проведена адаптация штамма «SAT-1/Нигерия/2015» вируса ящура к перевиваемой монослойной клеточной линии ПСГК-30.

Пример 3. Изучение условий монослойного культивирования вируса ящура штамма «SAT-1/Нигерия/2015» в промышленных масштабах.

В процессе промышленного культивирования штамма «SAT-1/Нигерия/2015» вируса ящура в перевиваемой монослойной культуре клеток ПСГК-30 осуществляли подбор оптимальных условий культивирования вируса, анализируя разный состав поддерживающей среды, температурный фактор и дозу заражения клеток.

На первом этапе исследования оценивали влияние состава поддерживающей среды на репродукцию штамма «SAT-1/Нигерия/2015» вируса ящура в монослойной культуре клеток ПСГК-30 в масштабах производства (на этапе с 5-ого на 6-ой пассажи). Для сравнения применяли три среды с добавлением 2% фетальной сыворотки крови телят: 1) среда Игла DMEM; 2) среда RPMI-1640; 3) раствор Хэнкса с 3,0% гидролизата белков крови. Посевная концентрация клеток составляла 0,20-0,25 млн кл./см³, доза заражения вирусом - 0,1000-0,0001 ТЦД₅₀/кл. Культивирование вируса осуществляли при температурах 35±0,2 - 38±0,2°С до разрушения клеточного монослоя на 95-100% в течение 15-30 ч. Результаты адаптации штамма «SAT-1/Нигерия/2015» вируса ящура с поддерживающими средами разного состава отражены в таблице 2.

Из данных таблицы 2 видно, что при репродукции штамма «SAT-1/Нигерия/2015» вируса ящура в монослойной культуре клеток ПСГК-30 с применением поддерживающих сред разного состава, оптимальной является среда Игла DMEM, позволяющая за 15-16 ч достичь специфического разрушения клеточного монослоя на 95-100% с накоплением в полученной суспензии 146S компонента в количестве 1,10±0,03 мкг/см³ и титром инфекционной активности 7,62±0,12 lg ТЦД₅₀/см³. При использовании среды RPMI-1640 и раствора Хэнкса показатели репродукции вируса были ниже.

На следующем этапе изучения условий монослойного культивирования штамма «SAT-1/Нигерия/2015» вируса ящура в культуре клеток ПСГК-30 в условиях производства оценивали влияние на процесс репродукции вируса температурного фактора. Для этого культивирование вируса проводили в среде Игла DMEM с 2% сыворотки КРС при следующих температурах: 35,0±0,2; 36,0±0,2; 37,0±0,2; 38,0±0,2°С. Доза заражения культуры клеток вирусом ящура составляла 0,010-0,001 ТЦД₅₀/кл. Культивирование вируса осуществляли до разрушения клеточного монослоя на 80-100%) в течение 15-30 ч (таблица 2). По итогам исследования выявили, что для полной репродукции штамма «SAT-1/Нигерия/2015» вируса ящура в монослойной культуре клеток ПСГК-30 оптимальной является температура среды 37,0±0,02°С, при которой за 15-16 ч развитие ЦПД достигало 95-100%) с накоплением 146S частиц, равным 1,10±0,03 мкг/см³ и титром инфекционной активности вируса 7,62±0,12 lg ТЦД₅₀/см³.

Оценивали влияние дозы заражения монослоя клеток линии ПСГК-30 штаммом «SAT-1/Нигерия/2015» при культивировании в масштабах производства. Для этого использовали разные дозы вируса: 0,10-0,01; 0,010-0,001; 0,0010-0,0001 ТЦД₅₀/кл. В качестве поддерживающей среды применяли среду Игла MEM с 2% сыворотки крови КРС. Репродукцию вируса проводили при температуре 37,0±0,2°С в течение 15-24 ч до специфического разрушения клеток на 90-100%. По итогам культивирования определяли концентрацию 146S компонента и титр инфекционной активности вируса ящура. Как следует из данных таблицы 2, наибольшее накопление «полных» частиц вируса достигалось при дозе заражения 0,01-0,001 ТЦД₅₀/кл. и составило 1,10±0,03 мкг/см³ с титром инфекционной активности вируса 7,62±0,12 lg ТЦД₅₀/см³.

