РАДИКАЛСВЯЗЫВАЮЩЕЕ СРЕДСТВО НА ОСНОВЕ ПРОИЗВОДНЫХ АЦИЛПИРОВИНОГРАДНЫХ КИСЛОТ Российский патент 2023 года по МПК A61K31/216 A61K31/341 A61K31/381 A61P43/00 

Изобретение относится к области медицины, ветеринарии, фармации и фармакологии, а именно к применению метиловых эфиров 4-алкил- и (гет)арил-2-ариламино-4-оксо- Z-2-бутеновых кислот общей формулы 1 в качестве средства, обладающего радикалсвязывающей активностью, которое может найти применение для профилактики и лечения людей и животных в качестве антиоксиданта, а также в качестве антиоксидантных стабилизаторов материалов.

,

где R¹ = C₆H₅, C₄H₃S, C₄H₃O, t-Bu, R² = H, Me, Br, F.

Свободные радикалы возникают в организме в качестве продукта метаболизма или в результате негативных внешних воздействий. Будучи высоко реакционноспособными частицами они атакуют клетки органов, повреждая клеточные мембраны, ферменты и ДНК, если присутствуют в количествах, превышающих физиологический уровень, или локализуются в местах, где их присутствие в норме не предполагается. Свободные радикалы представляют особую опасность для клеток нервной и иммунной систем, способствуют развитию многих заболеваний и преждевременному старению организма. Антиоксиданты в кормах помогают предотвратить повреждение клеток, вызванное свободными радикалами. Кроме того, антиоксиданты, дополнительно поступающие в организм, могут вносить вклад в эффективность естественной антиоксидантной защиты организма.

Из литературы известно, что производные β-енаминонов 2 обладают радикалсвязывающей активностью [А. Theppawong, R. D. Vreese, L. Vannecke, C. Grootaert , J. V. Camp, M. D’hooghe. Bioorg. Med. Chem. Lett., 2016, 26 Р. 5650–5656]. Они приняты за прототип изобретения, поскольку близки к заявляемому техническому решению по сущности и по достигаемым результатам.

Основными недостатками прототипа служит то, что радикалсвязывающая активность соединений 2 была установлена в тесте с 1,1-дифенил-2-пикрилгидразилом (DPPH), который менее биологически релевантен по сравнению с тестом ORAC-FL [Burgart, Y.V.; Makhaeva, G.F.; Krasnykh, O.P.; Borisevich, S.S.; Agafonova, N.A.; Kovaleva, N.V.; Boltneva, N.P.; Rudakova, E.V.; Shchegolkov, E.V.; Triandafilova, G.A.; et al. Molecules 2022, 27, 7722-7748].

Технической задачей предлагаемого изобретения является расширение арсенала средств, обладающих радикалсвязывающей активностью. Поставленная задача решается применением метиловых эфиров 4-алкил- и (гет)арил-2-ариламино-4-оксо- Z-2-бутеновых кислот общей формулы 1 в качестве средства, обладающего радикалсвязывающей активностью.

В литературе имеются сведения о синтезе, физико-химических, спектральных характеристиках заявляемых метиловых эфирах 4-алкил- и (гет)арил-2-ариламино-4-оксо- Z-2-бутеновых кислот общей формулы 1, получение которых реализуется реакцией метиловых эфиров алкил- и (гет)ароилпировиноградных кислот с замещенными анилинами [А.Н. Масливец, О.П. Красных, Л.И. Смирнова и др., Ж. орган. химии, 25 (5), 1045-1053 (1989); А. А. Ботева, О. П. Красных, И. В. Фефилова, Е. Б. Бабушкина, П. А. Слепухин. Известия Академии наук. Серия химическая, 2014, № 3, С. 731-738; Ботева А.А. дис. … канд. фарм. наук. Пер. гос. фарм. академия, Пермь, 2008]. Однако в литературе отсутствуют сведения о радикалсвязывающей активности данных соединений.

Новое свойство метиловых эфиров 4-алкил- и (гет)арил-2-ариламино-4-оксо- Z-2-бутеновых кислот общей формулы 1 было обнаружено авторами путем ряда экспериментов и его нельзя было предсказать заранее.

К основным достоинствам изобретения можно отнести:

• высокую радикалсвязывающую активность в тесте ORAC-FL при низких концентрациях (10 мкмоль) заявляемых веществ

• заявляемые вещества по эффекту превосходят общепринятый «золотой стандарт» тролокс

• низкую токсичность заявляемых соединений.

Оценку радикалсвязывающего / антиоксидантного действия проводили в тесте ORAC-FL. Тест основан на инициировании образования радикальных частиц из AAPH (2,2'-азобис(2-амидинопропан)дигидрохлорида) в растворе флуоресцеина с последующим измерении уровня флуоресценции в присутствии исследуемых веществ и в их отсутствие.

