Способ выделения тотальной РНК из межпозвонковых дисков человека Российский патент 2023 года по МПК C12N15/10 G01N33/00 G01N33/48 C12Q1/68 

Изобретение относится к области биотехнологии и молекулярной биологии, а именно к способу выделения рибонуклеиновых кислот (РНК) из биологических образцов - послеоперационного материала межпозвонковых дисков человека.

Получение высокоочищенных и интактных РНК является важной проблемой в молекулярной биологии, особенно такие методики важны для исследования транскриптома различных образцов. Так как транскриптом является крайне тканеспецифичным и сильно зависит от внешних воздействий, способ получения тотальной РНК должен максимально отражать профиль экспрессии в момент забора образца и вносить минимальное искажение в конечный результат. Соблюсти все вышеперечисленные условия достаточно сложно, особенно для некоторых типов материала, к которым относятся, например, межпозвонковые диски человека: в настоящее время активное исследование их транскриптома затруднено в связи со сложностью получения РНК.

Большинство предлагаемых способов выделения РНК из образцов можно отнести к категории инвазивных, то есть требующих ферментативной обработки живых клеток.

Известен способ выделения тотальной РНК из более мягкого пульпозного ядра межпозвонкового диска, которое включает следующие сдадии: сперва образец нарезается на небольшие кусочки, потом обрабатывается коллагеназой II в течение 4 ч при температуре 37°С, затем из полученного образца выделяется фракция хондроцитов, тотальная РНК из которых выделяется с использованием реагента Тризол (TRIzol, Thermo Fisher Scientific, кат. номер 15596026) [1].

Недостатком описанного способа является длительное нагревание образца и его обработка ферментом, что однозначно приведет к существенному изменению профиля экспрессии.

Еще более «инвазивным» аналогом является способ получения первичной культуры хондроцитов для выделения РНК, заключающийся в том, что исходный образец инкубируется с коллагеназой II в течение 12 ч при температуре 37°С, затем выделяется фракция хондроцитов, которая культивируется в питательной среде с антибиотиками (стрептомицин, пенициллин) [2].

Недостатком этого способа также является длительный нагрев с ферментативной обработкой, а также продолжительное культивирование хондроцитов в культуральной среде в присутствии антибиотика и отсутствии внеклеточного матрикса, который очень важен для хрящевых тканей.

Наиболее близким к заявляемому способу - прототипом, является способ выделения РНК из суставных хрящей без предварительной обработки с использованием криопомола [3]. Данный способ предполагает измельчение образца с помощью криогенной мельницы, затем полученная из хряща пудра помещается в реагент Тризол (TRIzol, Thermo Fisher Scientific, кат. номер 15596026) и инкубируется в течение 15 мин при комнатной температуре; далее из образца удаляются центрифугированием сперва крупные фрагменты хряща, затем фильтрованием мелкие, с помощью хлороформа извлекаются белковые примеси и из полученного раствора тотальная РНК осаждается спиртовой преципитацией.

Основным недостатком прототипа является высокая стоимость целевого продукта, связанная с необходимостью использования криогенной мельницы, чтобы не допустить нагревания образца при гомогенизации. Данное оборудование является весьма дорогостоящим (около 10000 €).

Задачей изобретения является получение тотальной РНК высокого качества, пригодной для проведения транскриптомных исследований, а также упрощение и удешевление процесса.

Технический результат: получение тотальной РНК высокого качества, упрощение и удешевление известного способа.

Поставленная задача достигается предлагаемым способом, который заключается в измельчении и гомогенизации хрящей в жидком азоте при помощи ступки и пестика с последующей адсорбцией РНК на стекловолоконном фильтре.

Способ включает следующую последовательность стадий:

1. Измельчение и гомогенизация хряща в ступке в жидком азоте с использованием шила и пестика.

2. Добавление лизирующего реагента QIAzol (QIAGEN, кат. номер 79306), растирание до однородности.

3. Оттаивание образца на льду, повторное добавление реагента QIAzol (QIAGEN, кат. номер 79306).

4. Извлечение белковых примесей экстракцией хлороформом с последующим центрифугированием и разделением фракций.