Таким образом, проведено изучение условий монослойного культивирования штамма «SAT-1/Нигерия/2015» вируса ящура в культуре клеток ПСГК-30 в промышленных масштабах. В результате исследования определены следующие оптимальные параметры репродукции штамма «SAT-1/Нигерия/2015» вируса ящура в монослойной клеточной линии ПСГК-30: 1) поддерживающая среда - среда Игла DMEM; 2) температурный режим культивирования - 37,0±0,02°С; 3) доза заражения вирусом - 0,01-0,001 ТЦД₅₀/кл.

Пример 4. Изучение условий суспензионного культивирования штамма «SAT-1/Нигерия/2015» вируса ящура в промышленных масштабах.

При промышленном культивирования штамма «SAT-1/Нигерия/2015» вируса ящура в перевиваемой суспензионной культуре клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH проводили поиск оптимальных параметров для успешной репродукции возбудителя ящура, используя разные концентрации клеток, температуру и дозу заражения.

На первом этапе работы определяли влияние посевной концентрации клеток линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH в суспензии на репродукцию штамма «SAT-1/Нигерия/2015» вируса ящура в промышленных масштабах. Для анализа подготовили суспензии со следующими концентрации клеток: 2,5; 3,0; 3,5; 4,0 млн кл./см³. Водородный показатель рН поддерживали в диапазоне 7,45-7,65. Температура культивирования вируса составляла 37,0±0,02°С, доза заражения вирусом - 0,10-0,01 ТЦД₅₀/кл. Репродукцию вируса проводили до специфической гибели клеток на 95-100%, которая осуществлялась в течение 9-11 ч.

Результаты суспензионного культивирования штамма «SAT-1/Нигерия/2015» вируса ящура в суспензии с разными концентрациями клеток представлены в таблице 3, из которой следует, что при культивировании вируса ящура штамма «SAT-1/Нигерия/2015» в суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH с разными концентрациями клеток, определили, что накопление 146S компонента в суспензии с концентрацией клеток 2,5 млн кл./см³ составило 0,49±0,03 мкг/см³, с концентрацией 3,0 млн кл./см³ - 0,74±0,03 мкг/см³, с концентрацией 3,5 млн кл./см³ - 1,21±0,03 мкг/см³, и с концентрацией 4,0 млн кл./см³ - 1,42±0,03 мкг/см³. Как следует из полученных данных для репродукции штамма «SAT-1/Нигерия/2015» вируса ящура оптимальной является концентрация клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH в суспензии, равная 4,0 млн кл./см³. Значение титра инфекционной активности вируса при этом составило 8,50±0,11 lg ТЦД₅₀/см³. Большая концентрация клеток позволяла получить такой же выход продукта с небольшим увеличением. С экономической точки зрения, таким образом, для репродукции штамма «SAT-1/Нигерия/2015» вируса ящура оптимально использовать суспензию клеток линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH с концентрацией 4,0 млн кл./см³.

Исследовали влияние фактора температуры на суспензионное культивирование штамма «SAT-1/Нигерия/2015» вируса ящура в культуре клеток линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH в промышленных масштабах. Для этого репродукцию вируса проводили при следующих температурных условиях: 35,0±0,2; 36,0±0,2; 37,0±0,2; 38,0±0,2°С. Доза заражения культуры клеток вирусом составляла 0,10-0,01 ТЦД₅₀/кл. Водородный показатель рН вирусной суспензии поддерживали в диапазоне 7,45-7,65. Культивирование вируса проводили до ЦПД, равного 90-100%, в течение 14-26 ч. По результатам анализа определили, что для полной репродукции штамма «SAT-1/Нигерия/2015» вируса ящура в суспензионной культуре клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH оптимальной является температура среды 37,0±0,02°С, при которой в течение 14-15 ч наблюдается специфическая гибель клеток на 95-100%) с высоким накоплением 146S компонента (1,42±0,03 мкг/см³) и титром инфекционной активности вируса 8,50±0,11 lg ТЦД₅₀/см³.