Способность поглощать кислородные радикалы определяли по способности соединений защищать флуоресцеин от пероксильных радикалов, образующихся из AAPH при 37°C. Реакцию проводили при 37°C в черных 96-луночных планшетах, а конечный объем реакционной смеси составлял 200 мкл на лунку. Флуоресценцию регистрировали с помощью микропланшетного ридера Tecan M1000 PRO (Швейцария) при возбуждении 485 нм и эмиссии 520 нм.

Фосфатно-солевой буфер (рН 7,4) готовили в соответствии с инструкциями производителя путем разведения 1 гранулы в 100 мл деионизированной воды. При необходимости рН доводили до 7,4, приготовленный буфер хранили в холодильнике. Готовили исходный раствор 0,7 мМ флуоресцеин-натриевой соли в PBS и хранили в холодильнике в течение 1 месяца. Часть исходного раствора дополнительно разбавляли PBS непосредственно перед каждым анализом, чтобы получить рабочий раствор с концентрацией 70 нМ. Раствор 133 мМ ААРН в PBS готовили непосредственно перед использованием. Растворы всех исследованных образцов готовили в ДМСО.

Крайние ряды планшеты заполнялись водой. В каждую оставшуюся лунку планшета добавляли 15 мкл PBS и 5 мкл образца (или 5 мкл ДМСО) после 120 мкл рабочего раствора флуоресцеина, и смеси предварительно инкубировали. Затем в каждую лунку с помощью многоканального дозатора добавляли 60 мкл ААРН. Планшет помещали в ридер при температуре 37 ºC и регистрировали флуоресценцию каждую минуту в течение двух часов.

Каждое значение кривой было скорректировано относительно начального значения:

Nt = 100 * nt / n0, где - значение флуоресценции в момент времени t; n0 - значение флуоресценции в момент времени 0. Площадь под кривой (AUC) рассчитывали для периода времени обнаружения флуоресценции по формуле расчета площади трапеции. Степень антиоксидантной активности выражали по формуле: % Ing = 100 * (AUC_S-AUC_AAPH) / (AUC_FL-AUC_AAPH). Пересчет значений в тролоксовом эквиваленте проводили по формуле:

ORAC,TE = (AUC_S-AUC_DMSO)/(AUC_Trolox-AUC_DMSO).

Исследование острой токсичности для веществ CBR-173, CBR-177, CBR-183, CBR-424, CBR- 426, CBR- 363 проводили на аутбредных белых мышах линии CD-1 массой 25-35 грамм. Исследуемые вещества вводили внутрибрюшинно в 1 % крахмальной слизи. После введения исследуемых веществ оценивали выживаемость животных в группах при постоянном мониторинге в течение 24 часов и последующем общем наблюдении в течение 14 дней. Установлено, что вышеуказанные вещества формулы 1 не проявляют токсичность в дозе 500 мг/кг, что позволяет их отнести к соединениям 4 класса токсичности «малотоксичные вещества» [К.К. Сидоров, Токсикология новых промышленных веществ, Москва, (1973), вып. 13, с. 47-51].

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

ПРИМЕР 1: Антиоксидантная активность (АОА) метиловых эфиров 4-алкил- и (гет)арил-2-ариламино-4-оксо- Z-2-бутеновых кислот общей формулы 1 в концентрации 10 мкмоль

Таблица 1

№ Шифр R¹ R² АОА, % Тролоксовый эквивалент 1 CBR- 394 Ph Н 38,5±0,7 2,1±0,2 2 CBR-409 Ph Me 52,0±4,5 2,7±0,2 3 CBR-363 Ph Br 15,9±4,0 0,8±0,2 4 CBR-173 Ph F 47,0±3,8 2,5±0,2 5 CBR-183 C₄H₃S H 49,5±3,1 2,5±0,2 6 CBR-184 C₄H₃S Me 64,9±1,2 3,3±0,2 7 CBR-176 C₄H₃S Br 26,2±9,5 1,4±0,3 8 CBR-177 C₄H₃S F 57,1±0,9 3,0±0,2 9 CBR-424 C₄H₃О Me 59,3±2,1 3,2±0,1 10 CBR-426 C₄H₃О Br 33,3±1,7 1,8±0,2 11 CBR-425 C₄H₃О F 68,2±3,3 3,7±0,2 12 CBR-417 t-Bu F 48,2±3,1 2,5±0,1 тролокс 19,8±0,7 -

ПРИМЕР 2: Метиловый эфир 4-оксо-4-(2-тиенил)-2-фениламино-Z-2-бутеновой кислоты (CBR-183)

