СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КЛЕТОЧНОГО ПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ АКТИВИРОВАННЫХ ЛИМФОЦИТОВ ИЗ ЛЕЙКОЦИТАРНЫХ ФИЛЬТРОВ Российский патент 2025 года по МПК A61K38/20 C12N5/781 C12N5/783 

Изобретение относится к области медицины - к клеточной биологии, а именно к биотехнологии, и может применяться для активации лимфоцитов человека (Т-, TNK- и NK-клеток), полученных из лейкоцитарных фильтров, конкретно для создания клеточных препаратов - цитокин индуцированных киллерных клеток (ЦИК) в масштабном производстве для терапии рака.

В последнее время активно применяются методы иммунокоррекции, основанные на введении в организм онкологическим больным аутологичных лейкоцитов, предварительно активированных различными иммуномодуляторами в условиях in vitro [Гельм Ю.В., Абакушина Е.В., Пасова И.А., Гривцова Л.Ю. Разработка подходов к клеточной иммунотерапии онкологических больных // Медицинская иммунология, 2021. Т. 23, №2. С. 381-388]. Показана хорошая переносимость иммунотерапии лимфоцитами, активированными in vitro с помощью IL-2 и IL-15 [Гельм Ю.В., Кузьмина Е.Г., Абакушина Е.В. Функциональная активность лимфоцитов здоровых доноров и онкологических больных при культивировании в присутствии ИЛ-2 и ИЛ-15 // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2019 г. Т. 167, №4. С. 471-477]. Адоптивная иммунотерапия является не только безопасным, но и эффективным методом сопроводительной терапии, так как она позволяет увеличить продолжительность безрецидивного периода, уменьшить количество побочных эффектов химиотерапии и улучшить результаты комплексного лечения онкологических пациентов. Поэтому является актуальным разработка новых способов получения больших доз лимфоцитов и их активация.

Широко распространенным методом лейкодеплеции трансфузионных сред является их фильтрация через лейкоцитарные фильтры. Лейкодеплеция может производиться как на этапе производства путем пропускания цельной крови или отдельных ее компонентов через «производственные» лейкоцитарные фильтры, так и на этапе гемотрансфузии с использованием «госпитальных» лейкоцитарных фильтров. Таким образом, основная роль лейкоцитарного фильтра заключается в удалении лейкоцитов из плазмы. Далее лейкоцитарные фильтры подлежат утилизации, однако могут быть использованы для извлечения лимфоцитов и последующего их применения. В среднем из 1 мл крови донора можно выделить до 3 млн. лимфоцитов. Один фильтр после использования может содержать несколько сотен млн. лимфоцитов, что дает основание применять их, а не утилизировать сразу после использования, и т.к. система является закрытой и стерильной, вероятность контаминации сводится к нулю.

Известно множество способов получения клеточных препаратов, основанных на лимфоцитах доноров (RU 2201762, RU 2414915, RU 2402338). В известных патентах описано получение активированных цитотоксических клеток in vitro с помощью различных сред и компонентов - у каждого изобретения своя исключительная методика. Во всех способах источником лимфоцитов служит периферическая кровь человека в разном объеме.

Общим недостатком известных способов является необходимость дополнительных заборов крови для получения большого количества клеточной массы и поиск доноров, что затрудняет возможность осуществления крупномасштабного производства.

Известен способ дифференцировки моноцитов от аллогенных доноров (RU 2668816). Получают неистощенные незрелые дендритные клетки (ДК), происходящих из нескольких аллогенных доноров, с их последующей активацией и получением провоспалительных ДК. Способ включает выделение лейкоцитов из лейкоцитарных фильтров методом трехкратного промывания буфером ФБР/ЭДТА обратным потоком с помощью 50 миллилитрового шприца. Изобретение позволяет получить провоспалительные ДК для терапии рака

Недостатками способа является применение методики только для получения ДК, и не предусматривает получение активированных цитотоксических Т-лимфоцитов, TNK- и NK-клеток, играющих огромную роль в получении противоопухолевых клеточных препаратов. Использование шприца для промывания лейкоцитарного фильтра является недостаточно удобным способом, т.к. необходимо каждый раз извлекать шприц из трубки фильтра и заново наполнять его промывающим раствором или применять несколько шприцев.