Условия суспензионного культивирования штамма «SAT-1/Нигерия/2015» вируса ящура в промышленных масштабах изучали с применением культуры клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH оценивали влияние дозы заражения клеток. Для этого клеточные суспензии заражали вирусом в разных дозах: 0,10-0,01; 0,01-0,001; 0,001-0,0001 ТЦД₅₀/кл. Репродукцию вируса осуществляли при температуре 37,0±0,2°С в течение 14-26 ч до цитопатического действия, равного 90-95%. По итогам культивирования определяли концентрацию 146S частиц и титр инфекционной активности вируса ящура. Как видно из данных таблицы 3, наибольшее накопление 146S компонента отмечали при дозе заражения 0,010-0,001 ТЦД₅₀/кл. (1,42±0,03 мкг/см³) с титром инфекционной активности вируса, равным 8,50±0,11 lg ТЦД₅₀/см³.

Таким образом, проведено изучение параметров суспензионного культивирования штамма «SAT-1/Нигерия/2015» вируса ящура в суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH в промышленных масштабах. Выявлены оптимальные условия репродукции штамма «SAT-1/Нигерия/2015» в суспензионной культуре клеток ВНК-21: 1) концентрация клеток перед заражением - 4,0 млн кл./см³; 2) температурный режим культивирования - 37,0±0,02°С; 3) доза заражения вирусом - 0,010-0,001 ТЦД₅₀/кл.

Пример 5. Инактивация суспензии вируса ящура штамма «SAT-1/Нигерия/2015» генотипа SAT-1/X.

По окончании цикла репродукции вируса ящура, не прекращая процесс термостатирования (37,0±0,02°С), в вируссодержащую суспензию добавляли подкисленный раствор аминоэтилэтиленимина (АЭЭИ) с рН, равным 8,2-8,3. Конечная концентрация АЭЭИ в вируссодержащей суспензии должна быть равной 0,025%. Инактивацию инфекционной активности вируса ящура штамма «SAT-1/Нигерия/2015» генотипа SAT-1/X проводили в течение 12 часов при температуре 37,0±0,1°С и рН 7,45-7,65 с перемешиванием.

Для определения времени полной инактивации после добавления 1,2-АЭЭИ каждый час производили отбор проб. Полученные образцы проверяли на наличие инфекционной активности вируса ящура в первичной культуре клеток почки свиньи СП. Результаты представлены в таблице 4, из данных которой видно, что полная инактивация вируса ящура штамма «SAT-1/Нигерия/2015», репродуцированного в культиваторах, произошла через 8 часов после внесения 1,2-АЭЭИ.

Готовые вирусные инактивированные суспензии исследовали в РСК для оценки содержания в них компонентов вируса. Концентрация 146S компонента составила 1,37±0,03 мкг/см³ (64% от концентрации общего вирусного белка), а 146S+75S компонента - 1,80±0,0 мкг/см³ (88% от концентрации общего вирусного белка).

Пример 6. Подбор условий очистки суспензии вируса ящура штамма «SAT-1/Нигерия/2015» генотипа SAT-1/Х.

Суспензию вируса ящура штамма «SAT-1/Нигерия/2015» генотипа SAT-1/Х, полученную при репродукции в суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, подвергали инактивации и очистке. Для получения очищенного антигена вируса ящура использовали полигексаметиленгуанидин (ПГМГ) с концентрациями 0,010, 0,012 и 0,014%. До и после процесса очистки антигена вируса ящура штамма «SAT-1/Нигерия/2015» генотипа SAT-1/Х в количественном варианте РСК определяли концентрацию общего вирусного белка и иммуногенных компонентов. Результаты анализа отражены в таблице 5, из которой следует, что в результате очистки антигена вируса ящура штамма «SAT-1/Нигерия/2015» генотипа SAT-1/Х с помощью ПГМГ в концентрации 0,010% отмечали снижение концентрации балластного белка на 6%, иммуногенных компонентов - на 0,5%. При использовании ПГМГ в концентрации 0,012% наблюдали снижение количества балластного белка на 43%, 146S компонента - на 2%. Применяя ПГМГ в концентрации 0,014% содержание балластного белка уменьшалось на 52%, а иммуногенных компонентов - на 10%. Таким образом, исследуя условия очистки антигена штамма «SAT-1/Нигерия/2015» генотипа SAT-1/Х, пришли к выводу о том, что для получения очищенного продукта оптимально использовать ПГМГ с концентрацией 0,012%.

