Способ получения средства на основе экстрактов из базидиальных грибов, обладающего противовирусным действием Российский патент 2024 года по МПК C12N1/14 A61K36/06 A61P31/12 

Изобретение относится к способу получения противовирусных средств на основе биологически активных веществ из базидиальных грибов и может быть использовано в медицине и биотехнологической промышленности.

Одной из перспективных групп продуцентов, чей химический состав биологически активных веществ и свойства этих веществ в настоящее время изучены достаточно полно, являются высшие базидиальные грибы.

Исследованием лечебных свойств высших базидиальных грибов и практическим их применением в области медицины занимаются ученые ряда стран на протяжении последних 50-ти лет. Результаты этих исследований особо широко используются в Китае, Японии, Корее, США, Канаде, России и в последнее время в Норвегии.

Среди метаболитов высших базидиальных грибов выделены и идентифицированы вещества, которые являются иммуномодуляторами и проявляют противоопухолевые, кардиоваскулярные, противовирусные, антибактериальные, противопаразитарные, гепатозащитные и противодиабетические свойства (Материалы IV Международной конференции «Наука и практика грибоводства»/М., Международная Ассоциация Грибоводов. 1997 г. - 92 с; Перспективы использования в медицине веществ, образуемых базидиальными грибами. Обзор /International Journal of Medicinal Mushrooms. Vol. 3, 31-62, 1999).

Показано, что высшие базидиомицеты, способны синтезировать широкий комплекс биологически активных веществ, таких как полисахариды, гликопротеины, терпены, стеролы, пигменты и др. [5-9], которые могут проявлять антибактериальные [5,10], антивирусные [5,11-14], противоопухолевые, антипаразитарные и иммуномодулирующие свойства [5-8,15]. При этом указанные комплексы из базидиомицетов, как правило, не являются токсичными для человека или животных [5-11]. Поэтому высшие базидиальные грибы и вещества, выделенные из них, например, из гриба чаги Inonotus ohliquus [5-7,13-14,16], гриба вешенки обыкновенной Pleurotus ostreatus [5,15], могут быть использованы в качестве перспективного сырья для фармацевтической промышленности, в частности, для разработки на их основе мазей для местного (медикаментозного) лечения ран.

Полисахариды - наиболее хорошо изученные сильнодействующие вещества, извлеченные из грибов, обладающих противоопухолевыми и иммуномодулирующими свойствами. В частности, показано, что полисахаридные фракции, выделенные из клеточных стенок плодовых тел вешенки Pleurotus ostreatus, ингибируют рост саркомы-180 у мышей, а также активны в отношении вируса иммунодефицита человека и вируса гриппа (Теплякова Т.В., Косогова Т.А. Высшие грибы Западной Сибири -перспективные объекты для биотехнологии лекарственных препаратов. Новосибирск, 2014. - 298 с).

Меланины - природные пигменты, участвуют в работе живых систем различного уровня организации. Меланины содержатся в микроорганизмах, грибах и растениях, в тканях животных и человека (придают окраску волосам, ресницам, коже), в ряде пищевых продуктов (чай, кофе, грибы, гречиха и др.). Меланины - высокомолекулярные соединения, образуются в результате полимеризации тирозина, диоксифенилаланина или катехоламинов на белковой матрице, обладают широким спектром биомедицинских и технических свойств. Известны сообщения о практическом применении синтетических, полусинтетических и выделенных из биологических источников меланинов в медицине, косметологии, пищевой и лакокрасочной отраслях промышленности, технике и электронике.

По данным доклинического фармакологического исследования водорастворимые меланины не токсичны. После однократного внутрижелудочного или внутрибрюшинного введения в дозах от 100 до 3000 мг/кг не отмечено гибели мышей. При введении в течение 15 суток не зафиксировано смертельных исходов, нарушения общего состояния, патологических изменений внутренних органов, не выявлено канцерогенного действия. В то же время опубликованные данные указывают на наличие у меланинов разнообразных фармакологических свойств.

В экспериментах на грызунах показано, что меланин обладает антистрессорным, противосудорожным и антимутагенным действием, повышает физическую работоспособность, усиливает иммунную защиту организма, вызывает продукцию цитокинов, таких как интерлейкины - 6 и 8, туморнекротического фактора, ростового фактора эндотелия, ускоряет рост массы тела и нормализует гематологический статус.

