СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТЕКТИВНОЙ БЕЛОКСОДЕРЖАЩЕЙ ФРАКЦИИ БАКТЕРИЙ Российский патент 2014 года по МПК C12P21/00 C07K2/00 C12N1/00 A61K39/85 

Описание патента на изобретение RU2533815C1

Изобретение относится к медицине, а именно к вакцинным препаратам, и касается способа получения протективных антигенов на основе секретируемых белоксодержащих соединений Staphylococcus aureus, которые могут быть использованы для получения профилактических и лечебных иммунопрепаратов.

Проблема стафилококковых инфекций на протяжении многих лет является одной из актуальнейших проблем медицинской науки и здравоохранения всего мира, поскольку Staphylococcus aureus - доминирующий возбудитель гнойно-септических внутрибольничных инфекций. Проблема антибиотикотерапии осложнена распространенностью метициллинрезистентных штаммов, а также тем, что многие антибиотики, обладая иммунодепрессивными свойствами, снижают защитные силы организма. Трудности терапии определяют необходимость профилактики и комплексной терапии стафилококковой инфекции, включающей использование бактериостатических и иммунобиологических препаратов, активирующих иммунную систему. Разработка стафилококковых вакцин велась в различных направлениях, однако по разным причинам в настоящее время отсутствуют коммерческие противостафилококковые иммунопрепараты с доказанной эффективностью.

В последние годы большое внимание уделяют исследованиям по изучению патогенеза стафилококковой инфекции, в которых выявлена значимость многочисленных факторов патогенности, таких, в частности, как секретируемые белки [Otto M. Novel targeted immunotherapy approaches for staphylococcal infection. Expert Opin Biol Ther. 2010 July; 10(7): 1049-59. doi:10.1517/14712598.2010.495115].

Однако в настоящее время нет препаратов с доказанной эффективностью, поскольку при изучении вакцин, разработанных на основе железорегулируемого белка IsdB [Intercell in trouble as Merck stops MRSA vaccine trial. World News, 09.06.2011.; Kuklin N.A., dark D.J, Secore S., Cook J., Cope L.D, McNeely T. et al. A novel Staphylococcus aureus vaccine: iron surface determinant В induces rapid antibody responses in rhesus macaques and specific increased survival in a murine S. aureus sepsis model. Infect. Immun. 2006; 74(4): 2215-2223], хлопьеобразующего фактора ClfA [DeJonge M., Burchfield D., Bloom В., Duenas M., Walker W., Polak M. et al. Clinical trial of safety and efficacy of INH-A21 for the prevention of nosocomial staphylococcal bloodstream infection in premature infants. J. Pediatr. 2007 151(3): 260-265; Josefsson E., Hartford 0., O′Brien L., Patti J.M., Foster T. Protection against experimental Staphylococcus aureus arthritis by vaccination with clumping factor A, a novel virulence determinant. J. Infect. Dis. 2001; 184(12): 1572-1580] или лейкоцидина Пантона-Валентайна (PVL), получены противоречивые результаты [Brown E.L., Dumitrescu О., Thomas D., Badiou С., Koers E.M., Choudhury P. et al. The Panton-Valentine leukocidin vaccine protects mice against lung and skin infections caused by Staphylococcus aureus USA 300. Clin. Microbiol. Infect. 2008; 15(2); 156-164; Bubeck Wardenburg J., Palazzolo-Ballance A.M., Otto M., Schneewind O., DeLeo F.R. Panton-Valentine leukocidin is not a virulence determinant in murine models of community-associated methicillinresistant Staphylococcus aureus disease. J. Infect. Dis. 2008; 198(8): 1166-1170].

Проводятся также исследования белоксодержащих соединений, секретируемых бактериальной клеткой в процессе ее жизнедеятельности.