Пример 7. Подбор условий концентрирования суспензии антигена штамма «SAT-1/Нигерия/2015» генотипа SAT-1/Х вируса ящура.

Культуральную инактивированную суспензию штамма

«SAT-1/Нигерия/2015», полученную с применением суспензионной клеточной линии ВНК-21 /SUSP/ARRIAH, подвергали концентрированию в 8 раз по объему. Для увеличения концентрации иммуногенных компонентов антигена вируса ящура использовали следующие приемы: 1) добавление полиэтиленгликоля (ПЭГ-6000) с концентрацией 50% к антигену в соотношении 1:4, с экспозицией 4 ч; 2) добавление полиэтиленгликоля (ПЭГ-6000) с концентрацией 50% к антигену в соотношении 1:4, с экспозицией 12 ч; 3) концентрирование с помощью гидроокиси алюминия (10%) коллоидный раствор в количестве 45%, антиген вируса - 55% от общего объема).

До и после процесса концентрирования суспензии антигена вируса ящура штамма «SAT-1/Нигерия/2015» определяли концентрацию общего вирусного белка и иммуногенных компонентов в количественном варианте РСК. Результаты исследований представлены в таблице 6, из которой видно, что при концентрировании антигена штамма «SAT-1/Нигерия/2015» вируса ящура с помощью ПЭГ-6000 в течение 4 ч отмечали увеличение содержания компонентов по сравнению с исходными значениями (до концентрирования) в 5,5 раз. Используя тот же полимер, но повышая время воздействия до 12 ч, увеличили концентрацию компонентов вируса в 6,3 раз. Применяя метод сорбирования с помощью гидроксида алюминия, удалось увеличить количество иммуногенных компонентов антигена штамма «SAT-1/Нигерия/2015» вируса ящура в суспензии в 7,9 раз. Таким образом, исследуя условия концентрирования антигена штамма «SAT-1/Нигерия/2015», пришли к выводу о том, что оптимальным способом увеличения концентрации компонентов вируса ящура является метод сорбирования с применением коллоидного раствора гидроксида алюминия.

Пример 8. Подбор адъюванта и соотношения антиген-адъювант.

Для изготовления противоящурной моновалентной сорбированной вакцины из антигена штамма «SAT-1/Нигерия/2015» в качестве адъюванта был выбран гидроксид алюминия в комплексе с сапонином. При изготовлении моновалентной сорбированной вакцины против вируса ящура использовали 4,5% гидроокиси алюминия в пересчете на сухое вещество и сапонин в количестве 1,5 мг/см³.

Пример 9. Компоновка вакцины против ящура из штамма «SAT-1/Нигерия/2015» генотипа SAT-1/Х кулътуральной инактивированной сорбированной.

Из полученного концентрата антигена вируса ящура штамма «SAT-1/Нигерия/2015» изготовили вакцину против ящура генотипа SAT-1/X культуральную инактивированную сорбированную с применением в качестве адъювантов гидроокиси алюминия и сапонина. Количество 146S иммуногенного компонента в 1,0 см³ готового антигена составило 10,35±0,09 мкг/см³ (таблица 6).

Пример 10. Иммунизация животных вакциной против ящура из штамма «SAT-1/Нигерия/2015» генотипа SAT-1/Х кулътуральной инактивированной сорбированной (предлагаемое изобретение).