Сообщается об успешном применении меланина в схеме комплексной терапии онкологических заболеваний и при сахарном диабете.

Известен препарат, влияющий на тканевой обмен, и применение штамма гриба Pleurotus ostreatus 1137 для его получения (патент РФ №2192873, МГЖ А61К 35/70, опубл. 2001 г. ), используемый в медицинской и биотехнологической промышленности для производства физиологически активных препаратов и пищевых добавок на основе грибных продуцентов биологически активных веществ, применяемых в медицине для снижения токсических проявлений противоопухолевых препаратов.

Известно противовирусное средство на основе меланина (патент РФ №2480227, МПК А61К 36/06, опубл. 27.04.2013 г.). В качестве меланина оно содержит водорастворимый меланин в концентрации от 0,002 мг/мл до 25 мг/мл, полученный экстракцией из базидиального гриба Inonotus ohliquus и обладающий противовирусной активностью в отношении вирусов гриппа, простого герпеса 2-го типа, иммунодефицита (ВИЧ-1) и осповакцины.

Известно применение экстракта базидального гриба Inonotus ohliquus, полученного водной экстракцией при температуре 50-95°С в течение от 1,0 до 72 часов, для ингибирования репликации коронавируса SARS-CoV-2, который при концентрации в диапазоне 0,75-11,6 мкг/мл проявляет 50%-ную противовирусную дозазависимую активность против SARS-CoV-2 в тестах на клеточных культурах Vero Е6 и Vero. (патент РФ №2741714, МПК А61К 36/06, опубл. 28.01.2021 г.).

Водорастворимый меланиновый экстракт (http://melanin.com.ua/voda-s-melaninom/38-melaninovyy-ekstrakt.html) рекламируется в качестве средства для лечения инсульта, диабета, язвенной болезни желудка и 12-перстной кишки, антирадиационного, иммуномодулирующего и противовирусного средства при СПИДе.

Известен ингибитор репродукции вируса иммунодефицита человека первого типа, содержащий водный экстракт природных биологически активных веществ из базидального гриба Inonotus ohliquus в концентрации не менее 156 нг/мл, обеспечивающей 100%-ную противовирусную защиту клеток (патент РФ №2375073, МПК А61К 38/06, опубл. 1012.2009 г.). Для экстракции водорастворимых веществ в некоторых случаях смесь прогревали на водяной бане 20 мин или встряхивали на качалке при температуре 28-30°С в течение 18 часов со скоростью перемешивания 120 об/мин. В другом варианте способа навеску измельченного нароста гриба Inonotus obliquus и измельченного гриба из аптеки (производства г. Москва) 3 г и 5 г, соответственно, суспендируют в 100 мл стерильной дистиллированной воды и прогревают на кипящей водяной бане 20 мин, освобождают от осадка.

Однако выше приведенные экстракты из гриба Inonotus ohliquus и способы их получения не исследованы на других вирусах кроме вируса иммунодефицита человека первого типа.

Наиболее близким техническим решением (прототипом) является способ получения экстракта из базидального гриба Inonotus ohliquus, включающего водную экстракцию измельченного гриба при температуре 50-95°С в течение от 1,0 до 72 часов. Экстракт используют для ингибирования репликации коронавируса SARS-CoV-2, который при концентрации в диапазоне 0,75-11,6 мкг/мл проявляет 50%-ную противовирусную дозазависимую активность против SARS-CoV-2 в тестах на клеточных культурах Vero Е6 и Vero (патент РФ №2741714, МПК А61К 36/06, опубл. 28.01.2021 г.). В одном из вариантов способа получения экстракта из базидального гриба Inonotus ohliquus к 20 г сухого измельченного до 1 мм (на мельнице IKA WERKE MF-10) природного сырья чаги добавили 200 мл дистиллированной воды, выдержали 72 часа при 50°С в термостате. Затем профильтровали через капроновый фильтр, осадок осадили на центрифуге Centra CL3 4000 об/мин в течение 20 минут, высушили при 50±2°С. Растворение сухого экстракта для исследований провели в стерильной воде из расчета 2,0 мг в 1 мл. В другом варианте способа к 200 г природного сухого сырья чаги, размером частиц от 0,1 до 7 мм, добавили 1 л водопроводной воды, выдержали на водяной бане при 95°С 3 часа, после фильтрования через капроновый фильтр раствор высушили при 50±2°С. Растворение сухого экстракта для исследований провели в стерильной воде из расчета 2,0 мг в 1 мл.

