Способ определения витамина А в форме ретинол ацетата в исследуемом образце Российский патент 2024 года по МПК G01N33/82 G01N33/15 G01N30/00 

Изобретение относится к области аналитической химии и может быть использовано в медицинских, ветеринарных и других биологических исследованиях для определения витамина А в форме ретинол ацетата в биорелевантной среде сельскохозяйственных животных или птицы.

Известен способ определения витамина A методом тонкослойной хроматографии, включающий выделение указанного витамина путем экстракции исходного материала спиртом и проведение хроматографии полученного спиртового экстракта с использованием силикагелевых пластинок (см. патент РФ № 2530620, МПК G01N 30/90, G01N 33/15, G01N 33/02, дата публикации 10.10.2014 г.).

В качестве ближайшего аналога принят способ определения витаминов, содержащий подготовку контрольного образца, представляющего собой стандартный раствор с известной концентрацией витамина, подготовку исследуемого образца, включающую проведение жидкостной экстракции, отбор проб одинакового объема у подготовленных образцов и их высокоэффективную жидкостную хроматографию и определение содержания витамина расчетным путем на основе сравнения площадей пиков проб контрольного и исследуемого образцов (см. патент РФ № 2318216, МПК G01N 33/82, дата публикации 27.02.2008).

Однако аналоги позволяют определить только фактическое содержание витаминов в конкретных продуктах, содержание жирорастворимых витаминов при совместном присутствии и не рассматривают сравнение витаминов в образцах до и после экспозиции последних в биорелевантных средах (искусственные жидкости, имитирующие условия желудка, двенадцатиперстной кишки, кишечника сельскохозяйственных животных или птиц).

Кроме того, ближайший аналог позволяет определить содержание только водорастворимых витаминов, к которым витамин А не относится.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является разработка способа определения витамина А в форме ретинол ацетата в биорелевантных средах сельскохозяйственных животных или птицы.

Технический результат, проявляющийся при решении поставленной задачи, выражается в возможности достоверной оценки усваиваемости кормового микрокапсулированного витамина А (в форме ретинол ацетата) в организме сельскохозяйственных животных или птицы путем количественного определения витамина А методом ВЭЖХ в соответствующей биорелевантной среде после экспозиции.

Поставленная задача решается тем, что способ определения витамина А в форме ретинол ацетата в биорелевантных средах сельскохозяйственных животных или птицы, содержащий подготовку контрольного образца, представляющего собой стандартный раствор с известной концентрацией витамина, подготовку исследуемого образца, включающую проведение жидкостной экстракции, отбор проб одинакового объема у подготовленных образцов и их высокоэффективную жидкостную хроматографию и определение содержания витамина расчетным путем на основе сравнения площадей пиков проб контрольного и исследуемого образцов отличается тем, что при подготовке контрольного образца в колбе объемом 100 мл перемешивают 50 мл изопропилового спирта и 20-25 мг стандарта витамина А в форме ретинола ацетата до полного растворения последнего, полученный раствор доводят до метки изопропиловым спиртом и повторно перемешивают, а при подготовке исследуемого образца витамин А в форме ретинол ацетата подвергают экспозиции в соответствующей биорелевантной среде при их соотношении 5,16 мг : 30 мл соответственно и постоянном перемешивании на биореакторе со скоростью 50 об/мин, далее к аликвоте раствора витамина А в биорелевантной среде объемом 5 мл добавляют 10 мл раствора, содержащего аскорбиновую кислоту и воду для анализа в соотношении 1 г : 10 мл соответственно, перемешивают, вносят 20 мл раствора, содержащего гидроксид калия, воду для анализа и этиловый спирт в соотношении 2 г : 2 мл : 18 мл соответственно, снова перемешивают и выдерживают в течение 30 минут на водяной бане при температуре 55-60 ºС, полученную смесь охлаждают до 20 ºС, добавляют к ней 10 мл воды для анализа, перемешивают и подвергают двукратной экстракции двумя порциями гексана по 10 мл, отделяют гексановые экстракты, объединяют их и упаривают досуха, а полученный сухой остаток растворяют в 10 мл изопропилового спирта и выдерживают в течение 10 минут в темном месте, после чего отбирают пробы одинакового объема у полученного контрольного и исследуемого образцов, проводят их высокоэффективную жидкостную хроматографию при расходе элюента 0,4 мл/мин и длине волн 328 нм и определяют содержание витамина А расчетным путем.

