СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУММЫ ФЛАВОНОИДОВ В ЛИСТЬЯХ ВАХТЫ ТРЕХЛИСТНОЙ Российский патент 2023 года по МПК A61K8/30 A61K8/9783 B01D11/02 G01N21/00 

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и может быть использовано в центрах контроля качества лекарственных средств и контрольно-аналитических лабораториях при проведении количественного определения суммы флавоноидов в листьях вахты трехлистной (Menyanthes trifoliata L.).

Действующая система контроля качества лекарственных средств нуждается в методиках стандартизации биологически активных соединений (БАС), которые обеспечивают точность анализа и минимальный временной промежуток анализа.

Вахта трехлистная (Menyanthes trifoliata L.) является одним из видов растений, включенных в Государственную Фармакопею Российской Федерации XIV издания: в качестве лекарственного растительного сырья (ЛРС) зарегистрированы листья (ФС.2.5.0042.15) [1]. Препараты на основе вахты трехлистной обладают желчегонным, седативным действием, а также стимулируют функцию пищеварительного тракта [2].

Листья вахты трехлистной являются перспективным источником БАС, обладающих диуретическим и противовоспалительным действием, ингибирующими апоптоз [3,4].

Прототипом для разработки данной методики является способ количественного определения флавоноидов в листьях вахты трехлистной из фармакопейной статьи «Вахты трехлистной трава» (ФС.2.5.0042.15) [1]. Он основан на способности флавоноидов, содержащих свободные ароматические гидроксильные группы образовывать с диазотированной сульфаниловой кислотой окрашенные продукты. Недостатком данной методики является длительный и трудоемкий этап очистки экстракта от кумаринов, которые также вступают в реакцию с диазотированной сульфаниловой кислотой с образованием окрашенных продуктов, путем многократной экстракции в аппарате Сокслета в течение 14 часов с использованием хлороформа. Методика длительная, с использованием органических растворителей и необходимостью при каждом исполнении готовить свежий раствор диазотированной сульфаниловой кислоты.

Таким образом, целью изобретения является разработка способа количественного определения суммы флавоноидов в листьях вахты трехлистной, обладающего высокой специфичностью, точностью и воспроизводимостью, а также достаточной скоростью выполнения анализа.

Технической задачей является создание способа количественного определения суммы флавоноидов в листьях вахты трехлистной в пересчете на рутин, а при отсутствии рутина - с использованием теоретического удельного показателя поглощения равного 248 [5].

Технический результат заключается в уменьшении временных затрат для выполнения анализа, сокращении числа операций на стадии пробоподготовки, исключения из числа экстрагентов токсического соединения - хлороформа, обеспечении при этом условий для максимального выхода действующих веществ (флавоноидов) из листьев вахты трехлистной.

Достижение технического результата обеспечивается тем, что способ количественного определения суммы флавоноидов в листьях вахты трехлистной, включает измельчение листьев вахты трехлистной до размера частиц 1 мм с последующим получением водно-спиртового извлечения однократной экстракцией 1 г точной навески измельченных листьев вахты трехлистной 70%-ным этиловым спиртом в течение 45 мин, при соотношении сырье:экстрагент 1:25, с последующей пробоподготовкой и определением оптической плотности методом дифференциальной спектрофотометрии с использованием стандартного образца рутина, а при его отсутствии - с использованием теоретического удельного показателя поглощения, проведением количественного определения суммы флавоноидов в листьях вахты трехлистной с использованием цветной реакции с алюминия хлорида раствором 5%, при длине волны 409 нм в пересчете на рутин и содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырье рассчитывают по формуле:

где х – содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин, %,

D – оптическая плотность испытуемого раствора,

D_o – оптическая плотность раствора стандартного образца рутина,

m – масса сырья, г,

m_o – масса стандартного образца рутина, г,

W – потеря в массе при высушивании, %.

В случае отсутствия стандартного образца рутина целесообразно использовать теоретическое значение его удельного показателя поглощения, равное 248:

где х – содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин, %,

D – оптическая плотность испытуемого раствора,

m – масса сырья, г,

248 – удельный показатель поглощения стандартного образца рутина при 409 нм,

W – потеря в массе при высушивании, %.