Известен способ активации цитотоксических лимфоцитов человека (RU 2603079) и способ лечения онкологических больных цитотоксическими лимфоцитами (RU 2596505). Оба способа выбраны в качестве прототипа как наиболее близкие к предлагаемому техническому решению. В них описано, как МНК выделяют из крови человека, культивируют в бессывороточной среде, дополненной рч IL-2 (125-500 нг/мл) и IL-15 (2,5-5 нг/мл). Культивирование клеток предусматривается на протяжении 10-14 или 9 суток соответственно. Полученные данными способами цитотоксические лимфоциты обладают повышенной жизнеспособностью, пролиферативной активностью и функциональной противоопухолевой активностью.

Общим недостатком изобретений является необходимость дополнительных заборов крови для получения большого количества клеточной массы и поиск доноров, что затрудняет возможность осуществления крупномасштабного производства.

Техническим решением является получение больших доз - более 300 млн. клеток за раз - с одного фильтра после активации активированных лимфоцитов (HLA-DR+): Т-цитотоксических клеток (CD3+CD8+) и NKT-клеток (CD3+CD16+CD56+) с высокой жизнеспособностью (>96%), а также получение супернатантов, содержащих высокие дозы цитокинов продуцируемых лимфоцитами в процессе активации in vitro: IL-2 >250 МЕ/мл, IL-6 >30 МЕ/мл, IL-10 >180 МЕ/мл, IFN-γ >550 МЕ/мл, TNF-α >100 МЕ/мл.

Указанные технические результаты при осуществлении изобретения достигаются за счет того, что так же как в известном способе лимфоциты, выделенные на градиенте фиколла плотностью 1,077 г/см³, активируют в культуральных флаконах или планшетах в питательной среде, содержащей рекомбинантный человеческий интерлейкин-2, интерлейкин-15, альбумин, пируват натрия, гентамицин, L-глутамин, на протяжении 10-14 дней в условиях CO2-инкубатора, затем активированные цитотоксические лимфоциты ресуспендируют в супернатанте и вводят внутрикожно паравертебрально в 2-8 точек онкологическому больному начиная с 3 дня активации, далее каждые 48 часов обновляют половину объема питательной среды, а клеточный продукт распределяют в ампулы объемом 1,3-2 мл и хранят в морозильной камере для последующего использования в амбулаторном лечении.

Особенность заявляемого способа заключается в том, что лимфоциты донора получают из лейкоцитарных фильтров, путем обратной промывки с помощью изотонического раствора натрия хлорида и медицинской капельной системы, при этом с одного фильтра получают 180-350 млн активированных лимфоцитов (HLA-DR+): Т-цитотоксических клеток (CD3+CD8+) и NKT-клеток (CD3+CD16+CD56+) с высокой жизнеспособностью >96%. После культивирования лимфоцитов, выделенных из лейкоцитарных фильтров получают супернатанты, содержащие высокие дозы цитокинов продуцируемых лимфоцитами, в процессе активации in vitro: IL-2 >250 МЕ/мл, IL-6 >30 МЕ/мл, IL-10 >180 МЕ/мл, IFN-γ >550 МЕ/мл, TNF-α >100 МЕ/мл.

Сущность изобретения заключается в следующем: лейкоциты донора получают из лейкоцитарных фильтров, путем промывания через медицинскую капельную систему изотоническим раствором натрия хлорида обратным потоком в стерильную пробирку. Элюированные лимфоциты выделяют на градиенте фиколла плотностью 1,077 г/см³. Полученные лимфоциты активируют в культуральных флаконах или планшетах в питательной среде, содержащей рекомбинантный человеческий интерлейкин-2, интерлейкин-15, альбумин, пируват натрия, гентамицин, L-глутамин, на протяжении 10-14 дней в условиях CO2-инкубатора. Затем активированные цитотоксические лимфоциты ресуспендируют в супернатанте и вводят внутрикожно паравертебрально в 2-8 точек онкологическому больному начиная с 3 дня активации, каждые 48 часов обновляют половину объема питательной среды, а клеточный продукт распределяют в ампулах объемом 1,3-2 мл и хранят в морозильной камере для последующего использования в амбулаторном лечении. Применение фильтров позволяет получить большие дозы активированных лимфоцитов (за раз - с одного фильтра получают 180-350 млн.) с уровнем жизнеспособности >96%, а также получение супернатантов, содержащих высокие дозы цитокинов: IL-2, IL-6, IL-10, IFN-γ, TNF-α.

