Способ выделения тотальной рибонуклеиновой кислоты из тканей растений плодовых культур Российский патент 2023 года по МПК C12N15/10 C12Q1/68 C12P19/34 

Изобретение относится к области биохимии и молекулярной биологии, и может быть использовано для выделения рибонуклеиновой кислоты (РНК) из растительного материала.

Выделение нуклеиновых кислот (НК) из растительных тканей, является сложной процедурой, что связано с присутствием в тканях плодовых растений сопутствующих биохимических веществ: сложных эфиров, Сахаров, полифенолов и пигментов. Более того, процесс очистки НК, как правило, многостадийный и времязатратный. В большинстве лабораторных методов в качестве денатурирующих агентов применяют достаточно токсичные вещества, такие как фенол, высокие концентрации которых оказывают негативное влияние на здоровье человека [Macedo N.J., Ferreira Т.L. Maximizing total RNA yield from TRIzol reagent protocol: a feasibility study //ASEE zone I conference. - 2014. - C. 1-8].

Один из способов выделения вироидной РНК основывается на обработке растительного материала растворами фенола с последующим обогащением препарата малыми РНК путем хроматографии на неионогенной целлюлозе [Pallis V., Navarro A., Flores R. Isolation of a viroid-like RNA from hop different from hop stunt viroid // J Gen Virol. 1987. - Vol. 68. - P. 3201-3205.].

Недостатками данного способа являются: сложность исполнения, связанная с наличием этапа хроматографии, а также использование токсичных веществ, таких как фенол.

Известен способ выделения РНК с использованием двух экстрагирующих буферов. На первом этапе к порошку семян добавляли аликвоту 400 мкл экстракционного буфера I (100 мМ трис(гидроксиметил) аминометан (Трис), рН 8,0, 150 мМ LiCl, 50 мМ этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), 1,5% додецилсульфат натрия (ДСН), 1,5% 2-меркаптоэтанол). После смешивания содержимого энергичным вихревым перемешиванием добавляли 250 мкл смеси фенол-хлороформ (1:1, рН 4,7) и образцы хорошо перемешивали переворачиванием. После центрифугирования образовавшуюся верхнюю водную фазу переносили в новую 1,5-мл пробирку, содержащую 250 мкл экстракционного буфера II (70% сульфат гуанидиния (вес/объем), 0,75 М цитрата натрия, 10% лаурилсаркозин, 2 М натрия ацетата, рН 4,0). К извлеченному супернатанту (около 450 мкл) добавляли 300 мкл изопропанола и 250 мкл 1,2 М хлорида натрия. Полученные осадки РНК сушили и суспендировали в соответствующем объеме воды.

Недостатком способа является использование большого количества токсичных для оператора веществ: фенола, сульфата гуанидиния и хлороформа.

Наиболее близким способом является экспресс-способ, заключающийся в последовательной экстракции в буферном растворе, ДСН и 5 М ацетате калия с дальнейшим осаждением НК этанолом. Растительный образец измельчали в жидком азоте, а затем использовали аликвоты по 0,1 г для каждого метода экстракции. Навеску растительной ткани гомогенизировали в 2,5 мл буфера для экстракции (100 мМ трис (гидроксиметил) аминометан + НСl (Трис-НСl), 50 мМ ЭДТА, рН 8,0, 500 мМ NaCl, 10 мМ денатурирующего агента 2-меркаптоэтанола), 0,5 мл гомогената переносили в пробирку на 1,5 мл и инкубировали с 25 мкл 20% ДСН при 65°С в течение 20 мин. Затем добавляли экстракту 125 мкл 5 М ацетата калия и смесь выдерживали при 0°С в течение 20 мин. Затем пробирки центрифугировали при 10 К в течение 15 мин для удаления нежелательных растительных остатков. Нуклеиновые кислоты извлекали из супернатанта осаждением этанолом и ресуспендировали в 50 мкл стерильной воды.

Недостатки заключаются в наличие в препарате тотальной РНК, двух-цепочечной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) и одноцепочечной ДНК и неудовлетворительное качество по соотношению экстинкций 260 нм/ 280 нм, показывающие наличие белкового загрязнения.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является увеличение выхода и повышение качества препарата тотальной РНК из различных тканей плодовых растений.

Технический результат достигается тем, что на этапе экстракции нуклеиновых кислот (НК) из тканей растений плодовых культур богатых содержанием, прежде всего, фенольных веществ, в состав экстрагирующего буфера кроме 200 мМ Трис-HCl рН 8.5, 50 мМ ЭДТА, 500 мМ NaCl, 1% 2-меркаптаэтанол, добавляют хаотропный агент - 2% додецилсульфат натрия (ДСН) и повышающий вязкость раствора антиоксидант - 2% поливинилпир-ролидон 40 (ПВП 40); для очистки и осаждения тотальной рибонуклеиновой кислоты на втором этапе выделения используют изопропиловый спирт (94%), для промывки НК используется солевой буфер: 160 мМ ацетата натрия, 23 мМ Трис-HCl рН 8.0, 0.1 мМ ЭДТА; для селективного осаждения рибонуклеиновой кислоты и обогащения тотального препарата РНК молекулами микрорибонуклеиновой кислоты (миРНК) используют смесь LiCl/мочевина в концентрации 4 М.