При изучении спектральных характеристик водно-спиртовых извлечений из листьев вахты трехлистной было установлено, что характер кривой поглощения определяет рутин. Определено, что при реакции водно-спиртового извлечения с алюминия хлорида раствором 5 % извлечений из листьев вахты трехлистной наблюдается батохромный сдвиг длинноволновой полосы флавоноидов в видимую область, как и в случае рутина (Фиг. 1,2), где кривая 1 на фигуре 1 демонстрирует раствор стандартного образца рутина без добавления алюминия хлорида раствора 5%, кривая 2 – раствор СО рутина с добавлением алюминия хлорида раствора 5%. На фигуре 2 кривая 2 обозначает раствор водно-спиртового извлечения из листьев вахты трехлистной в присутствии алюминия хлорида раствора 5%, а кривая 1 - раствор рутина в присутствии алюминия хлорида раствора 5%.

Изучение спектральных характеристик СО рутина и водно-спиртового извлечения из листьев вахты трехлистной показало, что в присутствии алюминия хлорида раствора 5% наблюдается максимум поглощения при длине волны 409 нм. И для раствора СО рутина и для извлечения из листьев вахты трехлистной. Данный факт позволяет проводить спектрофотометрическое определение суммы флавоноидов в листьях вахты трехлистной при аналитической длине волны 409 нм.

Таблица 1. Влияние условий экстрагирования на содержание суммы флавоноидов в листьях вахты трехлистной в пересчете на абсолютно сухое сырье и рутин.

Концентрация водно-спиртовых извлечений, % Соотношение «сырье : экстрагент» Время экстракции на кипящей водяной бане, мин. Измельченность, мм Содержание суммы флавноидов в пересчете на абс. сухое сырье и рутин вода 1:50 60 1 0,66±0,04 40% этиловый спирт 0,44±0,03 70% этиловый спирт 0,98±0,03 70% этиловый спирт 1:10 60 1 0,43±0,01 1:25 0,99±0,04 70% этиловый спирт 1:25 30 1 0,84±0,02 45 1,08±0,03 70% этиловый спирт 1:25 45 3 0,94±0,03 5 0,77±0,02

Далее нами было изучено влияние экстрагента на процесс экстракции. В таблице 1 представлена зависимость выхода суммы флавоноидов листьев вахты трехлистной от концентрации экстрагента. В результате эксперимента в качестве оптимального экстрагента нами был выбран 70% этиловый спирт, так как выход действующих веществ из сырья при его использовании максимален.

Далее нами был изучен вопрос относительно продолжительности экстракции на кипящей водяной бане, в таблице 1 представлена зависимость выхода суммы флавоноидов листьев вахты трехлистной от времени экстракции на кипящей водяной бане, при этом было выбрано время экстракции 45 минут.

В таблице 1 также представлена зависимость выхода суммы флавоноидов листьев вахты трехлистной от соотношения «сырье-экстрагент». Из таблицы 1 видно, что максимальный выход действующих веществ наблюдается при соотношении «сырье:экстрагент» 1:25, по этой причине данное соотношение было выбрано нами в качестве оптимального.

В таблице 1 также представлена зависимость выхода суммы флавоноидов листьев вахты трехлистной от степени измельченности сырья. Из таблицы 1 видно, что максимальный выход действующих веществ наблюдается при размере частиц 1 мм в связи с этим была выбрана данная степень измельчения.

Учитывая, что увеличение числа операций на стадии пробоподготовки ведет к возрастанию ошибки, выбор сделан в пользу одностадийного процесса экстракции с подтверждением требуемой точности количественного определения.

Таким образом, было определено, что оптимальными параметрами экстракции являются: однократное извлечение 70% этиловым спиртом на кипящей водяной бане в течение 45 минут в соотношении «сырье : экстрагент» - 1:25 и степенью измельчения частиц сырья 1 мм.

