Биорелевантная среда двенадцатиперстной кишки крупного рогатого скота натощак Российский патент 2023 года по МПК A61K35/413 A61K31/685 A61K33/08 A61K33/14 A61K33/42 

Изобретение относится к области аналитической химии и может быть использовано в медицинских, ветеринарных и других биологических исследованиях для оценки биодоступности препаратов, моделирования процессов их растворения и всасывания, а также для изучения особенностей процессов пищеварения крупного рогатого скота.

Известен состав для моделирования кишечного сока натощак, разработанный Дженнифер Дрессман (Dressman Jennifer, Institute of Pharmaceutical Technology, Johann Wolfgang Goethe University) и содержащий натрия таурохолат, лецитин, дигидрофосфат калия, хлорид калия, гидроксид натрия и воду деминерализованную (см. Е.А. Волкова, И.Е. Шохин, Г.В. Раменская, А.Ю. Савченко Биорелевантные среды растворения - современный инструмент для моделирования процессов растворения и всасывания ЛС. Биомедицина № 3, 2011, C. 135, табл. 2).

В качестве ближайшего аналога принята биорелевантная среда натощак, содержащая лецитин, дигидрофосфат калия, хлорид калия, гидроксид натрия и воду деминерализованную (см. Е.А. Волкова, И.Е. Шохин, Г.В. Раменская, А.Ю. Савченко Биорелевантные среды растворения - современный инструмент для моделирования процессов растворения и всасывания ЛС. Биомедицина № 3, 2011, C. 134, табл. 1).

Однако аналоги предназначены для моделирования кишечного сока человека in vitro, где на кинетику распада пищи влияют физиологические условия в пищеварительной системе, такие как механические силы, pH, температура и ферменты, наличие поверхностно-активных веществ пищи, а также свойства, такие как состав, массовая доля, текстура, структура и вязкость.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является разработка биорелевантной среды двенадцатиперстной кишки крупного рогатого скота натощак.

Технический результат, проявляющийся при решении поставленной задачи, выражается в имитации кишечного сока крупного рогатого скота in vitro натощак с высокой достоверностью.

Поставленная задача решается тем, что биорелевантная среда двенадцатиперстной кишки крупного рогатого скота натощак, содержащая лецитин, дигидрофосфат калия, хлорид калия, гидроксид натрия и воду деминерализованную, отличается тем, что дополнительно содержит желчь крупного рогатого скота при следующем соотношении компонентов на 1 л воды деминерализованной:

лецитин 0,75 мкмоль/л дигидрофосфат калия 3,9 г хлорид калия 7,7 г гидроксид натрия для обеспечения pH 7,0 желчь крупного рогатого скота 2 г/л вода деминерализованная 1 л

Сопоставительный анализ признаков заявляемого изобретения с признаками прототипа и аналогов свидетельствует о соответствии заявляемого решения критерию «новизна».

При этом отличительные признаки формулы изобретения обеспечивают решение следующих функциональных задач.

Признак «дополнительно содержит желчь крупного рогатого скота» позволяет с высокой достоверностью имитировать кишечный сок крупного рогатого скота натощак.

Признаки «при следующем соотношении компонентов на 1 л воды деминерализованной:

лецитин 0,75 мкмоль/л дигидрофосфат калия 3,9 г хлорид калия 7,7 г гидроксид натрия для обеспечения pH 7,0 желчь крупного рогатого скота 2 г/л вода деминерализованная 1 л»

описывают оптимальное соотношение компонентов.

Заявляемый состав готовят на стандартном оборудовании по стандартной технологии.

Лецитин, дигидрофосфат калия, хлорид калия, желчь крупного рогатого скота и воду деминерализованную в заданном соотношении смешивают в общей емкости при температуре 20-25°С, в конце при перемешивании вносят гидроксид натрия до достижения pH 7,0.

Авторы применяли заявляемую биорелевантную среду для определения содержания кормового микрокапсулированного витамина А (в форме ретинол ацетата).

Исследования проводили в несколько этапов на стандартном оборудовании.

1. Подготовка контрольного образца.

В мерную колбу объемом 100 мл вносят 20-25 мг аналитического или фармацевтического стандарта витамина А в форме ретинола ацетата, добавляют 50 мл изопропилового спирта и тщательно перемешивают содержимое до полного растворения указанного стандарта.