Известен способ получения протективной белоксодержащей фракции бактерий, включающий культивирование бактерий на жидких питательных средах, отделение культуральной среды от бактерий. Культуральную среду, содержащую секретируемые белоксодержащие фракции, подвергают очистке и концентрируют методом ультрафильтрации с порогом отсечения белка 30 кДа и колоночной хроматографии с помощью гель-фильтрации на сефадексе G-75 и последующей очистке на ДЕАЕ-сефарозе в градиенте Nad до получения фракций с молекулярной массой 30-50 кДа и содержанием белка 4-5 мг/мл. Для получения протективных антигенов на основе секретируемых белоксодержащих фракций используют нетоксигенные штаммы грамотрицательных или грамположительных микроорганизмов (RU 2311197 C1, A61K 39/00, 2007).

Недостатком этого способа является невозможность получения препаратов на основе протективного секретируемого стафилококкового белоксодержащего соединения для лечения и профилактики стафилококковых инфекций.

Техническим результатом, на решение которого направлено данное изобретение, является создание обладающего протективными свойствами белоксодержащего соединения на основе секретируемых белоксодержащих соединений Staphylococcus aureus, которые могут быть использованы для лечения и профилактики стафилококковых инфекций.

Для достижения указанного технического результата в способе получения протективной белоксодержащей фракции бактерий, включающем культивирование бактерий на жидкой питательной среде, отделение культуральной среды от бактерий и последующую очистку и концентрирование методом ультрафильтрации до получения белоксодержащей фракции бактерий, согласно изобретению осуществляют культивирование на жидкой питательной среде вирулентного штамма бактерий Staphylococcus aureus № 6, отделение культуральной среды от бактерий проводят путем фильтрования через фильтр PLASMAFILTER PLASMAFLUX PSu 2S с последующим добавлением к полученному фильтрату сульфата аммония, центрифугированием его при 10000 g в течение 30 минут и растворением в фосфатном буфере с pH 7,4, перед очисткой и концентрированием проводят микрофильтрацию белоксодержащей фракции через мембрану 0,22 мкм и обессоливание на колонке PD-10, а очистку и концентрирование осуществляют путем проведения ион-обменной хроматографии на колонке Q-сефарозы и элюции 0,15 М NaCl, ультрафильтрации на двух фильтрах 100 и 30 кДа до получения белоксодержащей фракции с молекулярной массой 30-90 кДа и содержанием белка 0,5-1,0 мг/мл.

Кроме того, в жидкую питательную среду добавляют 2,0 г/л экстракта дрожжевого растворимого при следующем соотношении компонентов питательной среды:

KH2PO4 - 4,50 г/л

K2HPO4 - 5,00 г/л

(NH4)2SO4 - 1,00 г/л

MgSO4×7H2O - 0,30 г/л

Цитрат натрия - 0,50 г/л

Глюкоза - 2,0 г/л

Экстракт дрожжевой растворимый - 2,0 г/л.

В предварительных экспериментах было выявлено, что в качестве продуцента протективных белоксодержащих соединений S. aureus целесообразно использование вирулентного слабоиммуногенпого штамма №6 по сравнению с высокоиммуногенным слабовирулентным штаммом №1991 (ЛД50 последнего (0,5-2,0)×109). Для изучения протективной активности выделенных белоксодержащих соединений иммунизацию мышей проводили подкожно двукратно двумя десятикратно убывающими дозами препаратов, выделенных из штаммов №№1991 и 6; заражали двумя штаммами S.aureus: №№1986 и 6. Перед заражением мышей была оттитрована доза ЛД50, которая составляла для штаммов №№1986 и 6 соответственно 1,14×109 и 0,18×109. Результаты, приведенные в таблице 1, свидетельствуют о большей выживаемости мышей, иммунизированных препаратом из штамма №6 в дозе 1,0 мкг белка на мышь, при заражении 2,2 ЛД50 двух штаммов, что говорит о более высоких протективных свойствах изучаемого препарата.