Способ выделения тотальной рибонуклеиновой кислоты включает в себя следующие последовательные этапы:

1) приготовление буферных растворов;

2) пробоподготовка;

3) лизис клеточных мембран и экстракция рибонуклеиновой кислоты из клеток тканей растений плодовых культур в экстрагирующем буфере;

4) центрифугирование с целью удаления неэкстрагированых клеточных структур;

5) осаждение НК;

6) промывка в солевом буферном растворе (промывочный раствор)

7) селективное осаждение РНК;

8) промывка в 70%-м растворе этанола;

9) растворение осадка РНК в трис-ЭДТА (ТЕ).

К измельченной ткани растения добавляют от 1 - 2 мл экстрагирующего буфера (200 мМ Трис-HCl рН 8.5, 50 мМ ЭДТА, 500 мМ NaCl, 1% 2-меркаптаэтанол, 2% ДСН, 2% ПВП 40). Полученный раствор разрушенных клеток (лизат) инкубировали на твердотельном термостате при 56°С в течении 20 минут, затем охлаждали до комнатной температуры и вносили 300 мкл 5М ацетата натрия. Затем проводили инкубацию при температуре близкой к 0°С в течении 20 мин. Пробирки центрифугировали при 12 000g и 4°С, 15 мин. Далее дозатором, стараясь не задевать интерфазы и осадка, собрали супернатант и переносили в новые пробирки 1,5 мл и добавляли 800 мкл изо-пропилового спирта в каждую. После осаждения экстракта нуклеиновых кислот, осадок ресуспендировали в 200 мкл промывочного солевого буфера (160 мМ ацетата натрия, 23 мМ Трис-HCl рН 8.0, 0.1 мМ ЭДТА), после полного растворения осадка, вносили 400 мкл 96% этанола, перемешивали и центрифугировали на 16 000g при 4°С 10 мин. Надосадочную жидкость сливали, дожидались высыхания осадка, не допуская его пересыхания. Затем растворяли осадок в 133 мкл воды, добавляли 167 мкл 8М LiCl/мочевина и инкубировали 60 мин при температуре от 0 до 4°С. Центрифугировали пробы 30 мин при 16 000g и 4°С, сливали надосадочную жидкость и добавляли к осадку 150 мкл 70% охлажденного этанола. Ресуспендировали осадок. Центрифугировали пробирки при 4°С, в режиме короткого центрифугирования (shot-spin) 20-30 секунд. Дождались высыхания осадка, не допуская пересушивания, затем растворяли осадок в 60 мкл буфера ТЕ.

В результате проведенных исследований и сравнений с аналогом было определено, что добавление на первом этапе экстракции тотальной рибонуклеиновой кислоты ПВП 40 в экстрагирующий буфер позволило удалить примеси органических загрязнителей и сохранить их структуру от действия окислителей, а включение в процесс выделения этапов осаждения изопропа-нолом и промывки в буферах, содержащих ацетат натрия, повышает выход тотальной РНК. Осаждение РНК в присутствии LiCl/мочевина в конечной концентрации 4 М, позволило избавиться от примеси ДНК в выделяемом образце.

Исследования проведены более чем на 100 образцах растительного материала различных плодовых культур. В качестве материала использовали листья, корни и стебли плодовых растений.

Пробы анализировали на нанофотометре NanoPhotometer® NP80 по показателям оптической плотности раствора, по коэффициентам соотношений длин волн 260/280 нм, 260/230 нм. Количество выделенной РНК рассчитывалось на длине волны 260 нм. Результаты показаны в таблице 1.

Качество выделенной РНК оценивалось методом гель электрофореза в 2%-агарозном геле, после денатурации образца выделенной РНК. И определялось соотношением полос по 28S и 18S РНК (фиг. 1). Соотношение полос, в среднем было 1:1. Интенсивность флюоресценции полосы 28S выше, чем у 18S. Полос ДНК не наблюдалось.

