Способ выделения тотальной рибонуклеиновой кислоты из мицелия фитофторы Российский патент 2023 года по МПК C07H21/02 

Изобретение относится к области биотехнологии и молекулярной биологии, а именно к способу выделения рибонуклеиновых кислот (РНК) из биологических образцов - мицелия фитофторы Phytophthora infestans.

Получение высокоочищенных и интактных РНК из грибов и грибоподобных организмов является важной проблемой в молекулярной биологии, особенно такие методики важны для исследования транскриптома. Сложности с выделением РНК возникают в первую очередь из-за толстой клеточной стенки и активных эндогенных РНКаз.

P. infestans - это паразитический Оомицет, поражающий такие значимые хозяйственные культуры, как картофель и томаты. Не являясь родственником настоящих грибов, она демонстрирует определенное конвергентное сходство с ними, формируя несептированный мицелий с клеточной стенкой из целлюлозы и бета-глюканов, поэтому проблемы, встающие при выделении РНК из настоящих грибов, справедливы и в случае P. Infestans.

Из уровня техники известен способ выделения РНК (патент RU2232810). Способ включает инкубацию биологического образца с мелкодисперсным сетчатым стеклом, предварительно обработанным 3,5-7% раствором плавиковой кислоты, в течение 2-6 ч в буферном растворе, содержащем хаотропный агент, отделение сорбента и связанной с сорбентом РНК центрифугированием, промывку сорбента и элюирование РНК из сорбента буферным раствором, содержащим 5-50 мМ гидрокарбоната ионов (HCO3) и 5-10 мМ ЭДТА при рН 8,0-10,0. Способ позволяет сократить время процесса, повысить выход РНК и обеспечить выделение как низкомолекулярных, так и высокомолекулярных фракций РНК.

Недостатком прототипа является отсутствие значимых подробностей при выделении, которые могут существенно влиять на общий выход и качество РНК: время измельчения, добавление ингибиторов РНКаз, использование лизирующего буфера.

Задачей изобретения является получение тотальной РНК высокого качества из мицелия фитофторы P. infestans.

Технический результат заключается в получении тотальной РНК из мицелия фитофторы (P. Infestans). Кроме того, технический результат заключается в оптимизации проведения транскриптомных исследований. Дополнительный технический результат заключается в сокращении операций для получения тотальной РНК из мицелия фитофторы.

Технический результат достигается предлагаемым способом, который заключается в сборе материала, его измельчении в приборе, например, Tissue Lyzer LT (QIAGEN) с последующей адсорбцией РНК на стекловолоконном фильтре, например, из набора «RNEasy plant mini kit» (QIAGEN).

Способ включает следующую последовательность стадий:

1. Сбор биомассы P. infestans и ее заморозка в жидком азоте.

2. Измельчение мицелия в шаровой мельнице - гомогенизаторе, с добавлением лизирующего реагента, например тризол или Qiazol.

3. Инкубация образца на льду.

4. Удаление белковых примесей хлороформной экстракцией.

5. Выделение тотальной РНК на стекловолоконном фильтре.

Разработанный способ позволяет получить образцы РНК, пригодные для современных методов исследования, которые требуют очень высокого качества материала, например, изучение экспрессии и переключения генов.

При выделении тотальной рибонуклеиновой кислоты из мицелия фитофторы, измельчают и гомогенизируют биологический образец мицелия фитофторы при температуре ниже 0°С в лизирующем растворе, далее удаляют из него белковые примеси с помощью хлороформа с последующим центрифугированием и разделением фракций. При этом водную фракцию, содержащую РНК, смешивают с 96% этанолом в пропорции 2:1 и наносят на стекловолоконный фильтр для дальнейшей экстракции.

В частном варианте осуществления способа, при выделении тотальной рибонуклеиновой кислоты из мицелия фитофторы, измельчают и гомогенизируют биологический образец мицелия фитофторы в лизирующем растворе. Из раствора удаляют белковые примеси с помощью хлороформа с последующим центрифугированием и разделением фракций, далее проводят экстракцию РНК из водной фракции. К измельченному образцу добавляют реагент QIAzol, из расчета 0,5 мл на каждые 300 мг образца и растирают до однородности в жидком азоте. Образец размещают на льду для дальнейшего его оттаивания. Далее повторно добавляют реагент QIAzol, удаляют белковые фракции, отделяют водную фракцию центрифугированием с последующей экстракцией РНК из водной фракции на стекловолоконном фильтре.

Пример №1.

С помощью препаровальной иглы из чашек Петри собирается выращенный на среде с агаром образец мицелия фитофторы P. infestans массой, помещается в микроцентрифужную пробирку и замораживается в жидком азоте.