Пример осуществления способа

Способ получения протективного секретируемого белоксодержащего соединения S. aureus №6, предусматривающий следующие стадии:

а) культивирование S. Aureus №6 в жидкой синтетической питательной среде;

б) отделение микробной массы стерилизующей фильтрацией;

в) концентрирование и очистка фильтрата методом ион-обменной хроматографии;

д) фракционирование по молекулярной массе с помощью ультрафильтрации на двух фильтрах с порогом отсечения белка ниже 30 кДа и выше 100 кДа.

Вирулентный штамм S. aureus №6, полученный из ФГБУ «НЦ ЭСМП» Минздрава России, ЛД50 которого при внутривенном и внутрибрюшинном заражении соответственно (0,8-2,8)×108 и (0,04-1,9)×108, выращивали в синтетической среде следующего состава, с добавлением экстракта дрожжевого растворимого:

KH2PO4 - 4,50 г/л

K2HPO4 - 5,00 г/л

(NH4)2SO4 - 1,00 г/л

MgSO4×7H2O - 0,30 г/л

Цитрат натрия - 0,50 г/л

Глюкоза - 2,0 г/л

Экстракт дрожжевой растворимый - 2,0 г/л.

Флакон с 200 мл питательной среды инокулировали 5-7 изолированными колониями агаровой культуры и после 12-14-часовой инкубации выросшую культуру переносили в бутыль с 2 л среды, сохраняя соотношение культуры к среде 1:10, и инкубировали при 37°C и 90 об/мин на Biosan Multi-Shaker. Рост бактерий контролировали по оптической плотности при 565 нм (на спектрофотометре Genesys 10 UV, Thermo Spectronic, Rochester, NY, USA) и заканчивали через 4,5 ч - в конце фазы экспоненциального роста. Уровень накопления биомассы по оптической плотности (ΔОП=ОПконечн-ОПначальн) составляет 2,7±0,6, что соответствует (1,5±0,4)×109 микробных клеток/мл, рассчитанных по КОЕ.

Полученную микробную суспензию фильтруют через фильтр PLASMAFILTER PLASMAFLUX PSu 2S, что позволяет избежать использования азида натрия, который применяют для инактивации бактерий, и полноту стерилизации фильтрата контролируют путем высева на питательный агар. К полученному фильтрату прибавляют сульфат аммония до 80% насыщения по методу [Koide N., Muramatsu T. Endo-N-acetylglucosaminnidase acting on carbohydrate moieties of glycoproteins. Mol. Microbiol., 1974, 249 (15)^897-4904]. Осадок отделяют центрифугированием при 10000 g в течение 30 минут, растворяют в 50 мл фосфатного буфера pH 7,4. Проводят микрофильтрацию через мембрану 0,22 мкм и обессоливание на колонке PD-10.

Фракционирование с помощью ион-обменной хроматографии проводят на колонке Q-сефарозы с последующей элюцией 0,15 М NaCl. Концентрирование и очистку методом ультрафильтрации выполняют на двух фильтрах 100 и 30 кДа и в итоге получают соединение с молекулярной массой свыше 30 кДа (рис.1) и содержанием белка 0,5-1,0 мг/мл.

Исследование протективной активности

Для оценки протективной активности полученных соединений в эксперименте активной защиты иммунизацию мышей линии BALB/c проводят 2-кратно подкожно с интервалом 14 дней. Иммунизированных мышей заражают разными дозами S. aurens №6.

В таблице 2 приведены результаты изучения выделенного белоксодержащего соединения в опытах активной защиты мышей линии BALB/c при внутривенном заражении штаммом S. aureus №6. Показано, что выделенное белоксодержащее соединение при иммунизирующих дозах 4,0 и 12,0 мкг (группа 1, 3) обладает протективной активностью: значимые различия с контролем (группа 2, 4), соответственно p<0,05 и p<0,01.

