Биорелевантная среда двенадцатиперстной кишки свиньи натощак Российский патент 2023 года по МПК A61K35/413 A61K31/685 A61K33/08 A61K33/14 A61K33/42 

Изобретение относится к области аналитической химии и может быть использовано в медицинских, ветеринарных и других биологических исследованиях для оценки биодоступности препаратов, моделирования процессов их растворения и всасывания, а также для изучения особенностей процессов пищеварения свиньи.

Известен состав для моделирования кишечного сока натощак, разработанный Дженнифер Дрессман (Dressman Jennifer, Institute of Pharmaceutical Technology, Johann Wolfgang Goethe University) и содержащий натрия таурохолат, лецитин, дигидрофосфат калия, хлорид калия, гидроксид натрия и воду деминерализованную (см. Е.А. Волкова, И.Е. Шохин, Г.В. Раменская, А.Ю. Савченко Биорелевантные среды растворения – современный инструмент для моделирования процессов растворения и всасывания ЛС. Биомедицина № 3, 2011, C. 135, табл. 2).

В качестве ближайшего аналога принята биорелевантная среда натощак, содержащая лецитин, дигидрофосфат калия, хлорид калия, гидроксид натрия и воду деминерализованную (см. Е.А. Волкова, И.Е. Шохин, Г.В. Раменская, А.Ю. Савченко Биорелевантные среды растворения – современный инструмент для моделирования процессов растворения и всасывания ЛС. Биомедицина № 3, 2011, C. 134, табл. 1).

Однако аналоги предназначены для моделирования кишечного сока человека in vitro, где на кинетику распада пищи влияют физиологические условия в пищеварительной системе, такие как механические силы, pH, температура и ферменты, наличие поверхностно-активных веществ пищи, а также свойства, такие как состав, массовая доля, текстура, структура и вязкость.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является разработка биорелевантной среды двенадцатиперстной кишки свиньи натощак.

Технический результат, проявляющийся при решении поставленной задачи, выражается в имитации кишечного сока свиньи in vitro натощак с высокой достоверностью.

Поставленная задача решается тем, что биорелевантная среда двенадцатиперстной кишки свиньи натощак, содержащая лецитин, дигидрофосфат калия, хлорид калия, гидроксид натрия и воду деминерализованную, отличается тем, что дополнительно содержит желчь крупного рогатого скота при следующем соотношении компонентов на 1 л воды деминерализованной:

лецитин 0,75 мкМоль/л дигидрофосфат калия 3,9 г хлорид калия 7,7 г гидроксид натрия для обеспечения pH 6,5 желчь крупного рогатого скота 3 г/л вода деминерализованная 1 л

Сопоставительный анализ признаков заявляемого изобретения с признаками прототипа и аналогов свидетельствует о соответствии заявляемого решения критерию «новизна».

При этом отличительные признаки формулы изобретения обеспечивают решение следующих функциональных задач.

Признак «дополнительно содержит желчь крупного рогатого скота» позволяет с высокой достоверностью имитировать биорелевантную среду натощак.

Признаки «при следующем соотношении компонентов на 1 л воды деминерализованной:

лецитин 0,75 мкМоль/л дигидрофосфат калия 3,9 г хлорид калия 7,7 г гидроксид натрия для обеспечения pH 6,5 желчь крупного рогатого скота 3 г/л вода деминерализованная 1 л»

описывают оптимальное соотношение компонентов.

Заявляемый состав готовят на стандартном оборудовании по стандартной технологии.

Лецитин, дигидрофосфат калия, хлорид калия, желчь крупного рогатого скота и воду деминерализованную в заданном соотношении смешивают в общей емкости при температуре 20-25°С, в конце при перемешивании вносят гидроксид натрия до достижения pH 6,5.

Авторы применяли заявляемую биорелевантную среду для определения содержания кормового микрокапсулированного витамина А (в форме ретинол ацетата).

Исследования проводили в несколько этапов на стандартном оборудовании.

1. Подготовка контрольного образца.

В мерную колбу объемом 100 мл вносят 20-25 мг аналитического или фармацевтического стандарта витамина А в форме ретинола ацетата, добавляют 50 мл изопропилового спирта и тщательно перемешивают содержимое до полного растворения указанного стандарта.

Полученный раствор доводят до метки изопропиловым спиртом, плотно закрывают пробкой и еще раз перемешивают.

