Дипептидные лиганды TSPO, обладающие нейропсихотропной активностью Российский патент 2021 года по МПК C07K5/78 C07K5/62 A61K38/05 A61P25/22 A61P25/24 

Область изобретения

Изобретение относится к новым биологически активным дипептидам
общей формулы:

где АК₁ = Тгр или Gly, АК₂ = Leu;

Х= L или D конфигурация, Y= L или D конфигурация;

R₁=C₆H₅-(CH₂)₂-C(O) или С₆Н₅-СН₂-С(O) или СН₃-(СН₂)₄-С(O);

R₂=OH или ОСН₃ или NH₂ или NHCH₃,

Новые соединения являются лигандами транслокаторного протеина (18 kDa, TSPO) и обладают нейропсихотропными свойствами, в частности анксиолитическими и антидепрессивными.

Уровень техники

Транслокаторный протеин (TSPO), открытый в 1977 году [Braestrup С, Squires R.F.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Sep 1977; 74(9): 3805-3809.] - это трансмембранный полипептид, состоящий в зависимости от вида из 153-169 аминокислот, локализующийся преимущественно на внешней мембране митохондрий и ответственный за перенос холестерина с внешней мембраны митохондрий на внутреннюю. Кроме того, TSPO задействован в транспорте порфиринов, митохондриальном дыхании, открытии митохондриальных пор, апоптозе и пролиферации клеток. До 2006 года TSPO был известен как периферический бензодиазепиновый рецептор (PBR), однако вследствие лучшего понимания механизма действия был переименован в транслокаторный протеин (TSPO) [Papadopolous V., Baraldi М., Guilarte T.R., Knudsen T.B., Lacapère J.-J., Lindemann P. et al. Translocator protein (18 kDa): new nomenclature for the peripheral-type benzodiazepine receptor based on its structure and molecular function. Trends Pharmacol. Sci. 2006; 27, №8: 402-409]. Находится транслокаторный протеин на внешней митохондриальной мембране в основном в стероидгенерирующих клетках, но также присутствует и в других тканях и органах, таких как почки, легкие, сердце, а такжн представлен в глиальных клетках головного мозга [Beurdeley-Thomas A., Miccoli L., Oudard S., Dutrillaux В., Poupon M.F., J. Neurooncol. 2000. V. 46. №1. P. 45-56. Также, высокое содержание TSPO было обнаружено в некоторых типах нейрональных клеток, таких как нейроны обонятельной луковицы млекопитающих [Anholt R.R., Murphy K.М., Mack G.Е., Snyder S.Н. Peripheral-type benzodiazepine receptors in the central nervous system: localization to olfactory nerves. J. Neurosci. 1984.; 4: 593-603, Bolger G.T., Mezey E., Cott J., Weissman B.A., Paul S.M., Skolnick P. Differential regulation of 'central' and 'peripheral' benzodiazepine binding sites in the rat olfactory bulb. Eur. J. Pharmacol. 1984; 105: 143-148].

Основными эндогенными лигандами являются холестерин и порфирины, также в эту группу входят эндозепины, которые относятся к нейропептидам. Холестерин является ключевым эндогенным лигандом TSPO, так как именно он является исходным веществом для дальнейшего биосинтеза нейростероидов после проникновения через мембрану митохондрии. Холестерин обладает наномолярным сродством к TSPO (Kd<10 нМ). Связываясь с TSPO, холестерин переносится с внешней мембраны митохондрий на внутреннюю мембрану, где под действием ферментов цитохрома P450scc, 3-β гидроксистероиддегидрогеназы (3β-HSD), 5α-редуктазы, 3-α гидроксистероиддегидрогеназы(3α-HSD) происходит каскад превращений и образование нейростероидов, которые выполняют модуляторную функцию ГАМК_А. По силе воздействия они или равны или превосходят бензодиазепины и барбитураты.

Ряд порфиринов также рассматривается в качестве эндогенных лигандов TSPO. Наибольшим аффинитетом обладают следующие производные порфиринов: протопорфирин IX (Ki 14.5±10.7 нМ), дейтеропорфирин IX (Ki=31.3±2 нМ) и гемин (Ki=40.6±13.7 нМ). Несмотря на то, что многие порфирины обладают высокой аффинностью по отношению к TSPO, эти соединения практически не изучались на наличие биологических эффектов. В процессе поиска эндогенных лигандов TSPO было установлено, что одним из таковых является ингибитор связывания диазепама (DBI). DBI представляет собой полипептид массой 9 кДа, который был открыт в 1983 году в мозге крысы при изучении белков, ингибирующих бензодиазепиновое связывание с ГАМК_А-рецептором. Также было показано, что основные посттрансляционные продукты DBI - октадеканейропептид DBI_33-50 (octadecaneuropeptide, ODN) и триаконтатетронейропептид DBI_17-50 (triakontatetraneuropeptide, TTN), также обладают сродством к TSPO.

Синтетическими лигандами TSPO долгое время считались диазепам, клоназепам и некоторые другие производные бензодиазепина, однако указанные вещества связываются как с TSPO, так и с центральным бензодиазепиновым рецептором.

Первыми синтетическими лигандами TSPO, которые были использованы для изучения in vivo, являются: производное изохинолина PK-11195, производное бензодиазепина Ro5-4864.

Авторы, впервые опубликовавшие данные о РК11195, не представили в своей работе подход к дизайну данной молекулы, на основании чего можно предположить, что оно было открыто путем широкого скрининга [Le Fur G., Perrier M.L., Vaucher N., Imbault F., Flamier A., Benavides J. et al. Peripheral benzodiazepine binding sites: effect of PK 11195, 1-(2-chlorophenyl)-N-methyl-N-(1-methylpropyl)-3-isoquinolinecarboxamide. I. In vitro studies. Life Sci. 1983; 18; 32(16): 1839-47]. Исследование влияния PK-11195 на нейростероидогенез показало, что при одновременном введении PK-11195 и Ro5-4864 эффект от последнего снижался. Исходя из того, что Ro5-4864 является агонистом, то был сделан вывод, что PK-11195 является антагонистом TSPO. РК11195 с момента открытия и до настоящего времени широко используется в качестве «золотого стандарта» лигандов TSPO в исследованиях, связанных с этим рецептором.

Рядом фармацевтическимх фирм ведется интенсивный поиск лигандов - агонистов TSPO с целью создания препаратов для лечения неврологических и психических заболеваний. Так, в компании Dainippon Sumitomo Pharma (Япония) совместно с компанией Novartis Pharmaceuticals (США) был создан лиганд TSPO АС-5216 (XBD173, Emapunil), [Kita A. et al. Antianxiety and antidepressant-like effects of AC-5216, a novel mitochondrial benzodiazepine receptor ligand // British journal of pharmacology. - 2004. - T. 142. - №.7. - C. 1059-1072], производное оксопурина, проявившее анксиолитический и антидепрессивный эффект в тестах Фогеля, в тесте темно-светлая камера. АС-5216 (XBD173, Emapunil) прошел II стадию клинических исследований в качестве анксиолитика с антидепрессивным компонентом действия. Для исследования анксиолитического потенциала, XBD173, был исследован на здоровых добровольцах мужского пола с использованием тетрапептида холецистокинина (CCK4). CCK-4 - фрагмент гормона холецистокинина, известный своей способностью вызывать тревогу, а также оказывающий воздействие на желудочно-кишечный тракт, но менее выраженное по сравнению с другими формами холецистокинина. У людей CCK-4 вызывает выраженное чувство тревоги, начиная с доз в 50 мг, в связи с чем препарат используется для индукции панических атак и для тестирования возможных анксиолитиков. Исследование II фазы клинических испытаний по эффективности, безопасности и переносимости XBD173 было проведено компанией Novartis у больных с тревожными расстройствами. [Efficacy, safety and tolerability of XBD173 in patients with generalized anxiety disorder» ClinicalTrials.gov Identifier: NCT00108836]

Авторами статьи [Campiani, G.; Nacci, V.; Fiorini, L.; De Filippis, M.P.; Garofalo, A.; Ciani, S.M.; Greco, G.; Novellino, E.; Williams, D.C.; Zisterer, D.M.; Woods, M.J.; Mihai, C; Manzoni, C; Mennini, T.J. Med. Chem., 1996, 39, 3435-50] изучались лиганды бензоксиазепинового класса в условиях конкурентного вытеснения PK-11195. Соединение OXA-17f было отмечено как самое селективное из этой серии (Ki=0,26 цМ).

Общая формула лигандов TSPO бензоксиазепинового ряда ряда (ОХА)

Соединение OXA-17f

В 1990 году авторами [Nacci, V.; Fiorini, I.; Garofalo, A.; Cagnotto, A. Farmaco, 1990, 45, 545-557.] был предложен новый класс бензотиоазепиновых лигандов TSPO.. Некоторые из этих лигандов, такие как THIA-66 и THIA-67 имеют высокое сродство и селективность по отношению к TSPO, однако, доказано, что они связываются с TSPO менее выраженно, чем PK-11195 [Fiorini I., Nacci V., Ciani S.M, Garofalo A., Campiani G., Savini L., Novellino E., Greco G., Bernasconi P., Mennini T.J. A comparative molecular field analysis model for 6-arylpyrrolo[2,1-d] [1,5]benzothiazepines binding selectively to the mitochondrial benzodiazepine receptor. // J Med Chem. - 1994. - №37. - P. 4100-4108]. Эти лиганды применимы в качестве зондов в радиоисследованиях in vitro.

Соединения THIA-66 и THIA-67

В статье (Romeo, ЕА. et al. J. Pharmacol. Exp. Ther., 1992, 262, 971-978) описаны производные арилиндолацетамида, проявившие агонистическую активность к TSPO. Арилиндолацетамид под шифром SSR180575 [Ferzaz В., Brault Е., Bourliaud G., Robert J.P., Poughon G., Claustre Y., Marguet F., Liere P., Schumacher M., Nowicki J.P., Fournier J., Marabout В., Sevrin M., George P., Soubrie P., Benavides J., Scatton B. SSR180575 (7-chloro-N,N,5-trimethyl-4-oxo-3-phenyl-3,5-dihydro-4H-pyridazino[4,5-b]indole-1-acetamide), a peripheral benzodiazepine receptor ligand, promotes neuronal survival and repair. J Pharmacol Exp Ther. 2002 Jun; 301(3): 1067-78] имеет наномолярное сродство к TSPO в четыре раза выше, чем у Ro-5 4864, как для крыс, так и для человека. SSR180575 повышает уровень прегненолона в мозге, это означает, что его терапевтические эффекты опосредованы через его способность стимулировать стероидогенез.. SSR180575 находится на второй стадии клинических испытаний (Sanofi-Aventis, NCT00502515) для лечения диабетической нейропатии.

Соединение SSR180575

В 1991 году фирма Synthelabo (сейчас Sanofi-Aventis) рассмотрела производное имидазопиридина Alpidem, как потенциальный лиганд TSPO. Однако в 1995 году Alpidem был снят с производства после выявления вызванной им дисфункции печени с тяжелыми последствиями и даже смертельными исходами. Также эти побочные эффекты могут быть связаны с его связыванием с ГАМК-рецепторами, которые иногда могут также содержаться в ткани печени - например, в клетках гепатоцеллюлярной карциномы. В 1997 авторы статьи [Trapani, G.; Franco, М.; Ricciardi, L.; Latrofa, A.; Genchi, G.; Sanna, E.; Tuveri, F.; Cagetti, E.; Biggio, G.; Liso, G.J. Med. Chem., 1997, 40, 3109-18] провели ряд исследований в попытках разработать новый спектр производных имидазопиридина с улучшенной селективностью по отношению к TSPO. Разработанное ими соединение СВ-34 оказалось самым перспективным в связи с его высоким сродством, избирательностью и способностью стимулировать стероидогенез в периферических тканях.

Соединение СВ-34

Производные феноксифенилацетамида, N-(4-хлор-2-феноксифенил)-N-(2-изопропоксибензил)-ацетамид, DAA1097 и N-(2,5-диметоксибензил)-N-(5-фтор-2-феноксифенил) ацетамид, DAA1106 рассматриваются как лиганды TSPO. Эти соединения проявляют мощное анксиолитическое действие в экспериментах in vivo. [Chaki S., Funakoshi Т., Yoshikawa R., Okuyama S., Okubo Т., Nakazato A., Nagamine M., Tomisawa K. Neuropharmacological profile of peripheral benzodiazepine receptor agonists, DAA1097 and DAA1106. // Eur. J. Pharmacol. - 1999. - №371. - P. 197-204]

Соединения DAA1097 и DAA1106

Авторы патента РФ 2573823 (дата приоритета 26.03.2014) раскрывают первые в мире дипептидные лиганды TSPO общей формулы R₁-C(O)-X-Trp-Y-Ile-R₂ обладающие анксиолитическими свойствами, где Х=L или D конфигурация, Y=L конфигурация, R₁=C₆H₅-CH₂-O- или С₆Н₅-(СН₂)₅- или С₆Н₅-СН₂-, R₂=ОН или ОСН₃ или NH₂ или NHCH₃.

В качестве примера лигандов TSPO, обладающих анксиолитической и антидепрессивной активностями, можно привести ряд соединений - производных пирроло[1,2-α]пиразина, раскрытых в патенте РФ 2572076.

Однако соединения, описанные в вышеприведенных сведениях, не открывают и не предполагают новых структурных вариаций патентуемых соединений.

Актуальность задачи, решаемой с помощью данного изобретения

Эпидемиологические данные свидетельствуют, что состояния тревоги, включающие по МКБ-10 генерализованные тревожные, фобические, панические и обсессивно-компульсивные расстройства, встречаются у 6-10% населения. Тревожные состояния, коморбидные соматическим заболеваниям, отягощают последние, увеличивая, например, летальность при сердечнососудистых заболеваниях вдвое. Существующие на данный момент лекарственные препараты для лечения тревожных расстройств не обладают достаточной эффективностью. Быстродействующие бензодиазепиновые транквилизаторы вызывают седацию, миорелаксацию, привыкание и зависимость. Для серотонинэргических анксиолитиков, свободных от этих побочных действий, необходим двухнедельный период наступления эффекта. Вследствие этого актуальным является создание лекарственного препарата, направленного на регуляцию нейростероидных механизмов цитопротекции, сочетающего свойства быстродействующего анксиолитика и антидепрессанта. Перспективным подходом к созданию новых препаратов, обладающих широким спектром нейропсихотропной активности, в том числе анксиолитической, антидепрессивной, и ноотропной, является получение новых лигандов трансклокаторного белка TSPO. Так как TSPO играет важнейшую роль в регуляции синтеза нейростероидов, лиганды этого рецептора могут являться эффективными нейропсихотропными препаратами, например, антидепрессантами, анксиолитиками, ноотропами, или препаратами комплексного действия. Оригинальные лиганды TSPO предполагается создать на базе замещенных триптофаниллейцил-содержащих дипептидов.