Исследование антигенной активности

Для получения кроличьих сывороток разработана курсовая схема иммунизации белоксодержащим препаратом при суммарной иммунизирующей дозе - 480 мкг белка, в то время как по данным исследователей при получении сывороток к секретируемым белкам S. aureus (коагулазе, железорегулируемым белкам, хлопьеобразующему фактору и фибронектин-связывающему белку) она составляет 1500 мкг [Arrecubieta С., Matsunaga I., Asai Т., Naka Y., Deng M.C., Lowy F.D Vaccination with clumping factor A and fibronectin binding protein A to prevent Staphylococcus aureus infection of an aortic patch in mice. J Infect Dis., 2008, 198: 571-575; Cheng A.G., McAdow M., Kirn H.K., Bae Т., Missiakas D., Schneewind O. Contribution of Coagulases towards Staphylococcus aureus Disease and Protective Immunity. PLoS Pathog 6(8): e1001036. doi: 10.1371/journal. ppat.1001036; Kirn H.K., DeDent A, Cheng A.G, McAdow M, Bagnoli F, Missiakas D.M, Schneewind O. IsdA and IsdB antibodies protect mice against Staphylococcus aureus abscess formation and lethal challenge. Vaccine. 2010, 28: 6382-92].

Для получения мышиных сывороток животных иммунизировали двукратно в дозах 4,0-12,0 мкг белка.

Изучение антигенных свойств белоксодержащих соединений проводили в твердофазном ИФА, определяя динамику накопления специфических IgG антител в полученных сыворотках кроликов (средние данные по сывороткам, полученным от 3 кроликов) и в сыворотках крови иммунизированных мышей, полученной через 14 суток после второй иммунизации. Сыворотки изучены в подобранных условиях ИФА: сорбция антигенного препарата в дозе 10 мкг белка/мл; использован антивидовой конъюгат - антитела диагностические против IgG кролика или мыши, меченные пероксидазой, в разведении 1:200; исходное разведение сыворотки в 100 раз. Учет проводили на планшетном фотометре (bio Rad) при λ 450 нм по оптической плотности иммунных сывороток с вычетом фона (ΔОПим-ф). В таблицах 3 и 4 приведены полученные результаты, свидетельствующие о высокой антигенпой активности полученных иммунных кроличьих и мышиных сывороток.

Полученные кроличьи и мышиные сыворотки изучены в опытах пассивной защиты мышей, для чего их вводят мышам линии BALB/c внутрибрюшинно по 0,5 мл сывороток иммунных и интактных животных, разведенных в 5 раз. Через 2 часа после введения сывороток мышей заражают внутрибрюшинно разведением штамма S. aureus №6 в 0,4% агаре в дозе 2,5×107 на мышь. Учет выживаемости мышей приведен в таблице 5 и свидетельствует о протективных свойствах мышиных и кроличьих сывороток, полученных при иммунизации белоксодержащим препаратом, поскольку выявлены различия с контрольной группой (p=0,022<0,05). При этом различий с контролем в пассивной защите сыворотками интактных мышей и кроликов (соответственно, группы 2 и 3, 5 и 6) не выявлено, т.к. p>0,05 (p=0,576 и 0,302).

Преимущество изобретения заключается в создании белоксодержащего соединения, обладающего антигенными и протективными свойствами, рассматриваемого как кандидат при разраработке противостафилококковой вакцины, предназначенной для профилактики и терапии инфекций, вызываемых S. aurens, выделенного из стерильного фильтрата культуральной жидкости вирулентного штамма S. aureus №6, выращенного в синтетической питательной среде, очищенного и концентрированного до содержания 0,5-1,0 мг белка в мл.