Принимая по внимание тот факт, что специфическим для листьев вахты трехлистной является рутин, а максимумы поглощения раствора рутина и водно-спиртового извлечения листьев вахты трехлистной находятся в области 409 нм, целесообразным является определение содержания суммы флавоноидов в пересчете на рутин при длине волны 409 нм.

Способ реализуется следующим образом.

Аналитическую пробу листьев вахты трехлистной измельчают до величины частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями размером 1 мм. Около 1,0 г (точная навеска) измельченной пробы помещают в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляют 25 мл 70 % этилового спирта. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 45 мин. После охлаждения до комнатной температуры содержимое колбы фильтруют через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 25 мл (испытуемый раствор А).

Испытуемый раствор Б готовят следующим образом: 2 мл полученного извлечения помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, добавляют 0,5 мл 30 % уксусной кислоты раствора, 2 мл 5% спиртового раствора алюминия хлорида и доводят объем раствора до метки 96% этиловым спиртом (испытуемый раствор Б).

Раствор сравнения готовят следующим образом: 2 мл полученного извлечения помещают в мерную колбу на 50 мл, доводят объем раствора до метки 96% этиловым спиртом (раствор сравнения).

Для расчета содержания суммы флавоноидов готовят раствор стандартного образца (СО) рутина, добавляют к нему 5% спиртовой раствор алюминия хлорида, измеряют оптическую плотность окрашенного комплекса при аналитической длине волны 409 нм и определенное значение оптической плотности используют в формуле расчета.

Приготовление раствора СО рутина: около 0,05 г (точная навеска) СО рутина, предварительно высушенного до постоянной массы при температуре 130 – 135 °С, помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в 85 мл спирта 96 % при нагревании на водяной бане, охлаждают, доводят объем спиртом 96 % до метки и перемешивают (раствор А СО рутина). Срок годности раствора 30 сут.

1,0 мл раствора А СО рутина помещают в мерную колбу на 25 мл, прибавляют 0,5 мл уксусной кислоты раствора 30 %, 1 мл алюминия хлорида раствора 5 % и доводят до метки спиртом 96 % и перемешивают (раствор Б СО рутина). Измерение оптической плотности проводят при длине волны 409 нм через 30 минут после приготовления всех растворов.

Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырье рассчитывают по формуле:

где х - содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин, %;

D - оптическая плотность испытуемого раствора;

Do - оптическая плотность раствора СО рутина;

m - масса сырья, г;

mo - масса СО рутина, г;

W - потеря в массе при высушивании, %.

В случае отсутствия стандартного образца рутина целесообразно использовать теоретическое значение его удельного показателя поглощения, равное 248:

где х - содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин, %;

D - оптическая плотность испытуемого раствора;

m - масса сырья, г;

248 - удельный показатель поглощения стандартного образца рутина при 409 нм;

W - потеря в массе при высушивании, %.

Примеры осуществления представлены ниже.

Пример 1.

Разработка способа количественного определения суммы флавоноидов проводилась с использованием оборудования Томского регионального центра коллективного пользования ТГУ (ТРЦКП). Аналитическую пробу воздушно-сухого сырья вахты трехлистной (образец собран в Томской области, окрестности села Тимирязевское в 2021 году) измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм. Около 1 г точной навески измельченного сырья помещают в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляют 25 мл 70% этилового спирта. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане (умеренное кипение) в течение 45 минут. После охлаждения до комнатной температуры содержимое колбы фильтруют через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 25 мл (испытуемый раствор А).

Испытуемый раствор Б готовят следующим образом: 2 мл полученного извлечения помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, добавляют 0,5 мл 30 % уксусной кислоты раствора, 2 мл спиртового раствора алюминия хлорида 5% и доводят объем раствора до метки 96% этиловым спиртом (испытуемый раствор Б).

Раствор сравнения готовят следующим образом: 2 мл полученного извлечения помещают в мерную колбу на 50 мл, доводят объем раствора до метки 96% этиловым спиртом (раствор сравнения).

