Способ определения активности супероксиддисмутазы Советский патент 1989 года по МПК C12N9/02 C12Q1/00 G01N33/573 

Изобретение относится к биологии и медицине и может быть использовано в биохимических и клинических исследованиях, а также для контроля технологического процесса получения препарата супероксиддисмутазы (СОД) в микробиологической промьшиенности.

Цель изобретения - повышение специфичности и чувствительности определения и удешевление способа.

На фиг. Т показано изменение спектра кверцетина в процессе его окисления (1- исходньй спектр; 2,3,4,5 - спектр после 5, 10, 13 и 20 мин окисления);, на фиг. 2 - зависимость степени торможения реакции автоокисления кверцетина от концентрации СОД; на

фиг. 3 - зависимость скорости окисления кверцетина от рН; на фиг. 4 - зависимость скорости окисления кверцетина от концентрации фосфатного буфера; на фиг. 5 - зависимость скорости окисления кверцетина от концентрации тетраметилэтилендиамина (ТМЭДА); на .фиг. 6 - зависимость скорости окисления кверцетина от времени инкубации. Способ заключается в том, что для определения активности СОД используют вновь установленную реакцию автоокис- ления флавоноида растительного происхождения - кверцетина в присутствии тетраметилзтилендиамина. К 2,5 мл 0,02 М фосфатного буфера, рН 7,8, добавляют 0,5 мл 0,005 М раствора ТМЭДА,

СП

а

ч

ОАЭ

приготовленного на 0,3 мМ растворе ЭДТА, и 0,1 мл 0,3 мМ раствора квер- цетина. Установлено, что в этом случае имеет место зависящее от анион- радикала кислорода окисление молекулы кверцетина, сопровождающееся увеличением максимума поглощения в области 333 нм и исчезновением в области 406 нм (фиг, 1). Ловушка синглет- ного кислорода - азид натрия (6 -

60 1) , каталаза (0,01-100 мкг/мл) не оказывают влияние на этот процесс. В то же время очищенный препарат СОД с удельной активностью 3000 U/кг его ингибирует. Степень ингибирования оценивается по отношению величины изменения оптической плотности при 406 нм ( ) в присутствии СОД к Д в контрольной пробе, не со- .держащей фермента за 20 мин.

Изобретение относится к биологии и медицине и может быть использовано в биохимических и клинических исследованиях, а также для контроля технологического процесса получения препарата супероксиддисмутазы (СОД) в микробиологической промышленности. Целью изобретения является повышение специфичности и чувствительности определения, удешевление способа. Для определения активности СОД используют вновь установленную реакцию автоокисления флавоноида растительного происхождения-кверцетина в присутствии тетраметилэтилендиамина при оптимальном соотношении концентраций реагентов: 0,8 мм тетраметилэтилендиамин в 0,015 М фосфатном буфере при конечном PH 10 и 0,08 мм этилендиаминтетраацетат. Реакцию характеризуют величиной изменения оптической плотности при 406 нм за 20 мин. 3 табл., 6 ил.

% торможения l i-25H3: 25 2P26E

контрольная проба

Степе-нь торможения реакции окисле- ния квердетина : зависит от концентрации добавленной СОД и эта зависимость представляет собой монотонно возрастающую кривую, представленную на фиг. 2. По этой кривой определена ве- личина IjQ , соответствующая количеству фермента, ингибирующего реакцию iавтоокисления кверцетина на 30%, и равная 1,4 нг/мл.

На основании сравнения величин 1 можно утверждать, что данньш способ примерно в 6 раз чувствительнее прототипа и в 35 раз чувствительнее . способа, основанного на реакции автоокисления адреналина.

Активность фермента сохраняется постоянной в интервале рН от 4,8 до 10, Максимальная скорость процесса имеет место при максимальном значении оптимума рН анализируемого фермента, т.е. рН 10 (фиг. 3), концентрации фосфатного буфера 0,013 М (фиг. 4) и концентрации тетраметилэтилендиамина (ТМЭДА), равной 0,8 мМ (фиг. 3). Максимальное время, соответствующее ли- нейному участку зависимости количеств окисленного продукта от времени реакции 20 мин (фиг. 5,6), максимальные спектральные изменения, отражающие процесс окисления кверцетина, наблюдают при длине волны ЙС 406 Н1Я (см. фиг. 1).

Пример1,К стандартной инкубационной среде, содержащей 2,5 мл 0,02 М фосфатного буфера, рН 7,8, и 0,5 мл 0,005 М ТМЭДА, приготовленного на 0,3 мМ. растворе , добавляют 0,2 мл синовиальной жидкости, разведенной в 10 раз, и 0,1 МП 0,5 мМ раствора квердетина в диметилсульфоксиде опытная проба; 0,2 мл синовиальной шедкости, разведенной в 10 раз и выдержанной в кипящей водяной бане 10 мин, и 0,1 мл 0,5 мМ раствора квер

100,

цетииа - контрольная проба; , мп физиологического раствора и О,1 мп 0,5 мМ раствора кверцетина - холостая проба.

