Питательная среда для культивирования базидиального гриба Inonotus obliquus Российский патент 2023 года по МПК C12N1/14 C12R1/645 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к питательным средам для культивирования базидиального гриба Inonotus obliquus (чага).

Гриб Inonotus obliquus (чага) является ценным природным сырьем, поскольку содержит различные биологически активные вещества, в том числе, основной активный компонент - меланин (Szychowski, K.A. Inonotus obliquus - from folk medicine to clinical use / K.A. Szychowski et al.// Journal of Traditional and Complementary Medicine. - 2021. - V.11. - P. 293-302 doi:10.1016/j.jtcme.2020.08.003). На сегодняшний день из природного сырья чаги производят лекарственный препарат Бефунгин, биологически активные добавки на основе измельченного сырья, жидких и сухих экстрактов в России и других странах. Спектр терапевтической активности препаратов чаги очень широк. Известно, что они обладают антиоксидантными, протекторными, противоопухолевыми, иммуномодулирующими свойствами. Показано, что экстракты и меланин чаги проявляют противовирусную активность в отношении вирусов гриппа, простого герпеса 2-го типа, иммунодефицита (ВИЧ-1) и осповакцины (Патент RU 2375073, МПК A61K 38/06, A61P 31/18, опубл. 10.12.2009, Патент RU 2480227, МПК A61K 36/06, B01D 11/02, A61P 31/14, опубл. 27.04.2013). Особого внимания заслуживает эффективность водных экстрактов и меланина чаги в отношении новой коронавирусной инфекции, доказано, что они ингибируют репликацию коронавируса SARS-CoV-2 (Патент RU 2741714, МПК A61K 36/06, B01D 11/02, A61P 31/14, опубл. 28.01.2021; Патент RU 2747018, МПК A61K 36/06, B01D 11/02, A61P 31/14, опубл. 23.04.2021).

Большие объемы заготовки гриба Inonotus obliquus, учитывая длительное время возобновления (не менее 4-5 лет), привели к истощению его запасов в природе. В связи с этим актуальным является разработка биотехнологии гриба Inonotus obliquus, что позволит заменить дефицитное природное сырье на биомассу, полученную в искусственных условиях. При культивировании гриба, важным является подбор условий. Главным требованием к питательной среде для культивирования гриба является обеспечение биомассы всеми необходимыми компонентами для ее интенсивного роста и накопления целевых метаболитов.

Предложена жидкая питательная среда для поверхностного культивирования гриба чага на основе картофельного отвара, содержащего глюкозу, глицин, комплекс меланина с железом и полифепан при массовой концентрации компонентов в г/л: глюкоза - 20,0; комплекс меланина с железом - 0,10-0,50; глицин - 0,10-0,50; полифепан - 0,1. При поверхностном культивировании гриба на этой питательной среде в течение 12 суток выход биомассы не превышает 5 г/л. Низкая продуктивность гриба может быть обусловлена долгим периодом адаптации культуры к питательной среде, а также неэффективным потреблением субстрата вследствие ее роста только на поверхности питательной среды.

Более высокую продуктивность по сравнению с поверхностным способом культивирования имеет глубинный способ, когда культура выращивается в слое питательный среды.

Известна жидкая питательная среда для глубинного культивирования штамма базидиального гриба Inonotus obliquus TV-18, в состав которой входят, г/л: глюкоза - 30; триптон - 10,0; дрожжевой экстракт - 5,0; КН₂РО₄ - 1,1; K₂HPO₄ - 4,4; MgSO₄×7H2O - 0,25; вода - до 1 л. Выход биомассы по сухим веществам на 10 сутки культивирования составляет в среднем 18,2 г/л (Патент RU 2716590, МПК C12N 1/14, A61P 31/00, A61P 35/00, опубл. 12.03.2020).

Предложена питательная среда для выращивания штамма гриба Inonotus obliquus БИМ F-350 Д, в состав которой входят, г/л: глюкоза-30; пептон-3,0; кукурузный экстракт - 2 мл; КН₂РО₄ - 1,0; K₂HPO₄ - 1,0; (NH₄)₂SO₄ - 1,4; MgSO₄ - 0,25; CuSO₄×5H₂O - 0,08; тирозин - 0,2; тиамин - 300 мкг; вода - до 1 л. Выход биомассы при глубинном культивировании в течение 10 суток составил 12,5 г/л (Патент BY 10670, МПК C12N 1/14, С12Р 19/00, опубл. 30.06.2008).