Однако данные экстракты из гриба Inonotus ohliquus, полученные способом-прототипом, не исследованы на других вирусах кроме коронавируса SARS-CoV-2.

Техническим результатом является создание такого способа получения средства на основе экстракта из базидиальных грибов, который обладает ингибирующим действием в отношении более широкого спектра патогенных вирусов для человека и животных.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе получения средства на основе экстракта из базидиальных грибов, включающем измельчение биомассы гриба и его экстракцию на водяной бане в течение времени, достаточном для извлечения биологически активных веществ, обладающих противовирусным действием, с последующей его фильтрацией, согласно изобретения, в качестве сырья для экстракции используют биомассу природного гриба Inonotus ohliquus, биомассу глубинной культуры вешенки устричной Pleurotus ostreatus, биомассу сухих плодовых тел вешенки устричной природной Pleurotus ostreatus, биомассу культуры вешенки легочной Pleurotus pulmonarius и биомассу культуры дедалеопсиса шершавого Daedaleopsis confragosa, биомассу сухих грибов измельчают до размера частиц 0,1-7 мм, а биомассу грибов, полученных культивированием, гомогенизируют после отделения от культуральной жидкости фильтрованием, подготовленную биомассу каждого гриба смешивают с нагретой водой до температуры 90-100°С в соотношении от 1:5 до 1:20 соответственно, экстрагируют биомассу каждого гриба в воде на водяной бане при указанной температуре 90-100°С в течение 0,5-3,0 часов, отделяют жидкие экстракты от осадка фильтрованием или центрифугированием и приготавливают следующее противовирусное средство в 1 мл:

экстракт биомассы природного гриба Inonotus ohliquus 2 мг/мл 5%-ный раствор этилового спирта в воде остальное до 1 мл или:

экстракт биомассы природного гриба Inonotus ohliquus 2 мг/мл 10%-ный раствор этилового спирта в воде остальное до 1 мл или:

экстракт биомассы природного гриба Inonotus ohliquus 2 мг/мл экстракт биомассы глубинной культуры вешенки устричной Pleurotus ostreatus 2 мг/мл вода остальное до 1 мл или:

экстракт биомассы природного гриба Inonotus ohliquus 2 мг/мл экстракт биомассы природных плодовых тел вешенки устричной Pleurotus ostreatus 2 мг/мл вода остальное до 1 мл или:

экстракт биомассы природного гриба Inonotus ohliquus 2 мг/мл экстракт биомассы культуры вешенки легочной Pleurotus pulmonarius 2 мг/мл вода остальное до 1 мл или:

экстракт биомассы природного гриба Inonotus ohliquus 2 мг/мл экстракт биомассы культуры дедалеопсиса шершавого Daedaleopsis confragosa 2 мг/мл вода остальное до 1 мл

Для получения экстракта биомассу природного гриба Inonotus ohliquus с размером частиц 0,1-7 мм смешивают с нагретой водой до температуры 98°С в соотношении 1:5 и экстрагируют при указанной температуре на водяной бане в течение 3 часов с последующим отделением экстракта от осадка фильтрованием.

Для получения экстракта отфильтрованную и гомогенизированную биомассу глубинной культуры вешенки устричной Pleurotus ostreatus смешивают с нагретой водой до температуры 100°С в соотношении 1:5 и экстрагируют при указанной температуре на водяной бане в течение 1 часа с последующим центрифугированием при 4000 об/мин в течение 20 мин и получением экстракта в виде надосадочной жидкости.

Для получения экстракта биомассу природных плодовых тел вешенки устричной Pleurotus ostreatus со средним размером частиц 1 мм смешивают с нагретой водой до температуры 100°С в соотношении 1:19 и экстрагируют при указанной температуре на водяной бане в течение 30 минут, охлаждают в холодильнике с последующим центрифугированием при 4000 об/мин в течение 20 мин и получением экстракта в виде надосадочной жидкости.