Способ поясняется подробным описанием, клиническими примерами и иллюстрациями, на которых изображено:

Фиг. 1. - Отработанный лейкоцитарный фильтр: а) до элюирования лейкоцитов, с запаянными трубками; б) после элюирования лейкоцитов -промывания раствором хлорида натрия.

Фиг. 2. - Процесс промывания фильтра - элюирование лейкоцитов донора.

Фиг. 3. - Процесс получения лимфоцитов донора из лейкоцитарных фильтров: а) интерфазное кольцо лимфоцитов после центрифугирования на фиколле; б) промывание лимфоцитов фосфатно-солевым буфером, после центрифугирования; в) подсчет клеток в камере Горяева; г - перенос клеток в культуральные флаконы для активации в полной питательной среде.

Фиг. 4. - График роста цитокинов в супернатантах на этапах культивирования лимфоцитов, значения представлены на графике в Пг/мл на 3 и 8 сутки активации.

Фиг. 5. - Фенотипическая картина лимфоцитов до и после культивирования, увеличение уровня активации.

Фиг. 6. - Адоптивная иммунотерапия активированными лимфоцитами, полученными из лейкоцитарных фильтров: а) введение пациенту препарата, полученного из лейкоцитарных фильтров; б) местная реакция на введение препарата.

Способ осуществляют следующим образом.

По завершении забора донорской крови на донорском пункте и сепарации плазмы и клеточной части в закрытом контуре лейкоцитарные фильтры с оставшимися на них лейкоцитами изымаются, запаиваются в стерильных условиях, помещаются в стерильные крафт пакеты и доставляются в лабораторию в течение 30 минут. В лаборатории в стерильных условиях (в биокабинете биологической безопасности класса IIA) проводят процедуру извлечения лейкоцитов с фильтра.

От фильтра стерильными ножницами отрезают запаянные трубки и подсоединяют медицинскую капельную систему с изотоническим раствором натрия хлорида в объеме 150-250 мл.

Элюированные аллогенные лейкоциты собирают в стерильные пробирки объемом 50 мл (в которые предварительно добавляют 50 мкл гепарина) путем сильного сжатия флакона с изотоническим раствором натрия хлорида и вымывания раствора с клетками через фильтр по капельной системе.

Для выделения лимфоцитов, элюированные лейкоциты с раствором натрия хлорида, наслаивают на градиент фиколла-1077 плотностью 1,077 г/см3 и центрифугируют при 2000 об/мин в течение 40 мин, что приводит к оседанию эритроцитов и гранулоцитов на дно пробирки. В результате центрифугирования лимфоциты образуют интерфазное кольцо, которое собирают пипеткой и двукратно отмывают центрифугированием с помощью фосфатно-солевого буфера при 1500 об/мин 10 мин.

Выделенные лимфоциты подсчитывают, ресуспендируют в концентрации 1,5-2×10⁶ кл/мл в приготовленной питательной среде, содержащей рекомбинантный человеческий альбумин, пируват натрия, гентамицин, L-глутамин с добавлением от 125 до 500 МЕ/мл (нг/мл) человеческого рекомбинантного IL-2 (ронколейкин, Биотех, Россия) и от 2,5 до 5 нг/мл человеческого рекомбинантного IL-15 и помещают в пластиковые флаконы с вентилируемой крышкой или культуральные планшеты в СО2-инкубатор при 37°C. На 3 день культивирования получают активированные цитотоксические лимфоциты. В качестве питательной среды могут быть использованы X-vivo 20, RPMI-1640 или DMEM.

Ежедневно проводят морфологическую оценку культуры лимфоцитов и визуальную оценку питательной среды на отсутствие патогенной микрофлоры. Для поддержания жизнеспособности активированных цитотоксических лимфоцитов на протяжении 10-14 дней через каждые 48 часов обновляют половину объема среды. На этапах культивирования определяют концентрацию цитокинов в питательной среде, фенотип и маркеры активации цитотоксических лимфоцитов оценивают их жизнеспособность и пролиферативную активность.

Представляем этапы реализации способа, выполненные по группе фильтров (n=15).

Элюирование аллогенных лимфоцитов.