Сущность изобретения

Нашей целью явилось получение дипептидных лигандов TSPO, обладающих спектром нейропсихотропной активности, в частности анксиолитической и антидепрессивной. Мы нашли, что эта цель может быть достигнута с помощью соединений общей формулы:

R₁-X-AK₁-Y-AK₂-R₂

где АК₁ = Тгр или Gly, АК₂ = Leu; Х= L или D конфигурация, Y= L или D конфигурация; R₁=C₆H₅-(CH₂)₂-C(O) или С₆Н₅-СН₂-С(O) или СНз-(СН₂)₄-С(О); R₂=OH или ОСН₃ или NH₂ или NHCH₃.

Примерами осуществления изобретения могут служить следующие соединения:

I. амид N-фенилпропионил-L-триптофанил-L-лейцина

II. амид N-фенилпропионил-D-триптофанил-L-лейцина

III. амид N-фенилпропионил-L-триптофанил-D-лейцина

IV. метиловый эфир N-фенилпропионил-L-триптофанил-L-лейцина

V. N-фенилпропионил-L-триптофанил-L-лейцин

VI. метиламид N-фенилпропионил-L-триптофанил-L-лейцина

VII. амид N-фенилацетил-L-триптофанил-L-лейцина

VIII. амид N-капроил-L-триптофанил-L-лейцина

IX. амид N-фенилпропионил-глицил-L-лейцина

X. амид N-фенилпропионил-L-триптофанил-глицина

Представляемые в изобретении соединения дополнительно иллюстрирует табл. 1.

Приведенные выше соединения были получены хорошо известными способами синтеза пептидов. Обычный процесс получения рассматриваемых соединений состоит в смешивании и конденсации требуемых аминокислот, как правило, в гомогенной фазе.

Конденсация в гомогенной фазе может быть выполнена следующим образом:

а) конденсация аминокислоты, имеющей свободную карбоксильную группу и защищенную другую реакционноспособную группу, с аминокислотой, которая имеет свободную аминогруппу и защищенные другие реакционоспособные группы, в присутствии конденсирующего агента такого как карбодиимид;

б) конденсация аминокислоты, имеющей активированную карбоксильную группу и защищенную другую реакционноспособную группу, с аминокислотой, которая имеет свободную аминогруппу и защищенные другие реакционноспособные группы;

в) конденсация аминокислоты, имеющей свободную карбоксильную группу и защищенную другую реакционноспособнуюгруппу, с аминокислотой, имеющей активированную аминогруппу и защищенные другие реакционносособные группы.

Карбоксильная группа может быть активирована превращением ее в хлорагидридную, азидную, ангидридную группы или активированный эфир, такой как N-оксисукцинимидный, N-оксибензотриазольный, пентахлофениловый или паранитрофениловый эфиры. Аминогруппа может быть активирована превращением ее в фосфитамид или «фосфоразным» методом.

Наиболее общими для рассмотренных выше реакций конденсации являются: карбодиимидный метод; азидный метод; метод смешанных ангидридов; метод активированных эфиров. Эти методы описаны в "The Peptides". Vol. 1. 1965 (Academic Press), E. Schroeder, K. Lubke, или в "The Peptides", Vol. 1, 1979 (Academic Press) E. Cross, L. Meinhofen.

Предпочтительными методами конденсации при получении пептидов формулы (1) является метод активированных эфиров, который проводят преимущественно с применением сукцинимидных эфиров, защищенных по аминогруппе аминокислот. Лучшими растворителями являются смесь этилацетата с дихлорметаном, чистый этилацетат и тетрагидрофуран

Реакционноспособные группы, которые не должны участвовать в конденсации, могут быть защищены группами, которые легко удаляются, например, гидролизом или восстановлением. Так, карбоксильная группа может быть защищена этерфикацией метанолом, этанолом, трет-бутанолом, бензиловым спиртом.

Аминогруппу обычно эффективно защищают кислотными группами, например остатками алифатических, ароматических, гетероциклических карбоновых кислот, такими как ацетил, бензоил, пиридинкарбоксил, кислотными группами, производными угольной кислоты, такими как этоксикарбонил, бензилоксикарбонил, трет-бутилоксикарбонил; или кислотными группами, производными сульфокислоты, такой как пара-толуосульфониловая.

Защитные группы удаляли в соответствии с природой этих групп. Карбобензокси-группу удаляли каталитическим гидрогенолизом в токе водорода в метаноле с добавкой 10%-ного палладия на угле; трет-бутилоксикарбонильную группу удаляли в присутствии безводной трифторуксусной кислоты в дихлорметане.

При синтезе заявляемых соединений N-ацильные производные получали используя активированные сукцинимидные эфиры фенилуксусной, фенилпропионовой и гексановой кислот.

Амиды дипептидов по формуле (1) могут быть получены введением амидной группы в соответствующий дипептид каким-либо подходящим способом, например обработкой дипептида аммиаком в присутствии конденсирующего агента. Алкиламиды пептидов получают аминолизом алкилэфира соответствующего дипептида или реакцией с аминокислотой в виде желаемого алкиламида. Эфиры пептидов согласно формуле (1) получают предпочтительно путем использования аминокислоты в форме желаемого эфира. Они могут быть получены также соответствующей этерификацией полученного пептида. Предпочтительны метиловые и этиловые эфиры. Соединения с открытой карбоксильной группой получают щелочным гидролизом соответствующего эфира дипептида.

При введении эффективных количеств дипептида общей формулы I, согласно настоящему изобретению, может быть реализован способ лечения тревожных и депрессивных состояний.

Дипептид общей формулы I, согласно настоящему изобретению, может в качестве действующего вещества в терапевтически эффективном количестве входить в состав фармацевтической композиции, обладающей нейропсихотропным действием.

Примеры осуществления изобретения

В дальнейшем используются следующие сокращения:

Воc - трет-бутилоксикарбонил

DIPEA - диизопропилэтиламин

DMAPA - диметилпропилендиамин

DMSO - диметилсульфоксид

Gly - глицил

Leu - лейцил

Me - метил

OSu - оксисукцинил

Ph - фенил

TFA - трифторуксусная кислота

Тгр - триптофанил

Pd/C - катализатор: наночастицы палладия на поверхности активированного угля

Z - бензилоксикарбонил

ДМФА - диметилформамид

ТГФ - тетрагидрофуран

ТСХ - тонкослойная хроматография

ЭА - этилацетат

ЯМР - ядерный магнитный резонанс

Для определения физико-химических характеристик полученных веществ была использована следующая аппаратура:

- точки плавления определяли на приборе Optimelt МРА100 (Stanford Research Systems, Англия) в открытых капиллярах без корректировки;

- удельное вращение плоскости поляризации света регистрировали на автоматическом поляриметре ADP 440 Polarimeter (Bellingham+Stanley Ltd., Англия);

- ¹Н-ЯМР-спектры регистрировали в шкале δ, м.д., на спектрометре Fourier-300 (Bruker, Германия) в растворах DMSO-d₆, используя в качестве внутреннего стандарта тетраметилсилан. Для обозначения резонансных сигналов использовали следующие сокращения: с - синглет, д - дублет, д д - дублет дублетов, т - триплет, м - мультиплет;

- тонкослойную хроматографию (ТСХ) выполняли на силикагелевых пластинах DC Kieselgel 60 G/F₂₅₄ (Merck, Германия) в системах растворителей хлороформ : метанол, 9:1 (А) или изопропиловый спирт : водный аммиак, 7:3 (Б). Соединения, содержащие амидные группы идентифицировали хлор-толидиновой пробой; соединения, содержащие ароматические группы - в ультрафиолетовых лучах, а соединения содержащие открытые карбоксильные группы и сложноэфирные группы - 5% спиртовым раствором бромкрезолового зеленого

ПРИМЕР 1. Получение амида N-фенилпропионил-L-триптофанил-L-изолейцина (I), Ph(CH₂)₂-C(O)-L-Trp-L-Ile-NH₂.

а) N-третбутилоксикарбонил-L-лейцин, N-Boc-L-Leu-OH.

Растворяли 8.00 г (60.98 ммоль) L-лейцина в смеси 50 мл 1N NaOH, 100 мл воды, 200 мл изопропилового спирта. После полного растворения прибавляли 15.97 г (73.17 ммоль, 20% избыток) ди-трет-бутилпирокарбоната. Смесь перемешивали 2 ч при комнатной температуре, поддерживая рН=9-10 прикапыванием раствора 1N NaOH. Контроль за ходом реакции вели методом ТСХ в системе А. По окончании реакции реакционную массу упаривали в вакууме роторного испарителя до одной трети объема, при этом удалялся преимущественно изопропиловый спирт. Избыток ди-трет-бутилпирокарбоната экстрагировали гексаном (2×100 мл). Водный раствор подкисляли 10% раствором H₂SO₄ до рН 4, продукт выпадал в виде белого «творожистого» осадка. Осадку давали выстоять в течение 12 ч, затем отфильтровывали, промывали дистиллированной водой до нейтральной реакции, сушили на воздухе в фарфоровой чашке до постоянной массы. Получали 11.14 г (79%) продукта в виде белого порошка с т. пл. 82-83° и [α]_D²⁰ -23° (с=1, уксусная кислота), (лит. данные 83°C[α]_D²⁰ -24° (с=1, уксусная кислота [А.А. Гершкович, В.К. Кибирев. Химический синтез пептидов. Киев: Наукова думка, 1992]).

Спектр ¹Н-ЯМР (DMSO-d₆) δ, м.д.: 0,82-0,85 (6 Н, 2 д д, 2С^δH₃ Leu), 1,08-1,22 (1 Н, м, C^γH₂ Leu), 1.36 (9 Н, с, -ОС(СН₃)₃), 1,45 (2 Н, м, С^βН Leu), 3,86-3,88 (1 Н, д.д., C^αH Leu), 6,72 (1 Н, д, NH Leu), 6,89 и 7,19 (2 Н, два с, NH₂ амид).

б) Сукцинимидный эфир N-трет-бутилоксикарбонил-L-лейцина, N-Boc-L-Leu-OSu.

К раствору 8,00 г (34.63 ммоль) Boc-L-лейцина в 150 мл THF добавляли 4,73 г (39.88 ммоль, 15% избыток) N-гидроксисукцинимида, раствор охлаждали до +5°С на водяной бане со льдом, затем прибавляли 8.26 г (39.88 ммоль, 15% избыток) дицилогексилкарбодиимида. Реакционную массу перемешивали 30 мин при +5°С и 5 ч при комнатной температуре. Контроль за ходом реакции вели методом ТСХ в системе А. по окончании реакции осадок дициклогексилмочевины отфильтровывали, фильтрат упаривали. Полученное вязкое масло растворяли в 30 мл дихлорметана. Раствор выдерживали 24 ч в холодильнике при +8°С, повторно образовавшийся осадок дициклогексилмочевины отфильтровывали, органическую фазу промывали 5% NaHCO₃ (2×100 мл), и 100 мл дистиллированной воды. Сушили над Na₂SO₄, осушитель отфильтровывали, фильтрат упаривали, получали густое белое масло, которое закристаллизовывали в изопропиловом спирте. Полученные кристаллы выдерживали 12 ч в холодильнике при +8°С, получили продукт в количестве 8.31 г (73%) в виде стеклообразных кристаллов с т. пл. 110-112°С, [α]_D²⁶=-40° (с=2, диоксан)). (Лит. данные: т. пл. 116°С (крист. из диизопропилового эфира), [α]_D²⁵ =-41.8° (с=2, диоксан) [Anderson, G.W.; Zimmerman, J.E.; Callahan, F.M. The use of esters of N-hydroxysuccinimide in peptide synthesis. J. Am. Chem. Soc., 1964, 86, 1839-1842]).

¹Н-ЯМР (DMSO-d₆) δ, м.д.: 0,82-0,88 (6 H, 2 д д, 2C^δH₃ Leu), 1,39 (9 H, с, -ОС(СН₃)₃), 1,45 (2 Н, т, С^βН Leu), 1,56-1,73 (1 Н, м, C^γH₂ Leu), 2,82 (4 Н, м, OSu), 3,86-3,88 (1 Н, м., С^αН Leu), 7,93 (1 Н, д, NH Leu).

в) Амид N-третбутилоксикарбонил-L-лейцина, N-Boc-L-Leu-NH₂.

К раствору 8.00 г (24.36 ммоль) Boc-L-Leu-OSu в 15 мл DMF приливали 100 мл водного раствора аммиака при перемешивании, сразу выпадал белый творожистый осадок. Полученную суспензию перемешивали 30 мин до полного прохождения реакции. Осадку давали выстоять 3 ч в прохладном месте, но не в холодильнике, затем сформировавшийся осадок отфильтровывали на стеклянном фильтре, промывали дистиллированной водой до нейтральной реакции промывных вод, сушили в сушильном шкафу при 100°С до постоянной массы. Получали 3.37 г (60%) Boc-L-Leu-NH₂ в виде белого порошка с т. пл. 148-149°С, [α]_D²⁶ -11.0° (с=1, ДМФА). (Лит. данные: т. пл. 150-152°С, [α]_D²⁴ -11.9° (с=1, метанол) [С. Somlai G. Szokan, L. Balaspiri. Efficient, racemization-free amidation of protected amino acids Synthesis; 3; (1992); p. 285-287])

Спектр ¹Н-ЯМР (DMSO-d₆) δ, м.д.: 0,82-0,85 (6 H, 2 д д, 2C^δH₃ Leu), 1,08-1,22 (1 Н, м, C^γH₂ Leu), 1.36 (9 Н, с, -ОС(СН₃)₃), 1,45 (2 Н, м, С^βН Leu), 3,86-3,88 (1 H, д.д., С^αН Leu), 6,72 (1 Н, д, NH Leu), 6,89 и 7,19 (2 Н, два с, NH₂ амид).

г) Трифторацетат амида L-лейцина, TFA*L-Leu-NH₂

К суспензии 12.00 г (52.10 ммоль) Boc-L-Leu-NH₂ в 30 мл дихлорметана приливали 60 мл TFA (150% избыток) при перемешивании на магнитной мешалке, перемешивали 2 ч. Раствор переупаривали с диэтиловым эфиром (3×50 мл). Полученное белое масло затирали под диэтиловым эфиром, получали белый порошок, эфир декантировали, остаток отфильтровывали. Продукт сушили на воздухе. Получали 11.88 г (99%) TFA*H-Leu-NH₂ в виде белого порошка с т. пл. 118-119°С, [α]_D²⁵ -18° (с=1, ДМФА).