Таблица 1 Сравнение протективных свойств белоксодержащих препаратов, выделенных из вирулентного штамма S.aureus №6 и слабовирулентного штамма №1991 №п/п групп Иммунизирующий препарат Заражающий штамм Отношение количества выживших мышей к зараженным из штамма № доза, мкг белка доза, ×109 абс % 1 1991 0,1 1986 2,5 0/10 0 2 6 0,4 0/10 0 3 1,0 1986 2,5 4/10 50 4 6 0,4 1/10 10 5 6 0,1 1986 2,5 2/10 20 6 6 0,4 1/10 10 7 1,0 1986 2,5 7/10 70 8 6 0,4 8/10 80 9 Невакцинированные (контроль) 1986 2,5 0/10 0 10 6 0,4 0/10 0

Различия протективных свойств иммунизирующих препаратов между группами определяли с использованием критерия согласия Пирсона - %2 (программа BioStat D):

для 7 и 9 групп χ2=7,912, p=0,005 (<0,05);

для 8 и 10 групп χ2=10,208, p=0,001 (<0,05);

для 4 и 8 групп χ2=7,273, p=0,007 (<0,05);

для 3 и 7 групп χ2=0,808, p=0,369 (>0,05);

для 3 и 9 групп χ2=2,812, p=0,094 (>0,05);

для 4 и 10 групп χ2=0, p=1,0 (>0,05).

Таблица 2 Результаты изучения выделенного препарата в опытах активной защиты мышей при внутривенном заражении № опыта № п/п группы Иммунизирующий препарат, доза мкг белка/мышь Заражение мышей Различия с контролем Доза, ×109 Количество павших/зараженным χ2* p 1 1 Белоксодержащее соединение, 4,0 мкг 0,4 0/10 4,29 <0,05 2,0 2/10 10,0 10/10 2 Контроль (0,9% р-р натрия хлорида) 0,4 4/10 2,0 6/10 10,0 10/10 2 3 Белоксодержащее соединение,12 мкг 0,4 1/10 6,857 <0,01 2,0 2/10 10,0 4/10 4 Контроль (0,9% р-р натрия хлорида) 0,4 4/10 2,0 5/10 10,0 9/10 * Различия с контролем определяли с использованием критерия согласия Пирсона - χ2 (программа BioStat D).

Таблица 3 Динамика накопления специфических IgG антител в сыворотках кроликов, иммунизированных белоксодержащими препаратами по разработанной схеме Анализируемые сыворотки Результаты по ΔОПим-ф сывороток № п/п Кровопускание При разведении сывороток в 100 раз (M±m) По титру* 1 До иммунизации 0,28±0,05 1:200 2 После 1 курса 0,37±0,01 1:400 3 После 2 курса 1,25±0,01 1:1600-1:3200 4 После 3 курса 1,88±0,6 1:3200-1:6400 5 После тотального кровопускания (лиофилизирован.) 1,99±0,36 1:6400 * ΔОПим-ф>0,2

Таблица 4 Уровень специфических IgG антител в сыворотках мышей, двукратно иммунизированных белоксодержащими препаратами Иммунизирующий препарат Количество изученных сывороток ΔОПим-ф сывороток (M±m) Белоксодержащее соединение 6 0,65±0,13 Неиммунизированные интактные мыши 6 0,13±0,07

Таблица 5 Пассивная защита мышей, зараженных S. aureus №6 в/бр в дозе 2,5×107 через 2 часа после введения сывороток Сыворотки иммунизированных животных № п/п группы Иммунизирующий препарат Количество мышей павших/ зараженных Различия с контролем χ2* p мышиные 1 Сыворотка к белоксодержащему соединению (1:4) 3/10 5,208 0,022 2 Сыворотка интактных мышей (1:4) 7/10 0,312 0,576 3 Контроль (0,9% р-р натрия хлорида) 9/10 кроличьи 4 Сыворотка к белоксодержащему соединению (1:4) 3/10 5,210 0,022 5 Сыворотка интактных кроликов (1:4) 6/10 1,067 0,302 6 Контроль (0,9% р-р натрия хлорида) 9/10