Лейкоцитарные фильтры предоставлялись отделением трансфузиологии после удаления лейкоцитов из цельной крови проверенных доноров. Кровь доноров проверяется на ВИЧ, Сифилис и Гепатиты В и С, Группу крови, Rh, общий анализ с лейкоцитарной формулой, биохимический анализ: билирубин общий, АЛТ. Данный набор анализов является стандартом проверки донорской крови, и проводится каждому поступающему в отделение донору. У отработанного лейкоцитарного фильтра запаивали выходные трубки (Фиг. 1 а) и помещали его в стерильный пакет, после чего максимально быстро при комнатной температуре доставляли в лабораторию. Во избежание снижения жизнеспособности клеток, не допускается замораживание и транспортировка фильтра на льду, извлечение клеток из фильтра необходимо проводить в течение 30 минут после получения отработанного фильтра при комнатной температуре.

Далее фильтр извлекали из пакета, дополнительно обрабатывали антисептическим средством и помещали в стерильный бокс. От фильтра отрезали стерильными ножницами запаянные концы трубки и подсоединяли медицинскую капельную систему с изотоническим раствором натрия хлорида в объеме 150-250 мл, предварительно прогретого до комнатной температуры (Фиг. 2). Далее путем сильного сжатия флакона с изотоническим раствором натрия хлорида через капельную систему жидкость под напором попадала в фильтр по направлению: «против стрелки» и вымывала аллогенные лейкоциты из фильтра, которые в тоже время собирали в стерильные пробирки объемом 50 мл, в которые предварительно добавлен гепарин 50 мкл (Фиг. 2, Фиг. 1 б).

Чтобы избавиться от эритроцитов, гранулоцитов и прочих элементов крови, а именно выделить лимфоциты, собранную в 50 мл пробирки клеточную массу, разбавленную раствором натрия хлорида, наслаивали на градиент фиколла-1077 плотностью 1,077 г/см3 (10 мл на 2 мл фиколла в 15 мл пробирках) и центрифугировали при 2000 об/мин в течение 40 мин. Это приводило к оседанию эритроцитов и гранулоцитов на дно пробирки. В результате центрифугирования лимфоциты образовывали интерфазное кольцо (Фиг. 3 а), которое собирали пипеткой и двукратно отмывали центрифугированием фосфатно-солевым буфером при 1500 об/мин. по 10 мин. (Фиг. 3 б).

Культивирование аллогенных лимфоцитов.

Выделенные лимфоциты подсчитывали (Фиг. 3 в), ресуспендировали в концентрации 1,5-2×10⁶ кл/мл в приготовленной питательной среде, содержащей рекомбинантный человеческий альбумин, пируват натрия, гентамицин, L-глутамин с добавлением от 250 МЕ/мл (нг/мл) человеческого рекомбинантного IL-2 (ронколейкин, Биотех, Россия) и 5 нг/мл человеческого рекомбинантного IL-15 и помещали в пластиковые флаконы с вентилируемой крышкой (Фиг. 3 г) или культуральные планшеты в СО2-инкубатор при 37°C. На 3 день культивирования получали активированные цитотоксические лимфоциты. В качестве питательной среды изучали X-vivo 20, RPMI-1640 или DMEM.

Контроль морфологии и контаминации.

Контроль контаминации и морфологию клеток в культуре оценивали ежедневно при помощи инвертированного микроскопа Eclipse TS100 (например, Nikon, Япония). С 3-го дня культивирования некоторые лимфоциты адгезировали к пластику флакона или планшета, увеличивались в размерах, начинали пролиферировать. При культивировании 10-14 дней большинство клеток сохраняли морфологию больших гранулярных лимфоцитов. После 8-9 суток лимфоциты самопроизвольно начинали отлипать от пластика флакона или планшета, что указывало на завершение процесса активации клеток. В конце срока культивирования клетки полностью собирали, супернатант отбирали и передавали пробу в БАК-лабораторию на контроль стерильности (отсутствия бактерий и грибов). Все изучаемые образцы были стерильны.

Оценка жизнеспособности и пролиферации клеток.

Подсчет лимфоцитов проводили с помощью камеры Горяева при каждом пересаживании клеток и обновления питательной среды. Для определения жизнеспособности культивируемых клеток использовали 0,1% краситель трипановый синий (Bio-Rad, Великобритания). Жизнеспособность культивируемых клеток до 14 дня культивирования составляля более 96%.