Спектр ¹Н-ЯМР (DMSO-d₆) δ, м.д.: 0,83-0,89(6 Н, 2 д д, 2С^δH₃ Leu), 1,08-1,22 (1 Н, м, C^γH₂ Leu), 1.36 (9 Н, с, -ОС(СН₃)₃), 1,45 (2 Н, м, С^βH Leu), 3,69 (1 Н, д д, C^αH Leu), 7,52 и 7,93 (2 Н, два с, NH₂ амид), 8,12 (3 Н, уш. с, N⁺Н₃ Leu).

д) N-Карбобензокси -L-триптофан (Z-L-TrpOH).

Растворяли 10,00 г (48,9 ммоль) L-триптофана в 200 мл 0,1 N раствора NaOH. При охлаждении из двух капельных воронок прикапывали 50% раствор карбобензоксихлорида в толуоле (10 мл, 10% избыток) и 100 мл 1N раствора NaOH. Реакционной массе давали нагреться до комнатной температуры, перемешивали 12 ч. По окончании реакции (ТСХ-контроль в системе Б) щелочной раствор промывали диэтиловым эфиром, водную фракцию нейтрализовывали 1 N раствором HCl. Выпавший осадок отфильтровывали, промывали 0,1 N HCl, дистиллированной водой, высушивали в вакууме в эксикаторе над CaCl₂. Получали 15,41 г (93%) продукта в виде серого порошка с т. пл. 125-127°С. (лит. данные 126°С [А.А. Гершкович, В.К. Кибирев. Химический синтез пептидов. Киев: Наукова думка, 1992]).

Спектр ¹Н-ЯМР (DMSO-d₆) δ, м.д.: 2.98 и 3.18 (2 Н, два д.д., С^βH Trp), 4.21 (1 Н, м, С^αН Trp), 5.96 (2 Н, с, -OCH₂C₆H₅), 6.87-7,76 (10 Н, м, -ОСН₂С₆Н₅, индол), 7.45 (1 Н, д, NH Trp), 10.80 (1 Н, с, NH индол).

е) Сукцинимидный эфир N-карбобензокси-L-триптофана, Z-L-Trp-OSu.

К раствору 10,00 г (29.6 ммоль) Z-L-TrpOH в 300 мл этилацетата добавляли 3.98 г (34.6 ммоль, 17% избыток) N-гидроксисукцинимида, раствор охлаждали до +5°С и затем прибавляли 7.25 (35.2 ммоль, 19% избыток) дицилогексилкарбодиимида, следя за тем, чтобы температура не превышала +5°С. Реакционную массу перемешивали 30 мин при температуре +5 - +7°С и затем 12 ч при комнатной температуре. Осадок дициклогексилмочевины отфильтровывали, фильтрат упаривали. Полученное вязкое масло растворяли в 200 мл дихлорметана. Раствор выдерживали 24 ч в холодильнике при +8°С, повторно образовавшийся осадок дициклогексилмочевины отфильтровывали, фильтрат упаривали. Полученное масло промывали гексаном, гексан декантировали, масло упаривали досуха. Получали продукт в количестве 11.84 г (92%) в виде белой пены, которую измельчали до состояния порошка с т. пл. 137-140°С [α]²⁵_D -60.0° (с 1, ДМФА).

Спектр ¹Н-ЯМР (DMSO-d₆) δ, м.д.: 2.78 (4 Н, м, OSu), 3.01 и 3.25 (2 Н, два д.д., С^βН Trp), 3.98 (1 Н, м, С^αН Trp), 4.97 (2 Н, с, -OCH₂C₆H₅), 6.73-7.62 (10 Н, м, -ОСН₂С₆Н₅, индол), 8.56 (1 Н, д, NH Trp), 10.78 (1 Н, с, NH индол).

ж) Амид N-карбобензокси-L-триптофанил-L-лейцина, Z-L-Trp-L-Leu-NH₂.

Растворяли 3.30 г (13.52 ммоль) TFA*L-IleNH₂ в 30 мл ДМФА с добавлением 2.35 мл (13.52 ммоль) DIPEA. Реакционную массу перемешивали с амином в течение получаса. Затем при перемешивании прибавляли раствор 7.06 г (16.22 ммоль 20% избыток) Z-L-TrpOSu в 30 мл ДМФА. Перемешивали 12 ч при комнатной температуре. По окончании реакции (ТСХ контроль в системе А, УФ и толидиновая проба) раствор упаривали до состояния подвижного масла, растворяли в 200 мл этилацетата, экстрагировали 3%H₂SO₄ (1×100 мл), затем 5% раствором NaHCO₃ (2×100 мл) и дистиллированной водой (1×100 мл), органическую фазу сушили над Na₂SO₄, осушитель отфильтровывали, фильтрат упаривали. Полученное масло растворяли в минимальном количестве ДМФА, разбавляли 200 мл дистиллированной воды, получали белый осадок. Осадку давали выстоять 12 ч в холодильнике при +5°С, отфильтровывали, промывали дистиллированной водой и гексаном. Сушили в вакуумном эксикаторе над CaCl₂ и парафином. Выход составил 6.78 г (%) чистого продукта с т. пл. 166-169°С, [α]^D₂₆=-31° (с=1, ДМФА).

Спектр ¹Н-ЯМР (DMSO-d₆) δ, м.д.: 0,82-0,88 (6 Н, 2 д д, 2С^δH₃ Leu), 1.08-1,22 (1 Н, м, C^γH₂ Leu), 1,45 (2 Н, м, С^βН Leu), 2,90 и 3,09 (2 Н, два д.д., С^βН Trp), 4,28-4,31 (2 Н, м., С^αН Leu и С^αН Trp), 4,93 (2 Н, м, CH₂CO), 6,99-7,30 (10 Н, м, Ar) 7,25 и 7,33 (2 Н, два с., NH₂ амид), 7,62 (1 Н, д, NH Leu), 7,97 (1 Н, д, NH Trp), 10,81 (1 Н, с, NH индол).

з) Амид L-триптофанил-L-лейцина, H-L-Trp-L-Leu-NH₂.

В колбу, содержащую суспензию 0,500 г 10% Pd/C в 50 мл метанола помещали 6.78 г (0.015 моль) Z-L-Trp-L-Leu-NH₂. Через полученную суспензию пропускали ток водорода из газометра в течение 2 часов при интенсивном перемешивании. По окончании реакции катализатор отфильтровывали через мелкопористый стеклянный фильтр, подложив на дно фильтра бумагу маркировки «черная лента», промывали 50 мл метанола, фильтрат упарили. Получали продукт в количестве 4.71 г (99%) в виде серой пены без четкой температуры плавления, [α]^D₂₆=-25° (с=1, ДМФА).

Спектр ¹H-ЯМР (DMSO-d₆) δ, м.д.:, 0,82-0,88 (6 Н, 2 д д, 2С^δH₃ Leu), 1.09- 1,26 (1 Н, м, C^γH₂ Leu), 1,45 (2 Н, м, С^βН Leu), 2,90 и 3,08 (2 Н, два д.д., С^βН Trp), 3,50 (1 Н, м, С^αН Trp), 4,14 (1 Н, д.д., С^αН Leu), 6,94-7,55 (5 Н, м, Ar), 7,05 и 7,41 (2 H, 2 д, NH₂ амид), 7,60 (1 Н, д, NH Leu), 8,05 (1 Н, д, NH Trp), 10,85 (1 Н, уш. с, N индол).

и) Сукцинимидный эфир фенилпропионовой кислоты, Ph(CH₂)₂C(O)Su.

10.00 г Ph-(CH₂)₂C(O)-OH (66.7 ммоль) растворили в 150 мл ТГФ. К раствору добавляли 8.97 г (79.0 ммоль, 18% избыток) N-гидроксисукцинимида, затем 16.07 г (79.0 ммоль 18% избыток) дициклогексилкарбодиимида. Реакцию вели 12 ч при перемешивании при комнатной температуре. Контроль за ходом реакции вели методом ТСХ в системе А, (УФ и толидиновая проба). Отфильтровывали осадок дициклогексилмочевины. Упаривали растворитель, при этом начинал выпадать белый осадок, его растирали с гексаном, декантировали, остаток гексана упаривали. Получали легко-кристаллизующееся масло,которое растворяли в 200 мл хлороформа. Экстрагировали 5% водного раствора NaHCO₃ (2×200 мл), затем однократно дистиллированной водой. Сушили над безводным Na₂SO₄ в течение получаса. Осушитель отфильтровывали, промывали небольшим количеством хлороформа, хлороформ упаривали. Получали продукт в виде белых кристаллов, сушили на воздухе при комнатной температуре. Выход составил 7.42 г (45%) продукта с т. пл. 83-84°С.

Спектр ¹Н-ЯМР (DMSO-d₆) δ, м.д.: 2,81 (4 Н, м, OSu), 2,97-3,01 (2 Н, м, СН₂С₆Н₅), 3,34 (2 Н, с, СН₂СО), 7,16-7,31 (5 Н, м, Ar).

к) Амид N-фенилпропионил-L-триптофанил-L-лейцина, Ph-(CH₂)₂-C(O)-L-Trp-L-Leu-NH₂ (I).

Растворяли 4,50 г (14.3 ммоль) H-L-Trp-L-Leu-NH₂ в 50 мл ДМФА, добавляли 3.86 г (15.6 ммоль, 10% изб.) сукцинимидного эфира фенилпропионовой кислоты, перемешивали 12 ч. Затем добавляли 0.20 мл DMAPA для удаления избытка Ph(CH₂)₂C(O)OSu, перемешивали еще полчаса, затем растворитель упарили в вакууме при температуре не выше +50°С. Полученное масло разбавляли 200 мл дистиллированной воды, получали белый «молочный» раствор. Раствору давали выстоять («созреть») в течение 24 ч в холодильнике при температуре +5°С, получали белый порошкообразный осадок, который затем отфильтровывали. Полученные кристаллы промывали 100 мл теплой (43-45°С) воды и 100 мл гексана и 50 мл диэтилового эфира. Сушили в вакуумированном эксикаторе над CaCl₂ и парафином. Выход составил 4.49 г (70%) продукта в виде белого порошка, с т. пл. 197-198°С, [α]_D²⁶=-27° (с=1, ДМФА), R_f 0,73 (CHCl₃:МеОН 9:1).

Спектр ¹Н-ЯМР (DMSO-d₆) δ, м.д.: 0.82-0,88 (6 Н, 2 д д, 2С^δH₃ Leu), 1,45 (2 Н, т, C^βH Leu), 1,56-1,73 (1 Н, м, C^γH₂ Leu), 2,38 (2 Н, т, CH₂C₆H₅), 2,69 (2 Н, т, СН₂СО), 2,90 и 3,09 (2 Н, два д.д., С^βН Trp), 4,22 (1 Н, д.д., C^αH Leu), 4,54 (1 Н, м, С^αН Trp), 6,99-7,20 (10 Н, м, Ar), 7,33 и 7,60 (2 Н, два с, NH₂ амид), 7,93 (1 Н, д, NH Leu), 8,08 (1 Н, д, NH Trp), 10,78 (1 Н, с, NH индол).

ПРИМЕР 2. Получение амида N-фенилпропиоиил-D-триптофаннл-L-лейцина (II), C₆H₅(CH₂)₂-C(O)-D-Trp-L-Leu-NH₂

а) Сукцинимидный эфир N-карбобензокси-L-триптофана, Z-D-Trp-OSu.

К раствору 10,00 г (29.6 ммоль) Z-D-TrpOH (GL Biochem, Шанхай) в 300 мл этилацетата добавляли 3.98 г (34.6 ммоль, 17% избыток) N-гидроксисукцинимида, раствор охлаждали до +5°С и затем прибавляли 7.25 (35.2 ммоль, 19% избыток) дицилогексилкарбодиимида, следя за тем, чтобы температура не превышала +5°С. Реакционную массу перемешивали 30 мин при температуре +5 - +7°С и затем 12 ч при комнатной температуре. Осадок дициклогексилмочевины отфильтровывали, фильтрат упаривали. Полученное вязкое масло растворяли в 200 мл дихлорметана. Раствор выдерживали 24 ч в холодильнике при +8°С, повторно образовавшийся осадок дициклогексилмочевины отфильтровывали, фильтрат упаривали. Полученное масло промывали гексаном, гексан декантировали, масло упаривали досуха. Получали продукт в количестве 11.84 г (92%) в виде кремовой пены, [δ]²⁵_D +44° (с 1, ДМФА).

Спектр ¹Н-ЯМР (DMSO-d₆) δ, м.д.: 2.80 (4 Н, м, OSu), 3.07 и 3.25 (2 Н, два д.д., С^βН Trp), 4.00 (1 Н, м, С^αН Trp), 4.95 (2 Н, с, -OCH₂C₆H₅), 6.95-7.77 (10 Н, м, -ОСН₂С₆Н₅, индол), 8.56 (1 Н, д, NH Trp), 10.80 (1 Н, с, NH индол).

б) Амид N-карбобензокси-D-триптофанил-L-лейцина, Z-D-Trp-L-Leu-NH₂.

Растворяли 3.30 г (13.52 ммоль) TFA*L-IleNH₂ (полученного как в Iг) в 30 мл ДМФА с добавлением 2.35 мл (13.52 ммоль) DIPEA. Реакционную массу перемешивали с амином в течение получаса. Затем при перемешивании прибавляли раствор 7.06 г (16.22 ммоль 20% избыток) Z-D-TrpOSu в 30 мл ДМФА. Перемешивали 12 ч при комнатной температуре. По окончании реакции (ТСХ контроль в системе А, УФ и толидиновая проба) раствор упаривали до состояния подвижного масла, растворяли в 200 мл этилацетата, экстрагировали 3% H₂SO₄ (1×100 мл), затем 5% раствором NaHCO₃ (2×100 мл) и дистиллированной водой (1×100 мл), органическую фазу сушили над Na₂SO₄, осушитель отфильтровывали, фильтрат упаривали. Полученное масло растворяли в минимальном количестве ДМФА, разбавляли 200 мл дистиллированной воды, получали белый осадок. Осадку давали выстоять 12 ч в холодильнике при +5°С, отфильтровывали, промывали дистиллированной водой и гексаном. Сушили в вакуумном эксикаторе над CaCl₂ и парафином. Выход составил 6.78 г (86%) чистого продукта с т. пл. 166-169°С, [α]^D₂₆=-31° (с=1, ДМФА).