Кроме того, при подготовке контрольного образца используют аналитический стандарт витамина А в форме ретинола ацетата.

Кроме того, при подготовке контрольного образца используют фармацевтический стандарт витамина А в форме ретинола ацетата.

Кроме того, экспозицию витамина А в форме ретинол ацетата в биорелевантной среде желудка крупного рогатого скота проводят при температуре 39 ºС в течение 1-2 часов.

Кроме того, экспозицию витамина А в форме ретинол ацетата в биорелевантной среде кишечника крупного рогатого скота проводят при температуре 39 ºС в течение 20-24 часов.

Кроме того, экспозицию витамина А в форме ретинол ацетата в биорелевантной среде двенадцатиперстной кишки крупного рогатого скота проводят при температуре 39 ºС в течение 2-3 часов.

Кроме того, экспозицию витамина А в форме ретинол ацетата в биорелевантной среде желудка свиньи проводят при температуре 40 ºС в течение 2-3 часов.

Кроме того, экспозицию витамина А в форме ретинол ацетата в биорелевантной среде кишечника свиньи проводят при температуре 40 ºС в течение 3 часов.

Кроме того, экспозицию витамина А в форме ретинол ацетата в биорелевантной среде двенадцатиперстной кишки свиньи проводят при температуре 40 ºС в течение 2-3 часов.

Кроме того, экспозицию витамина А в форме ретинол ацетата в биорелевантной среде желудка сельскохозяйственной птицы проводят при температуре 41 ºС в течение 3-4 часов.

Кроме того, экспозицию витамина А в форме ретинол ацетата в биорелевантной среде кишечника сельскохозяйственной птицы проводят при температуре 41 ºС в течение 3-5 часов.

Кроме того, экспозицию витамина А в форме ретинол ацетата в биорелевантной среде двенадцатиперстной кишки сельскохозяйственной птицы проводят при температуре 41 ºС в течение 2-2,5 часов.

Сопоставительный анализ признаков заявляемого изобретения с признаками прототипа и аналогов свидетельствует о соответствии заявляемого решения критерию «новизна».

При этом отличительные признаки формулы изобретения обеспечивают решение следующих функциональных задач.

Признаки «при подготовке контрольного образца в колбе объемом 100 мл перемешивают 50 мл изопропилового спирта и 20-25 мг стандарта витамина А в форме ретинола ацетата до полного растворения последнего, полученный раствор доводят до метки изопропиловым спиртом и повторно перемешивают», а также признаки первого и второго зависимых пунктов формулы описывают состав и технологию приготовления раствора стандарта витамина А, используемого в качестве контрольного образца.

Признаки «при подготовке исследуемого образца витамин А в форме ретинол ацетата подвергают экспозиции в соответствующей биорелевантной среде при их соотношении 5,16 мг : 30 мл соответственно и постоянном перемешивании на биореакторе со скоростью 50 об/мин, далее к аликвоте раствора витамина А в биорелевантной среде объемом 5 мл добавляют 10 мл раствора, содержащего аскорбиновую кислоту и воду для анализа в соотношении 1 г : 10 мл соответственно, перемешивают, вносят 20 мл раствора, содержащего гидроксид калия, воду для анализа и этиловый спирт в соотношении 2 г : 2 мл : 18 мл соответственно, снова перемешивают и выдерживают в течение 30 минут на водяной бане при температуре 55-60 ºС, полученную смесь охлаждают до 20 ºС, добавляют к ней 10 мл воды для анализа, перемешивают и подвергают двукратной экстракции двумя порциями гексана по 10 мл, отделяют гексановые экстракты, объединяют их и упаривают досуха, а полученный сухой остаток растворяют в 10 мл изопропилового спирта и выдерживают в течение 10 минут в темном месте» подробно описывают технологию подготовки исследуемого образца.