Из полученной вакцины против ящура из штамма «SAT-1/Нигерия/2015» генотипа SAT-1/Х культуральной инактивированной сорбированной (предлагаемое изобретение) был приготовлен ряд разведений для КРС с 4-х кратным шагом. 15 голов КРС разделили на 3 группы по 5 голов в каждой и 2 головы оставили без вакцинации для контроля вируса. Иммунизирующая доза составляла 2,0 см³. Первую группу КРС (№№ 1-5) иммунизировали вакциной без разведения, вторую группу КРС (№№ 6-10) привили вакциной, разведенной 1/4, третья группа КРС (№№ 11-15) - вакциной, разведенной 1/16. Препарат вводили внутримышечно в среднюю треть шеи.

Пример 11. Исследование сывороток крови вакцинированных животных на наличие антител к неструктурным белкам вируса ящура.

Сыворотки крови от КРС, полученные до иммунизации животных, через 14 суток после иммунизации, исследовали на наличие антител к неструктурным белкам вируса ящура с помощью блокирующего варианта иммуноферментного анализа (ИФА) в соответствии с рекомендациями OIE (МЭБ) [3]. Тестирование полученных сывороток проводили с использованием тест-системы для ИФА «Prio CHECK^®FMDV NSP ELISA for in vitro detection of antibodies against Foot and Mouth Disease Virus in serum of cattle, sheep and pigs» (Prionics Lelystad B.V., Нидерланды). Полученные результаты исследований отражены в таблице 7, из которой видно, что сыворотки крови животных не содержали антител к неструктурным белкам вируса ящура (значения PI для сывороток крови КРС < 50%).

Пример 12. Оценка авирулентности и безвредности вакцины против ящура из штамма «SAT-1/Нигерия/2015» генотипа SAT-1/Х кулътуральной инактивированной сорбированной.

Для определения авирулентности вакцины на КРС отобранную пробу вакцинного препарата (предлагаемое изобретение) вводили внутрикожно по 0,1 см³. В исследовании использовали КРС массой 270-300 кг. В течение 10 суток наблюдения животные остались клинически здоровыми, и при патологоанатомическом исследовании не было обнаружено изменений, характерных для ящура. Это свидетельствовало об отсутствии вирулентных свойств разработанной вакцины (предлагаемое изобретение).

Контроль безвредности продукта на КРС проводили путем внутримышечного введения вакцины (предлагаемое изобретение) в дозе 6,0 см³ (тройная доза по 2,0 см³). Срок наблюдения также составлял 10 суток. Следует отметить, что после иммунизации температура тела животного может повышаться до 41,4°С и удерживаться на этом уровне в течение 1-2 суток, что не выходит за рамки нормы после введения вакцинного препарата.

По результатам исследований вакцина против ящура из штамма «SAT-1/Нигерия/2015» генотипа SAT-1/Х культуральная инактивированная сорбированная (предлагаемое изобретение) была признана безвредной, все животные в период наблюдения оставались клинически здоровыми, при патологоанатомическом анализе некроза тканей на месте введения вакцины не обнаружено.

Пример 13. Изучение иммуногенных свойств вакцины (предлагаемое изобретение) по способности индуцирования вируснейтрализующих антител у естественно восприимчивых животных.

На 21 сутки после введения вакцины против ящура из штамма «SAT-1/Нигерия/2015» генотипа SAT-1/Х культуральной инактивированной сорбированной у КРС отбирали кровь и проводили исследование полученных сывороток крови в реакции микронейтрализации (РМН) [3]. Выявлено, что у КРС, иммунизированных вакциной в цельной дозе (5 голов), средние значения титра антител составили 7,45±0,11 log₂ SN₅₀, с разведением 1/4 (5 голов) -4,45±0,11 log₂ SN₅₀, с разведением 1/16 (5 голов) - 3,15±0,22 log₂ SN₅₀. (таблица 8). Полученные данные реакции микронейтрализации свидетельствуют о том, что после введения вакцины в цельном виде обеспечивается формирование гуморального иммунитета с защитными титрами штаммоспецифических антител (5,5 и более log₂ SN₅₀), что соответствует требованиям международных стандартов [3].