Пролиферативную активность лимфоцитов оценивали на 10-14 день культивирования. Количество клеток к окончанию активации увеличивалось в 1,5-2 раза. Таким образом, из одного лейкоцитарного фильтра удалось выделить 120-200 млн. лимфоцитов, а после культивирования 10-14 суток удавалось получить до 320 млн. активированных лимфоцитов. Активация клеток подтверждалась с помощью методов: ИФА и проточной цитометрии.

Иммуноферментный анализ (ИФА) супернатантов.

В супернатантах на этапах культивирования после 3 дня активации, измеряли концентрации цитокинов: IL-2, -4, -6, -10, IFN-γ и TNF-α для определения функциональной активности клеток. ИФА проводили с помощью реагентов (Вектор Бест, Россия). Оптическую плотность образцов измеряли на фотометре «ChroMate» (Awareness Technology, США) в рекомендуемом двухволновом режиме: основной фильтр-450 нм, референс-фильтр-620 нм.

Заключение.

Элюированные с фильтров лимфоциты в процессе активации in vitro продуцируют в среду достаточно высокие уровни цитокинов. Супернатанты содержали: IL-2 в среднем >250 МЕ/мл, IL-6 >30 МЕ/мл, IL-10 >180 МЕ/мл, IFN-γ >550 МЕ/мл, TNF-α >100 МЕ/мл (Фиг. 4) и применялись для адоптивной иммунотерапии, как бесклеточный препарат.

Проточная цитометрия.

Субпопуляционный состав суспензионных лимфоцитов и экспрессию маркеров активации определяли до и после окончания культивирования лимфоцитов. Оценивали субпопуляционный состав Т-, NK-, NKT-лимфоцитов (CD3, CD4, CD8, CD14, CD16, CD45, CD56) и маркеры активации на них (CD38 и HLA-DR). Для фенотипирования лимфоциты отмывали фосфатно солевым буфером методом центрифугирования и окрашивали конъюгированными с РЕ или FITC антителами к CD3, CD4, CD8, CD16, CD20, HLA-DR, CD38, CD56 (Beckman Coulter, Франция). Фенотипирование флуоресцентно меченых клеток проводили на цитофлуориметре FACScanto II (Becton Dickinson, США). Анализировали не менее 5000 событий в секторе живых клеток-мишеней. Прослеживалось нарастание экспрессии активационных рецепторов у элюированных с фильтров лимфоцитов после культивирования в полной питательной среде с цитокинами. В культуре лимфоцитов больший прирост и активация наблюдаются у цитотоксических Т-лимфоцитов и TNK-клеток, которые и применялись для адоптивной иммунотерапии. На протяжении всего времени наблюдения лимфоциты хорошо активировались и пролиферировали in vitro с сохранением высокой жизнеспособности (более 96%).

Таким образом, полученный препарат с живыми клетками состоит из Т-клеток (CD3+CD45+), Т-хелперов (CD3+CD4+), Т-цитотоксических (CD3+CD8+), NKT-клеток (CD3+CD16+, CD3+CD56+, CD3+CD16+CD56+), NK-клеток (CD3-CD16+, CD3-CD56+, CD3-CD16+CD56+), содержащих маркеры активации на лимфоцитах: HLA-DR+, CD38+ (Фиг. 5). Популяции Т-, NK-, NKT- клеток являются преобладающими (более 90% от всех клеток препарата).

Проведение иммунотерапии препаратом, полученным из лейкоцитарных фильтров.

Для проведения адоптивной иммунотерапии онкологическим больным начиная с 3 суток, активированные лимфоциты, выделенные из лейкоцитарных фильтров, собирали в количестве 5-10 млн. клеток, ресуспендировали в супернатанте объемом от 1,3 до 2,0 мл, и отдельно собирали супернатант в объеме от 1,3 до 2,0. Препарат вводили пациенту внутрикожно паравертебрально в 2-8 точек и отслеживали местную реакцию (Фиг. 6 а). Курс состоял из 10 таких инъекций клеточного и бесклеточного препарата. Из одного фильтра получали 180-350 млн активированных лимфоцитов и аликвоты с супернатантами, данное количество клеточного и бесклеточного препарата достаточно для проведения адоптивной иммунотерапии курсами 3-7 онкологическим больным, что способствует проведению иммунотерапии в более масштабных объемах.