При этом признаки «витамин А в форме ретинол ацетата подвергают экспозиции в соответствующей биорелевантной среде при их соотношении 5,16 мг : 30 мл соответственно и постоянном перемешивании на биореакторе со скоростью 50 об/мин» и признаки зависимых пунктов формулы с третьего по одиннадцатый описывают технологию получения раствора витамина А в биорелевантной среде.

При этом признаки «к аликвоте раствора витамина А в биорелевантной среде объемом 5 мл добавляют 10 мл раствора, содержащего аскорбиновую кислоту и воду для анализа в соотношении 1 г : 10 мл соответственно, перемешивают» позволяют предотвратить разрушение (окисление) витамина А.

При этом признаки «вносят 20 мл раствора, содержащего гидроксид калия, воду для анализа и этиловый спирт в соотношении 2 г : 2 мл : 18 мл соответственно, снова перемешивают и выдерживают в течение 30 минут на водяной бане при температуре 55-60 ºС» обеспечивают гидролиз жиров в результате омыления раствора, полученного на предыдущем этапе, водно-спиртовым раствором гидроксида калия в этаноле.

При этом признаки «полученную смесь охлаждают до 20 ºС, добавляют к ней 10 мл воды для анализа, перемешивают и подвергают двукратной экстракции двумя порциями гексана по 10 мл» позволяют выделить витамин А путем экстракции раствора гексаном.

При этом признаки «отделяют гексановые экстракты, объединяют их и упаривают досуха» обеспечивают удаление остатков гексана из исследуемого образца.

При этом признаки «полученный сухой остаток растворяют в 10 мл изопропилового спирта и выдерживают в течение 10 минут в темном месте» позволяют растворить извлеченный витамин А, находящийся в сухом остатке, и подготовить исследуемый образец к хроматографии.

Признаки «отбирают пробы одинакового объема у полученного контрольного и исследуемого образцов» позволяют унифицировать и сравнить результаты хроматографии образцов.

Признаки «проводят высокоэффективную жидкостную хроматографию [проб образцов] при расходе элюента 0,4 мл/мин и длине волн 328 нм» описывают тип и режимные характеристики хроматографического исследования.

Признак «определяют содержание витамина А расчетным путем» указывает на принцип определения содержания витамина А.

Заявляемый способ осуществляют на стандартном оборудовании в несколько этапов.

Подготовка контрольного образца.

В мерную колбу объемом 100 мл вносят 20-25 мг аналитического или фармацевтического стандарта витамина А в форме ретинола ацетата, добавляют 50 мл изопропилового спирта и тщательно перемешивают содержимое до полного растворения указанного стандарта.

Полученный раствор доводят до метки изопропиловым спиртом, плотно закрывают пробкой и еще раз перемешивают.

Концентрация контрольного образца составляет приблизительно 0,250 мг/мл. Действительное значение концентрации витамина А в контрольном образце (), выраженное в мг/мл, вычисляют по формуле:

где – активность витамина А в исходном аналитическом или фармацевтическом стандарте;

– концентрация витамина А в исходном аналитическом или фармацевтическом стандарте, указанная в сертификате качества, %;

– масса навески аналитического или фармацевтического стандарта витамина А, взятая для приготовления контрольного образца, мг;

– объем колбы, использованной для приготовления контрольного образца, мл.

Срок годности контрольного образца составляет 14 дней в холодильнике.

Подготовка исследуемого образца включает 2 основные стадии.