Для расчета содержания суммы флавоноидов готовят раствор стандартного образца рутина, добавляют к нему 5% спиртовой раствор алюминия хлорида, измеряют оптическую плотность окрашенного комплекса при аналитической длине волны 409 нм и определенное значение оптической плотности используют в формуле расчета.

Приготовление раствора СО рутина: около 0,05 г (точная навеска) СО рутина, предварительно высушенного до постоянной массы при температуре 130 – 135 °С, помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в 85 мл спирта 96 % при нагревании на водяной бане, охлаждают, доводят объем спиртом 96 % до метки и перемешивают (раствор А СО рутина). Срок годности раствора 30 сут.

2,0 мл раствора А СО рутина помещают в мерную колбу на 25 мл, прибавляют 0,5 мл уксусной кислоты раствора 30 %, 1 мл алюминия хлорида раствора 5 % и доводят до метки спиртом 96 % и перемешивают (раствор Б СО рутина).

Измерение оптической плотности проводят при длине волны 409 нм через 30 минут после приготовления всех растворов.

Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырье рассчитывают по формуле:

где 0,387 - оптическая плотность испытуемого раствора;

0,460 - оптическая плотность раствора СО рутина;

1,01 - масса сырья, г;

0,025 - масса СО рутина, г;

5,68 - потеря в массе при высушивании, %.

Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин равно 1,07%.

Пример 2.

В случае отсутствия стандартного образца рутина для определения суммы флавоноидов в листьях вахты трехлистной целесообразно использовать теоретическое значение его удельного показателя поглощения, равное 248. Для этого необходимо провести все действия из примера 1, кроме приготовления раствора СО рутина. После измерения оптической плотности извлечения из листьев вахты трехлистной при длине волны 409 нм, содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырье вычисляют по формуле, используя теоретическое значение удельного показателя поглощения рутина, равное 248:

0,387 - оптическая плотность испытуемого раствора;

1,01 - масса сырья, г;

248 - удельный показатель поглощения СО рутина при 409 нм;

5,68 - потеря в массе при высушивании, %.

Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин равно 1,02%, что совпадает со значением, полученном в примере 1.

Все результаты были статистически обработаны. Погрешность одного измерения составляла не более 5 %, что находится в пределах допустимой погрешности определения [6].

Таким образом, предлагаемый способ количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на рутин в водно-спиртовых извлечениях из листьев вахты трехлистной с использованием дифференциальной спектрофотометрии разработан впервые для данного вида сырья и обладает следующими преимуществами:

1. В основу положена цветная реакция флавоноидов с алюминия хлорида раствором с образованием в кислой среде устойчивых комплексов, которая является для флавоноидов специфичной.

2. Разработанный способ позволяет исключить длительную пробоподготовку, имеющуюся в прототипе, заключающуюся в обработке экстракта токсическим растворителем – хлороформом в аппарате Сокслета в течение 14 часов.

3. Разработанный метод позволяет проводить экстракцию флавоноидов из листьев вахты трехлистной однократно 70% этиловым спиртом, позволяющим исчерпывающе извлекать целевые вещества (флавоноиды).

4. Ошибка единичного определения предлагаемого способа составляет не более 5%, что свидетельствует об объективности разработанного способа.

Этот способ можно применять в центрах контроля качества лекарственных средств, на фармацевтических предприятиях и контрольно-аналитических лабораториях при проведении количественного анализа листьев вахты трехлистной.

Источники информации:

1. Вахты трехлистной листья. ФС.2.5.0065.18 // Государственная фармакопея Российской федерации [Электронный ресурс]: научное издание. 14-е изд. М.: Минздрав России, 2018. Том 4. 1294 с.: Режим доступа: http://www.femb.ru.

2. Куркин В.А. Фармакогнозия. Учебник для студентов фармацевтических вузов (факультетов). - 3-е изд., перераб. и доп.- Самара: ООО «Офорт»; ФГБОУ ВО СамГМУ Минздрава России, 2016. - 1279 с

3. Kowalczyk T., Sitarek P., Skała E., Monika Toma M., Wielanek M., Pytel D., Wieczfin´ska J., Szemraj J. Induction of apoptosis by in vitro and in vivo plant extracts derived from Menyanthes trifoliata L. in human cancer cells// Cytotechnology. 2019.№ 71. С. 165–180.