Конкретный пример выполнения.

Элюирование аллогенных лимфоцитов.

Лейкоцитарные фильтры предоставлялись отделением трансфузиологии после удаления лейкоцитов из цельной крови проверенных доноров. Кровь доноров проверяется на ВИЧ, Сифилис и Гепатиты В и С, Группу крови, Rh, общий анализ с лейкоцитарной формулой, биохимический анализ: билирубин общий, АЛТ. Данный набор анализов является стандартом проверки донорской крови, и проводится каждому поступающему в отделение донору. У отработанного лейкоцитарного фильтра запаивали выходные трубки (Фиг. 1 а) и помещали его в стерильный пакет, после чего максимально быстро при комнатной температуре доставляли в лабораторию. Во избежание снижения жизнеспособности клеток, не допускается замораживание и транспортировка фильтра на льду, извлечение клеток из фильтра необходимо проводить в течение 30 минут после получения отработанного фильтра при комнатной температуре.

Далее фильтр извлекали из пакета, дополнительно обрабатывали антисептическим средством и помещали в стерильный бокс. От фильтра отрезали стерильными ножницами запаянные концы трубки и подсоединяли медицинскую капельную систему с изотоническим раствором натрия хлорида в объеме 100 мл, предварительно прогретого до комнатной температуры (Фиг. 2). Далее путем сильного сжатия флакона с изотоническим раствором натрия хлорида через капельную систему жидкость под напором попадала в фильтр по направлению: «против стрелки» и вымывала аллогенные лейкоциты из фильтра, которые в тоже время собирали в стерильные пробирки объемом 50 мл, в которые предварительно добавлен гепарин 50 мкл (Фиг. 2, Фиг. 1 б).

Чтобы избавиться от эритроцитов, гранулоцитов и прочих элементов крови, а именно выделить лимфоциты, собранную в 50 мл пробирки клеточную массу, разбавленную раствором натрия хлорида, наслаивали на градиент фиколла-1077 плотностью 1,077 г/см3 (10 мл на 2 мл фиколла в 15 мл пробирках) и центрифугировали при 2000 об/мин в течение 40 мин. Это приводило к оседанию эритроцитов и гранулоцитов на дно пробирки. В результате центрифугирования лимфоциты образовывали интерфазное кольцо (Фиг. 3 а), которое собирали пипеткой и двукратно отмывали центрифугированием фосфатно-солевым буфером при 1500 об/мин. по 10 мин. (Фиг. 3 б).

Культивирование аллогенных лимфоцитов.

Выделенные лимфоциты подсчитывали (Фиг. 3 в), ресуспендировали в концентрации 1,5-2×10⁶ кл/мл в приготовленной питательной среде, содержащей рекомбинантный человеческий альбумин, пируват натрия, гентамицин, L-глутамин с добавлением от 250 МЕ/мл (нг/мл) человеческого рекомбинантного IL-2 (ронколейкин, Биотех, Россия) и 5 нг/мл человеческого рекомбинантного IL-15 и помещали в пластиковые флаконы с вентилируемой крышкой (Фиг. 3 г) или культуральные планшеты в СО2-инкубатор при 37°C. На 3 день культивирования получали активированные цитотоксические лимфоциты. В качестве питательной среды изучали X-vivo 20, RPMI-1640 или DMEM.

Контроль морфологии и контаминации.

Контроль контаминации и морфологию клеток в культуре оценивали ежедневно при помощи инвертированного микроскопа Eclipse TS100 (например, Nikon, Япония). С 3-го дня культивирования некоторые лимфоциты адгезировали к пластику флакона или планшета, увеличивались в размерах, начинали пролиферировать. При культивировании 12 дней большинство клеток сохраняли морфологию больших гранулярных лимфоцитов. После 8 суток лимфоциты самопроизвольно начинали отлипать от пластика флакона или планшета, что указывало на завершение процесса активации клеток. В конце срока культивирования клетки полностью собирали, супернатант отбирали и передавали пробу в БАК-лабораторию на контроль стерильности (отсутствия бактерий и грибов). Все изучаемые образцы были стерильны.

Оценка жизнеспособности и пролиферации клеток.