Экспозиция кормового микрокапсулированного витамина А (в форме ретинол ацетата) в соответствующей биорелевантной среде при их соотношении 5,16 мг : 30 мл соответственно и постоянном перемешивании на биореакторе (например RTS-1) со скоростью 50 об/мин.

Авторы разработали биорелевантные среды, составы которых приведены в таблицах 1-3.

Таблица 1

Биорелевантные среды желудка

Наименование компонента, ед. изм. Соотношение на 1 л воды с/х птица крупный рогатый скот свинья Желчь крупного рогатого скота, г/л 5 3 5 Лецитин, мкмоль/л 0,75 0,75 0,75 Хлорид калия, г 7,7 7,7 7,7 Пепсин, г 3,9 3,9 3,9 Альфа-амилаза с концентрацией 800 ед/мл для обеспечения активности 6000 для обеспечения активности 10000 для обеспечения активности 8000 Целлюлаза с концентрацией 4000 ед/мл для обеспечения активности 6000 для обеспечения активности 12000 - Протеаза с концентрацией 50000 ед/г для обеспечения активности 25000 для обеспечения активности 30000 для обеспечения активности 45000 Липаза с концентрацией 2000000 ед/г для обеспечения активности 800000 для обеспечения активности 1000000 для обеспечения активности 1500000 Пектиназа с концентрацией 35 ед/г - для обеспечения активности 125 - Соляная кислота для обеспечения pH 2,6 - для обеспечения pH 1,6 Гидроксид натрия - для обеспечения pH 6,5 - Вода деминерализованная q.s, л 1 1 1

Таблица 2

Биорелевантные среды кишечника

Наименование компонента Соотношение на 1 л воды с/х птица крупный рогатый скот свинья Желчь крупного рогатого скота, г/л 2 2 3 Лецитин, мкмоль/л 0,75 0,75 0,75 Хлорид калия, г 7,7 7,7 7,7 КН2РО4, г 3,9 3,9 3,9 Гидроксид натрия для обеспечения pH 6,7 для обеспечения pH 7,5 для обеспечения pH 6,5 Вода деминерализованная q.s, л 1 1 1

Таблица 3

Биорелевантные среды двенадцатиперстной кишки

Наименование компонента Соотношение на 1 л воды с/х птица крупный рогатый скот свинья Желчь крупного рогатого скота, г/л 2 2 3 Лецитин, мкмоль/л 0,75 0,75 0,75 Хлорид калия, г 7,7 7,7 7,7 КН2РО4, г 3,9 3,9 3,9 Гидроксид натрия для обеспечения pH 6,3 для обеспечения pH 7,0 для обеспечения pH 6,5 Вода деминерализованная q.s, л 1 1 1

Параметры экспозиции витамина А в форме ретинол ацетата в разных биорелевантных средах приведены в таблице 4.

Таблица 4

Параметры экспозиции витамина А в биорелевантных средах

Тип биорелевантной среды Температура, °C Число оборотов, min^-¹ Частота измерения, min^-¹ Реверс период, сек Объем пробы, мл Длина волны, нм Продолжительность измерений, ч желудок кишечник двенадцатиперстная кишка Крупный рогатый скот 39 50 30 60 30 850 1-2 20-24 2-3 Свинья 40 50 30 60 30 850 2-3 3 2-3 С/х птица 41 50 30 60 30 850 3-4 3-5 2-2,5

Приготовление исследуемого образца из раствора витамина А в биорелевантной среде.

Аликвоту раствора витамина А в биорелевантной среде объемом 5 мл переносят в коническую колбу вместимостью 100 мл и добавляют 10 мл раствора, для приготовления которого в химическом стакане растворяют 1 г аскорбиновой кислоты в 10 мл воды для анализа, после чего аккуратно перемешивают так, чтобы вся проба была смочена внесенным раствором, далее вносят 20 мл раствора, для приготовления которого в химическом стакане 2 г гидроксида калия растворяют в смеси, состоящей из 2 мл воды для анализа и 18 мл.