Культивирование штамма гриба Inonotus obliquus F-1244 в колбах на качалке осуществляли на питательной среде состава, г/л: глюкоза - 30; триптон - 2,5; дрожжевой экстракт - 1,25; KH₂PO₄ - 1,1; K₂HPO₄ - 4,4; MgSO₄ - 0,25; вода - до 1 л. Накопление биомассы в течение 12-15 суток составляет 17 г/л (Ананько Г.Г. Меланины из глубинной культуры Inonotus obliquus и их противовирусная активность в отношении вируса простого герпеса 2 типа / Г.Г. Ананько, Т.В. Теплякова, А.В. Бардашева, Т.Н. Ильичева // Успехи медицинской микологии. - 2015. - С. 384-388.).

Обзор литературных источников показывает еще множество исследований по глубинному культивированию различных штаммов гриба Inonotus obliquus, при этом питательные среды всегда имеют сложный состав. Таким образом, к основным недостаткам питательных сред, предлагаемых для культивирования различных штаммов гриба Inonotus obliquus, можно отнести многокомпонентность, использование дорогостоящих стимулирующих добавок (витамины, аминокислоты, белковые гидролизаты) и большого количества неорганических веществ. Кроме того, авторы не всегда приводят количество посевного материала, что не позволяет оценить эффективность использования сред, например, по выходу биомассы и/или меланина. Также стоит отметить, отсутствие ориентированности в имеющихся исследованиях на сокращение периода адаптации культуры гриба Inonotus obliquus при посеве на используемые питательные среды.

В качестве прототипа выбрана питательная среда для поверхностного способа выращивания гриба чага на основе картофельного отвара, содержащего глюкозу, глицин, комплекс меланина с железом и полифепан (Патент RU 2717974, МПК C12N 1/14, C12R 1/645, опубл. 27.03.2020).

Недостатком данной питательной среды является получение биомассы гриба с низким выходом.

Технической проблемой предлагаемого изобретения является конструирование жидкой питательной среды, которая позволит получить биомассу гриба Inonotus obliquus с высоким выходом при глубинном способе культивирования.

Техническая проблема решается конструированием жидкой питательной среды для глубинного культивирования гриба Inonotus obliquus на основе картофельного отвара, содержащего глюкозу, глицин, комплекс меланина с железом, полифепан и энзистал при массовой концентрации компонентов в г/л: глюкоза - 20,0; глицин - 0,30; комплекс меланина с железом - 0,10; полифепан - 1,9; энзистал - 0,60.

Использование предлагаемой питательной среды позволяет увеличить количество получаемой биомассы гриба Inonotus obliquus в 2,3-2,7 раза по сравнению с прототипом (табл. примеры 2 и 3).

В предлагаемой питательной среде к картофельному отвару, содержащему глюкозу и стимулирующие рост компоненты: глицин, комплекс меланина с железом и полифепан, добавляют энзистал. Это лекарственный ферментный препарат (рег. номер ПN015075/01), содержит 192 мг/г панкреатина, обладающего амилолитическим, липолитическим и протеолитическим действиями. При его использовании осуществляется ферментативный гидролиз различных компонентов питательной среды до простых соединений. В связи с этим, использование ферментного препарата позволит обогатить питательную среду легкоусвояемыми и доступными для гриба компонентами, главным образом, ди- и моносахаридами, являющимися источниками энергии, аминокислотами необходимыми для синтеза белков, жирными кислотами для образования липидов. При культивировании гриба в начале наблюдается лаг-фаза, в которой культура адаптируется к новым условиям среды, и основным из процессов приспособления является синтез необходимых ферментов для усвоения питательных веществ. Внесение энзистала позволит сократить лаг-фазу при глубинном культивировании гриба Inonotus obliquus, т.к. основная часть питательных веществ в среде будет гидролизована под действием панкреатина. Отсутствие необходимости культуре гриба синтезировать ферменты для расщепления субстрата позволит ей на метаболитическом уровне переключиться на активный рост и синтез целевых продуктов.

Стоит отметить, что по аналогии с прототипом в конструируемой жидкой питательной среде для глубинного культивирования гриба Inonotus obliquus используются те же стимулирующие добавки, при этом их дозировки изменены. Исключением является глицин, его содержание в конструируемой питательной среде составляется 0,30 г/л, также как в питательной среде по прототипу. Несмотря на то, что глицин является важной аминокислотой в метаболизме гриба, и в условиях глубинного культивирования потребность культуры гриба в ней может возрасти, его содержание в предлагаемой питательной среде оставили без изменений. Это обусловлено тем, что за счет ферментативного гидролиза белков картофельного отвара под действием энзистала конструируемая питательная среда по сравнению с прототипом имеет более богатый аминокислотный состав.