Для получения экстракта отфильтрованную и гомогенизированную биомассу культуры вешенки легочной Pleurotus pulmonarius смешивают с нагретой водой до температуры 100°С в соотношении 1:5 и экстрагируют при указанной температуре на водяной бане в течение 1 часа с последующим центрифугированием при 4000 об/мин в течение 20 мин и получением экстракта в виде надосадочной жидкости.

Для получения экстракта сухую измельченную биомассу культуры дедалеопсиса шершавого Daedaleopsis confragosa со средним размером частиц 1 мм смешивают с нагретой водой до температуры 90°С в соотношении 1:20 и экстрагируют при указанной температуре на водяной бане в течение 1 часа, охлаждают в холодильнике с последующим центрифугированием при 4000 об/мин в течение 20 мин и получением экстракта в виде надосадочной жидкости.

Эксперименты показывают, что используемый размер частиц гриба при экстракции в диапазоне 0,1-7 мм снижают выход токсичных веществ при водной экстракции. Более мелкие частицы грибов повышают выход токсичных веществ при водной экстракции, а при большем размере частиц замедляется выход полисахаридов, меланина и других биологически активных веществ (БАВ).

Изобретение поясняется следующими графическими материалами. На фиг. 1,а представлен график значения токсичности и противовирусной активности исследуемого препарата №23-19, а на фиг. 1,б - результат исследования этого препарата методом ИФА. На фиг. 2,а представлен график значения токсичности и противовирусной активности исследуемого препарата №23-42, а на фиг. 2,б - результат исследования препарата №23-42 методом ИФА. На фиг. 3,а представлен график значения токсичности и противовирусной активности исследуемого препарата №23-43, а на фиг. 3,б - результат исследования препарата №23-43 методом ИФА. На фиг. 4 представлен график значения токсичности и противовирусной активности исследуемого препарата №23-44. На фиг. 5,а представлен график значения токсичности и противовирусной активности исследуемого препарата №23-62, а на фиг. 5,б - результат исследования препарата №23-62 методом ИФА. На фиг. 6,а представлен график значения токсичности и противовирусной активности исследуемого препарата №23-63, а на фиг. 6,б - результат исследования препарата №23-63 методом ИФА.

Общие технологические приемы способа приготовления образцов для испытаний на противовирусную активность.

Стеклянными градуированными пипетками отбирают точный объем растворов исходных образцов (водных экстрактов грибов, 96%-ного этилового спирта), переносят их в мерную стеклянную колбу объемом 10 мл, затем объем раствора в колбе доводят до метки стерильной водой.

Объемы растворов исходных образцов грибов, необходимые для приготовления образцов для испытаний с массовой концентрацией 2 мг/мл, рассчитывают математически на основании содержания сухих веществ в исходном образце.

Определение содержания сухих веществ в исходных образцах грибов проводят путем высушивания 1 мл исходного образца в сушильном шкафу при температуре 105°С до постоянной массы.

Пример 1. Способ получения образца 23-19 (образец сравнения бефунгин в концентрации 2 мг/мл.)

Экстракт природного гриба березового (чага) Inonotus ohliquus является образцом сравнения. Исходный образец является аптечным препаратом БЕФУНГИН (производитель - АО «ТАТХИМФАРМ-ПРЕПАРАТЫ», серия 120323, годен до 04.2026 г.). В исследованиях используется препарат БЕФУНГИН, содержащий 2 мг Inonotus ohliquus в 1 мл стерильной воды. Пример 2. Способ получения образца 23-42 водного экстракта чаги (экстракция 3 час, концентрация 2 мг/мл.).

Берут 40 г чаги аптечной (размер частиц от 0,1 до 7 мм) заливают 200 мл воды дистиллированной, нагревают смесь на водяной бане до температуры 98°С и выдерживают в течение 3 часов, остужают и фильтруют через капроновый фильтр. Образец для испытаний содержит 2 мг экстракта Inonotus ohliquus в 1 мл стерильной воды.

Пример 3. Способ получения образца 23-43 экстракта чаги с 10%-ным водным раствором этилового спирта.

Экстракт чаги получают аналогично образцу 23-42, который смешивают с 10%-ным водным раствором этилового спирта. Образец для испытаний содержит 2 мг экстракта Inonotus ohliquus в 1 мл 10%-ного раствора этилового спирта.

Пример 4. Способ получения образца 23-44 экстракта чаги с 5%-ным водным раствором этилового спирта.