Пример 14. Изучение защитной способности вакцины против ящура из штамма «SAT-1/Нигерия/2015» генотипа SAT-1/X культуральной инактивированной сорбированной на естественно восприимчивых видах животных методом контрольного заражения естественно восприимчивых животных.

Крупный рогатый скот, иммунизированный в количестве 15 голов, вакциной (предлагаемое изобретение) в цельном виде и в разведениях, заражали контрольным штаммом «SAT-1/Нигерия/2015» генотипа SAT-1/X вируса ящура, адаптированного к этим животным в слизистую оболочку языка в дозе 10^4,0 ИД₅₀/0,20 см³ (в две точки по 0,10±0,05 см³). Спустя 7 суток после заражения всех животных подвергли эвтаназии и провели патологоанатомический осмотр. Защищенными от ящура считали животных, у которых на конечностях отсутствовали поражения. Первичные афты не учитывали.

Результаты контрольного заражения представлены в таблице 8, из которой следует, что вакцина против ящура из штамма «SAT-1/Нигерия/2015» генотипа SAT-1/Х культуральная инактивированная сорбированная в цельном виде и в разведении 1/4, введенная в однократной дозе (2,0 см³) защищает КРС от заражения гомологичным штаммом всех животных (5 из 5 голов).

Препарат (предлагаемое изобретение), инокулированный в разведении 1/16, защитил 4 из 5 животных. По результатам контрольного заражения было установлено, что в прививном объеме данной вакцины содержится 24,25 ПД₅₀ и 0,08 ИмД₅₀ для КРС.

Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о том, что вакцина против ящура генотипа SAT-1/Х из штамма «SAT-1/Нигерия/2015» культуральная инактивированная сорбированная, воплощающая предлагаемое изобретение, предназначена как резервная для использования в сельском хозяйстве, а именно в ветеринарной вирусологии и биотехнологии; подтверждена возможность осуществления представленного; вакцина, изготовленная из штамма «SAT-1/Нигерия/2015» генотипа SAT-1/X в соответствии с предлагаемым изобретением, обладает высокой иммуногенной активностью и способна обеспечить эффективную защиту восприимчивых животных против эпизоотического штамма вируса ящура серотипа SAT-1, генотипа SAT-1/Х, циркулирующего в странах Африки и Ближнего Востока.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Вакцина против ящура генотипа SAT-1/Х из штамма «SAT-1/Нигерия/2015» культуральная инактивированная сорбированная»:

1. Ящур. Меры профилактики. URL: http://89.rospotrebnadzor.ru /directions/epid_nadzor/146902 (Дата обращения: 13.09.2022).

2. Опасность болезни ящура. URL: https://vet.astrobl.ru/press-release/opasnost-bolezni-yashchura (Дата обращения: 24.09.2022).

3. OIE. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals - 24th Ed.-Paris, 2015 - Vol.1, Chapter 2.1.5. - P. 166-169.

4. Бурдов A.H., Дудников А.И., Малярец П.В. и др. Ящур. - М.: Агропромиздат, 1990. - 320 с.

5. Пономарев А.П., Узюмов В.Л., Груздев К.Н. Вирус ящура: структура, биологические и физико-химические свойства. - Владимир: Фолиант, 2006. - 250 с.

6. Aspects of emergency vaccination against foot-and-mouth disease / P. Barnett, J.M/ Garland, R.P. Kitching [et.al.] // Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. - October 2002. - V. 25. - P. 345-364.

7. Brown F. A brief history of FMD and its casual agent. FMD: Control Strateies: Proc. Jnt. Symp.2-5. June 2002, Lyons, France. - Paris, 2003. - p. 13-21.

8. Vaccination against foot-and-mouth disease virus confers complete clinical protection in 7 days and partial protection in 4 days: Use in emergency outbreak response / T.G. William, J. M. Pachecoa, T. Doel [et.al.] // Vaccine. - December 2005. - V. 23. - P. 5775-5782.