Содержимое колбы тщательно, но аккуратно перемешивают, соединяют с обратным холодильником и подвергают омылению в течение 30 минут на водяной бане при температуре 55-60 ºС.

После охлаждения реакционной смеси до 20 ºС к полученному гидролизату добавляют 10 мл дистиллированной воды для анализа, содержимое колбы перемешивают, переносят в делительную воронку вместимостью 100 мл и подвергают двукратной экстракции двумя порциями гексана по 10 мл, тщательно ополаскивая очередным объемом экстрагента колбу, в которой проводился гидролиз. Продолжительность каждой экстракции – не менее 1 минуты.

Гексановые экстракты отделяют, объединяют в круглодонной колбе и упаривают досуха. Полученный сухой остаток незамедлительно растворяют в 10 мл изопропилового спирта и выдерживают в течение 10 минут в темном месте.

Отбор проб одинакового объема у контрольного и исследуемого образцов, их перенос в хроматографическую виалу и ввод в хроматограф по отдельности.

Проведение высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Для разделения многокомпонентных смесей использовали жидкостный хроматограф высокого давления Shimadzu LC–20 Prominence HPLC (Shimadzu, Япония), оборудованный UV-VIS-детектором SPD-20A (Shimadzu, Япония) и обратнофазной колонкой Shodex. ODP2 HPG-4A (4.6 × 10 мм, размер частиц: 5 мкм; Shodex, Япония).

Термостатирование колонки проводили при 30 °С. Постоянный расход элюента составлял 0,4 мл/мин. Был использован следующий градиент элюции (элюент А – деионизованная вода с добавлением 0,1 % муравьиной кислоты; элюент B – ацетонитрил с добавлением 0,1 % муравьиной кислоты): 0 мин – 70% B, 0,1–1 мин – 70–0% B, 1-4 мин – 0–70% B, 4-5 мин – стабилизация колонки при 70% B. Регистрация UV-VIS-детектором проводилась при длине волны 328 нм (для определения витамина А). Объем впрыска образца составлял 10 мкл.

Строят хроматограммы проб контрольного и исследуемого образцов.

Обработка результатов измерений.

Количественное определение содержания витамина А в образцах проводят путем соотнесения площади пика на хроматограмме пробы исследуемого образца с аналогичными параметрами пика на хроматограмме пробы контрольного образца.

Массовую концентрацию витамина А в исследуемом образце (), выраженную в мкг/мл, определяют по формуле

где – действительное значение концентрации витамина А в контрольном образце, мг/мл;

– площадь пика на хроматограмме пробы исследуемого образца;

– площадь пика на хроматограмме пробы контрольного образца.

Массовую долю витамина А в исследуемом образце (), выраженную в МЕ/г, определяют по формуле

где – массовая концентрация витамина А в исследуемом образце, мкг/ мл;

– суммарный объем гексана, используемого для экстракции (20 мл);

– объем изопропилового спирта, используемый для растворения сухого остатка (10 мл);

– масса навески исследуемого образца, г;

– объем аликвотной части гексанового экстракта, взятый для упаривания (1 мл);

– фактор пересчета в международные единицы.

Результат измерения массовой доли витамина А в образцах, выраженный в МЕ/г, представляют в виде:

(±0,01·δ·)

где – массовая доля витамина А в исследуемом образце, МЕ/г;

δ – относительная суммарная погрешность результатов измерений.

Режимные характеристики для подготовки образцов и результаты их исследований приведены в таблице 5.