4. Ivanišová E., Krajčovič1 T, Tokár M., Dráb S. and all. Potential of Wild Plants as a Source of Bioactive Compounds.// Animal Science and Biotechnologies. 2017, № 50 (1). С 109-115.

5. Горца перечного трава. ФС.2.5.0067.18 // Государственная фармакопея Российской федерации [Электронный ресурс]: научное издание. 14-е изд. М.: Минздрав России, 2018. Том 4. 1294 с.: Режим доступа: http://www.femb.ru.

6. Валидация аналитических методик. ОФС.1.1.0012.15 // Государственная фармакопея Российской федерации [Электронный ресурс]: научное издание. 14-е изд. М.: Минздрав России, 2018. Том 1. 1294 с.: Режим доступа: http://www.femb.ru.

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, а именно к способу количественного определения суммы флавоноидов в листьях вахты трехлистной. Способ заключается в измельчении листьев вахты трехлистной до размера частиц 1 мм с последующим получением водно-спиртового извлечения однократной экстракцией 1 г точной навески измельченных листьев вахты трехлистной 70%-ным этиловым спиртом в течение 45 мин, при соотношении сырье:экстрагент 1:25, с последующей пробоподготовкой и определением оптической плотности методом дифференциальной спектрофотометрии с использованием стандартного образца рутина, а при его отсутствии - с использованием теоретического удельного показателя поглощения, проведением количественного определения суммы флавоноидов в листьях вахты трехлистной с использованием цветной реакции с алюминия хлорида раствором 5%, при длине волны 409 нм в пересчете на рутин и содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырье рассчитывают по формуле:

где х – содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин, %; D – оптическая плотность испытуемого раствора; Do – оптическая плотность раствора стандартного образца рутина; m – масса сырья, г; mo – масса стандартного образца рутина, г; W – потеря в массе при высушивании, %; в случае отсутствия стандартного образца рутина целесообразно использовать теоретическое значение его удельного показателя поглощения, равное 248:

где х – содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин, %; D – оптическая плотность испытуемого раствора; m – масса сырья, г; 248 – удельный показатель поглощения стандартного образца рутина при 409 нм; W – потеря в массе при высушивании, %. Вышеописанный способ позволяет количественно определять сумму флавоноидов в пересчете на рутин в водно-спиртовых извлечениях из листьев вахты трехлистной с использованием дифференциальной спектрофотометрии. 2 ил., 1 табл., 1 пр.

Способ количественного определения суммы флавоноидов в листьях вахты трехлистной, включающий измельчение листьев вахты трехлистной до размера частиц 1 мм с последующим получением водно-спиртового извлечения однократной экстракцией 1 г точной навески измельченных листьев вахты трехлистной 70%-ным этиловым спиртом в течение 45 мин, при соотношении сырье:экстрагент 1:25, с последующей пробоподготовкой и определением оптической плотности методом дифференциальной спектрофотометрии с использованием стандартного образца рутина, а при его отсутствии - с использованием теоретического удельного показателя поглощения, проведением количественного определения суммы флавоноидов в листьях вахты трехлистной с использованием цветной реакции с алюминия хлорида раствором 5%, при длине волны 409 нм в пересчете на рутин и содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырье рассчитывают по формуле:

где х – содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин, %,

D – оптическая плотность испытуемого раствора,

Do – оптическая плотность раствора стандартного образца рутина,

m – масса сырья, г,

mo – масса стандартного образца рутина, г,

W – потеря в массе при высушивании, %;

в случае отсутствия стандартного образца рутина целесообразно использовать теоретическое значение его удельного показателя поглощения, равное 248:

где х – содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин, %,

D – оптическая плотность испытуемого раствора,

m – масса сырья, г,

248 – удельный показатель поглощения стандартного образца рутина при 409 нм,

W – потеря в массе при высушивании, %.