5. Экстракция тотальной РНК из водной фракции с помощью коммерческого набора «RNEasy plant mini kit» (QIAGEN, кат. номер 74904), согласно инструкции.

Весь процесс выделения РНК занимает около 4 ч. Разработанный способ позволяет получить образцы РНК, пригодные для современных методов исследования, которые требуют очень высокого качества материала, например, секвенирование РНК, рибосомальный профайлинг.

Общий этап с прототипом заключается в гомогенизации образца при низких температурах, однако использование ступки и пестика существенно удешевляет процесс выделения РНК, а адсорбция РНК на стекловолоконном фильтре, который входит в набор, существенно ускоряет процесс.

Определяющими отличительными признаками предлагаемого способа по сравнению с прототипом являются:

1) для измельчения и гомогенизации хрящей используют шило, ступку и пестик, что позволяет удешевить процесс выделения РНК;

2) сразу после измельчения в гомогенат добавляют реагент QIAzol (QIAGEN, кат. номер 79306) из расчета 0,5 мл на каждые 300 мг образца, что позволяет защитить РНК от деградации при оттаивании;

3) для экстракции РНК используют коммерческий набор «RNEasy plant mini kit» (QIAGEN, кат. номер 74904), что позволяет повысить выход и качество выделяемой РНК.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения способа.

Пример 1.

Образец межпозвонкового диска массой 1,8 г поэтапно измельчают в ступке в жидком азоте следующим образом: 1) используя шило, как долото, а пестик, как молоток, дробят образец на небольшие фрагменты; 2) измельчают фрагменты на более мелкие фрагменты, совершая движения пестиком строго вверх-вниз; 3) образец растирают до однородного порошкообразного состояния, осуществляя круговые движения пестиком по дну ступки.

К полученному порошкообразному образцу добавляют 3 мл реагента QIAzol, растирают до однородности в жидком азоте и пересыпают образец в пробирку типа эппендорф на 25 мл, дают азоту испариться, закрывают и перемешивают, переворачивая пробирку. Затем добавляют еще 3 мл реагента QIAzol, перемешивают с использованием смесителя Вортекс 30 с, после чего инкубируют на льду 5 мин. Разливают по 1 мл полученного лизата в 1,5 мл микроцентрифужные пробирки, добавляют по 200 мкл хлороформа в каждую, перемешивают, используя Вортекс, инкубируют 2 мин на льду, затем центрифугируют пробирки 20 мин (10000 g, 4°С). Далее осторожно переносят 400 мкл водной фазы в новые 1,5 мл микроцентрифужные пробирки и добавляют 400 мкл реагента QIAzol. Перемешивают, переворачивая пробирки, инкубируют 30 мин на льду в темноте. Затем добавляют 180 мкл объема хлороформа в каждую, перемешивают, используя Вортекс, 1-2 с. Инкубируют 2 мин на льду, затем центрифугируют пробирки 20 мин (10000 g, 4°С). Далее 250 мкл водной фазы из каждой пробирки переносят в новые 1,5 мл микроцентрифужные пробирки. Для уменьшения расхода колонок и увеличения концентрации РНК на этом этапе можно объединить водную фазу из двух пробирок в одну, таким образом, выделение РНК будет осуществляться из 500 мкл водной фазы.

Для экстракции РНК используют коммерческий набор «RNEasy plant mini kit». В каждую пробирку добавляют 250 мкл перегнанного этанола и перемешивают пипетированием, переносят на «розовые» колонки со стекловолоконным фильтром из набора (RNeasy column), центрифугируют 15 с (10000 g, 15°С), затем удаляют смыв. Далее добавляют 700 мкл буфера RW1 из набора, центрифугируют 15 с (10000 g, 15°С), затем удаляют смыв. Затем добавляют 500 мкл буфера RPE, центрифугируют 15 с (10000 g, 15°С), затем удаляют смыв. Переносят каждую «розовую» колонку в новую пробирку, центрифугируют 1 мин (12000 g, 15°С). Снова помещают «розовые» колонки в новые 1,5 мл микроцентрифужные пробирки и осторожно наносят на фильтр 30 мкл воды, свободной от РНКаз. Инкубируют 1 мин при комнатной температуре, центрифугируют 30 с, при 10000 g, при температуре 15°С.