Таблица 5

Режимные характеристики для подготовки образцов и результаты их исследований

№ примера Контрольный образец Исследуемый образец Тип исходного стандарта витамина А Концентрация витамина А (ретинол ацетата), мг/мл Тип биорелевантной среды для экспозиции Длительность экспозиции, час Концентрация витамина А (ретинол ацетата) перед экспозицией, мг/мл Максимальная температура водяной бани, ºС Массовая концентрация витамина А (ретинол ацетата), мкг/мл Аналитический 0,23 Желудок крупного рогатого скота 1 0,17 55 121,42 Фармацевтический 0,23 Желудок крупного рогатого скота 1,5 0,17 56 118,9 Аналитический 0,23 Желудок крупного рогатого скота 2 0,17 57 125,15 Аналитический 0,23 Двенадцатиперстная кишка крупного рогатого скота 2,5 0,17 55 150,45 Фармацевтический 0,23 Двенадцатиперстная кишка крупного рогатого скота 2 0,17 58 145,31 Аналитический 0,23 Двенадцатиперстная кишка крупного рогатого скота 3 0,17 60 141,73 Фармацевтический 0,23 Кишечник крупного рогатого скота 24 0,17 58 54,66 Аналитический 0,23 Кишечник крупного рогатого скота 20 0,17 59 58,73 Фармацевтический 0,23 Кишечник крупного рогатого скота 22 0,17 60 63,18 Аналитический 0,23 Желудок свиньи 2,5 0,17 59 84,45 Фармацевтический 0,23 Желудок свиньи 3 0,17 58 96,12 Аналитический 0,23 Желудок свиньи 2 0,17 57 105,86 Фармацевтический 0,23 Двенадцатиперстная кишка свиньи 3 0,17 58 200,47 Аналитический 0,23 Двенадцатиперстная кишка свиньи 2 0,17 60 185,35 Фармацевтический 0,23 Двенадцатиперстная кишка свиньи 2 0,17 58 171,62 Фармацевтический 0,23 Кишечник свиньи 3 0,17 56 102,93 Фармацевтический 0,23 Кишечник свиньи 3 0,17 55 81,4 Аналитический 0,23 Кишечник свиньи 3 0,17 57 112,69 Аналитический 0,23 Желудок с/х птицы 3,5 0,17 55 130,11 Фармацевтический 0,23 Желудок с/х птицы 3 0,17 60 143,78 Аналитический 0,23 Желудок с/х птицы 4 0,17 59 142,2 Аналитический 0,23 Двенадцатиперстная кишка с/х птицы 2 0,17 56 212,35 Фармацевтический 0,23 Двенадцатиперстная кишка с/х птицы 2,5 0,17 58 175,17 Аналитический 0,23 Двенадцатиперстная кишка с/х птицы 2 0,17 60 206,54 Фармацевтический 0,23 Кишечник с/х птицы 4 0,17 58 54,8 Аналитический 0,23 Кишечник с/х птицы 5 0,17 57 50,25 Фармацевтический 0,23 Кишечник с/х птицы 3 0,17 56 45,4

На основе данных таблицы 5 можно сделать вывод, что предлагаемый способ определения витамина А в форме ретинол ацетата в биорелевантных средах сельскохозяйственных животных или птицы позволяет достоверно оценить биодоступность кормового микрокапсулированного витамина А (в форме ретинол ацетата) в условиях жидкостей желудочно-кишечного тракта сельскохозяйственных животных или птицы с учетом различной длительности экспозиции.