Примеры конкретного исполнения

Пример 1. Для выделения препарата тотальной РНК из листьев черешни сорта Алая, проводили пробоподготовку с использованием жидкого азота и керамических ступки и пестика. Материал измельчали до состояния гомогенной пудры и количественно, по 70 - 100 мг, переносили в пластиковую пробирку объемом 1,5 мл и вносили 1 мл экстрагирующего буфера (200 мМ Трис-HCl рН 8.5, 50 мМ ЭДТА, 500 мМ NaCl, 1% 2-меркаптаэтанол, 2% ДСН, 2% ПВП 40). Полученный раствор разрушенных клеток (лизат) инкубировали на твердотельном термостате в течении 20 минут, затем охлаждали до комнатной температуры и вносили 300 мкл 5М ацетата натрия. Затем проводили инкубацию при температуре близкой к 0°С в течении 20 мин. Пробирки центрифугировали при 12 000g и 4°С, 15 мин, не задевая интерфазы и осадка, дозатором собрали супернатант, переносили в новые пробирки 1,5 мл и добавляли 800 мкл изопропилового спирта в каждую. После осаждения НК, осадок ресуспендировали в 200 мкл промывочного солевого буфера (160 мМ ацетата натрия, 23 мМ Трис-HCl рН 8.0, 0.1 мМ ЭДТА), после полного растворения осадка, внесли 400 мкл 96% этанола, перемешивали и центрифугировали на 16000g при 4°С 10 мин. Надосадочную жидкость сливали, дождались высыхания осадка, не допуская его пересыхания. Затем растворяли осадок в 133 мкл воды, добавляли 167 мкл 8М LiCl/мочевина и инкубировали 60 мин при температуре от 0 до 4°С.Центрифугировали пробы 30 мин при 16 000g и 4°С, сливали надосадочную жидкость и добавляли к осадку 150 мкл 70% охлажденного этанола. Ресуспендировали осадок. Центрифугировали пробирки при 4°С в режиме короткого центрифугирования (shot-spin) 20-30 секунд. Дождались высыхания осадка, не допуская пересушивания, затем растворяли осадок в 60 мкл буфера ТЕ. Содержание РНК в пробе определяли спектрофотометрически.

В результате из 70 - 100 мг материала было выделено от 250-375 нг РНК. Чистота по показателям отношения коэффициентов экстинкции была 2.07 для (260/280 нм) и 2.03 для (260/230 нм).

Пример 2. Выделение препарата тотальной РНК из кожицы плодов яблони Женева Эрли, использовали ручную гомогенизацию с применением пластикового микропестика и микропробирки объемом 2 мл. В пробирку вносили 70 мг кожицы плода яблони сорта Женева Эрли и 1 мл экстрагирующего буфера. Проводили согласно Примеру 1.

Качественные показатели полученного препарата тотальной РНК исследовали методом спектрофотометрии. В результате из 70 мг материала было выделено от 50-120 нг РНК. Чистота по показателям отношения коэффициентов экстинкции была 2.05 для (260/280 нм) и 1. 94 для (260/230 нм).

Пример 3. Выделение препарата тотальной РНК из корней подвоя косточковых культур ПК СК 1.

В пробирку вносили 1 г корней и 2,5 мл экстрагирующего буфера, измельчали до гомогенного состояния и инкубировали при комнатной температуре в течении 5 минут. Из полученного гомогената отбирали жидкую фазу и переносили в пробирки объемом 1,5 мл. С полученным лизатом проводили манипуляции, описанные в примере 1.

Полученный препарат тотальной РНК исследовали методом спектро-фотометрии. В результате из 1 г материала было выделено от 250-400 нг РНК. Чистота по показателям отношения коэффициентов экстинкции была 2.15 для (260/280 нм) и 2. 01 для (260/230 нм).

Изобретение относится к биохимии и молекулярной биологии. Предложен способ выделения тотальной рибонуклеиновой кислоты из тканей растений плодовых культур, включающий лизис клеточных мембран и экстракцию нуклеиновых кислот из растительных клеток, при этом в качестве экстрагирующего буфера используют 200 мМ Трис-HCl рН 8.5, 50 мМ ЭДТА, 500 мМ NaCl, 1% 2-меркаптаэтанол, 2% ДСН, 2% ПВП 40; для очистки и осаждения тотальной рибонуклеиновой кислоты на втором этапе выделения используют изопропиловый спирт (94%), в промывочном буфере - ацетат натрия в концентрации 160 мМ и 23 мМ Трис-НСI рН 8.0, 0.1 мМ ЭДТА; для селективного осаждения рибонуклеиновой кислоты и обогащения тотального препарата РНК молекулами микрорибонуклеиновой кислоты (миРНК) - смесь LiCl/мочевина в концентрации 8 М. Изобретение обеспечивает повышение качества препарата тотальной РНК из различных тканей плодовых растений. 1 ил., 1 табл., 3 пр.

Способ выделения тотальной рибонуклеиновой кислоты из тканей растений плодовых культур, включающий лизис клеточных мембран и экстракцию нуклеиновых кислот из растительных клеток, отличающийся тем, что используют экстрагирующий буфер следующего состава: 200 мМ Трис-HCl рН 8.5, 50 мМ ЭДТА, 500 мМ NaCl, 1% 2-меркаптаэтанол, 2% ДСН, 2% ПВП 40; для очистки и осаждения тотальной рибонуклеиновой кислоты на втором этапе выделения используют изопропиловый спирт (94%), в промывочном буфере используют ацетат натрия в концентрации 160 мМ и 23 мМ Трис-НСI рН 8.0, 0.1 мМ ЭДТА; для селективного осаждения рибонуклеиновой кислоты и обогащения тотального препарата РНК молекулами микрорибонуклеиновой кислоты (миРНК) используют смесь LiCl/мочевина в концентрации 8 М.