Подсчет лимфоцитов проводили с помощью камеры Горяева при каждом пересаживании клеток и обновления питательной среды. Для определения жизнеспособности культивируемых клеток использовали 0,1% краситель трипановый синий (Bio-Rad, Великобритания). Жизнеспособность культивируемых клеток до 14 дня культивирования составляля более 96%.

Пролиферативную активность лимфоцитов оценивали на 12 день культивирования. Количество клеток к окончанию активации увеличивалось в среднем в 1,8 раз Таким образом, из одного лейкоцитарного фильтра удалось выделить в среднем 160 млн. лимфоцитов, а после культивирования 12 суток удавалось получить до 320 млн. активированных лимфоцитов. Активация клеток подтверждалась с помощью методов: ИФА и проточной цитометрии.

Иммуноферментный анализ (ИФА) супернатантов.

В супернатантах на этапах культивирования после 3 дня активации, измеряли концентрации цитокинов: IL-2, -4, -6, -10, IFN-γ и TNF-α для определения функциональной активности клеток. ИФА проводили с помощью реагентов (Вектор Бест, Россия). Оптическую плотность образцов измеряли на фотометре «ChroMate» (Awareness Technology, США) в рекомендуемом двухволновом режиме: основной фильтр-450 нм, референс-фильтр-620 нм.

Заключение.

Элюированные с фильтров лимфоциты в процессе активации in vitro продуцируют в среду достаточно высокие уровни цитокинов. Супернатанты содержали: IL-2 в среднем >250 МЕ/мл, IL-6 >30 МЕ/мл, IL-10 >180 МЕ/мл, IFN-γ >550 МЕ/мл, TNF-α >100 МЕ/мл (Фиг. 4) и применялись для адоптивной иммунотерапии, как бесклеточный препарат.

Проточная цитометрия.

Субпопуляционный состав суспензионных лимфоцитов и экспрессию маркеров активации определяли до и после окончания культивирования лимфоцитов. Оценивали субпопуляционный состав Т-, NK-, NKT-лимфоцитов (CD3, CD4, CD8, CD14, CD16, CD45, CD56) и маркеры активации на них (CD38 и HLA-DR). Для фенотипирования лимфоциты отмывали фосфатно солевым буфером методом центрифугирования и окрашивали конъюгированными с РЕ или FITC антителами к CD3, CD4, CD8, CD16, CD20, HLA-DR, CD38, CD56 (Beckman Coulter, Франция). Фенотипирование флуоресцентно меченых клеток проводили на цитофлуориметре FACScanto II (Becton Dickinson, США). Анализировали не менее 5000 событий в секторе живых клеток-мишеней. Прослеживалось нарастание экспрессии активационных рецепторов у элюированных с фильтров лимфоцитов после культивирования в полной питательной среде с цитокинами. В культуре лимфоцитов больший прирост и активация наблюдаются у цитотоксических Т-лимфоцитов и TNK-клеток, которые и применялись для адоптивной иммунотерапии. На протяжении всего времени наблюдения лимфоциты хорошо активировались и пролиферировали in vitro с сохранением высокой жизнеспособности (более 96%).

Таким образом, полученный препарат с живыми клетками состоит из Т-клеток (CD3+CD45+), Т-хелперов (CD3+CD4+), Т-цитотоксических (CD3+CD8+), NKT-клеток (CD3+CD16+, CD3+CD56+, CD3+CD16+CD56+), NK-клеток (CD3-CD16+, CD3-CD56+, CD3-CD16+CD56+), содержащих маркеры активации на лимфоцитах: HLA-DR+, CD38+ (Фиг. 5). Популяции Т-, NK-, NKT- клеток являются преобладающими (более 90% от всех клеток препарата).

Проведение иммунотерапии препаратом, полученным из лейкоцитарных фильтров.

Для проведения адоптивной иммунотерапии онкологическим больным начиная с 3 суток, активированные лимфоциты, выделенные из лейкоцитарных фильтров, собирали в количестве 8 млн. клеток, ресуспендировали в супернатанте объемом 1,5 мл, и отдельно собирали супернатант в объеме от 1,5. Препарат вводили пациенту внутрикожно паравертебрально в 8 точек и отслеживали местную реакцию (Фиг. 6 а). Курс состоял из 10 таких инъекций клеточного и бесклеточного препарата. Из одного фильтра получали до 350 млн активированных лимфоцитов и аликвоты с супернатантами, данное количество клеточного и бесклеточного препарата достаточно для проведения адоптивной иммунотерапии курсами 3-7 онкологическим больным, что способствует проведению иммунотерапии в более масштабных объемах.