Полученный раствор доводят до метки изопропиловым спиртом, плотно закрывают пробкой и еще раз перемешивают.

Концентрация контрольного образца составляет приблизительно 0,250 мг/мл. Действительное значение концентрации витамина А в контрольном образце (), выраженное в мг/мл, вычисляют по формуле:

где - активность витамина А в исходном аналитическом или фармацевтическом стандарте;

- концентрация витамина А в исходном аналитическом или фармацевтическом стандарте, указанная в сертификате качества, %;

- масса навески аналитического или фармацевтического стандарта витамина А, взятая для приготовления контрольного образца, мг;

- объем колбы, использованной для приготовления контрольного образца, мл.

Срок годности контрольного образца составляет 14 дней в холодильнике.

2. Подготовка исследуемого образца включает 2 основные стадии.

2.1. Экспозиция кормового микрокапсулированного витамина А (в форме ретинол ацетата) в заявляемой биорелевантной среде при их соотношении 5,16 мг : 30 мл соответственно и постоянном перемешивании на биореакторе (например RTS-1) со скоростью 50 об/мин.

Параметры экспозиции витамина А в форме ретинол ацетата приведены в таблице 1.

Таблица 1 Параметры экспозиции витамина А в биорелевантных средах Тип биорелевантной среды Температура, °C Число оборотов, min^-¹ Частота измерения, min^-¹ Реверс период, сек Объем пробы, мл Длина волны, нм Продолжительность измерений, ч Двенадцатиперстная кишка крупного рогатого скота натощак 39 50 30 60 30 850 2-3

2.2 Приготовление исследуемого образца из раствора витамина А в заявляемой биорелевантной среде.

Аликвоту раствора витамина А в заявляемой биорелевантной среде объемом 5 мл переносят в коническую колбу вместимостью 100 мл и добавляют 10 мл раствора, для приготовления которого в химическом стакане растворяют 1 г аскорбиновой кислоты в 10 мл воды для анализа, после чего аккуратно перемешивают так, чтобы вся проба была смочена внесенным раствором, далее вносят 20 мл раствора, для приготовления которого в химическом стакане 2 г гидроксида калия растворяют в смеси, состоящей из 2 мл воды для анализа и 18 мл.

Содержимое колбы тщательно, но аккуратно перемешивают, соединяют с обратным холодильником и подвергают омылению в течение 30 минут на водяной бане при температуре 55-60°С.

После охлаждения реакционной смеси до 20°С к полученному гидролизату добавляют 10 мл дистиллированной воды для анализа, содержимое колбы перемешивают, переносят в делительную воронку вместимостью 100 мл и подвергают двукратной экстракции двумя порциями гексана по 10 мл, тщательно ополаскивая очередным объемом экстрагента колбу, в которой проводился гидролиз. Продолжительность каждой экстракции - не менее 1 минуты.

Гексановые экстракты отделяют, объединяют в круглодонной колбе и упаривают досуха. Полученный сухой остаток незамедлительно растворяют в 10 мл изопропилового спирта и выдерживают в течение 10 минут в темном месте.

3. Отбор проб одинакового объема у контрольного и исследуемого образцов, их перенос в хроматографическую виалу и ввод в хроматограф по отдельности.

4 Проведение высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Для разделения многокомпонентных смесей использовали жидкостный хроматограф высокого давления Shimadzu LC-20 Prominence HPLC (Shimadzu, Япония), оборудованный UV-VIS-детектором SPD-20A (Shimadzu, Япония) и обратнофазной колонкой Shodex. ODP2 HPG-4A (4.6 × 10 мм, размер частиц: 5 мкм; Shodex, Япония).

Термостатирование колонки проводили при 30°С. Постоянный расход элюента составлял 0,4 мл/мин. Был использован следующий градиент элюции (элюент А - деионизованная вода с добавлением 0,1 % муравьиной кислоты; элюент B - ацетонитрил с добавлением 0,1 % муравьиной кислоты): 0 мин - 70% B, 0,1-1 мин - 70-0% B, 1-4 мин - 0-70% B, 4-5 мин - стабилизация колонки при 70% B. Регистрация UV-VIS-детектором проводилась при длине волны 328 нм (для определения витамина А). Объем впрыска образца составлял 10 мкл.

Строят хроматограммы проб контрольного и исследуемого образцов.

5. Обработка результатов измерений.