Дозировку комплекса меланина с железом по сравнению с прототипом сократили с 0,3 до 0,1 г/л на основании полученных результатов экспериментальных исследований. Комплекс меланина с железом является инициатором его активного роста, а также важным источником доступных ионов железа, которые гриб использует для биосинтеза ферментов пероксидазы и каталазы необходимых для синтеза меланинов и других вторичных метаболитов. Обычно потребность в ионах металлов и инициаторах биосинтеза у продуцентов низкая, и не превышает 0,1 г/л (Zheng W. Effects of culture media and three metal ions on the accumulation of lanosterol and ergosterol in cultured mycelia of Inonotus obliquus / W. Zheng et al.// Mycosystema. - 2008. - 27. - Р. 126-139).

Предложено, по сравнению с прототипом, увеличить дозировку полифепана в конструируемой питательной среде с 0,1 г/л до 1,9 г/л. Полифепан - это гидролизный лигнин. Его введение в состав питательной среды позволяет обеспечить культуру гриба фенольными соединениями, которые он обычно утилизирует из древесины в ходе развития в природных условиях. Кроме того, компоненты гидролизованного лигнина гриб может сразу использовать в качестве структурных единиц в биосинтезе меланина.

Для получения биомассы гриба Inonotus obliquus использовали штамм SUB2092728. Предлагаемый штамм гриба был выделен тканевым методом из плодовых тел, произрастающих в Звениговском районе Республике Марий Эл и депонирован в базе данных GenBank. Штамм хранится при 4-6°C на глюкозо-картофельной среде. Гриб Inonotus obliquus SUB2092728 является аэробом, оптимальной температурой роста является 24-27°C и рН 6,0-7,0.

Питательную среду готовили следующим образом. К измельченному картофелю добавляли воду в соотношении 5:1, кипятили в течение 30 мин и фильтровали. Полученный отвар доводили водой до 1 л, разливали по колбам объемом 500 мл и добавляли к нему компоненты питательной среды: глюкозу, комплекс меланина с железом, глицин и полифепан. В подготовленные колбы с питательной средой вносили энзистал в виде порошка, тщательно перемешивали и инкубировали при температуре 37±1°C в течение 1 часа. После этого питательную среду в колбах стерилизовали при температуре 115±3°C в течение 40 мин.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Культуру гриба Inonotus obliquus штамм SUB2092728 выращивали на агаризованной глюкозо-картофельной среде в течение 5-7 дней. Из зоны роста выросшей колонии культуры скальпелем отбирали мицелий и вносили в количестве 0,03±0,001 г/л в колбы с питательной средой в объеме 200 мл следующего состава, в г/л: глюкоза - 20,0; комплекс меланина с железом - 0,1; глицин - 0,3; полифепан - 1,9. Культивирование проводили в шейкер-инкубаторе Infors AG CH-4103 Bottmingen (США) в течение 12 дней в глубинных условиях со скоростью перемешивания 200 об/мин, при температуре 26±2°C. Выращенную биомассу гриба отделяли фильтрованием от культуральной жидкости, многократно промывали ее и высушивали при температуре 40±2°C.

Пример 2. Культуру гриба Inonotus obliquus штамм SUB2092728 выращивали на агаризованной глюкозо-картофельной среде в течение 5-7 дней. Из зоны роста выросшей колонии культуры скальпелем отбирали мицелий и вносили в количестве 0,03±0,001 г/л в колбы с питательной средой в объеме 200 мл следующего состава, в г/л: глюкоза - 20,0; комплекс меланина с железом - 0,1; глицин - 0,3; полифепан - 1,9; энзистал - 0,6. Культивирование проводили в шейкер-инкубаторе Infors AG CH-4103 Bottmingen (США) в течение 12 дней в глубинных условиях со скоростью перемешивания 200 об/мин, при температуре 26±2°C. Выращенную биомассу гриба отделяли фильтрованием от культуральной жидкости, многократно промывали ее и высушивали при температуре 40±2°C.

Пример 3 аналогичен примеру 2. Продолжительность культивирования составляет 15 дней.

Пример 4. Культуру гриба Inonotus obliquus штамм SUB2092728 выращивали на агаризованной глюкозо-картофельной среде в течение 5-7 дней. Из зоны роста выросшей колонии культуры скальпелем отбирали мицелий и вносили в количестве 0,03±0,001 г/л в колбы с питательной средой в объеме 200 мл следующего состава, в г/л: глюкоза - 20,0; комплекс меланина с железом - 0,1; глицин - 0,3; полифепан - 1,9; энзистал - 2,7. Культивирование проводили в шейкер-инкубаторе Infors AG CH-4103 Bottmingen (США) в течение 12 дней в глубинных условиях со скоростью перемешивания 200 об/мин, при температуре 26±2°C. Выращенную биомассу гриба отделяли фильтрованием от культуральной жидкости, многократно промывали ее и высушивали при температуре 40±2°C.