При использовании цитокин-активированных лимфоцитов полученных с лейкоцитарных фильтров мы наблюдали более отчетливые реакции гиперчувствительности немедленного типа, даже у пациентов со сниженным иммунологическим статусом (Фиг. 6 б).

Использование в клинической практике заявляемого способа позволяет достичь нескольких технических результатов:

- получение больших доз (более 300 млн. клеток за раз - с одного фильтра после активации) активированных лимфоцитов (HLA-DR+):

- Т-цитотоксических клеток (CD3+CD8+) и NKT-клеток (CD3+CD16+CD56+) с высокой жизнеспособностью (>96%),

- получение супернатантов, содержащих высокие дозы цитокинов продуцируемых лимфоцитами в процессе активации in vitro: IL-2 >250 МЕ/мл, IL-6 >30 МЕ/мл, IL-10 >180 МЕ/мл, IFN-γ >550 МЕ/мл, TNF-α >100 МЕ/мл.

Созданный клеточный препарат предназначен для проведения адоптивной иммунотерапии онкологическим больным в клинической практике. Использование заявляемого способа позволит производить аликвоты с клеточным препаратом в масштабном производстве.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу получения клеточного препарата на основе активированных лимфоцитов из лейкоцитарных фильтров. Способ включает выделение лимфоцитов на градиенте фиколла, активацию в культуральных флаконах или планшетах в питательной среде, ресуспендирование активированных цитотоксических лимфоцитов в супернатанте и введение внутрикожно паравертебрально с 3 дня активации, обновление половины объема питательной среды каждые 48 часов и распределение супернатантов в ампулы объемом 1,3-2 мл, хранение в морозильной камере для последующего использования в амбулаторном лечении. Способ позволяет получать большие дозы - более 300 млн клеток за раз - с одного фильтра после активации активированных лимфоцитов HLA-DR+: Т-цитотоксических клеток CD3+CD8+ и NKT- клеток CD3+CD16+CD56+ с высокой жизнеспособностью >96%, а также получать супернатанты, содержащие высокие дозы цитокинов, продуцируемых лимфоцитами в процессе активации in vitro: IL-2 >250 МЕ/мл, IL-6 >30 МЕ/мл, IL-10 >180 МЕ/мл, IFN-γ >550 МЕ/мл, TNF-α >100 МЕ/мл. 1 з.п. ф-лы, 6 ил., 1 пр.

1. Способ получения клеточного препарата на основе активированных лимфоцитов из лейкоцитарных фильтров, включающий выделение лимфоцитов на градиенте фиколла плотностью 1,077 г/см³; активацию в культуральных флаконах или планшетах в питательной среде, содержащей рекомбинантный человеческий интерлейкин-2, интерлейкин-15, альбумин, пируват натрия, гентамицин, L-глутамин, на протяжении 10-14 дней в условиях CO₂-инкубатора при 37°C; ресуспендирование активированных цитотоксических лимфоцитов в супернатанте и введение внутрикожно паравертебрально с 3 дня активации; обновление половины объема питательной среды каждые 48 часов и распределение супернатантов в ампулы объемом 1,3-2 мл, хранение в морозильной камере для последующего использования в амбулаторном лечении, отличающийся тем, что лимфоциты донора получают из лейкоцитарных фильтров путем обратной промывки с помощью изотонического раствора натрия хлорида и медицинской капельной системы, при этом с одного фильтра после культивирования получают 180-350 млн лимфоцитов с высокой жизнеспособностью >96%, содержащих маркеры активации: HLA-DR и CD38 и состоящих преимущественно из Т-цитотоксических клеток с фенотипом CD3+CD8+, Т-хелперов с фенотипом CD3+CD4+ и NKТ-клеток с фенотипом CD3+CD16+ и CD3+CD56+.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что после культивирования лимфоцитов, выделенных из лейкоцитарных фильтров, получают супернатанты, содержащие высокие дозы цитокинов, продуцируемых лимфоцитами, в процессе активации in vitro: IL-2 >250 МЕ/мл, IL-6 >30 МЕ/мл, IL-10 >180 МЕ/мл, IFN-γ >550 МЕ/мл, TNF-α >100 МЕ/мл.