9. Aspects of emergency vaccination against foot-and-mouth disease / P. Barnett, J.M/ Garland, R.P. Kitching [et.al.] // Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. - October 2002. - V. 25. - P. 345-364.

10. Barnett P.V. A review of emergency foot-and-mouth disease (FMD) vaccines / Vaccine. - February 2002. - V. 20. - P. 1505-1514.

11. Официальный сайт The FAO World Reference Laboratory for Foot-and-Mouth Disease - URL: http://www.wr1fmd.org/ref_labs/fmd_ref_lab reports.htm (Дата обращения 16.09.2022).

12. Salt I.S. Emergency vaccination of pigs against foot-and-mouth disease: protection against disease and reduction in contact transmission / Vaccine. - April 1998. - V. 16. - P. 746-754.

13. Рахманов A.M. Современная эпизоотическая ситуация в мире по ящуру и меры ее контроля //Ветеринарная медицина мiжвiд. тем. наук. Харкiв, 2013. - С. 37-38.

14. Longjam N., Тауо Т. Antigenic variation of Foot and Mouth Disease Virus // Vet. World. - 2011. - Vol. 4(10). - P. 475-479.

15. Мельник P.H., Хаустова H.B., Мельник H.B., Самуйленко А.Я., Гринь С.А., Святенко М.С., Литенкова И.Ю. Антигенная вариабельность вируса ящура серотипа А и обоснование необходимости получения новых актуальных производственных штаммов/ Ветеринария и кормление. - 2019. - №3. - С. 29-31.

16. Paton D.J., Sumption K.J., Charleston В. Options for control of foot-and-mouth disease: knowledge, capability and policy/ Phil. Trans. R. Soc. В (2009) 364. - P. 2657-2667.

17. Barnett P.V. A review of emergency foot-and-mouth disease (FMD) vaccines / Vaccine. - February 2002. - V. 20. - P. 1505-1514.

18. Методические рекомендации по определению концентрации 146S, 75S, 12S компонентов вакцинных штаммов культурального вируса ящура в реакции связывания комплемента (РСК) / ФГБУ «ВНИИЗЖ». - Утв. 21.09.17.

19. Методические указания по определению антигенного соответствия между эпизоотическими изолятами и производственными штаммами вируса ящура в перекрестной реакции микронейтрализации: утв. Россельхознадзором 13.09.2017 / ФГБУ «ВНИИЗЖ». - Владимир: 2017. - 24 с.

20. Saitou N. and Nei М. (1987). The neighbor-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees. Molecular Biology and Evolution 4:406-42.

21. Felsenstein J. (1985). Confidence limits on phylogenies: An approach using the bootstrap.Evolution 39:783-791.

22. Tamura K., Nei M., and Kumar S. (2004). Prospects for inferring very large phylogenies by using the neighbor-joining method. Proceedings of the National Academy of Sciences (USA) 101:11030-11035.

23. Kumar S., Stecher G., Li M., Knyaz C, and Tamura K. (2018). MEGA 6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis across computing platforms. Molecular Biology and Evolution 35:1547-1549.

24. Barnett P. Aspects of emergency vaccination against foot-and-mouth disease / P. Barnett, J.M/ Garland, R.P. Kitching [et.al.] // Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. - 2002. - V. 25. - P. 345-364.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="Vaccine FMDV

strain SAT-1 Nigeria 2015.xml" softwareName="WIPO Sequence"

softwareVersion="2.1.2" productionDate="2022-12-03">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2022-12-03</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>476</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2022-12-03</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">ФГБУ &quot;Федеральный центр охраны

здоровья животных&quot; (ФГБУ &quot;ВНИИЗЖ&quot;)</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>FGBI &quot;ARRIAH&quot;</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Доронин Максим

Игоревич</InventorName>

<InventorNameLatin>Doronin Maksim Igorevich </InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Вакцина против ящура генотипа