Содержание РБК в пробе определяли с помощью набора Qubit RNA HS Assay для количественного определения РНК (ThermoScientific, кат. номер Q32852), концентрация составила 71,2 нг/мкл (итого 2,1 мг РНК из образца межпозвонкового диска массой 1,8 г).

Для оценки качества РНК был измерен индекс целостности выделенной РНК с помощью РНК-анализатора Bioanalyzer 2100 (Agilent, кат. номер G2939BA), он составил 7,3 (высоким считается индекс от 6 и выше).

На фиг. 1 представлены этапы предварительного измельчения хряща ступкой и пестиком, где: I - фрагментация большого куска хряща с помощью шила; а - пестик, b - шило, с - хрящ; II - дробление небольших фрагментов хряща; III - раздавливание оставшихся небольших частиц. Жидкий азот не нарисован для упрощения иллюстрации.

Использование предлагаемого способа позволит повысить качество и удешевить выделение РНК из межпозвонковых дисков человека, пригодной для проведения транскриптомных исследований.

Источники информации

1. Gan, M.F.; Yang, H.L.; Qian, J.L.; Wu, C.S.; Yuan, C.X.; Li, X.F.; Zou, J. Comparison of two methods for RNA extraction from the nucleus pulposus of intervertebral discs. Genet. Mol. Res. 2016, 15, doi:10.4238/gmr.15027738.

2. Guo, W.; Mu, K.; Zhang, В.; Sun, C.; Zhao, L.; Dong, Z.Y.; Cui, Q. The circular RNA FAM169A functions as a competitive endogenous RNA and regulates intervertebral disc degeneration by targeting miR-583 and BTRC. Cell Death Dis. 2020 115 2020, 11, 1-17, doi:10.1038/s41419-020-2543-8.

3. Le Bleu, H.K.; Kamal, F.A.; Kelly, M.; Ketz, J.P.; Zuscik, M.J.; Elbarbary, R.A. Extraction of high-quality RNA from human articular cartilage. Anal. Biochem. 2017, 518, 134-138, doi:10.1016/J.AB.2016.11.018.

4. Sophia Fox, A.J.; Bedi, A.; Rodeo, S.A. The Basic Science of Articular Cartilage: Structure, Composition, and Function. Sports Health 2009, 7, 461, doi:10.1177/1941738109350438.

Изобретение относится к области биотехнологии. Описан способ выделения тотальной РНК из межпозвонковых дисков человека. Способ включает измельчение и гомогенизацию исходного образца при низких температурах в лизирующем растворе, удаление белковых примесей с помощью хлороформа с последующим центрифугированием и разделением фракций, экстракцию РНК из водной фракции на стекловолоконном фильтре с использованием коммерческого набора «RNEasy plant mini kit». Изобретение расширяет арсенал методов получения тотальной РНК высокого качества. 1 з.п. ф-лы, 1 ил., 1 пр.

1. Способ выделения тотальной РНК из межпозвонковых дисков человека, включающий измельчение и гомогенизацию исходного образца при низких температурах в лизирующем растворе, удаление белковых примесей с помощью хлороформа с последующим центрифугированием и разделением фракций, экстракцию РНК из водной фракции, отличающийся тем, что к измельченному образцу добавляют реагент QIAzol из расчета 0,5 мл на каждые 300 мг образца и растирают до однородности в жидком азоте, оттаивают образец на льду, повторно добавляют реагент QIAzol, удаляют белковые фракции, отделяют водную фракцию центрифугированием с последующей экстракцией РНК из водной фракции на стекловолоконном фильтре с использованием коммерческого набора «RNEasy plant mini kit».

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что измельчение исходного образца осуществляют в ступке, используя шило как долото, а пестик как молоток, дробя образец на небольшие фрагменты с последующим растиранием до однородного порошкообразного состояния, двигая пестиком строго вверх-вниз и выполняя круговые движения пестиком по дну ступки.