Изобретение относится к санитарной и клинической микробиологии и может быть использовано для селективного выявления бактерий родов Proteus, Morganella, Providencia и их дифференциации по способности расщеплять мочевину при санитарно-бактериологических исследованиях.
В соответствии с ГОСТ 28560-90 «Продукты пищевые. Метод выявления бактерий родов Proteus, Morganella, Providencia рекомендована Среда жидкая селективная. Основа среды: к 1 дм3 мясо-пептонного бульона добавляют 1,0 г маннита, 50,0 см3 натуральной бычьей желчи или эквивалентное количество сухой желчи, 0,8 г калия фосфорнокислого двузамещенного, 2,0 см3 раствора кристаллического фиолетового, 2,0 см3 спиртового раствора бромтимолового синего. Устанавливают pH таким образом, чтобы после стерилизации он составлял (6,9±0,1) при 25°С. Стерилизуют текучим паром при 100°С в течение 15 мин. Для приготовления среды к основе добавляют асептически 10,0 см3 раствора мочевины и 100 000 ЕД полимиксина В сульфата или 120 000 ЕД полимиксина М сульфата. Готовая среда прозрачная, желто-бурого цвета.
Селективное накопление бактерий родов Proteus, Morganella, Providencia обеспечивается наличием желчи, кристаллического фиолетового и полимиксина, в значительной степени подавляющих рост грамположительной и грамотрицательной сопутствующей микрофлоры, а маннит и мочевина придают дифференцирующие свойства среды в присутствии индикатора бромтимолового синего.
Недостатком Среды жидкой селективной лабораторного изготовления являются:
- сложность приготовления (предварительное изготовление мясо-пептонного бульона, приготовление маточных растворов кристаллического фиолетового и бромтимолового синего, что значительно увеличивает время и трудозатраты);
- использование в качестве элективного фактора неочищенной желчи крупного рогатого скота;
- отсутствие отечественных сухих препаратов - пептона и желчи, обладающих высокой степенью прозрачности в растворах;
- сложность соблюдения условий стерилизации текучим паром: - отсутствие химических (термовременных) индикаторов паровой стерилизации, с помощью которых при соблюдении заданной длительности стерилизационной выдержки и температуры необратимо изменяется цвет, и индикаторная метка достигает конечного цвета, соответствующего цвету эталона.
Известна коммерческая Селективная среда для определения родов Proteus, Morganella, Providencia
В настоящее время в России ООО «НПЦ «Биокомпас-С» выпускает Селективную среду для определения родов Proteus, Morganella, Providencia, предназначенную для приготовления жидкой селективной среды по ГОСТ 28560-90, представляющую собой набор из сухой среды с прилагаемыми флаконами растворов: индикатора бромтимолового синего и кристаллического фиолетового.
Недостатком коммерческих сред является:
- ограниченная доступность;
- сложность соблюдения условий стерилизации текучим паром: - отсутствие химических (термовременных) индикаторов паровой стерилизации, с помощью которых при соблюдении заданной длительности стерилизационной выдержки и температуры необратимо изменяется цвет, и индикаторная метка достигает конечного цвета, соответствующего цвету эталона.
- нестабильность ингибирующей способности бычьей желчи.
Наиболее близкой к предлагаемой среде является Среда жидкая селективная по ГОСТ 28560-90 лабораторного приготовления, на основе пептона мясного ферментативного,
Техническим результатом является создание отечественной сухой Селективной питательной среды с маннитом, желчью и полимиксином для выявления бактерий родов Proteus, Morganella, Providencia, прозрачной в готовом к применению состоянии, обладающей высокой специфической активностью и селективностью, обеспечивающей доступность и получение объективных результатов бактериологического контроля.