Концентрация контрольного образца составляет приблизительно 0,250 мг/мл. Действительное значение концентрации витамина А в контрольном образце выраженное в мг/мл, вычисляют по формуле:

где - активность витамина А в исходном аналитическом или фармацевтическом стандарте;

– концентрация витамина А в исходном аналитическом или фармацевтическом стандарте, указанная в сертификате качества, %;

– масса навески аналитического или фармацевтического стандарта витамина А, взятая для приготовления контрольного образца, мг;

– объем колбы, использованной для приготовления контрольного образца, мл.

Срок годности контрольного образца составляет 14 дней в холодильнике.

2. Подготовка исследуемого образца включает 2 основные стадии.

2.1. Экспозиция кормового микрокапсулированного витамина А (в форме ретинол ацетата) в заявляемой биорелевантной среде при их соотношении 5,16 мг : 30 мл соответственно и постоянном перемешивании на биореакторе (например RTS-1) со скоростью 50 об/мин.

Параметры экспозиции витамина А в форме ретинол ацетата приведены в таблице 1.

Таблица 1

Параметры экспозиции витамина А в биорелевантных средах

Тип биорелевантной среды Температура, °C Число оборотов, min^-¹ Частота измерения, min^-¹ Реверс период, сек Объем пробы, мл Длина волны, нм Продолжительность измерений, ч Двенадцатиперстная кишка свиньи натощак 40 50 30 60 30 850 2-3

2.2. Приготовление исследуемого образца из раствора витамина А в заявляемой биорелевантной среде.

Аликвоту раствора витамина А в заявляемой биорелевантной среде объемом 5 мл переносят в коническую колбу вместимостью 100 мл и добавляют 10 мл раствора, для приготовления которого в химическом стакане растворяют 1 г аскорбиновой кислоты в 10 мл воды для анализа, после чего аккуратно перемешивают так, чтобы вся проба была смочена внесенным раствором, далее вносят 20 мл раствора, для приготовления которого в химическом стакане 2 г гидроксида калия растворяют в смеси, состоящей из 2 мл воды для анализа и 18 мл.

Содержимое колбы тщательно, но аккуратно перемешивают, соединяют с обратным холодильником и подвергают омылению в течение 30 минут на водяной бане при температуре 55-60°С.

После охлаждения реакционной смеси до 20°С к полученному гидролизату добавляют 10 мл дистиллированной воды для анализа, содержимое колбы перемешивают, переносят в делительную воронку вместимостью 100 мл и подвергают двукратной экстракции двумя порциями гексана по 10 мл, тщательно ополаскивая очередным объемом экстрагента колбу, в которой проводился гидролиз. Продолжительность каждой экстракции – не менее 1 минуты.

Гексановые экстракты отделяют, объединяют в круглодонной колбе и упаривают досуха. Полученный сухой остаток незамедлительно растворяют в 10 мл изопропилового спирта и выдерживают в течение 10 минут в темном месте.

3. Отбор проб одинакового объема у контрольного и исследуемого образцов, их перенос в хроматографическую виалу и ввод в хроматограф по отдельности.

4. Проведение высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Для разделения многокомпонентных смесей использовали жидкостный хроматограф высокого давления Shimadzu LC–20 Prominence HPLC (Shimadzu, Япония), оборудованный UV-VIS-детектором SPD-20A (Shimadzu, Япония) и обратнофазной колонкой Shodex. ODP2 HPG-4A (4.6 × 10 мм, размер частиц: 5 мкм; Shodex, Япония).

Термостатирование колонки проводили при 30 °С. Постоянный расход элюента составлял 0,4 мл/мин. Был использован следующий градиент элюции (элюент А – деионизованная вода с добавлением 0,1 % муравьиной кислоты; элюент B – ацетонитрил с добавлением 0,1 % муравьиной кислоты): 0 мин – 70% B, 0,1–1 мин – 70–0% B, 1-4 мин – 0–70% B, 4-5 мин – стабилизация колонки при 70% B. Регистрация UV-VIS-детектором проводилась при длине волны 328 нм (для определения витамина А). Объем впрыска образца составлял 10 мкл.

Строят хроматограммы проб контрольного и исследуемого образцов.

5. Обработка результатов измерений.