6,00 г (28,3 ммоль) метилового эфира тиеноилпировиноградной кислоты и 2,62 г (28,1 ммоль) анилина растворяли в 60 мл бензола. Кипятили 5 часов с насадкой Дина-Старка, маточник упаривали. Полученный осадок перекристаллизовывали из этанола. Выход 51%, т.пл. 62-64 ^оС. ИК-спектр, ν/см^-1: 1735 (СООСН₃), 1625 (С₄Н₃SCO), 1600 (С=С). Спектр ЯМР ¹H (400 MГц, CDCl₃) δ м.д.: 3,72 (с, 3Н, ОСН₃); 6,27 (с, 1Н, СН); 6,98 (м, 2Н, 2’-Н, 6’-Н); 7,13 (м, 2Н, 4’-H, 4-H); 7,33 (м, 2Н, 3^’-H, 5’-H); 7,58 (дд, 1Н, J₁ 5,0 Гц, J₂ 1,2 Гц, 3(или 5)-H); 7,71 (дд, 1Н, J₁ 3,8 Гц, J₂ 1,2 Гц, 5(или 3)-Н); 11,73 (с, 1Н, NH).

ПРИМЕР 3: Метиловый эфир 4-oксо-4-фенил-2-((4-фторфенил)амино)-Z-2-бутеновой кислоты (CBR-173)

Синтезируют аналогично из 10 г (0.0485 моль) метилового эфира бензоилпировиноградной кислоты и 5.39 г (0.485 моль) п-фторанилина. Выход 84%. т.пл. 86,8-87,7 ^оС (этанол). ИК-спектр, ν/см^-1: 1736 (COOCH₃), 1602 (C=O, C=C). Спектр ЯМР ¹H (100 MГц, CDCl₃) δ м.д.: 3.72 (с, 3Н, ОМе); 6.41 (с, 1Н, СН); 7.45 (м, 9Н, Ar); 12.01 (с, 1Н, NH).

ПРИМЕР 4: Метиловый эфир 4-оксо-4-(2-фурил)-2-((4-метилфенил)амино)-Z-2-бутеновой кислоты (CBR-424)

Синтезируют аналогично из 6 г (0.031 моль) метилового эфира фуроилпировиноградной кислоты и 3.28 г (0.031 моль) п-толуидина. Выход 74%. т.пл. 56-58 ^оС (изопропанол). ИК-спектр, ν/см^-1: 1738 (СООМе), 1608, 1588 (С₄Н₃ОCO, С=С). Спектр ЯМР ¹H (400 MГц, CDCl₃) δ м.д.: 2.27 (с, 3Н, Ме); 3.71 (с, 3Н, ОМе); 6.23 (с, 1Н, СН); 6.70 (д.д, 1Н, Н(4), ³J = 1.7, ³J = 3.5); 6.92 (д, 2Н, Н(3’), Н(5’), ³J = 8.4); 7.15 (д, 2Н, Н(2’), Н(6’), ³J = 8.1); 7.39 (д.д, 1Н, Н(3), ³J = 3.8, ⁴J = 0.8); 7.95-7.96 (м, 1Н, Н(5)); 11.53 (с, 1Н, NH).

ПРИМЕР 5: Метиловый эфир 5,5-диметил-4-оксо-2-((4-фторфенил)aмино)-Z-2-бутеновой кислоты (CBR-417)

Синтезируют аналогично из 7,86 г (0.042 моль) метилового эфира пивалоилпировиноградной кислоты и 4.69 г (0.042 моль) п-фторанилина. Выход 70%. т.пл. 54-56 ^оС (гексан). ИК-спектр, ν/см^-1: 1732 (СООМе), 1624, 1576 (C⁴=O, C=C). Спектр ЯМР ¹H (100 MГц, CDCl₃) δ м.д.: 1.19 (c, 9H, 3Ме); 3.64 (с, 3Н, ОМе); 5.82 (c, 1H, CH); 6.73-6.90 (м, 4Н, ArH); 11.37 (c, 1Н, NH).

Изобретение относится к области медицины, ветеринарии, фармации и фармакологии, а именно к применению метиловых эфиров 4-алкил- и (гет)арил-2-ариламино-4-оксо- Z-2-бутеновых кислот общей формулы 1, где R¹ = C₆H₅, C₄H₃S, C₄H₃O, t-Bu, R² = H, Me, Br, F, в качестве средства, обладающего радикалсвязывающей активностью. Изобретение может найти применение для профилактики и лечения людей и животных в качестве антиоксиданта, а также в качестве антиоксидантных стабилизаторов материалов. 1 табл., 5 пр.

Применение производных метиловых эфиров 4-алкил- и (гет)арил-2-ариламино-4-оксо- Z-2-бутеновых кислот общей формулы 1

,

где R¹ = C₆H₅, C₄H₃S, C₄H₃O, t-Bu, R² = H, Me, Br, F,

в качестве средства, обладающего радикалсвязывающей активностью.