Технический результат достигается тем что предлагается Селективная питательная среда с маннитом, желчью и полимиксином для выявления бактерий родов Proteus, Morganella, Providencia сухая содержащая белковую основу, маннит, бычью желчь, кристаллический фиолетовый, бромтимоловый синий, полимиксина В сульфат и мочевину, а в качестве белковой основы содержит панкреатический гидролизат рыбной муки (ПГРМ K2HPO4) деминерализованный от катионов кальция и магния с дополнительным осаждением высокомолекулярных белков и пептидов, желчь очищенную (ЖОГ), при следующем количественном соотношении компонентов, г/л:
Состав СД, г/л:
Внесение калия фосфорнокислого в жидкий ПГРМ позволяет исключить дополнительное внесение его в состав среды, обеспечивает прозрачность и высокую буферную емкость готовой среды. Сбалансированность компонентного состава среды обеспечивает хорошие ростовые и селективные свойства Селективной питательной среды с маннитом, желчью и полимиксином для выявления бактерий родов Proteus, Morganella, Providencia.
Способ получения Селективной питательной среды с маннитом, желчью и полимиксином для выявления бактерий родов Proteus, Morganella, Providencia предусматривает смешивание сухих компонентов, г/л:
(ПГРМ K2HPO4 сухой)
Состав СД, г/л:
Добавка – мочевина (карбамид по ГОСТ 6691-77 или импортная аналогичного качества) из расчета 5,0 г/л. Мочевина в состав сухой среды не входит.
Отличием предлагаемой среды от прототипа является использование в качестве питательной основы специально изготовленного панкреатического гидролизата рыбной муки с фосфатом калия двузамещенным. Расчетное количество, в пересчете на сухое вещество двузамещенного фосфата калия вносят в жидкий ПГРМ, реакционную смесь нагревают до температуры 100°С, выдерживают в течение 15-20 мин, фильтруют и высушивают на сушильной установке в виброкипящем слое.
Также отличием является наличие желчи очищенной сухой, обеспечивающей прозрачность готовой среды и ингибирующие свойства среды.
Панкреатический гидролизат рыбной муки (ПГРМ K2HPO4) является источником питательных веществ, необходимых для роста микроорганизмов: азота, витаминов, минеральных солей и аминокислот. Маннит является ферментируемым и дифференцирующим субстратом, а также источником углерода. Среда обеспечивает элективность в отношении грамположительной и грамотрицательной сопутствующей микрофлоры за счет присутствия в среде желчи очищенной крупного рогатого скота, кристаллического фиолетового и полимиксина.
Пример 1. Для приготовления среды берут навески следующих ингредиентов, г/л:
(ПГРМ K2HPO4 сухой)
СД, г/л:
Навески размешивают в 1 л дистиллированной воды, кипятят в течение 2 мин, стерилизуют автоклавированием при температуре 121°С в течение 15 мин. После охлаждения питательной среды до температуры 40-45°С в асептических условиях вносят стерильный 50 % раствор мочевины из расчета 10 мл/л и содержимое флакона с СД из расчета 5 мл на 1 л питательной среды, разливают по 5 мл в стерильные стеклянные пробирки по ГОСТ 25336-82.
Для приготовления 50 % раствора мочевины 50,0 г мочевины помещают в колбу на 100 мл, растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды, затем объем раствора доводят до метки. Раствор мочевины стерилизуют выдержкой при комнатной температуре в течение 2-3 суток. Раствор мочевины хранят в течение месяца при температуре 2-8°С.
Для контроля полученной среды используют тест-штаммы микроорганизмов из Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск».
Готовят стандартную взвесь культуры каждого тест-штамма, соответствующую 10 единицам по стандартному образцу мутности ОСО 42-28-85 П, с использованием стерильного 0,9% раствора натрия хлористого. Полученные взвеси культур десятикратными разведениями (4,5 мл 0,9 % раствора натрия хлорида с 0,5 мл микробной взвеси) доводили до разведения 10-6 (для Escherichia coli АТСС 25922 и Staphylococcus aureus Wood-46 АТСС 10832 - до разведения 10-4)
Для определения ростовых свойств засев производили по 0,5 мл микробной взвеси каждого из тест-штаммов из разведения в 5,0 мл среды.
Посевы инкубировали при температуре (37±1)°С в течение 20-24 ч. Готовая питательная среда прозрачная зеленого цвета, обеспечивает рост и накопление следующих тест-штаммов: Proteus vulgaris HX 19 222, Proteus mirabilis 3177, Morganella morganii АТСС 25830 DSM 30164.