Оптическую плотность при 406 нм определяют сразу после добавления кверцетина и через 20 мин. Результаты приведены в табл. 1.

Таблица ,1

Результаты трех параллельных определений активности СОД в синовиальной жидкости больного ревматоидным артритом

JQ

Процент торможения реакции окисле- шя кверцетина под действием экаоген- ной супероксиддисмутазы вычисляют ; по уравнению

45 % торможения

йВлоб контрольная - ЛВ-к опытная .(-,.,

««.-«.-------.-«.----.«-------- X I иил

холостая

% торможения

0708

25%.

100%

Из графика, приведенного на фиг.2, определяют количество СОД в пробе: СОД 0,5 нг/мп.

Содержание СОД в синовиальной жидкости рассчитывают, учитывая ее разведение: СОД 0,5 нг 3,350 82,5 нг/мп синовиальной жидкости, х

Пример 2. К стандартной инкубационной среде, содержащей 2,5 мл 0,02 М фосфатного буфера, рН 7,8, и 0,5 МП 0,003 М ТМЭДА, приготовленного на 0,5 мМ растворе ЭДТА (конечньй рН составного буфера Ю), добавляли 0,1 МП крови, полученной из пальца пациента и разведенной в 600 раз дистиллированной водой, и О,1 МП 0,5 мМ раствора кверцетина в диметилформа- миде - опытная проба; 0,1 мл крови, разведенной в 600 раз и вьщержанной в кипящей водяной бане 10 мин, и 0,1 мл 0,5 мМ раствора кверцетина - контрольная проба; 0,1 мп дистиллированной воды и О,1 мл 0,5 мМ раствора кверцетина - холостая проба. Анализ проводили как и в случае примера 1, Результаты приведены в табл. 2.

Таблица 2

Результаты трех параллельных определений активности СОД в крови человека

% торможения

,007 0,08 °

50%

Из графитка, приведенного на фиг.2, определяют количество СОД в пробе: СОД 1,4 нг/мп.

Содержание СОД в крови рассчитыва- ,c ют, учитывая выполнение разведения: СОД 1,4-3,2-6000 26,8 мкг/мл.

дд

Q

ПримерЗ. К стандартной инкубационной среде добавляют 0,1 мл раз- .веденного в 500 раз 10% гомогената печени и О,1 мл 0,5 мМ раствора кверцетина в диметилформамиде - опытная проба; О,1 МП разведенного в 500 раз 10% гомогената печени, вьщержанного в кипящей водяной бане 10 мин, и 0,1 мл 0,5 мМ раствора кверцетина - контрольная, проба; 0,1 мл дистиллированной воды и 0,1 Mii 0,5 мМ раствора

кверцетина - холостая проба. Результаты приведены в табл. 3.

Таблица 3

Результаты трех параллельных опре-j делений активности СОД в гомогена- те печени крыс

10

5

c

Расчеты ньтолняют аналогично примеру 2.

ч0,08-0,06 .,.„,„

% торможения ---rr-nJ- 100%

и, ио

25%.

Из графика, приведенного на фиг.2, определяют количество СОД в пробе: СОД 0,05 нг/мл.

0Содержание на 1 г печени: СОД

0,5-3,2 50000 80 мкг/г ткани.

П р и М е р 4. Способ реализуют в наборе реактивов, состоящем из 4 флаконов и рассчитанном на 100 определений.

Флакон А из TEMHOi o стекла, объем 15 мл содержит 1,5 мг кверцетина.

Флакон Б содержит 10 мл диметил- сульфоксида.

дФлакон В, объем 75 мл, содержит

0,35 ТМЭДА.

Флакон Г содержит 50 мл У,5 па- створа ЭДТА. 0,02 М фосфатный буфер, рН 7,8, приготавливают отдельно.

Для проведения анализа содержимое флаконов Б и Г приливают соответственно во флаконы А и В, растворы перемешивают и вьдерживают 2 ч, после чего используют для проведения анали- Q за в соответствии с описанием, приведенным в примере. После смешивания реактивы могут быть использованы в течение 2 сут.

55

Формула изобре7ения Способ определения активности су- .пероксиддисмутазы, предусматривающий оценку степени торможения реакции окисления субстрата анион-радикалом

кислорода в присутствии тетраметил- этилендиагФ1на (ТМЭДЛ) по изменению величины оптической плотности в реакционной смеси, отличающийся, тем, что, с целью повьшения специфичности и чувствительности определения, а также удешевления способа, в качестве субстрата окисления используS

0.5SA

д. 12S.

300

1,0 Фиг. 2

ют кверцетин, реакцию проводят в течение 20 мин при рН 10 в 0,013 М фосфатном буфере в присутствии 0,8 ТЮДА, в реакционную смесь дополни- тепьно вносят 0,08 ftfi этилендиамин- тетраацетат, а величину оптической плотности определяют при длине волны Д06 нм.

,ffM

350

фиг. 1

00

Z,03,/7

Hoffiff/ffnofftftM СОД в ffpoffe, HZfff/f

г 1.0

19 фигЗ

pH

фиг. 5

0,15

/t/, 0OC0eff77ff W

50