Похожие патенты RU2533815C1

название год авторы номер документа
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТЕКТИВНОЙ БЕЛОКСОДЕРЖАЩЕЙ ФРАКЦИИ БАКТЕРИЙ 2006
  • Киселевский Михаил Валентинович
  • Доненко Федор Витальевич
  • Воюшин Константин Евгеньевич
  • Тришин Александр Владимирович
  • Курбатова Екатерина Алексеевна
  • Егорова Надежда Борисовна
  • Грубер Ирина Мироновна
  • Ахматова Нэлли Кимовна
  • Семенова Ирина Борисовна
  • Семенов Борис Федорович
RU2311197C1
ШТАММЫ ВИДА Streptococcus pneumoniae (ВАРИАНТЫ) И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИЗ НИХ ПРОТЕКТИВНОЙ БЕЛОКСОДЕРЖАЩЕЙ ФРАКЦИИ, ОБЛАДАЮЩЕЙ ВНУТРИВИДОВОЙ ИММУНОГЕННОЙ АКТИВНОСТЬЮ 2015
  • Егорова Надежда Борисовна
  • Курбатова Екатерина Алексеевна
  • Воробьев Денис Сергеевич
  • Батуро Алла Петровна
  • Романенко Эмма Евгеньевна
  • Михайлова Наталья Александровна
RU2601158C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВЫСОКОТИТРАЖНОЙ АНТИМИКРОБНОЙ СЫВОРОТКИ ДЛЯ ОЦЕНКИ АНТИГЕННОЙ АКТИВНОСТИ ПРОТИВОСТАФИЛОКОККОВЫХ ВАКЦИН 2012
  • Михайлова Наталья Александровна
  • Егорова Надежда Борисовна
  • Грубер Ирина Мироновна
  • Курбатова Екатерина Алексеевна
  • Игнатова Ольга Михайловна
  • Черкасова Лидия Серафимовна
  • Асташкина Елена Андреевна
  • Тарасова Ольга Евгеньевна
  • Злыгостев Сергей Александрович
  • Воробьев Денис Сергеевич
  • Зверев Виталий Васильевич
RU2525661C2
Рекомбинантная плазмидная ДНК pPA-FlicC, кодирующая синтез рекомбинантного флагеллина-С Pseudomonas aeruginosa, штамм Escherichia coli PA-FlicC - продуцент гибридного рекомбинантного белка и способ получения указанного белка 2022
  • Калошин Алексей Алексеевич
  • Жеребцов Антон Павлович
  • Михайлова Наталья Александровна
RU2793753C1
РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pPA-OPRF-ETA, КОДИРУЮЩАЯ СИНТЕЗ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА OPRF-ETA Pseudomonas aeruginosa, ШТАММ Escherichia coli PA-OPRF-ETA - ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА OPRF-ETA Pseudomonas aeruginosa И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА OPRF-ETA Pseudomonas aeruginosa 2012
  • Калошин Алексей Алексеевич
  • Солдатенкова Алена Владимировна
  • Михайлова Наталья Александровна
RU2529359C2
РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pPA-OPRFI, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ РЕКОМБИНАНТНЫЙ БЕЛОК F-I НАРУЖНОЙ МЕМБРАНЫ Pseudomonas aeruginosa, ШТАММ Escherichia coli PA-OPRFI-ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА F-I НАРУЖНОЙ МЕМБРАНЫ Pseudomonas aeruginosa И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИБРИДНОГО РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА F-I НАРУЖНОЙ МЕМБРАНЫ Pseudomonas aeruginosa 2011
  • Калошин Алексей Алексеевич
  • Михайлова Наталья Александровна
RU2537006C2
ПОЛИКОМПОНЕНТНАЯ ВАКЦИНА ДЛЯ ИММУНОПРОФИЛАКТИКИ И ИММУНОТЕРАПИИ ЗАБОЛЕВАНИЙ, ВЫЗЫВАЕМЫХ УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫМИ МИКРООРГАНИЗМАМИ 2002
  • Егорова Н.Б.
  • Семенов Б.Ф.
  • Курбатова Е.А.
  • Ефремова В.Н.
  • Каверина К.Г.
  • Михайлова Н.А.
RU2209081C1
НУКЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА, КОДИРУЮЩАЯ ФУНКЦИОНАЛЬНО АКТИВНУЮ РЕКОМБИНАНТНУЮ IgA1 ПРОТЕАЗУ NEISSERIA MENINGITIDIS СЕРОГРУППЫ B, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК, СОДЕРЖАЩАЯ НУКЛЕОТИДНУЮ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ, КОДИРУЮЩУЮ АКТИВНУЮ IgA1 ПРОТЕАЗУ, ШТАММ-ПРОДУЦЕНТ, СОДЕРЖАЩИЙ ПЛАЗМИДНУЮ ДНК, ПРОДУЦИРУЮЩИЙ ЗРЕЛУЮ ФОРМУ IgA1 ПРОТЕАЗЫ, РЕКОМБИНАНТНАЯ Ig ПРОТЕАЗА NEISSERIA MENINGITIDIS СЕРОГРУППЫ В, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЗРЕЛОЙ ФОРМЫ IgA1 ПРОТЕАЗЫ, ОБЛАДАЮЩЕЙ ИММУНОГЕННЫМИ И ПРОТЕКТИВНЫМИ СВОЙСТВАМИ 2011
  • Румш Лев Давыдович
  • Мельников Эдвард Эдуардович
  • Аллилуев Александр Павлович
  • Козлов Леонид Васильевич
  • Котельникова Ольга Викторовна
  • Жигис Лариса Стефановна
  • Серова Оксана Викторовна
  • Ягудаева Елена Юрьевна
  • Бичучер Анна Мироновна
  • Зубов Виталий Павлович
  • Анохина Ирина Викторовна
  • Зуева Вера Сергеевна
  • Аваков Анатолий Эдуардович
RU2453599C1
Рекомбинантная плазмидная ДНК pPA-OPRF-ATOX-OPRI, кодирующая синтез гибридного рекомбинантного белка, включающего аминокислотные последовательности белков F и I наружной мембраны и атоксического варианта экзотоксина A Pseudomonas aeruginosa, штамм Escherichia coli PA-OPRF-ATOX-OPRI - продуцент гибридного рекомбинантного белка и способ получения указанного белка 2017
  • Калошин Алексей Алексеевич
  • Зимина Екатерина Максимовна
  • Михайлова Наталья Александровна
RU2677790C1
Способ получения поликомпонентной вакцины на основе антигенов условно-патогенных микроорганизмов 2022
  • Михайлова Наталья Александровна
  • Солдатенкова Алёна Владимировна
  • Грубер Ирина Мироновна
  • Курбатова Екатерина Алексеевна
  • Свитич Оксана Анатольевна
  • Зверев Виталий Васильевич
  • Лазарев Сергей Александрович
  • Асташкина Елена Андреевна
RU2799527C1