Питательная среда в значительной степени ингибирует рост тест-штаммов Escherichia coli АТСС 25922, Staphylococcus aureus Wood-46 АТСС 10832.
Результаты биологического контроля лабораторных образцов Селективной среды для определения родов Proteus, Morganella, Providencia на наборе тест-штаммов представлены в таблице 2.
Пример 2. Среду готовят в соответствии с примером 1.
(ПГРМ K2HPO4 сухой)
СД, г/л:
Результаты биологического контроля представлены в таблице 2 и аналогичны результатам проверки по примеру 1.
Пример 3. Среду готовят в соответствии с примером 1.
(ПГРМ K2HPO4 сухой)
СД, г/л:
Результаты биологического контроля представлены в таблице 2 и аналогичны результатам проверки по примеру 1.
Пример 4. Среду готовят в соответствии с примером 1.
(ПГРМ K2HPO4 сухой)
СД, г/л:
Нарушение количественного соотношения ингредиентов среды в примере 4 ведет к ухудшению ростовых и ингибирующих свойств.
Результаты биологического контроля представлены в таблице 2.
Пример 5. Среду готовят в соответствии с примером 1.
(ПГРМ K2HPO4 сухой)
СД, г/л:
Результаты биологического контроля представлены в таблице 2.
Нарушение количественного соотношения ингредиентов среды в большую сторону на примере 5 ведет к значительному повышению ингибирующих свойств, что негативно сказывается на специфической активности среды.
Из таблицы видно, что предлагаемая питательная среда в соответствии с примерами 1, 2, 3 обладает хорошими ростовыми свойствами, эффективна в накоплении представителей рода Proteus и подавляет рост ряда грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов.
Визуальный учет результатов выявления бактерий рода Proteus и их дифференциации по способности расщеплять мочевину по окончании срока инкубации посевов показал идентичные результаты в испытуемых и контрольной (лабораторного приготовления) средах.
Изменение количественного соотношения компонентов среды ведет к нарушению биологических показателей качества предложенной среды.
Так, в случае приготовления среды в соответствии с примерами 4,5 наблюдается снижение специфической активности и изменение ингибирующей способности среды:
- при концентрации компонентов ниже минимальных пределов наблюдался рост Staphylococcus aureus Wood-46 АТСС 10832.
- слабое изменение цвета и диффузное помутнение при росте Proteus vulgaris HX 19 222, Proteus mirabilis 3177, Morganella morganii АТСС 25830 DSM 30164
- при концентрации компонентов выше максимальных пределов
- подавляется рост Proteus vulgaris HX 19 222, Proteus mirabilis 3177, Morganella morganii АТСС 25830 DSM 30164 (слабое изменение цвета и диффузное помутнение, при визуальном просмотре посевов после культивирования):
ингибирующий эффект среды ярко выражен.
Таким образом, разработана отечественная конкурентоспособная Селективная питательная среда с маннитом, желчью и полимиксином для выявления бактерий родов Proteus, Morganella, Providencia сухая;
разработана технология получения сухой питательной основы из жидкого панкреатического гидролизата рыбной муки (ПГРМ K2HPO4) с калием фосфорнокислым двузамещенным, деминерализованного от катионов кальция и магния с дополнительным осаждением высокомолекулярных белков и пептидов обеспечивает прозрачность и высокую буферную емкость готовой среды.
упрощена процедура и снижены трудозатраты приготовления среды;
готовая среда после стерилизации, внесения мочевины и селективной добавки (полимиксина В) - прозрачная, зеленого цвета, что улучшает визуальную интерпретацию результатов исследований;
изменен режим стерилизации среды, позволяющий проводить контроль за процессом с использованием индикаторов химических.
Таблица 2. Биологические показатели Селективной питательной среды с маннитом, желчью и полимиксином для выявления бактерий родов Proteus, Morganella, Providencia.