Спектр ¹Н-ЯМР (DMSO-d₆) δ, м.д.: 0,82-0,88 (6 Н, 2 д д, 2С^δH₃ Leu), 1,08-1,22 (1 Н, м, C^γH₂ Leu), 1,45 (2 Н, м, С^βН Leu), 2,90 и 3,09 (2 Н, два д.д., С^βН Trp), 4,28-4,31 (2 Н, м., С^αН Leu и С^αН Trp), 4,93 (2 Н, м, СН₂СО), 6,99-7,30 (10 Н, м, Ar) 7,25 и 7,33 (2 Н, два с, NH₂ амид), 7,62 (1 Н, д, NH Leu), 7,97 (1 Н, д, NH Trp), 10,81 (1 Н, с, NH индол).

в) Амид D-триптофанил-L-лейцина, H-D-Trp-L-Leu-NH₂.

В колбу, содержащую суспензию 0,500 г 10% Pd/C в 50 мл метанола помещали 6.78 г (0.015 моль) Z-D-Trp-L-Leu-NH₂. Через полученную суспензию пропускали ток водорода из газометра в течение 2 часов при интенсивном перемешивании. По окончании реакции катализатор отфильтровывали через мелкопористый стеклянный фильтр, подложив на дно фильтра бумагу маркировки «черная лента», промывали 50 мл метанола, фильтрат упарили. Получали продукт в количестве 4.71 г (99%) в виде серой пены с т. пл. 108°С.

Спектр ¹Н-ЯМР (DMSO-d₆) δ, м.д.: 0,82-0,88 (6 Н, 2 д д, 2C^δH₃ Leu), 1,09-1,26 (1 Н, м, C^γH₂ Leu), 1,45 (2 Н, м, С^βН Leu), 2.75 и 3.11 (2 Н, два д.д., С^βН Trp), 3.50 (1 Н, м, С^αН Trp), 4.14 (1 Н, д.д., С^αН Leu), 6.94-7.55 (5 Н, м, индол),7.05 и 7.41 (2 Н, 2 д, NH₂ амид) 7.95 (1 Н, д, NH Leu), 10.85 (2 Н, уш с, NH₂ Trp)

г) Амид N-фенилпропионил-D-триптофанил-L-лейцина, Ph(CH₂)₂C(O)-D-Trp-L-Leu-NH₂

Растворяли 4,50 г (14.3 ммоль) H-D-Trp-L-Leu-NH₂ в 50 мл ДМФА, добавляли 3.86 г (15.6 ммоль, 10% изб.) сукцинимидного эфира фенилпропионовой кислоты, перемешивали 12 ч. Затем добавляли 0.20 мл DMAPA для удаления избытка Ph(CH₂)₂C(O)OSu, перемешивали еще полчаса, затем растворитель упарили в вакууме при температуре не выше +50°С. Полученное масло разбавляли 200 мл дистиллированной воды, получали белый «молочный» раствор. Раствору давали выстоять («созреть») в течение 24 ч в холодильнике при температуре +5°С, получали белый порошкообразный осадок, который затем отфильтровывали. Полученные кристаллы промывали 100 мл теплой (43-45°С) воды и 100 мл гексана и 50 мл диэтилового эфира. Сушили в вакуумированном эксикаторе над CaCl₂ и парафином. Выход составил 4.49 г (70%) продукта в виде белого порошка, с т. пл. 190°С, [α]_D²⁶=-22° (с=1, ДМФА), R_f 0,73 (CHCl₃:МеОН 9:1).

Спектр ¹Н-ЯМР (DMSO-d₆) δ, м.д.: 0.82-0,88 (6 Н, 2 д д, 2С^δH₃ Leu), 1,45 (2 Н, т, С^βН Leu), 1,56-1,73 (1 Н, м, C^γH₂ Leu), 2,38 (2 Н, т, CH₂C₆H₅), 2,69 (2 Н, т, СН₂СО), 2,90 и 3,09 (2 Н, два д.д., С^βН Trp), 4,22 (1 Н, д.д., C^αH Leu), 4,54 (1 Н, м, С^αН Trp), 6,99-7,20 (10 Н, м, Ar), 7,33 и 7,60 (2 Н, два с, NH₂ амид), 7,93 (1 Н, д, NH Leu), 8,08 (1 Н, д, NH Trp), 10,78 (1 Н, с, NH индол).

ПРИМЕР 3. Получение амида N-фенилпропионил-L-триптофанил-D-изолейцина (III), C₆H₅(CH₂)₂-C(O)-L-Trp-D-Leu-NH₂

а) N-третбутилоксикарбонил-L-лейцин, N-Boc-D-Leu-OH.

Растворяли 8.00 г (60.98 ммоль) D-лейцина в смеси 50 мл 1N NaOH, 100 мл воды, 200 мл изопропилового спирта. После полного растворения прибавляли 15.97 г (73.17 ммоль, 20% избыток) ди-трет-бутилпирокарбоната. Смесь перемешивали 2 ч при комнатной температуре, поддерживая рН=9-10 прикапыванием раствора 1N NaOH. Контроль за ходом реакции вели методом ТСХ в системе А, проявка хлор-толидиновой пробой. По окончании реакции реакционную массу упаривали в вакууме роторного испарителя до одной трети объема, при этом удалялся преимущественно изопропиловый спирт. Избыток ди-трет-бутилпирокарбоната экстрагировали гексаном (2×100 мл). Водный раствор подкисляли 10% раствором H₂SO₄ до рН 4, продукт выпадал в виде белого «творожистого» осадка. Осадку давали выстоять в течение 12 ч, затем отфильтровывали, промывали дистиллированной водой до нейтральной реакции, сушили на воздухе в фарфоровой чашке до постоянной массы. Получали 11.14 г (79%) продукта в виде белого порошка с т. пл. 83°С.

Спектр ¹Н-ЯМР (DMSO-d₆) δ, м.д.: 0,82-0,85 (6 Н, 2 д д, 2С^δH₃ Leu), 1,08-1,22 (1 Н, м, C^γH₂ Leu), 1.36 (9 Н, с, -ОС(СН₃)₃), 1,45 (2 Н, м, С^βН Leu), 3,86-3,88 (1 Н, д.д., С^αН Leu), 6,72 (1 Н, д, NH Leu), 6,89 и 7,19 (2 Н, два с, NH₂ амид).

б) Сукцинимидный эфир N-трет-бутилоксикарбонил-D-лейцина, N-Boc-D-Leu-OSu.

К раствору 8,00 г (34.63 ммоль) Boc-D-лейцина в 150 мл THF добавляли 4,73 г (39.88 ммоль, 15% избыток) N-гидроксисукцинимида, раствор охлаждали до +5°С на водяной бане со льдом, затем прибавляли 8.26 г (39.88 ммоль, 15% избыток) дицилогексилкарбодиимида. Реакционную массу перемешивали 30 мин при +5°С и 5 ч при комнатной температуре. Контроль за ходом реакции вели методом ТСХ в системе А. по окончании реакции осадок дициклогексилмочевины отфильтровывали, фильтрат упаривали. Полученное вязкое масло растворяли в 30 мл дихлорметана. Раствор выдерживали 24 ч в холодильнике при +8°С, повторно образовавшийся осадок дициклогексилмочевины отфильтровывали, органическую фазу промывали 5% NaHCO₃ (2×100 мл), и 100 мл дистиллированной воды. Сушили над Na₂SO₄, осушитель отфильтровывали, фильтрат упаривали, получали густое белое масло, которое закристаллизовывали в изопропиловом спирте. Полученные кристаллы выдерживали 12 ч в холодильнике при +8°С, получили продукт в количестве 8.31 г (73%) в виде стеклообразного вещества с т. пл. 110-112°С, [α]_D²⁶=+39° (с=2, диоксан)

¹Н-ЯМР (DMSO-d₆) δ, м.д.: 0,82-0,88 (6 Н, 2 д д, 2C^δH₃ Leu), 1,39 (9 Н, с, -ОС(СН₃)₃), 1,45 (2 Н, т, С^βН Leu), 1,56-1,73 (1 Н, м, C^γH₂ Leu), 2,82 (4 Н, м, OSu), 3,86-3,88 (1 Н, м., C^αH Leu), 7,93 (1 Н, д, NH Leu).

в) Амид N-третбутилоксикарбонил-D-лейцина, N-Boc-D-Leu-NH₂.

К раствору 8.00 г (24.36 ммоль) Boc-D-Leu-OSu в 30 мл ДМФА приливали 100 мл водного раствора аммиака при перемешивании, сразу выпадал белый творожистый осадок. Полученную суспензию перемешивали 30 мин до полного прохождения реакции. Осадку давали выстоять 3 ч в прохладном месте, но не в холодильнике, затем сформировавшийся осадок отфильтровывали на стеклянном фильтре, промывали дистиллированной водой до нейтральной реакции промывных вод, сушили в сушильном шкафу при 100°С до постоянной массы. Получали 3.37 г (60%) Boc-L-Leu-NH₂ в виде белого порошка с т. пл. 148-149°С, [α]_D²⁵ (лит.данные 150°С)

Спектр ¹Н-ЯМР (DMSO-d₆) δ, м.д.: 0,82-0,85 (6 Н, 2 д д, 2С^δH₃ Leu), 1,08-1,22 (1 Н, м, C^γH₂ Leu), 1.36 (9 Н, с, -ОС(СН₃)₃), 1,45 (2 Н, м, С^βН Leu), 3,86-3,88 (1 Н, д.д., C^αH Leu), 6,72 (1 Н, д, NH Leu), 6,89 и 7,19 (2 Н, два с, NH₂ амид).

г) Трифторацетат амида D-лейцина, TFA*D-Leu-NH₂

К суспензии 5.12 г (22.3 ммоль) Boc-D-Leu-NH₂ в 20 мл дихлорметана приливали 26 мл (330 ммоль, 150% избыток) TFA, перемешивали 2 ч. Раствор упаривали с диэтиловым эфиром (3×50 мл). Полученное белое масло затирали под диэтиловым эфиром, получали белый порошок, эфир декантировали, остаток фильтровали. Продукт сушили на воздухе. Получали 5.37 г (98%) TFA*D-Leu-NH₂ в виде слегка желтоватых расплывающихся на воздухе кристаллов без четкой температуры плавления, [α]_D²⁶=+44° (с=1, ДМФА).

Спектр ¹H-ЯМР (DMSO-d₆) δ, м.д: 0,83-0,88(6 Н, 2 д д, 2С^δH₃ Leu), 1,08-1,22 (1 Н, м, C^γH₂ Leu), 1.36 (9 Н, с, -ОС(СН₃)₃), 1,45 (2 Н, м, С^βН Leu), 3,69 (1 Н, д д, С^αН Leu), 7,52 и 7,93 (2 Н, два с, NH₂ амид), 8,12 (3 Н, уш. с, N⁺H₃ Leu).

д) Амид L-триптофанил-D-лейцина, H-LTrp-D-Leu-NH₂.

В колбу, содержащую суспензию 0,500 г 10% Pd/C в 50 мл метанола помещали 6.78 г (0.015 моль) Z-L-Trp-D-Leu-NH₂. Через полученную суспензию пропускали ток водорода из газометра в течение 2 часов при интенсивном перемешивании. По окончании реакции катализатор отфильтровывали через мелкопористый стеклянный фильтр, подложив на дно фильтра бумагу маркировки «черная лента», промывали 50 мл метанола, фильтрат упарили. Получали продукт в количестве 4.71 г (99%) в виде серой пены с т. пл. 110°С.

Спектр ¹Н-ЯМР (DMSO-d₆) δ, м.д.: 0,82-0,88 (6 Н, 2 д д, 2С^δH₃ Leu), 1,09-1,26 (1 Н, м, C^γH₂ Leu), 1,45 (2 Н, м, С^βН Leu), 2.75 и 3.11 (2 Н, два д.д., С^βН Trp), 3.50 (1 Н, м, С^αН Trp), 4.14 (1 Н, д.д., С^αН Leu), 6.94-7.55 (5 Н, м, индол),7.05 и 7.41 (2 Н, 2 д, NH₂ амид) 7.95 (1 Н, д, NH Leu), 10.85 (2 Н, уш с, NH₂ Trp)

е) Амид N-фенилпропионил-L-триптофанил-D-лейцина, Ph(CH₂)₂C(O)-L-Trp-D-Leu-NH₂

Растворяли 4,50 г (0.0143 моль) H-L-Trp-D-Leu-NH₂ в 50 мл ДМФА, добавляли 3.86 г (0.0156 моль, 10% изб.) сукцинимидного эфира фенилпропионовой кислоты Ph(CH₂)₂C(O)OSu (полученого как в Iи), перемешивали 24 ч. Затем добавляли 0,20 мл ДМПДА, для удаления избытка Ph(CH₂)₂C(O)OSu, перемешивали еще полчаса, затем растворитель упаривали в вакууме при температуре не выше +45°С. Полученное масло разбавляли 200 мл дистиллированной воды, получали белый «молочный» осадок. Осадку дали выстоять (сформироваться) 12 ч в холодильнике при температуре +8°С, затем отфильтровывали. Полученные кристаллы промывали 100 мл теплой (43°С) воды и 100 мл гексана и 50 мл диэтилового эфира. Сушили в вакуумированном эксикаторе над CaCl₂. Выход составил 4.49 г (70%) продукта в виде белого порошка, с Т. пл. 197-198°С, [α]_D²⁶=-27° (с=1, DMF), R_f 0,73 (CHCl₃:МеОН 9:1).

Спектр ¹Н-ЯМР (DMSO-d₆) δ, м.д.: 0,82-0,88 (6 Н, м, 2С^δH₃ Leu), 1,45 (2 Н, т, С^βН Leu), 1,56-1,73 (1 Н, м, C^γH₂ Leu), 2,38 (2 Н, т, CH₂C₆H₅), 2,69 (2 Н, т, CH₂CO), 2,90 и 3,09 (2 Н, два дд, С^βН Trp), 4,22 (1 Н, дд, С^αН Leu), 4,54 (1 Н, м, С^αН Trp), 6,99-7,20 (10 Н, м, Арил), 7,33 и 7,60 (2 Н, два с, NH₂ амид), 7,93 (1 Н, д, NH Leu), 8,08 (1 Н, д, NH Trp), 10,78 (1 Н, с, NH индол).