Значения массовой концентрации витамина А (в форме ретинол ацетата) в мкг/мл, позволяют сделать вывод, что биодоступность кормового микрокапсулированного витамина А (в форме ретинол ацетата) варьируется в зависимости от вида животного и от отдела желудочно-кишечного тракта. Это позволяет использовать заявляемый способ в биологических, ветеринарных и фармакологических исследованиях.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ определения витамина А в форме ретинол ацетата в исследуемом образце, включающий растворение контрольного образца-раствора с известной концентрацией витамина в изопропиловым спирте по предложенному протоколу, подготовку исследуемого образца, включающую проведение жидкостной экстракции объекта исследований, отбор проб одинакового объема у подготовленных образцов и их высокоэффективную жидкостную хроматографию и определение содержания витамина расчетным путем на основе сравнения площадей пиков проб контрольного и исследуемого образцов. Предварительно исследуемый образец подвергают экспозиции в соответствии с заданными параметрами в предложенной биорелевантной среде сельскохозяйственных животных или птицы при постоянном перемешивании на биореакторе со скоростью 50 об/мин. Затем к аликвоте раствора витамина А в биорелевантной среде вносят заданный объем раствора аскорбиновой кислоты и воды в соотношении 1 г : 10 мл, перемешивают, вносят раствор гидроксида калия, воду и этиловый спирт в соотношении 2 г : 2 мл : 18 мл, перемешивают, выдерживают 30 мин на водяной бане при 55-60°С, полученную смесь охлаждают до 20°С, после добавления к ней воды для анализа, подвергают двукратной экстракции двумя порциями гексана в заданном соотношении, отделяют гексановые экстракты, объединяют их и упаривают досуха, затем растворяют в изопропиловом спирте, и выдерживают 10 мин в темном месте. Отбирают пробы одинакового объема у полученного контрольного и исследуемого образцов и проводят их высокоэффективную жидкостную хроматографию при расходе элюента 0,4 мл/мин и длине волн 328 нм и определяют содержание витамина А расчетным путем. Изобретение обеспечивает возможность оценки усваиваемости кормового микрокапсулированного витамина А в форме ретинол ацетата в организме сельскохозяйственных животных или птицы. 2 з.п. ф-лы, 5 табл.

1. Способ определения витамина А в форме ретинол ацетата в исследуемом образце, содержащий подготовку контрольного образца, представляющего собой раствор с известной концентрацией витамина, подготовку исследуемого образца, включающую проведение жидкостной экстракции объекта исследований, отбор проб одинакового объема у подготовленных образцов и их высокоэффективную жидкостную хроматографию и определение содержания витамина расчетным путем на основе сравнения площадей пиков проб контрольного и исследуемого образцов, отличающийся тем, что при подготовке контрольного образца в колбе объемом 100 мл перемешивают 50 мл изопропилового спирта и 20-25 мг стандарта витамина А в форме ретинола ацетата до полного растворения указанного стандарта, полученный раствор доводят до метки изопропиловым спиртом и повторно перемешивают, а при подготовке исследуемого образца объект исследований, содержащий 5,16 мг витамина А в форме ретинол ацетата, подвергают экспозиции в соответствии с параметрами, указанными в таблице 1

в 30 мл биорелевантной среды сельскохозяйственных животных или птицы, состав которой приведен в таблицах 2-4, при постоянном перемешивании на биореакторе со скоростью 50 об/мин,

далее к 5 мл раствора объекта исследований в биорелевантной среде, содержащего витамин А, добавляют 10 мл раствора, содержащего аскорбиновую кислоту и воду для анализа в соотношении 1 г : 10 мл соответственно, перемешивают, вносят 20 мл раствора, содержащего гидроксид калия, воду для анализа и этиловый спирт в соотношении 2 г : 2 мл : 18 мл соответственно, снова перемешивают и выдерживают в течение 30 мин на водяной бане при температуре 55-60°С, полученную смесь охлаждают до 20°С, добавляют к ней 10 мл воды для анализа, перемешивают и подвергают двукратной экстракции двумя порциями гексана по 10 мл, отделяют гексановые экстракты, объединяют их и упаривают досуха, а полученный сухой остаток растворяют в 10 мл изопропилового спирта и выдерживают в течение 10 мин в темном месте, после чего отбирают пробы одинакового объема у полученного контрольного и исследуемого образцов, проводят их высокоэффективную жидкостную хроматографию при расходе элюента 0,4 мл/мин и длине волн 328 нм и определяют содержание витамина А расчетным путем.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что при подготовке контрольного образца используют аналитический стандарт витамина А в форме ретинола ацетата.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что при подготовке контрольного образца используют фармацевтический стандарт витамина А в форме ретинола ацетата.