Количественное определение содержания витамина А в образцах проводят путем соотнесения площади пика на хроматограмме пробы исследуемого образца с аналогичными параметрами пика на хроматограмме пробы контрольного образца.

Массовую концентрацию витамина А в исследуемом образце (), выраженную в мкг/мл, определяют по формуле

где - действительное значение концентрации витамина А в контрольном образце, мг/мл;

- площадь пика на хроматограмме пробы исследуемого образца;

- площадь пика на хроматограмме пробы контрольного образца.

Массовую долю витамина А в исследуемом образце (), выраженную в МЕ/г, определяют по формуле

где - массовая концентрация витамина А в исследуемом образце, мкг/ мл;

- суммарный объем гексана, используемого для экстракции (20 мл);

- объем изопропилового спирта, используемый для растворения сухого остатка (10 мл);

- масса навески исследуемого образца, г;

- объем аликвотной части гексанового экстракта, взятый для упаривания (1 мл);

- фактор пересчета в международные единицы.

Результат измерения массовой доли витамина А в образцах, выраженный в МЕ/г, представляют в виде:

( ± 0,01·δ·)

где - массовая доля витамина А в исследуемом образце, МЕ/г;

δ - относительная суммарная погрешность результатов измерений.

Режимные характеристики для подготовки образцов и результаты их исследований приведены в таблице 2.

Таблица 2

Режимные характеристики для подготовки образцов и результаты их исследований

№ примера Контрольный образец Исследуемый образец Тип исходного стандарта витамина А Концентрация витамина А (ретинол ацетата) в стандарте, мг/мл Тип биорелевантной среды для экспозиции Концентрация витамина А (ретинол ацетата) перед экспозицией в биорелевантной среде, мг/мл Длительность экспозиции, час Максимальная температура водяной бани, °С Массовая концентрация витамина А (ретинол ацетата) после экспозиции в биорелевантной среде, мкг/мл 1. Аналитический 0,23 Двенадцатиперстная кишка крупного рогатого скота 0,17 2,5 55 150,45 2. Фармацевтический 0,23 Двенадцатиперстная кишка крупного рогатого скота 0,17 2 58 145,31 3. Аналитический 0,23 Двенадцатиперстная кишка крупного рогатого скота 0,17 3 60 141,73

По данным таблицы 2 можно сделать вывод, что после экспозиции концентрация кормового микрокапсулированного витамина А (в форме ретинол ацетата) в условиях биорелевантной среды двенадцатиперстной кишки крупного рогатого скота произошло растворение защитной оболочки микрокапсул и выделение витамина в среду, что свидетельствует об имитации физиологических условий желудочно-кишечного тракта крупного рогатого скота и растворимости указанного препарата в данных условиях, аналогичное заключение можно сделать и при использовании известных биорелевантных сред.

Таким образом, заявляемый состав биорелевантной среды может быть использован для оценки биодоступности препаратов, моделирования процессов их растворения и всасывания, а также для изучения особенностей процессов пищеварения крупного рогатого скота.

Изобретение относится к области аналитической химии, в частности к биорелевантным средам двенадцатиперстной кишки крупного рогатого скота натощак. Заявленное изобретение представляет собой биорелевантную среду двенадцатиперстной кишки крупного рогатого скота натощак, содержащую лецитин, дигидрофосфат калия, хлорид калия, гидроксид натрия, желчь крупного рогатого скота и деминерализованную воду при следующем соотношении компонентов на 1 л воды деминерализованной: лецитин 0,75 мкмоль, дигидрофосфат калия 3,9 г, хлорид калия 7,7 г, гидроксид натрия для обеспечения pH 7,0, желчь крупного рогатого скота 2 г, вода деминерализованная 1 л. Вышеописанное изобретение обеспечивает имитацию кишечного сока крупного рогатого скота in vitro натощак с высокой достоверностью. 2 табл., 2 пр.

Биорелевантная среда двенадцатиперстной кишки крупного рогатого скота натощак, содержащая лецитин, дигидрофосфат калия, хлорид калия, гидроксид натрия и воду деминерализованную, отличающаяся тем, что дополнительно содержит желчь крупного рогатого скота при следующем соотношении компонентов на 1 л воды деминерализованной:

лецитин 0,75 мкмоль дигидрофосфат калия 3,9 г хлорид калия 7,7 г гидроксид натрия для обеспечения pH 7,0 желчь крупного рогатого скота 2 г вода деминерализованная 1 л