ПРИМЕР 4. Получение метилового эфира фенилпропионил-L-триптофанил-L-лейцина, N-Ph(CH₂)₂C(O)-L-Trp-L-Leu-OMe (IV)

а) Гидрохлорид метилового эфира L-лейцина, HCl*L-Leu-OMe

В трехгорлую круглодонную колбу, снабженную термометром, капельной воронкой и воздушным холодильником с хлоркалыдиевой трубкой вносили 150 мл безводного метилового спирта (высушен над ситами с размером пор 3Å), колбу охлаждали до -20°С на бане со спиртом и жидким азотом. При перемешивании по каплям прибавляли 7.67 мл (106.70 ммоль) хлористого тионила. Во время прибавления поддерживали температуру реакционной смеси -20° - -15°С. После прибавления всего хлористого тионила в реакционную колбу вносили 7.00 г (53.35 ммоль) L-лейцина (одномоментно, но следя за тем, чтобы температура реакционной смеси не поднималась выше -15°С). Реакцию вели при -15°С в течение 10 мин, затем давали нагреться до -5°С, после чего реакцию вели при этой температуре еще в течение 2 ч. Реакционную массу нагревали до +40°С при помощи водяной бани с регулируемой температурой, реакцию вели еще в течение 8 ч. По окончании реакции (ТСХ контроль в системе Б,) упаривали, получали белые стеклообразные кристаллы, их переупаривали с метанолом (2×150 мл), затем затирали под 50 мл безводного (выдержанного над CaCl₂) диэтилового эфира, эфир декантировали, остаток отфильтровывали. Полученный продукт сушили в вакуумированном эксикаторе над KOH. Получали белый порошок гидрохлорида метилового эфира L-лейцина массой 8.96 г (92.4%) с т. пл. 147-149°C, [α]^D₂₆=-13.8° (с=5, H₂O), (лит. данные: т. пл. 150°С, [α]^D₂₅=-13.4°, с=5, H₂O [А.А. Гершкович, В.К. Кибирев. Химический синтез пептидов. Киев: Наукова думка, 1992]).

Спектр ¹Н-ЯМР (DMSO-d₆) δ, м.д.: 0,82-0,86 (6 Н, м, 2С^δH₃ Leu), 1,64-1,67 (3 Н, м, С^βН Leu, C^γH₂ Leu), 3,72 (3 Н, с, -ОСН₃), 3,88 (1 Н, д.д., C^αH Leu), 8,75 (3 Н, уш. с, N⁺Н₃ Leu)

б) Метиловый эфир N-карбобензокси-L-триптофанил-L-лейцина, Z-L-Trp-L-Leu-OMe.

Растворяли 2.43 г (13.36 ммоль) HCl*L-Leu-OMe в 30 мл DMFA с 2.54 мл (14.57 ммоль, 10% избыток) DIPEA, к этому раствору прикапывали 6.98 г (16.03 ммоль, 20% избыток) Z-L-Trp-OSu полученного как в I(e) в 50 мл ДМФА. Реакцию вели 24 часа при комнатной температуре (ТСХ-конроль в системе A, R_f 73). Реакционную массу упаривали до состояния подвижного масла, разбавляли 300 мл ЭА, этот раствор промывали 3% раствором H₂SO₄ (2×300 мл) затем 5% раствором NaHCO₃ (2×300 мл) и дистиллированной водой (1×300 мл). Органическую фракцию отделяли, высушивали над безводным MgSO₄ в течение получаса, упаривали до состояния подвижного масла, к нему приливали 200 мл дистиллированной воды комнатной температуры, получали «молочный» осадок, воду упаривали досуха, продукт сушили в вакуумном эксикаторе над CaCl₂ и парафином. Получали 5.95 г (95,6%) вещества в виде густого масла с вкраплениями кристаллов без четкой температуры плавления, [α]_D²⁶=-21.8° (с=1, DMFA).(Лит данные: т. пл. 55-57°С [I. Bhardwaj, R. Sapra, V. Haridas. Urea-cored peptides for anion binding and vesicle formation. Arkivoc 2016 (6) 184-197], [α]_D²⁴=-28° (c=0.1, ацетонитрил) [V. Haridas; S. Sadanandan; S. Dhawan; R. Mishra; I. Jain; G. Goel; Hu Yuan; S. Patel. Synthetic minimalistic tryptophan zippers as a chiroptical switch. Org. Biomol. Chem.; vol. 15; №.7; (2017); p. 1661-1669]).

Спектр ¹Н-ЯМР (DMSO-d₆) δ, м.д.: 0.83-0.88 (6 H, м, 2C^δH₃ Leu), 1.06-1.35 (2 Н, т, С^βН Leu), 1.58 (1 Н, м, C^γH₂ Leu), 2.90 и 3.06 (2 Н, два д.д., С^βН Trp), 3.63 (3 H, с, -ОСН₃), 4.29 (1 Н, д.д., С^αН Leu), 4,41 (1 Н, м, С^αН Trp),), 4.96 и 5.02 (2 Н, 2 д, -OCH₂C₆H₅), 6.98-7.51 (10 Н, м, -ОСН₂С₆Н₅, индол), 7.67 (1 Н, д, NH Trp), 8.27 (1 Н, д, NH Leu), 10.83 (1 Н, с, NH индол)

в) Метиловый эфир L-триптофанил-L-лейцина, H-L-Trp-L-Leu-ОМе.

В колбу, содержащую суспензию из 1.00 г 10% Pd/C с 100 мл метанола и 1 мл дистиллированной воды помещали 5.79 г (12.44 ммоль) Z-L-Trp-L-Leu-OMe. Через полученную суспензию пропускали водород в течение 2 часов при интенсивном перемешивании. За ходом реакции следили методом ТСХ в системе A (R_f продукта 0.35) По окончании реакции катализатор отфильтровывали через стеклянный фильтр, проложив фильтрующее дно бумагой маркировки «черная лента», промывали метанолом. Фильтрат упаривали, получали 4.15 г продукта в виде белого густого масла с [α]_D²⁶=-28.6° (c=1, DMFA).

Спектр ¹Н-ЯМР (DMSO-d₆) δ, м.д.: 0.83-0.88 (6 Н, м, 2С^δH₃ Leu), 1.06-1.35 (2 Н, т, С^βН Leu), 1.58 (1 Н, м, C^γH₂ Leu), 2.90 и 3.06 (2 Н, два д.д., С^βН Trp), 3.63 (3 Н, с, -ОСН₃), 4.29 (1 Н, д.д., С^αН Leu), 4,41 (1 Н, м, С^αН Trp), 6.98-7.51 (10 Н, м, -ОСН₂С₆Н₅, индол), 7.67 (1 Н, д, NH Trp), 8.27 (1 Н, д, NH Leu), 10.83 (1 Н, с, NH индол)

г) Метиловый эфир N-фенилпропионил-L-триптофанил-L-лейцин, N-Ph(CH₂)₂C(O)-L-Trp-L-Leu-OMe (IV)

К 4.10 г (12.37 ммоль) H-L-Trp-L-Leu-OMe в 70 мл DMFA прибавляли 3.67 г (14.85 ммоль, 20% избыток) сукцинимидного эфира фенилпропионовой кислоты. Раствор перемешивали 12 ч. Контроль за ходом реакции вели методом ТСХ в системе А. Избыточное количество сукцинимидного эфира гасили добавлением 0.2 мл DMAPA. Растворитель упаривали, разбавляли 300 мл ЭА. Экстрагировали 3% раствором H₂SO₄ (1×300 мл) затем 5% раствором NaHCO₃ (2×300 мл), затем насыщенным раствором NaCl (1×300 мл) и дистиллированной водой (1×300 мл). Органическую фракцию высушивали над безводным MgSO₄, упаривали досуха, получали легко-кристаллизующееся масло, его дважды переупаривали с диэтиловым эфиром до получения устойчивой пены. Пену измельчали, переносили на стеклянный фильтр и промывали гексаном. Продукт сушили в вакуумном эксикаторе над Na₂SO₄ и парафином. Получали 4.25 г (74%) вещества в виде белого порошка с т. пл. 134-135°С, [α]_D²⁶=-41.4°, с=1, DMFA

Спектр ¹Н-ЯМР (DMSO-d₆) δ, м.д.: 0.83-0.88 (6 Н, м, 2С^δH₃ Leu), 1.06-1.35 (2 Н, т, С^βН Leu), 1.58 (1 Н, м, C^γH₂ Leu), 2.34 (2 Н, м, СН₂ цепи), 2.69 (Н, м, СН₂ цепи), 2.92 и 3.08 (2 Н, два д.д., С^βН Trp), 3.61 (3 Н, с, -ОСН₃), 4.32 (1 Н, д.д., C^αH Leu), 4,61 (1 Н, м, С^αН Trp), 6.91-7.61 (10 Н, м, арил), 8.02 (1 Н, д, NH Trp), 8.35 (1 Н, д, NH Leu), 10.91 (1 Н, с, NH индол)

ПРИМЕР 5 Получение фенилпропионил-L-триптофанил-L-лейцина, Ph(CH₂)₂C(O)-L-Trp-L-Leu-OH (V).

а) N-фенилпропионил-L-триптофанил-L-изолейцин, N-Ph(CH₂)₂C(O)-L-Trp-Leu-OH.

Растворяли 1,10 г (2.32 ммоль) N-Ph(CH₂)₂C(O)-L-Trp-L-Leu-OMe, полученного как в IV(г) в 10 мл метанола, при перемешивании приливали раствор 0,19 г (4.64 ммоль, 100% избыток) NaOH в 5 мл воды. Перемешивали в течение 3 часов до полного растворения реакционной массы. Реакционную массу разбавляли 100 мл воды, при перемешивании подкисляли 10% H₂SO₄ до рН 4-5, при этом выпадал «молочный» осадок, которому давали выстоять 12 ч в холодильнике при +5°С. Раствор над сформировавшимся твердым продуктом декантировали, продукт растворяли в 100 мл этилацетата. Органическую фазу экстрагировали дистиллированной водой (2×100 мл), сушили над безводным Na₂SO₄ в течение получаса. Осушитель отфильтровывали, промывали небольшим количеством этилацетата, упаривали, затем переупаривали 3 раза с диэтиловым эфиром до получения белой устойчивой пены. Пену измельчали, переносили на стеклянный фильтр и промывали гексаном. Выход составил 0.95 г (%) с т. пл. 91-92°С, [α]_D²⁹=-19.8°, с=1, DMFA.

Спектр ¹Н-ЯМР (DMSO-d₆) δ, м.д.: 0.83-0.88 (6 Н, м, 2С^δН₃ Leu), 1.06-1.35 (2 Н, т, С^βН Leu), 1.58 (1 Н, м, C^γH₂ Leu), 2.34 (2 Н, м, СН₂ цепи), 2.69 (Н, м, СН₂ цепи), 2.92 и 3.08 (2 Н, два д.д., С^βН Trp), 3.61 (3 Н, с, -ОСН₃), 4.32 (1 H, д.д., C^αH Leu), 4,61 (1 Н, м, С^αН Trp), 6.91-7.61 (10 Н, м, арил), 8.02 (1 Н, д, NH Trp), 8.35 (1 Н, д, NH Leu), 10.91 (1 Н, с, NH индол) 12.63 (1 Н, ушир. с, ОН).

ПРИМЕР 6. Получение метиламида фенилпропионил-L-триптофанил-L-лейцина, Ph(CH₂)₂C(O)-L-Trp-L-Leu-NHCH₃ (VI).

Растворяли 1,10 г (2,37 ммоль) N-Ph(CH₂)₂C(O)-L-Trp-L-Leu-OMe, полученного как в IV(г) в 23 г раствора метиламина в этиловом спирте, содержащего 5.7 г чистого метиламина. Оставили в герметично закрытой посуде на 6 суток при комнатной температуре. Раствор упарили, затем переупарили дважды с диэтиловым эфиром. Получили 1.05 г (96%) вещества в виде белого порошка с т. пл. 201°С с разложением, [α]_D²⁹=-16.6°, с=1, DMFA.

Спектр ¹Н-ЯМР (DMSO-d₆) δ, м.д.: 0.83-0.88 (6 Н, м, 2С^δH₃ Leu), 1.06-1.35 (2 Н, т, С^βН Leu), 1.58 (1 Н, м, C^γH₂ Leu), 2.37 (2Н, т, СН₂С(O)), 2.57 (3 Н, д, -NHCH₃), 2.69 (2Н, т, CH₂C₆H₅), 2.91 и 3.11 (2 Н, два д.д., С^βН Trp), 4.12 (1 Н, д.д., C^αH Leu), 4,35 (1 Н, м, С^αН Trp), 4.93 и 4.99 (2 Н, 2 д, -OCH₂C₆H₅), 6.91-7.28 (10 Н, м, -ОСН₂С₆Н₅, индол), 7.60 (1 Н, д, NH Trp), 7.85 (1 Н, д, NH Leu), 10.83 (1 Н, с, NH индол).

ПРИМЕР 7. Получение амида N-фенилацетил-L-триптофанил-L-лейцина, PhCH₂C(O)-L-Trp-L-Leu-NH₂ (VII).

а) Сукцинимидный эфир фенилуксусной кислоты.

К раствору 5,00 г (37,0 ммоль) фенилуксусной кислоты в 50 мл тетрагидрофурана добавляли 5,07 г (44,0 ммоль, 20% избыток) N-гидроксисукцинимида, раствор охлаждали до 0°С, после чего в течение 5 мин прибавляли 9,08 г (44,0 ммоль, 20% избыток) дицилогексилкарбодиимида, следя за тем, чтобы температура не превышала +5°С. Реакционную массу перемешивали 30 мин при температуре 0 - +5°С и еще 5 ч при комнатной температуре. По окончании реакции (ТСХ контроль в системе A, Rf 0.83) осадок дициклогексилмочевины отфильтровывали, фильтрат упаривали на роторном испарителе. Полученное вязкое масло растворяли в 50 мл дихлорметана. Раствор выдерживали 24 ч в холодильнике при +8°С, повторно образовавшийся осадок дициклогексилмочевины отфильтровывали, фильтрат упаривали, масло растирали с гексаном, гексан декантировали, остаток упаривали досуха. Получали чистый продукт в количестве 9,44 г (97%) в виде белого порошка с т. пл. = 111-112°С.

Спектр 1Н-ЯМР (DMSO-d6) d, м.д.: 2.81 (4 Н, м, OSu), 4.10 (2 Н, с, CH₂C₆H₅), 7.20-7.42 (5 Н, м, С₆Н₅).

б) Амид N-фенилацетил-L-триптофанил-L-лейцина, PhCH₂C(O)-LTrp-L-Leu-NH₂ (VII).