Среда лабораторного приготовления
разведение 10-6
изменение цвета среды из зеленого в синий
изменение цвета среды из зеленого в синий
изменение цвета среды из зеленого в синий
изменение цвета среды из зеленого в синий
изменение цвета среды из зеленого в синий
изменение цвета среды из зеленого в синий
разведение 10-6
изменение цвета среды из зеленого в синий
изменение цвета среды из зеленого в синий
изменение цвета среды из зеленого в синий
изменение цвета среды из зеленого в синий
изменение цвета среды из зеленого в синий
изменение цвета среды из зеленого в синий
разведение 10-6
Без изменения цвета среды
Без изменения цвета среды
Без изменения цвета среды
Без изменения цвета среды
Без изменения цвета среды
Без изменения цвета среды
разведение 10-6
изменение цвета среды из зеленого в синий
изменение цвета среды из зеленого в синий
изменение цвета среды из зеленого в синий
изменение цвета среды из зеленого в синий
изменение цвета среды из зеленого в синий
изменение цвета среды из зеленого в синий
разведение 10-4
Без изменения цвета среды
разведение 10-4
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| Способ получения белковой основы для производства селективной питательной среды с маннитом, желчью и полимиксином для выявления бактерий родов Proteus, Morganella, Providencia | 2022 |
|
RU2798547C1 |
| СУХАЯ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНО-ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ И УЧЕТА E.coli И КОЛИФОРМНЫХ БАКТЕРИЙ | 2012 |
|
RU2508399C1 |
| Дифференциально-элективная питательная среда для выделения клебсиелл | 2019 |
|
RU2704854C1 |
| СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ БАКТЕРИЙ РОДА Shewanella | 2010 |
|
RU2435845C1 |
| ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ СЕЛЕКТИВНОГО НАКОПЛЕНИЯ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ, СУХАЯ (БУЛЬОН МОССЕЛЯ), ВАРИАНТЫ | 2013 |
|
RU2553224C2 |
| Питательная среда для выделения Pseudomonas aeruginosa | 2019 |
|
RU2709136C1 |
| ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНО-ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ КИШЕЧНОГО ИЕРСИНИОЗА И ПСЕВДОТУБЕРКУЛЕЗА | 1995 |
|
RU2101342C1 |
| СПОСОБ КОНТРОЛЯ ИНГИБИРУЮЩИХ СВОЙСТВ В ОТНОШЕНИИ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ФЛОРЫ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ БРУЦЕЛЛ | 2019 |
|
RU2733431C2 |
| ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНО-ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ЛИСТЕРИЙ | 2001 |
|
RU2223313C2 |
| СУХАЯ ХРОМОГЕННАЯ ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ КОЛИФОРМНЫХ БАКТЕРИЙ И E.coli (ВАРИАНТЫ) | 2012 |
|
RU2508400C1 |
Изобретение относится к области биотехнологии. Сущность изобретения заключается в том, что в качестве белковой основы используют панкреатический гидролизат рыбной муки (ПГРМ K2HPO4) деминерализованный от катионов кальция и магния с дополнительным осаждением высокомолекулярных белков и пептидов, желчь очищенную (ЖОГ) при следующем количественном соотношении компонентов, г/л: панкреатический гидролизат рыбной муки сухой (ПГРМ K2HPO4 сухой) 8,8-12,8, желчь очищенная сухая 3,0-7,0, маннит D(-) 0,5-1,5, натрий хлористый 4,0-6,0, бромтимоловый синий 0,03-0,05, кристаллический фиолетовый 0,0015-0,0025. Состав СД, г/л: полимиксина В сульфат 0,01-0,014. Готовая среда после стерилизации, внесения мочевины и селективной добавки (полимиксина В) – прозрачная, зеленого цвета, что улучшает визуальную интерпретацию результатов исследований. 1 табл., 5 пр.
Селективная питательная среда для выявления бактерий родов Proteus, Morganella, Providencia сухая, содержащая следующие исходные компоненты, г/л:
селективная добавка (СД), г/л:
| Зажим для закрепления электрических проводов на поддерживающих опорах | 1931 |
|
SU28560A1 |
| ШЕПЕЛИН А.П., и др | |||
| Сравнительный анализ питательных сред для выделения протеев, Бактериология, 2019, том 4, N 3, с | |||
| Способ очистки нефти и нефтяных продуктов и уничтожения их флюоресценции | 1921 |
|
SU31A1 |