Далее замороженный мицелий измельчается с помощью стальных шариков на приборе Tissue Lyser LT, режим измельчения: частота колебаний 50 Гц, время обработки 15 с (увеличение времени приводит к падению качества тотальной РНК и контаминации образца примесью ДНК). Ротор прибора предварительно охлаждается до -70°С. Сразу после измельчения к образцам добавляется лизирующий реагент тризол. Образцы тщательно перемешиваются и инкубируются на льду.

Затем для удаления белковых примесей производится их экстракция хлороформом, для этого хлороформ добавляется к образцу, тщательно перемешивается и инкубируется на льду. Далее образец центрифугируется в 400 - 500 мкл водной фазы отбирается в новую микроцентрифужную пробирку.

Для экстракции к водной фракции, содержащей РНК образец добавляется 200 мкл 96% этанола в пропорции 2:1, образец перемешивается пипетированием, переносится на колонку со стекловолоконным фильтром, центрифугируется, после этого смыв удаляется.

Содержание РНК в пробе определяется с помощью набора Qubit RNA HS Assay (Измерение концентрации двуцепочечной РНК в пробе) для количественного определения РНК, концентрация составила 55 нг/мкл (итого 2,75 мг РНК из образца мицелия массой 100 мг).

Для оценки качества РНК был измерен индекс целостности выделенной РНК с помощью РНК-анализатора, он составил 7,2.

Пример №2.

С помощью препаровальной иглы из чашек Петри собирается выращенный на среде с агаром образец мицелия фитофторы P. infestans массой, помещается в микроцентрифужную пробирку и замораживается в жидком азоте.

Далее замороженный мицелий измельчается с помощью стальных шариков на приборе Tissue Lyser LT, режим измельчения: частота колебаний 60 Гц, время обработки 10 с (увеличение времени приводит к падению качества тотальной РНК и контаминации образца примесью ДНК). Ротор прибора предварительно охлаждается до -80°С. Сразу после измельчения к образцам добавляется лизирующий реагент QIAzol. Образцы тщательно перемешиваются и инкубируются на льду.

Затем для удаления белковых примесей производится их экстракция хлороформом, для этого хлороформ добавляется к образцу, тщательно перемешивается и инкубируется на льду. Далее образец центрифугируется в 400 - 600 мкл водной фазы отбирается в новую микроцентрифужную пробирку.

Для экстракции к водной фракции, содержащей РНК образец добавляется 300 мкл 96% этанола в пропорции 2:1, образец перемешивается пипетированием, переносится на колонку со стекловолоконным фильтром, центрифугируется, после этого смыв удаляется.

Содержание РНК в пробе определяется с помощью набора Qubit RNA HS Assay (Измерение концентрации двуцепочечной РНК в пробе) для количественного определения РНК, концентрация составила 45 нг/мкл (итого 1,35 мг РНК из образца мицелия массой 100 мг).

Для оценки качества РНК был измерен индекс целостности выделенной РНК с помощью РНК-анализатора, он составил 7,2.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ выделения тотальной рибонуклеиновой кислоты из мицелия фитофторы, характеризующийся тем, что измельчают и гомогенизируют биологический образец мицелия фитофторы в течение 10-15 с стальными шариками с частотой 50-60 Гц, при температуре ротора от -70 до -80 °C в лизирующем реагенте Trizol или Qiazol, удаляют из него белковые примеси с помощью хлороформа, далее центрифугируют и разделяют на фракции; при этом водную фракцию, содержащую РНК, смешивают с 96% этанолом в пропорции 2:1 и наносят на стекловолоконный фильтр RNEasy для экстракции, далее определяют количественное наличие РНК при помощи набора Qubit RNA HS Assay. Изобретение обеспечивает расширение арсенала способов получения тотальной РНК из биологических образцов - мицелия фитофторы. 2 пр.

Способ выделения тотальной рибонуклеиновой кислоты из мицелия фитофторы, характеризующийся тем, что измельчают и гомогенизируют биологический образец мицелия фитофторы в течение 10-15 с стальными шариками с частотой 50-60 Гц, при температуре ротора от -70 до -80 °С в лизирующем реагенте Trizol или Qiazol, удаляют из него белковые примеси с помощью хлороформа, далее центрифугируют и разделяют на фракции; при этом водную фракцию, содержащую РНК, смешивают с 96% этанолом в пропорции 2:1 и наносят на стекловолоконный фильтр RNEasy для экстракции, далее определяют количественное наличие РНК при помощи набора Qubit RNA HS Assay.