К 0.55 г (1.76 ммоль) амида L-триптофанил-L-лейцина полученного как в I(з) в 20 мл диметилформамида прибавляли 0.46 г (20% избыток) сукцинимидного эфира фенилуксусной кислоты. Раствор перемешивали 24 часа. Контроль за ходом реакции вели методом ТСХ (система A, R_f 0.55). Избыточное количество сукцинимидного эфира гасили добавлением 0.065 мл DMAPA. Затем реакционную массу упаривали на роторном испарителе до состояния подвижного масла, которое растворяли в 100 мл этилацетата. Экстрагировали 3% водным раствором H₂SO₄ (2×100 мл), 5% водным раствором NaHCO₃ (2×200 мл), и дистиллированной водой (однократоно). Органическую фазу отделяли, сушили над безводным Na₂SO₄ в течение получаса. Осушитель отфильтровывали, промывали небольшим количеством этилацетата, упаривали. Сушили в вакуумированном эксикаторе над CaCl₂, выход составил 0.700 г (%) вещества в виде белого порошка с т. пл. 123°С, [α]_D²⁷=-16°, с=0.5, DMFA.

Спектр ¹Н-ЯМР (DMSO-d₆) δ, м.д.:, 0.82-0,88 (6 Н, м, 2С^δH₃ Leu), 1,45 (2 Н, т, С^βН Leu), 1,56-1,73 (1 Н, м, C^γH₂ Leu), 2.95 и 3.09 (2 Н, два д.д., С^βН Trp), 3.39 (2 Н, с, СН₂С₆Н₅), 4.15 (1 Н, д.д., C^αH Leu), 4,62 (1 Н, м, С^αН Trp), 6.97-7.38 (10 Н, м, СН₂С₆Н₅, индол), 7.07 и 7.58 (2 Н, 2 д, NH₂ амид), 7.77 (1 Н, д, NH Leu), 8.28 (1 Н, д, NH Trp), 10.81 (1 Н, с, NH индол).

ПРИМЕР 8. Получение амида N-капроил-L-триптофанил-L-лейцина, CH₃(CH₂)₄C(O)-L-Trp-L-Leu-NH₂ (IIX).

а) Сукцинимидный эфир капроновой (гексановой) кислоты, CH₃(CH₂)₄C(O)Su.

К раствору 7.00 г (60.26 ммоль) капроновой кислоты в 100 мл ТГФ добавляли 7.97 г (69.30 ммоль, 15% избыток) N-гидроксисукцинимида, раствор охлаждали до +5°С, после чего прибавляли 13.66 г (66.29 ммоль, 10% избыток) дицилогексилкарбодиимида, следя за тем, чтобы температура не превышала +5-+10°С. Затем реакционную массу перемешивали 30 мин при температуре +5-+10°С и 5 ч при комнатной температуре. Осадок дициклогексилмочевины отфильтровывали, промывали небольшим количеством ТГФ, растворитель упаривали на роторном испарителе. Получали легко-кристаллизующееся масло, которое растирали с 50 мл гексана, затем гексан декантировали. Полученное масло затирали с диэтиловым эфиром, однако продукт не закристаллизовался. Эфир декантировали, масло растворяли в 100 мл хлороформа, промывали 5% раствором NaHCO₃ (2×100 мл) и однократно 100 мл дистиллированной воды. Органическую фракцию сушили над прокаленным безводным Na₂SO₄ в течение часа, осушитель отфильтровывали, растворитель упаривали. Получали чистый продукт в количестве 6.27 г (49%) в виде светло-желтого воска без четкой температуры плавления.

Спектр ¹H-ЯМР (DMSO-d₆) δ, м.д.: 0.87 (3 Н, м, СН_{3 цепи}), 1.32 (2 Н, м, С^δН₂), 1.62 (4 Н, м, C^γH₂C^βH₂), 2.63-2.68 (2 Н, т, С^αН₂), 2.80, (4 Н, м, OSu).

б) Амид N-капроил-L-триптофанил-L-лейцина, СН₃(СН₂)₄С(O)-LTrp-L-Leu-NH₂ (IIX).

К 0.55 г (1.73 ммоль) амида L-триптофанил-L-лейцина полученного как в I(з) в 20 мл DMFA прибавляли 0.45 г (2.10 ммоль, 20% избыток) сукцинимидного эфира капроновой кислоты. Раствор перемешивали 7 ч. Контроль за ходом реакции вели методом ТСХ в системе A, R_f 0.62. Избыточное количество сукцинимидного эфира гасили добавлением 0.02 мл DMAPA и перемешивали еще полчаса. Затем реакционную массу разбавляли дистиллированной водой в 3 раза, упаривали на роторном испарителе. Получали легко-кристаллизующееся масло, которое растворяли в 70 мл этилацетата. Этот раствор экстрагировали 3% водным раствором H₂SO₄ (2×70 мл), 5% водным раствором NaHCO₃ (2×70 мл), затем однократно дистиллированной водой. Органическую фазу отделяли, сушили над прокаленным безводным Na₂SO₄ в течение получаса. Осушитель отфильтровывали, промывали небольшим количеством этилацетата, упаривали. Сушили в вакуумированном эксикаторе над CaCl₂, выход составил 0.745 г (%) вещества в виде белого порошка с т пл. 166°С, [α]_D²⁷=-20°,c=1, DMFA.

Спектр ¹H-ЯМР (DMSO-d₆) δ, м.д.: 0.82-0,88 (9 Н, м, 2С^δH₃ Leu и СН_{3 капроил(цепь)}),), 1.32 (2 Н, м, С^δH₂), 1,45 (2 Н, т, С^βН Leu), 1,56-1,73 (1 Н, м, С^γН₂ Leu), 1.62 (4 Н, м, C^γH₂C^βH₂), 2.63-2.68 (2 Н, т, С^αН₂), 2.95 и 3.09 (2 Н, два д.д., С^βН Trp), 3.39 (2 Н, с, CH₂C₆H₅), 4.15 (1 Н, д.д., С^αН Leu), 4,62 (1 Н, м, С^αН Trp), 6.97-7.38 (10 Н, м, СН₂С₆Н₅, индол), 7.07 и 7.58 (2 Н, 2 д, NH₂ амид), 7.77 (1 Н, д, NH Leu), 8.28 (1 Н, д, NH Trp), 10.81 (1 Н, с, NH индол).

ПРИМЕР 9. Получение амида N-фенилпропионил-глицил-L-лейцина, Ph(CH₂)₂C(O)-Gly-L-Leu-NH₂ (IX).

а) Сукцинимидный эфир N-фенилпропионил-глицина, Ph(CH₂)₂C(O)-Gly-OSu.

К раствору 2,00 г (9,65 ммоль) фенилпропионилглицина (получен ранее в лаборатории пептидных биорегуляторов, ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова») в 50 мл ТГФ добавляли 1,33 г (11,58 ммоль, 20% избыток) N-гидроксисукцинимида, затем прибавляли 2,38 г (11,58 ммоль, 20% избыток) дицилогексилкарбодиимида. Реакцию вели 12 ч при комнатной температуре. Осадок дициклогексилмочевины отфильтровывали, промывали небольшим количеством ТГФ, растворитель упаривали на роторном испарителе. Получали легко-кристаллизующееся масло, которое растворяли в 200 мл этилацетата. Промывали 5% водного раствора NaHCO₃ (2×100 мл), затем однократно дистиллированной водой. Органическую фазу сушили над безводным Na₂SO₄ в течение получаса. Осушитель отфильтровывали, промывали небольшим количеством этилацетата, упаривали. Получали продукт в количестве 2.55 г (83%) в виде белых стеклообразных кристаллов без четкой температуры плавления.

Спектр ¹Н-ЯМР (DMSO-d₆) δ, м.д.: 2,37 (2 Н, т, СН₂СО), 2,69 (2 Н, т, СН₂С₆Н₅), 3.56 (2 Н, м, СН₂ Gly), 2.80, (4 Н, м, OSu).

б) Амид N-фенилпропионил-глицил-L-лейцина, Ph(CH₂)₂C(O)-Gly-L-Leu-NH₂ (IX).

Растворяли 2.51 г (10.29 ммоль) TFA*L-IleNH₂ полученного как в 1(г) в 30 мл DMFA с добавлением 2.00 мл (11.31 ммоль, 10% избыток) DIPEA. Реакционную массу перемешивали с амином в течение получаса. Затем при перемешивании прибавляли раствор 3.39 г (11.31 ммоль 10% избыток) Ph(CH₂)₂C(O)-Gly-OSu в 30 мл ДМФА. Перемешивали 12 ч при комнатной температуре. По окончании реакции (ТСХ контроль в системе А, УФ и толидиновая проба) раствор упаривали до состояния подвижного масла, разбавляли 200 мл дистиллированной воды, получали маслообразный легко-кристаллизующийся осадок, дополнительной очистки экстракцией не требовалось. Осадку давали выстоять 24 ч в холодильнике при +5°С, отфильтровывали, промывали дистиллированной водой и гексаном. Сушили в вакуумированном эксикаторе над Na₂SO₄ и парафином. Выход составил 1.50 г (46%) продукта в виде слегка желтоватого порошка с т. пл. 162°С, [α]^D₂₉=-5.2° c=1, DMFA.

Спектр ¹Н-ЯМР (DMSO-d₆) δ, м.д.: 0,85 (6 Н, м, 2С^δН₃ Leu), 1,45 (2 Н, т, С^βН Leu), 1,56-1,73 (1 Н, м, C^γH₂ Leu), 2,37 (2 Н, т, СН₂СО). 2,69 (2 Н, т, CH₂C₆H₅), 3.56 (2 Н, м, СН₂ Gly), 4,22 (1 Н, дд, C^αH Leu), 6,99-7,20 (10 Н, м, арил), 7,33 и 7,60 (2 Н, два с, NH₂ амид), 7,93 (1 Н, д, NH Leu).

ПРИМЕР 10. Амид N-фенилпропионил-L-триптофанил-глицина, Ph(CH₂)₂C(O)-L-Trp-Gly-NH₂ (X).

а) Сукцинимидный эфир N-трет-бутилоксикарбонил-глицина, N-Boc-Gly-OSu.

К раствору 3.00 г (17.1 ммоль) N-Boc-глицина в 100 мл ЭА добавляли 2.31 г (20.0 ммоль, 17% избыток) N-гидроксисукцинимида, раствор охлаждали до +5°С на водяной бане со льдом, затем прибавляли 3.70 г (18.5 ммоль, 10% избыток) дицилогексилкарбодиимида. Реакционную массу перемешивали 30 мин при +5°С и 5 ч при комнатной температуре. Контроль за ходом реакции вели методом ТСХ в системе А. По окончании реакции осадок дициклогексилмочевины отфильтровывали, фильтрат упаривали. Полученное вязкое масло растворяли в 30 мл дихлорметана. Раствор выдерживали 24 ч в холодильнике при +8°С, повторно образовавшийся осадок дициклогексилмочевины отфильтровывали, органическую фазу промывали 5% NaHCO₃ (2×100 мл), и 100 мл дистиллированной воды. Сушили над безводным MgSO₄, осушитель отфильтровывали, фильтрат упаривали, при упаривании получали продукт в виде пластинчатых кристаллов в количестве 4.56 г (98%) с т. пл. 158°С. (Лит данные: 168-170°С [Anderson, G.W.; Zimmerman, J.E.; Callahan, F.M. The use of esters of N-hydroxysuccinimide in peptide synthesis. J. Am. Chem. Soc, 1964, 86, 1839-1842]).

Спектр ¹Н-ЯМР (DMSO-d₆) δ, м.д.: 1.39 (9 H, с, -ОС(СН₃)₃), 2.81 (4 Н, м, OSu), 4.01-4.10 (2 Н, д.д, СН₂ Gly), 7.46-7.50 (1 Н, т, NH Gly).

б) Амид N-трет-бутилоксикарбонил-глицина Boc-Gly-NH₂

К раствору 4 г (14.0 ммоль) Boc-Gly-OSu в 20 мл ДМФА добавляли 40 мл водного раствора аммиака. Полученный раствор перемешивали 30 мин, затем упаривали досуха. Полученный продукт затирали под диэтиловым эфиром, получали густое карамелеобразное масло желтого цвета. Эфир декантировали, продукт использовали в дальнейшем без дополнительной очистки.

Спектр ¹Н-ЯМР (DMSO-d₆) δ, м.д.: 1.39 (9 Н, с, -ОС(СН₃)₃), 3.54 - 3.59 (2 Н, д.д, CH₂Gly), 7.10 (2 Н, два с, NH₂), 7.48-7.50 (1 Н, т, NH Gly).

в) Трифторацетат амида глицина, TFA*Gly-NH₂

_{К 3,65 г (21.0 ммоль) Boc-Gly-NH2 добавили 10 мл дихлорметана и 25,14 г (221 ммоль, 1000% избыток) трифторуксусной кислоты, перемешивали 2 ч. Затем растворители упаривали, полученное масло переупаривали трижды с диэтиловым эфиром для удаления избытка трифторуксусной кислоты. Получали продукт в виде желтого масла, выход составил 4.13 г (98%). Продукт использовали в дальнейшем без дополнительной очистки.}

Спектр ¹Н-ЯМР (DMSO-d₆) δ, м.д.: 3.50 (2 Н, м, СН₂ Gly), 8.05 (3 Н, уш. с, N⁺Н₃ Gly), 7.10 и 7.21 (2 Н, два с, NH₂),

г) Амид N-карбобензокси-L-триптофанил-глицина, Z-L-Trp-Gly-NH₂.