Иллюстрации к изобретению RU 2 533 815 C1

Реферат патента 2014 года СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТЕКТИВНОЙ БЕЛОКСОДЕРЖАЩЕЙ ФРАКЦИИ БАКТЕРИЙ

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения протективных антигенов на основе секретируемых белоксодержащих соединений Staphylococcus aureus. Способ предусматривает культивирование на жидкой питательной среде вирулентного штамма бактерий Staphylococcus aureus №6 с последующим отделением культуральной среды от бактерий путем фильтрования через фильтр PLASMAFILTER PLASMAFLUX PSu 2S с получением фильтрата. К полученному фильтрату добавляют сульфат аммония до 80% насыщения с получением осадка. Полученный осадок отделяют центрифугированием при 10000 g в течение 30 минут и растворяют в фосфатном буфере с pH 7.4 с последующей микрофильтрацией белоксодержащей фракции через мембрану 0,22 мкм и обессоливанием на колонке PD-10, очисткой и концентрированием путем проведения ион-обменной хроматографии на колонке Q-сефарозы, элюции 0,15 М NaCl и ультрафильтрацией на двух фильтрах 100 и 30 кДа до получения белоксодержащей фракции с молекулярной массой 30-90 кДа и содержанием белка 0,5-1,0 мг/мл. Изобретение позволяет получить препараты на основе протективного секретируемого белоксодержащего соединения. 1 ил., 5 табл., 1 пр.

Формула изобретения RU 2 533 815 C1

Способ получения протективной белоксодержащей фракции бактерий, включающий культивирование бактерий на жидкой питательной среде, отделение культуральной среды от бактерий и последующую очистку и концентрирование методом ультрафильтрации до получения белоксодержащей фракции бактерий, отличающийся тем, что осуществляют культивирование на жидкой питательной среде вирулентного штамма бактерий Staphylococcus aureus №6, отделение культуральной среды от бактерий проводят путем фильтрования через фильтр PLASMAFILTER PLASMAFLUX PSu 2S, с последующим добавлением к полученному фильтрату сульфата аммония до 80 % насыщения, центрифугированием его при 10000g в течение 30 минут и растворением в фосфатном буфере с pH 7,4, перед очисткой и концентрированием проводят микрофильтрацию белоксодержащей фракции через мембрану 0,22 мкм и обессоливание на колонке PD-10, а очистку и концентрирование осуществляют путем проведения ион-обменной хроматографии на колонке Q-сефарозы и элюции 0,15 М NaCl и ультрафильтрации на двух фильтрах 100 и 30 кДа до получения белоксодержащей фракции с молекулярной массой 30-90 кДа и содержанием белка 0,5-1,0 мг/мл.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2014 года RU2533815C1

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТЕКТИВНОЙ БЕЛОКСОДЕРЖАЩЕЙ ФРАКЦИИ БАКТЕРИЙ 2006
  • Киселевский Михаил Валентинович
  • Доненко Федор Витальевич
  • Воюшин Константин Евгеньевич
  • Тришин Александр Владимирович
  • Курбатова Екатерина Алексеевна
  • Егорова Надежда Борисовна
  • Грубер Ирина Мироновна
  • Ахматова Нэлли Кимовна
  • Семенова Ирина Борисовна
  • Семенов Борис Федорович
RU2311197C1
Способ получения очищенного белка а золотистого стафилококка 1985
  • Жебрун Анатолий Борисович
  • Рощина Наталья Георгиевна
  • Бельдер Рита Борисовна
  • Краснова Нонна Александровна
SU1363569A1
ИГНАТОВА О.М., Характеристика антигенных преаратов, выделенных из вакцинных штаммов Staphylococcus aureus, культивируемых в различных условиях, автореф
дисс
на соискание ученой степени кандидата биологических наук, М, 2010
СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ БИВАЛЕНТНОЙ ВАКЦИНЫ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ МЕНИНГОКОККОВОЙ ИНФЕКЦИИ 2003
  • Несмеянов В.А.
  • Котельникова О.В.
  • Вольпина О.М.
  • Феоктистов К.М.
  • Чибискова О.В.
  • Жмак М.Н.
  • Короев Д.О.
  • Аллилуев А.П.
  • Иванов В.Т.
RU2250113C2

RU 2 533 815 C1

Авторы

Грубер Ирина Мироновна

Доненко Федор Витальевич

Асташкина Елена Андреевна

Игнатова Ольга Михайловна

Егорова Надежда Борисовна

Ванеева Наталья Павловна

Черкасова Лидия Серафимовна

Тарасова Ольга Евгеньевна

Киселевский Михаил Валентинович

Даты

2014-11-20Публикация

2013-09-09Подача