SAT-1/X из штамма «SAT-1/Нигерия/2015» культуральная инактивированная

сорбированная</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>2</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>663</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..663</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q1">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>acaacgtcagcgggcgaaggtgcagaagtggtcacggtcgatgtttcgg

cccacggcggaaatgcccgcccgacacggcgtcagcacactgatgtcgcgttccttctggaccgtttcac

aaaaattggtaagacgacagacaacaagctggtccttgaccttctcaagactaaagagaaggcactggtg

ggcgcactcctccgctcagctacctactacttctgcgacctcgaggttgcggcagtgggtacgaacaagt

gggtcggatgggtgccaaacgggtccccggtcgtgaacgaagtggacgacaacccagtcgtcttctcaca

caacggggtcacccgctttgccttaccgtacaccgcaccacaccaagtgttggccacagtgtacaaaggg

agctgcaagtacaagcccaccacggaggcacaacccgccgccatccgcggcgatttcgccacgctggccg

cccgcctgtcctctgagacgcacattcccacatccttcaatttcggtatgatacttaccgagagcgaagt

tgacgtgtacgtgcgcatgaagcgggccgagttgtactgccctcggcccctactcacaacctacgcccac

accggcgataggtacaaggtgaaactggtggcgccagaaaaacagatggcaaac</INSDSeq_sequen

ce>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>221</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..221</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>TTSAGEGAEVVTVDVSAHGGNARPTRRQHTDVAFLLDRFTKIGKTTDNK

LVLDLLKTKEKALVGALLRSATYYFCDLEVAAVGTNKWVGWVPNGSPVVNEVDDNPVVFSHNGVTRFALP

YTAPHQVLATVYKGSCKYKPTTEAQPAAIRGDFATLAARLSSETHIPTSFNFGMILTESEVDVYVRMKRA

ELYCPRPLLTTYAHTGDRYKVKLVAPEKQMAN</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии. Предложена вакцина против ящура культуральная инактивированная сорбированная. Вакцина содержит авирулентный и очищенный концентрированный антиген штамма «SAT-1/Нигерия/2015» генотипа SAT-1/Х, полученный в суспензионной перевиваемой клеточной линии почки новорожденного сирийского хомячка BHK-21/SUSP/ARRIAH, представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S иммуногенный компонент вируса ящура, адъювант - гидроксид алюминия и сапонин в эффективных соотношениях. Вакцина обладает высокой иммуногенностью и способна обеспечить эффективную защиту от гомологичного возбудителя инфекции, циркулирующего в странах Африки и Ближнего Востока. 2 з.п. ф-лы, 1 ил., 8 табл., 14 пр.

1. Вакцина против ящура культуральная инактивированная сорбированная, содержащая активное вещество и адъювант, отличающаяся тем, что в качестве активного вещества она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из гомологичного возбудителю инфекции штамма «SАТ-1/Нигерия/2015» генотипа SAT-1/X, депонированного во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных Федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный центр охраны здоровья животных», под регистрационным номером: №414 - деп / 22-48 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ», репродуцированного в перевиваемой суспензионной клеточной линии почки новорожденного сирийского хомячка BHK-21/SUSP/ARRIAH, в количестве не менее 4,0 мкг; в качестве адъюванта гидроксид алюминия 10%-ный коллоидный раствор с содержанием 45% по объему 4,0% в пересчете на сухое вещество в комплексе с сапонином в количестве 1,5 мг и поддерживающую среду до 1,0 см³.

2. Вакцина по п. 1, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «SAT-1/Нигерия/2015» генотипа SAT-1/X, полученный в чувствительной биологической системе BHK-21/SUSP/ARRIAH и представляющий собой вирусную суспензию, содержащую преимущественно 146S иммуногенный компонент вируса ящура генотипа SAT-1/X.

3. Вакцина по п. 1, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из гомологичного возбудителю инфекции штамма «SAT-1/Нигерия/2015» генотипа SAT-1/X и адъювант - гидроксид алюминия в комплексе с сапонином в эффективном соотношении: 55% и 45% соответственно.