Растворили 1,25 г (9,0 ммоль), TFA*Gly-NH₂ в 30 мл ДМФА с добавлением 3,51 мл ДИПЕА, перемешивали 30 мин. К полученному раствору добавляли 4,0 г (1,08 моль, 20% избыток) Z-L-Trp-OSu (полученного как в Iе), перемешивали при комнатной температуре 24 ч. По окончании реакции (ТСХ контроль в системе A, Rf=0,51) добавляли 0,2 мл ДМАПА для нейтрализации избытка сукцинимидного эфира, перемешивали 30 мин. Растворители упаривали, полученное масло растворяли в 200 мл этилацетата, эстрагировали 3% раствором H₂SO₄ (1×200 мл), 5% раствором NaHCO₃ (1×200 мл), дистиллированной водой (2×200 мл), органическую фазу отделяли, сушили над безводным Na₂SO₄, осушитель отфильтровывали, фильтрат упаривали. К еще теплому и легкоподвижному маслу приливали 100 мл дистиллированной воды, выпадал белый осадок, который отфильтровывали, промывали водой. Выход составил 2,26 г (92%) продукта с т. пл. 123°С, [α]_D²⁷=-37° (с=0.5, ДМФА). (Лит. данные: т. пл 118-119°С [α]_D²⁴=+4° (с=0.5, уксусная кислота) [М. Bodanszky; J.C. Tolle; J. Seto; W.H. Sawyer; Synthesis and some pharmacological properties of [8-L-tryptophan]oxytocin J. Med. Chem. V. 23; №11; (1980); p. 1259-1261, или [α]_D²³=-26.4° (c=1.8, ДМФА) [Celik, I.; Abdel-Fattah; Ashraf, A.A. Convenient synthesis of C-terminal di- and tri-peptide amides from N-protected dipeptidoylbenzotriazoles. Tetrahedron, 2009, 65, 4923-4929])

Спектр ¹Н-ЯМР (дейтероацетон) δ, м.д.: 2.92 и 3.11 (2 Н, два д.д., С^βН Trp), 3.40 и 3.32 (2Н, 2 д д CH₂Gly), 4.34 (1 Н, м, С^αН Trp), 4.98 и 5.03 (2 Н, 2 д, -OCH₂C₆H₅), 6.52-7.77 (10 Н, м, -OCH₂C₆H₅, индол), 7.41 (1 Н, д, NH Trp), 7.41 и 7.10 (2 Н, два с., NH₂ амид), 7.66 (1 Н, д, NH Gly), 10.12 (1 Н, с, NH индол).

д) Амид L-триптофанил-глицина, H-L-Trp-Gly-NH₂

В колбу, содержащую суспензию 0,400 г 10% Pd/C в 100 мл метанола помещали 2.97 г (7.5 ммоль) Z-L-Trp-Gly-NH₂. Через полученную суспензию пропускали ток водорода из газометра в течение 2 часов при интенсивном перемешивании. По окончании реакции катализатор отфильтровывали через мелкопористый стеклянный фильтр, подложив на дно фильтра бумагу маркировки «черная лента», промывали 50 мл метанола, фильтрат упарили. Получали продукт в количестве 2.04 г (99%) в виде серой пены без четкой температуры плавления, который использовали далее без дополнительной очистки.

е) Амид N-фенилпропионил-L-триптофанил-глицина, Ph(CH₂)₂C(O)-L-Trp-Gly-NH₂ (X).

Растворяли 4.50 г (14.3 ммоль) H-L-Trp-Gly-NH₂ в 50 мл ДМФА, добавляли 3.86 г (15.6 ммоль, 10% изб.) сукцинимидного эфира фенилпропионовой кислоты (Ph(CH₂)₂C(O)Su) полученного как в I(и), перемешивали 24 ч. Затем добавляли 0.20 мл ДМПДА, для удаления избытка Ph(CH₂)₂C(O)OSu, перемешивали еще полчаса, затем растворитель упаривали. Полученное масло разбавляли 200 мл дистиллированной воды, получали белый «молочный» осадок. Осадку дали выстоять (сформироваться) 24 ч в холодильнике при температуре +8°С, затем отфильтровывали. Полученные кристаллы промывали 100 мл дистиллированной воды и 50 мл гексана. Сушили в вакуумированном эксикаторе над CaCl₂. Выход составил 4.49 г (70%) продукта в виде белого порошка, с т. пл. 118°С, [α]_D²⁶=-33° (с=1, DMF), R_f 0,73 (CHCl₃:МеОН 9:1).

Спектр ¹Н-ЯМР (DMSO-d₆) δ, м.д.: 2.92 и 3.11 (2 Н, два д.д., С^βН Trp), 2,37 (2 Н, т, CH₂CO), 2,69 (2 Н, т, СН₂С₆Н₅), 3.40 (2 Н, м, CH₂ Gly), 4.34 (1 Н, м, С^αН Trp), 6.52-7.77 (10 Н, м, Арил, индол), 7.41 (1 Н, д, NH Trp), 7.41 и 7.10 (2 Н, два с, NH₂ амид), 7.66 (1 Н, д, NH Gly), 10.12 (1 Н, с, NH индол).

Результаты фармакологического изучения заявляемых соединений

1. Влияние заявляемых соединений на поведение мышей линии BALB/c в условиях эмоционально-стрессового воздействия в тесте «открытое поле».

Тест «открытое поле» - распространенная модель оценки поведения грызунов в условиях эмоционального стресса, формирующегося как реакция на новую обстановку и угрожающую ситуацию. В работе применена методика освещенного «открытого поля», при котором перенос животного из темноты на ярко подсвеченную арену создает дополнительный стрессирующий фактор, основанный на естественном стремлении грызунов избегать ярко освещенных мест (С.Б. Середенин, А.А. Ведерников. Влияние психотропных препаратов на поведение инбредных мышей в условиях открытого поля // Бюлл. Эксп. Биол. Мед. - 1979. - Т. 88, №7, с. 38-40).

В исследовании использованы мыши-самцы инбредной линий BALB/c массой 19-25 г (НПП «Питомник лабораторных животных ФИБХ РАН). Животные содержались в условиях лабораторного вивария в контролируемых условиях окружающей среды (20-22°С и 30-70% относительная влажность, 12-часовой цикл освещения, 10-ти кратная смена объема воздуха комнаты в час), в пластмассовых клетках с верхней крышкой из нержавеющей стали с обеспыленной подстилкой из деревянной стружки, по 20 мышей в каждой клетке, при постоянном доступе к экструдированному брикетированному корму ГОСТ Р 50258-92 [1993] и питьевой воде. Животные распределялись по группам рандомизированно, по критерию массы тела, с отклонением от среднего значения не более чем на ±10%. Перед опытом животных выдерживали в экспериментальной комнате в «домашних» клетках в течение 24 часов.

Соединения готовились в виде суспензии с Твин-80 и дистиллированной водой и вводились однократной внутрибрюшинной инъекцией (в/б). Через 30 минут после внутрибрюшинного введения животное сначала помещали на 1 мин в темную камеру, а затем - на один из периферических квадратов "открытого поля", которое представляет из себя белую круглую арену диаметром 1 метр с белыми бортами высотой 50 см. Арена равномерно освещена 4-мя бестеневыми лампами по 75 Вт каждая, расположенными на высоте 1 м над поверхностью поля. Все пространство арены равномерно разделено 4-мя концентрическими окружностями, которые в свою очередь разбиты радиусами на сектора так, что периферическая окружность состоит из 16 одинаковых криволинейных квадратов. Наблюдение за животным производили в течение 3 минут, раздельно фиксировали число пересеченных квадратов на периферии (ПА), в центральных областях (ЦА), число заходов в центр (Ц), а также число вертикальных стоек (ВА). Суммарное число пересеченных квадратов вместе с числом вертикальных стоек обозначали как общую активность (ОДА).

О наличии анксиолитического действия судили по выявлению активирующего эффекта на двигательную активность у животных с реакцией замирания в тесте «открытое поле» (линия BALB/c).

Статистическую обработку полученных результатов проводили, используя однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA, критерий Краскела-Уоллиса) и непараметрический анализ для независимых переменных (U-критерий Манна-Уитни).

В условиях эмоционально-стрессового воздействия в тесте «открытое поле» при внутрибрюшинном (в/б) введении у соединения ГД-102 в дозах 0,01-0,10 мг/кг обнаружено статистически значимое повышение периферической, центральной и общей двигательной активности мышей линии BALB/c по сравнению с контролем (фиг. 1, табл. 2) В дозах 0,5, 1,0 и 5,0 мг/кг достоверного эффекта не наблюдалось.

Примечания:

Данные представлены в виде M(SD), где М - среднее арифметическое; SD - стандартное отклонение;

число животных в группе -8;

* - статистически значимые различия по сравнению с группой «Контроль» согласно критерию Манна-Уитни.

В условиях эмоционально-стрессового воздействия в тесте «открытое поле» при внутрибрюшинном введении у соединения ГД-118 в дозах 0,1-1,0 мг/кг обнаружено статистически значимое повышение периферической, центральной и общей двигательной активности мышей линии BALB/c по сравнению с контролем (табл.3)

Примечания:

Данные представлены в виде M(SD), где М-среднее арифметическое; SD-стандартное отклонение;

число животных в группе - 8;

* - статистически значимые различия по сравнению с группой «Контроль» согласно критерию Манна-Уитни.

В условиях эмоционально-стрессового воздействия в тесте «открытое поле» при внутрибрюшинном введении у соединения ГД-123 в дозах 0,1-1,0 мг/кг статистически значимое повышение периферической, центральной и общей двигательной активности мышей линии BALB/c по сравнению с контролем не обнаружено (табл. 4)

Примечания:

Данные представлены в виде M(SD), где М - среднее арифметическое; SD - стандартное отклонение;

число животных в группе - 8;

* - статистически значимые различия по сравнению с группой «Контроль» согласно критерию Манна-Уитни.

В условиях эмоционально-стрессового воздействия в тесте «открытое поле» при внутрибрюшинном введении у соединения ГД-125 в дозах 0,5-1,0 мг/кг обнаружено статистически значимое повышение периферической, центральной и общей двигательной активности мышей линии BALB/c по сравнению с контролем (табл. 5)

Примечания:

Данные представлены в виде M(SD), где М - среднее арифметическое; SD - стандартное отклонение;

число животных в группе - 8;

* - статистически значимые различия по сравнению с группой «Контроль» согласно критерию Манна-Уитни.

В условиях эмоционально-стрессового воздействия в тесте «открытое поле» при внутрибрюшинном введении у соединения ГД-128 в дозе 0,5 мг/кг обнаружено статистически значимое повышение периферической, центральной и общей двигательной активности мышей линии BALB/c по сравнению с контролем (табл. 6)

Примечания:

Данные представлены в виде M(SD), где М - среднее арифметическое; SD - стандартное отклонение;

число животных в группе - 8;

* - статистически значимые различия по сравнению с группой «Контроль» согласно критерию Манна-Уитни.

В условиях эмоционально-стрессового воздействия в тесте «открытое поле» при внутрибрюшинном введении у соединения ГД-129 в дозе 0,5 мг/кг обнаружено статистически значимое повышение периферической, центральной и общей двигательной активности мышей линии BALB/c по сравнению с контролем (табл. 7)

Примечания:

Данные представлены в виде M(SD), где М - среднее арифметическое; SD - стандартное отклонение;

число животных в группе - 8;

* - статистически значимые различия по сравнению с группой «Контроль» согласно критерию Манна-Уитни.

В условиях эмоционально-стрессового воздействия в тесте «открытое поле» при внутрибрюшинном введении у соединения ГД-107 в дозах 0,1-1,0 мг/кг обнаружено статистически значимое повышение периферической, центральной и общей двигательной активности мышей линии BALB/c по сравнению с контролем (табл. 8)

Примечания:

Данные представлены в виде M(SD), где М - среднее арифметическое; SD - стандартное отклонение;

число животных в группе - 8;

* - статистически значимые различия по сравнению с группой «Контроль» согласно критерию Манна-Уитни.

В условиях эмоционально-стрессового воздействия в тесте «открытое поле» при внутрибрюшинном введении у соединения ГД-108 в дозах 0,5-1,0 мг/кг обнаружено статистически значимое повышение периферической, центральной и общей двигательной активности мышей линии BALB/c по сравнению с контролем (табл. 9)

Примечания:

Данные представлены в виде M(SD), где М - среднее арифметическое; SD - стандартное отклонение;

число животных в группе - 8;

* - статистически значимые различия по сравнению с группой «Контроль» согласно критерию Манна-Уитни.

В условиях эмоционально-стрессового воздействия в тесте «открытое поле» при внутрибрюшинном введении у соединения ГД-116 в дозах 0,1-1,0 мг/кг обнаружено статистически значимое повышение периферической, центральной и общей двигательной активности мышей линии BALB/c по сравнению с контролем (табл. 10)

Примечания:

Данные представлены в виде M(SD), где М - среднее арифметическое; SD - стандартное отклонение;

число животных в группе - 8;

* - статистически значимые различия по сравнению с группой «Контроль» согласно критерию Манна-Уитни.

В условиях эмоционально-стрессового воздействия в тесте «открытое поле» при внутрибрюшинном введении у соединения ГД-119 в дозах 0,1-1,0 мг/кг обнаружено статистически значимое повышение периферической, центральной и общей двигательной активности мышей линии BALB/c по сравнению с контролем (табл. 11)

Примечания:

Данные представлены в виде M(SD), где М - среднее арифметическое; SD - стандартное отклонение;

число животных в группе - 8;

* - статистически значимые различия по сравнению с группой «Контроль» согласно критерию Манна-Уитни.

2. Влияние заявляемых соединений на поведение мышей линии ICR в условиях эмоционально-стрессового воздействия в тесте «приподнятый крестообразный лабиринт» на примере соединения ГД-102.

Метод «приподнятого крестообразного лабиринта» (ПКЛ) является в настоящее время общепринятым для оценки анксиолитического действия (File S.E. Factors controlling measures of anxiety and responses to novelty in the mouse. Behav Brain Res 2001; 125:151-7). Сущность метода заключается в анализе соотношения реакции страха животных в незнакомом пространстве и высоты с одной стороны и поисковой активности в новой обстановке с другой.

Установка ПКЛ для мышей представляет собой две взаимопересекающиеся под прямым углом горизонтальные дорожки 65×5 см. Два противоположных отсека имеют непрозрачные вертикальные стенки высотой 15 см. Лабиринт приподнят от пола на 40 см. В месте перекрестья плоскостей находится открытая центральная платформа 5×5 см.

Эксперимент проводился в условиях дневного освещения. В начале тестирования животное помещалось в центр лабиринта, что давало возможность переместиться в темные, либо светлые рукава лабиринта - в зависимости от преобладания тревоги (боязнь высоты, открытого пространства) или исследовательской активности (что побуждало животное выходить из «защищенных» рукавов). Фиксировали следующие показатели поведения в ПКЛ в течение 300 сек: время нахождения в открытых рукавах, время нахождения в закрытых рукавах, время нахождения на центральной площадке, число заходов в открытые рукава, число заходов в закрытые рукава.