Пример 5 аналогичен примеру 4. Продолжительность культивирования составляет 15 дней.

Определение выхода биомассы проводили гравиметрически. Результаты многократно проведенных экспериментов обработаны с помощью программы «Статистика 10.0» (при р=0,95, n=5) и приведены в таблице.

Таблица
Выход биомассы при глубинном способе культивирования
гриба Inonotus obliquus штамм SUB2092728 Пример Состав питательной среды Продолжительность
культивирования,
дни Выход
биомассы,
г/л компоненты Массовая концентрация, г/л Прототип Глюкоза
Комплекс меланина с железом
Глицин
Полифепан 20,0
0,30
0,30
0,10 12 4,90±0,23 Пример 1 Глюкоза
Комплекс меланина с железом
Глицин
Полифепан 20,0
0,10
0,30
1,90 12 5,31±0,36 Пример 2 Глюкоза
Комплекс меланина с железом
Глицин
Полифепан
Энзистал 20,0
0,10
0,30
1,90
0,60 12 11,28±0,32 Пример 3 Глюкоза
Комплекс меланина с железом
Глицин
Полифепан
Энзистал 20,0
0,10
0,30
1,90
0,60 15 13,43±0,24 Пример 4 Глюкоза
Комплекс меланина с железом
Глицин
Полифепан
Энзистал 20,0
0,10
0,30
1,90
2,70 12 3,92±0,08 Пример 5 Глюкоза
Комплекс меланина с железом
Глицин
Полифепан
Энзистал 20,0
0,10
0,30
1,90
2,70 15 5,52±0,35

Анализ табличных данных показывает, что несмотря на высокую продуктивность глубинного культивирования, главным образом, за счет более эффективного массообмена, его использование для выращивания гриба Inonotus obliquus в примере 1, увеличивает выход биомассы по сравнению с поверхностным способом культивирования гриба в прототипе незначительно - не более 0,4 г/л. Это свидетельствует о том, что культура гриба при пересеве с агаризованной питательной среды в жидкую питательную среду испытывает существенный стресс, для преодоления которого ей нужен долгий период времени. Для сокращения длительности лаг-фазы при глубинном культивировании гриба Inonotus obliquus предложено сбалансировать питательную среду по составу легкоусвояемых и доступных питательных компонентов. Это достигается внесением энзистала в питательную среду на стадии ее приготовления, под действием этого ферментного препарата комплексного действия проходит ферментативный гидролиз компонентов питательной среды с накоплением простых соединений, которые могут сразу использоваться культурой гриба Inonotus obliquus для питания. Как видно из таблицы, при глубинном культивировании гриба Inonotus obliquus на предлагаемой питательной среде с добавкой энзистала в примере 2 и 3 увеличивается выход биомассы почти в 2,5 раза по сравнению с прототипом и примером 1. Активный рост биомассы на предлагаемой питательной среде наблюдается при дозировке энзистала 0,6 г/л. Внесение энзистала в питательную среду в высокой дозировке 2,7 г/л привело к заметному ингибированию роста культуры гриба Inonotus obliquus и, соответственно, низкому выходу биомассы. По-видимому, при использовании энзистала в больших количествах в питательной среде в ходе ферментативного гидролиза накапливается значительное количество простых соединений. Это создает неблагоприятные условия для роста культуры. Например, известно, что высокое содержание простых углеводов в среде может вызывать осмотический шок у культивируемого биообъекта.

Биомасса гриба Inonotus obliquus полученная при культивировании на предлагаемой питательной среде является перспективным объектом для разработки на ее основе лекарственных и косметических средств, биологически активных добавок.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к питательной среде для культивирования базидиального гриба Inonotus obliquus. Питательная среда для культивирования гриба чага на основе картофельного отвара содержит глюкозу, глицин, комплекс меланина с железом, полифепан и энзистал при массовой концентрации компонентов в г/л: глюкоза-20,0; глицин-0,3; комплекс меланина с железом-0,1; полифепан-1,9; энзистал-0,6. Применение предлагаемой питательной среды по сравнению с прототипом приводит к увеличению выхода биомассы гриба в 2,3-2,7 раза. 1 табл., 5 пр.

Питательная среда на основе картофельного отвара для глубинного культивирования гриба Inonotus obliquus, содержащая глюкозу – 20 г/л и стимулирующие добавки: глицин – 0,3 г/л, комплекс меланина с железом – 0,1 г/л, полифепан – 1,9 г/л, энзистал - 0,6 г/л.