Количественное определение содержания витамина А в образцах проводят путем соотнесения площади пика на хроматограмме пробы исследуемого образца с аналогичными параметрами пика на хроматограмме пробы контрольного образца.

Массовую концентрацию витамина А в исследуемом образце выраженную в мкг/мл, определяют по формуле

где – действительное значение концентрации витамина А в контрольном образце, мг/мл;

– площадь пика на хроматограмме пробы исследуемого образца;

– площадь пика на хроматограмме пробы контрольного образца.

Массовую долю витамина А в исследуемом образце выраженную в МЕ/г, определяют по формуле

где – массовая концентрация витамина А в исследуемом образце, мкг/ мл;

– суммарный объем гексана, используемого для экстракции (20 мл);

– объем изопропилового спирта, используемый для растворения сухого остатка (10 мл);

– масса навески исследуемого образца, г;

– объем аликвотной части гексанового экстракта, взятый для упаривания (1 мл);

– фактор пересчета в международные единицы.

Результат измерения массовой доли витамина А в образцах, выраженный в МЕ/г, представляют в виде:

где – массовая доля витамина А в исследуемом образце, МЕ/г;

δ – относительная суммарная погрешность результатов измерений.

Режимные характеристики для подготовки образцов и результаты их исследований приведены в таблице 2.

Таблица 2

Режимные характеристики для подготовки образцов и результаты их исследований

№ примера Контрольный образец Исследуемый образец Тип исходного стандарта витамина А Концентрация витамина А (ретинол ацетата) в стандарте, мг/мл Тип биорелевантной среды для экспозиции Концентрация витамина А (ретинол ацетата) перед экспозицией в биорелевантной среде, мг/мл Длительность экспозиции, час Максимальная температура водяной бани, °С Массовая концентрация витамина А (ретинол ацетата) после экспозиции в биорелевантной среде, мкг/мл Фармацевтический 0,23 Двенадцатиперстная кишка свиньи 0,17 3 58 200,47 Аналитический 0,23 Двенадцатиперстная кишка свиньи 0,17 2 60 185,35 Фармацевтический 0,23 Двенадцатиперстная кишка свиньи 0,17 2 58 171,62

По данным таблицы 2 можно сделать вывод, что после экспозиции концентрация кормового микрокапсулированного витамина А (в форме ретинол ацетата) в условиях биорелевантной среды двенадцатиперстной кишки свиньи произошло растворение защитной оболочки микрокапсул и выделение витамина в среду, что свидетельствует об имитации физиологических условий желудочно-кишечного тракта свиньи и растворимости указанного препарата в данных условиях, аналогичное заключение можно сделать и при использовании известных биорелевантных сред.

Таким образом, заявляемый состав биорелевантной среды может быть использован для оценки биодоступности препаратов, моделирования процессов их растворения и всасывания, а также для изучения особенностей процессов пищеварения свиньи.

Изобретение относится к области аналитической химии и может быть использовано в медицинских, ветеринарных и других биологических исследованиях для оценки биодоступности препаратов, моделирования процессов их растворения и всасывания, а также для изучения особенностей процессов пищеварения свиньи. Биорелевантная среда двенадцатиперстной кишки свиньи натощак, содержащая лецитин, дигидрофосфат калия, хлорид калия, гидроксид натрия и воду деминерализованную, отличающаяся тем, что дополнительно содержит желчь крупного рогатого скота при следующем соотношении компонентов на 1 л воды деминерализованной: лецитин 75 мкМоль; дигидрофосфат калия 3,9 г; хлорид калия 7,7 г; гидроксид натрия для обеспечения pH 6,5; желчь крупного рогатого скота 3 г; вода деминерализованная 1 л. Вышеописанная биорелевантная среда двенадцатиперстной кишки свиньи имитирует кишечный сок свиньи in vitro натощак с высокой достоверностью. 2 табл.

Биорелевантная среда двенадцатиперстной кишки свиньи натощак, содержащая лецитин, дигидрофосфат калия, хлорид калия, гидроксид натрия и воду деминерализованную, отличающаяся тем, что дополнительно содержит желчь крупного рогатого скота при следующем соотношении компонентов на 1 л воды деминерализованной:

лецитин 0,75 мкМоль дигидрофосфат калия 3,9 г хлорид калия 7,7 г гидроксид натрия для обеспечения pH 6,5 желчь крупного рогатого скота 3 г вода деминерализованная 1 л