В исследовании использованы беспородные мыши-самцы ICR массой 19-25 г (НЛП «Питомник лабораторных животных ФИБХ РАН). Животные содержались в условиях лабораторного вивария в контролируемых условиях окружающей среды (20-22°С и 30-70% относительная влажность, 12-часовой цикл освещения, 10-ти кратная смена объема воздуха комнаты в час), в пластмассовых клетках с верхней крышкой из нержавеющей стали с обеспыленной подстилкой из деревянной стружки, по 20 мышей в каждой клетке, при постоянном доступе к экструдированному брикетированному корму ГОСТ Р 50258-92 [1993] и питьевой воде. Животные распределялись по группам рандомизированно, по критерию массы тела, с отклонением от среднего значения не более чем на ±10%. Перед опытом животных выдерживали в экспериментальной комнате в «домашних» клетках в течение 24 часов. Соединения вводили в виде суспензии с водным раствором Твин-80 (две капли на 10 мл) однократно внутрибрюшинно за 30 мин до начала эксперимента. Статистическую обработку результатов фармакологических экспериментов проводили, используя однофакторный дисперсионный анализ ANOVA, критерий Краскела-Уоллиса и непараметрический критерий U Вилкоксона-Манна-Уитни для независимых переменных.

Соединение ГД-102 в диапазоне доз 0,1-0,5 мг/кг демонстрировало достоверный (р<0.05) анксиолитический эффект как по относительному времени пребывания в открытых рукавах, так и по относительному числу заходов в открытые рукава лабиринта (табл. 12).

Примечание. Относительное время пребывания в открытых рукавах лабиринта рассчитывалось по формуле:

где Т₀ - время пребывания животных в открытых рукавах, Т₃ - время пребывания животных в закрытых рукавах лабиринта.

Относительное число заходов в открытые рукава лабиринта рассчитывалось по формуле:

где N₀ - число заходов животных в открытые рукава, N₃ - число заходов животных в закрытые рукава лабиринта.

Количество животных в каждой группе n=8

* р<0,05 - достоверные различия с контролем согласно U-критерию Манна-Уитни

3. Влияние специфического ингибитора TSPO (18kDa) на анксиолитический эффект заявляемых соединений на примере соединения ГД-102

TSPO (18кDа) рецептор представляет собой внутриклеточный белок расположенный на внешней мембране митохондрий, который стимулирует стероидогенез, осуществляя транспорт холестерина от внешней к внутренней митохондриальной мембране. Образующиеся нейростероиды выполняют ряд физиологических функций, являются, в частности, аллостерическими модуляторами ГАМК_А рецептора, усиливая ГАМК трансмиссию. В настоящее время лиганды TSPO рассматриваются как перспективные кандидаты для фармакотерапии ряда неврологических и психиатрических расстройств, включая тревожные и депрессивные состояния (Rupprecht R., Papadopoulos V., Rammes G, Baghai Т.С., Fan J., Akula N., Groyer G., Adams D., Schumacher M. Translocator protein (18 kDa) (TSPO) as a therapeutic target for neurological and psychiatric disorders. Nat Rev Drug Discov. 2010 Dec; 9(12): 971-88. doi: 10.1038/nrd3295. Review; Nothdurfter C, Rammes G, Baghai TC, Schüle C, Schumacher M, Papadopoulos V, Rupprecht R. Translocator protein (18 kDa) as a target for novel anxiolytics with a favourable side-effect profile. J Neuroendocrinol. 2012 Jan; 24(1): 82-92. doi: 10.1111/j. 1365-2826.2011.02166.x. Review.).

Вещество PK11195 (1-(2-chlorophenyl)-N-methyl-(1-methylpropyl)-3-isoquinoline-carboxamide) является специфическим ингибитором связывающимся с рецепторным участком TSPO и при совместном введении с лигандами TSPO (18 kDa) блокируетиханксиолитическийэффект (KitaA, KohayakawaH, KinoshitaT, OchiY, NakamichiK, KurumiyaS, FurukawaK, OkaM.Antianxiety and antidepressant-like effects of AC-5216, a novel mitochondrial benzodiazepine receptor ligand.Br J Pharmacol. 2004; 142(7): 1059-72; Le Fur G, Guilloux F, Rufat P, Benavides J, Uzan A, Renault C, Dubroeucq MC, Guérémy C. Peripheral benzodiazepine binding sites: effect of PK 11195, 1-(2-chlorophenyl)-N-methyl-(1-methylpropyl)-3 isoquinolinecarboxamide. II. Invivostudies.LifeSci. 1983; 32(16): 1849-56).

С целью изучения зависимости эффекта соединения ГД-102 от взаимодействия на участке связывания TSPO эксперимент выполнялся по следующей схеме: беспородные мыши-самцы ICR были разделены на 4 группы по 8 особей в каждой. Группа 1 являлась контрольной, мышам внутрибрюшинно вводилась дистиллированная вода из расчета 0,1 мл на 10 г веса, через 30 мин проводилась повторная аналогичная инъекция и через 30 мин поведение животных оценивали в тесте «приподнятый крестообразный лабиринт». Мышам группы 2 в/бр вводилась суспензия PK11195 в дозе 10,0 мг/кг, через 30 мин - дистиллированная вода и через 30 мин поведение животных оценивали в тесте «приподнятый крестообразный лабиринт». Мышам группы 3 в/бр вводилась дистиллированная вода, через 30 мин суспензия ГД-23 в дозе 0,5 мг/кг и через 30 мин поведение животных оценивали в тесте «приподнятый крестообразный лабиринт». Мышам группы 4 в/бр вводилась суспензия PK11195 в дозе 10,0 мг/кг, через 30 мин суспензия ГД-23 в дозе 0,5 мг/кг и через 30 мин поведение животных оценивали в тесте «приподнятый крестообразный лабиринт».

В работе использовали соединение ГД-102 в дозе 0,5 мг/кг и субстанцию PK11195 (Sigma-Aldrich, USA) в дозе 10,0 мг/кг. Все вещества готовились в виде суспензии с Твин-80 и дистиллированной водой и вводились однократной внутрибрюшинной инъекцией.

Эксперимент выполнен на беспородных мышах-самцах ICR массой 19-25 г. Поведение животных оценивали в тесте «приподнятый крестообразный лабиринт».

Статистическую обработку полученных результатов проводили, используя однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA, критерий Краскела-Уоллиса) и непараметрический анализ для независимых переменных (U-критерий Манна-Уитни) (табл. 13).

Примечание. Относительное время пребывания в открытых рукавах лабиринта рассчитывалось по формуле:

где Т₀ - время пребывания животных в открытых рукавах, Т₃ - время пребывания животных в закрытых рукавах лабиринта.

Относительное число заходов в открытые рукава лабиринта рассчитывалось по формуле:

где N₀ - время пребывания животных в открытых рукавах, N₃ - время пребывания животных в закрытых рукавах лабиринта.

Количество животных в каждой группе n=8

* р<0,05 - достоверные различия с контролем согласно U-критерию Манна-Уитни

Соединение ГД-102 в дозе 0,5 мг/кг вызывало выраженный анксиолитический эффект у мышей ICR в тесте ПКЛ, статистически значимо увеличивая время нахождения в открытых рукавах лабиринта и число заходов в открытые рукава по сравнению с контрольной группой 1. Предварительное введение PK11195 в дозе 10,0 мг/кг (группа 4) полностью блокировало анксиолитический эффект ГД-102, показатели поведения животных этой группы оставались на уровне контроля (табл. 13).

4. Антидепрессивная активность предложенных соединений на примере соединения ГД-102 в тесте вынужденного плавания по Порсолту

Антидепрессивную активность ГД-102 оценивали в тесте вынужденного плавания по Порсолту [Porsolt RD, Anton G, Blavet N, Jalfre M. Behavioural despair in rats: A new model sensitive to antidepressant treatments. Eur J Pharmacol. 1978; 47(4): 379-391]. Этот тест наиболее часто используется во всем мире для выявления антидепрессивной активности соединений.

В первый день мышей помещали в цилиндры (высота 30 см, диаметр 10 см), наполненные на 2/3 водой температурой 22°С на 10 мин. На следующий день (через 22 ч после первой посадки) животных снова помещали в сосуды с водой в те же условия и на протяжении 5-минутного тестового периода регистрировали время сохранения животным характерной позы иммобильности (отказ от активно-оборонительного и исследовательского поведения). Уменьшение длительности и мышей расценивали как свидетельство антидепрессивной активности. В эксперименте использовались мыши-самцы линии BALB/c весом 19-22 г. ГД-102 растирали с Tween80, затем разводили дистиллированной водой из расчета 5 мл/кг и вводили животным в/б в дозах 0,01 и 0,05 мг/кг через 60 мин после первой посадки в цилиндры. В качестве препарата сравнения использовали раствор Амитриптилина 10 мг/кг в дистиллированной воде. Группам «Контроль (вода)» и «Контроль (твин)» вводили в/б соответственно дистиллированную воду или дистиллированную воду с Твин-80 из расчета 5 мл/кг.

Экспериментальные группы:

1. «Контроль (вода)» (n=10)

2. «Контроль (твин)» (n=10)

3. «ГД-102 (0,01 мг/кг)» (n=10)

4. «ГД-102 (0,05 мг/кг)» (n=10)

5. «Амитриптилин (10 мг/кг)» (n=10)

Для выявления статистических различий между экспериментальными группами применяли U тест Манна-Уитнии.

Установлено, что в контрольных группах («Контроль (вода)» и «Контроль (твин)») суммарное время иммобильности составляло соответстенно 227 и 239 с. Достоверных различий между этими группами не выявлено. ГД-102 статистически достоверно снижал время иммобильности в обеих изученных дозах на 9 и 10% по сравнению с группой «Контроль (вода)» и на 15 и 17% по сравнению с группой «Контроль (твин)».

Таким образом, показано, что соединение ГД-102 проявляет антидепрессивную активность в дозах 0,01 и 0,05 мг/кг при однократном внутрибрюшинном введении в тесте вынужденного плавания по Порсолту на мышах линии BALB/c.

Описание чертежей

Фиг. 1. Влияние ГД-102 при однократном внутрибрюшинном введении на поведение мышей BALB/c в тесте «Открытое поле» со световой вспышкой, данные представлены в виде зависимости дозы испытуемого соединения от увеличения общей двигательной активности по отношению к контролю. В качестве контроля использовалась дистиллированная вода.

По оси абсцисс - дозы вводимых соединений, мг/кг, по оси ординат - доля общей двигательной активности относительно контроля, %.

* р<0.05 статистически значимые различия по сравнению с группой «Контроль» согласно критерию U-Манна-Уитни

Группа изобретений относится к новым дипептидным лигандам TSPO, обладающим спектром нейропсихотропной активности. Предложен дипептид общей формулы R₁-X-AК₁-Y-AК₂-R₂, где X=L или D конфигурация, Y=L или D конфигурация, АК₁=Trp или Gly, АК₂=Leu, R₁=C₆H₅-(CH₂)₂-C(O), С₆Н₅-СН₂-С(O) или CH₃-(CH₂)₄C(O), R₂=OH, OCH₃, NH₂ или NHCH₃. Также предложены фармацевтическая композиция указанного дипептида, обладающая нейропсихотропной активностью, способ лечения тревожных состояний и способ лечения депрессивных состояний введением эффективного количества указанного дипептида. Анксиолитическая активность дипептидов была выявлена в дозах 0,1-1,0 мг/кг, а для C₆H₅-(CH₂)₂C(O)-L-Trp-L-Leu-NH₂ в дозах 0,01-5,00 мг/кг. Антидепрессивная активность для С₆Н₅-(СН₂)₂С(O)-L-Trp-L-Leu-NH₂ была выявлена в дозах 0,01-0,05 мг/кг. 4 н. и 9 з.п. ф-лы, 1 ил., 14 табл., 10 пр.

1. Дипептид общей формулы R₁-X-AК₁Y-AК₂-R₂,

где X=L или D конфигурация, Y=L или D конфигурация;

АК₁=Trp или Gly; АК₂=Leu;

R₁=C₆H₅-(CH₂)₂-C(O), или С₆Н₅-СН₂-С(O), или CH₃-(CH₂)₄C(O);

R₂=OH, или OCH₃, или NH₂, или NHCH₃, являющийся лигандом транслокаторного протеина (TSPO), обладающий нейропсихотропными свойствами.

2. Дипептид по п. 1, отличающийся тем, что

X=L, Y=L, АК₁=Trp, АК₂=Leu, R₁=С₆Н₅-(СН₂)₂-С(O), R₂=NH₂.

3. Дипептид по п. 1, отличающийся тем, что

X=D, Y=L, АК₁=Trp, АК₂=Leu, R₁=С₆Н₅-(СН₂)₂-С(O), R₂=NH₂.

4. Дипептид по п. 1, отличающийся тем, что

X=L, Y=D, АК₁=Trp, АК₂=Leu, R₁=C₆H₅-(CH₂)₂-C(O), R₂=NH₂.

5. Дипептид по п. 1, отличающийся тем, что

X=L, Y=L, AК₁=Gly, АК₂=Leu, R₁=C₆H₅-(CH₂)₂-C(O), R₂=NH₂.

6. Дипептид по п. 1, отличающийся тем, что

X=L, Y=L, АК₁=Trp, АК₂=Leu, R₁=С₆Н₅-(СН₂)₂-С(O), R₂=OCH₃.

7. Дипептид по п. 1, отличающийся тем, что

X=L, Y=L, АК₁=Trp, АК₂=Leu, R₁=C₆H₅-(CH₂)₂-C(O), R₂=OH.

8. Дипептид по п. 1, отличающийся тем, что

X=L, Y=L, АК₁=Trp, АК₂=Leu, R₁=С₆Н₅-(СН₂)₂-С(O), R₂=NHCH₃.

9. Дипептид по п. 1, отличающийся тем, что

X=L, Y=L, АК₁=Trp, АК₂=Leu, R₁=С₆Н₅-СН₂-С(O), R₂=NH₂.

10. Дипептид по п. 1, отличающийся тем, что

X=L, Y=L, АК₁=Trp, АК₂=Leu, R₁=СН₃-(СН₂)₄-С(O), R₂=NH₂.

11. Способ лечения тревожных состояний введением эффективного количества дипептида по п. 1, где X=L, Y=L, АК₁=Trp, АК₂=Leu, R₁=С₆Н₅-(СН₂)₂-С(O), R₂=NH₂, или X=L, Y=L, АК₁=Trp, АК₂=Leu, R₁=C₆H₅-(CH₂)₂-C(O), R₂=OH.

12. Способ лечения депрессивных состояний введением эффективного количества дипептида по п. 1, где X=L, Y=L, AK₁=Trp, AK₂=Leu, R₁=С₆Н₅-(CH₂)₂-C(O), R₂=NH₂.

13. Фармацевтическая композиция, обладающая нейропсихотропной активностью, содержащая в качестве действующего вещества терапевтически эффективное количество дипептида по п. 1.