Экстракт чаги получают аналогично образцу 23-42, который смешивают с 5%-ным водным раствором этилового спирта. Образец для испытаний содержит 2 мг экстракта Inonotus ohliquus в 1 мл 5%-ного раствора этилового спирта.

Пример 5. Способ получения образца 23-62 смеси 1:1 водных экстрактов чаги и биомассы культуры вешенки устричной Pleurotus ostreatus.

К водному раствору образца экстракта чаги 23-42 добавлен образец экстракта вешенки устричной культивированной, приготовленный следующим образом. Берут 5,0 г промытой дистиллированной водой биомассы Pleurotus ostreatus (глубинная культура, культивирование на среде ГПС в течение 7 суток), отделенной от культуральной жидкости (КЖ) путем фильтрования через капроновый фильтр. Далее биомассу измельчают на гомогенизаторе, добавляют 25,0 мл дистиллированной воды (1:5), выдерживают на кипящей водяной бане в течение 1 часа, центрифугируют при 4000 об./мин в течение 20 мин с получением экстракта в виде надосадочной жидкости. Далее смешивают 1:1 экстракт чаги и экстракт биомассы культуры вешенки устричной Pleurotus. Исследуемый образец содержит 2 мг экстракта Inonotus ohliquus и 2 мг экстракта Pleurotus ostreatus в 1 мл стерильной воды.

Пример 6. Способ получения образца 23-63 смеси 1:1 водных экстрактов чаги и биомассы культуры дедалеопсиса шершавого Daedaleopsis confragosa.

К водному раствору образца экстракта чаги 23-42 добавлен образец экстракта дедалеопсиса шершавого, приготовленный следующим образом. Биомассу культуры Daedaleopsis confragosa, выращенного в течение 4 недель в среде МК (меласса с кукурузным экстрактом), промывают дистиллированной водой, высушивают при температуре 70°С, затем измельчают в ступке до среднего размера частиц 0,1-1 мм. Далее 1,0 г сухой биомассы Daedaleopsis confragosa растворяют в 20 мл дистиллированной воды при температуре 90°С и выдерживают на водяной бане в течение 1 часа, остужают, центрифугируют при 4000 об./мин в течение 20 мин с получением экстракта в виде надосадочной жидкости. Далее смешивают 1:1 экстракт чаги и экстракт биомассы культуры Daedaleopsis confragosa. Исследуемый образец содержит 2 мг экстракта Inonotus ohliquus и 2 мг экстракта Daedaleopsis confragosa в 1 мл стерильной воды. Пример 7. Способ получения образца 23-65 смеси 1:1 водных экстрактов чаги и биомассы культуры вешенки легочной Pleurotus pulmonarius.

К водному экстракту образца чаги 23-42 добавлен образец экстракта биомассы культуры вешенки легочной, приготовленный следующим образом. Берут 5,0 г промытой дистиллированной водой биомассы Pleurotus pulmonarius (глубинная культура, культивирование 7 суток на среде ГПС), отделенной от КЖ путем фильтрования через капроновый фильтр, измельчают на гомогенизаторе, добавляют 25,0 мл дистиллированной воды (1:5), выдерживают на кипящей водяной бане в течение 1 часа, центрифугируют при 4000 об./мин в течение 20 мин с получением экстракта в виде надосадочной жидкости. Далее смешивают 1:1 экстракт чаги и экстракт биомассы культуры Pleurotus pulmonarius. Исследуемый образец содержит 2 мг экстракта Inonotus ohliquus и 2 мг экстракта Pleurotus pulmonarius в 1 мл стерильной воды.

Пример 8. Способ получения образца 23-66 смеси 1:1 водных экстрактов чаги и плодовых тел вешенки устричной природной Pleurotus ostreatus.

К водному экстракту образца чаги 23-42 добавлен образец экстракта плодовых тел вешенки устричной природной Pleurotus ostreatus, приготовленный следующим образом. Сухие плодовые тела Pleurotus ostreatus измельчали на мельнице до среднего размера частиц 1 мм. К навеске в 5 г добавляют 95 мл дистиллированной воды (соотношение 1:19), выдерживают на кипящей водяной бане в течение 30 минут, оставляют на 10 часов в холодильнике, а затем центрифугируют при 4000 об./мин в течение 20 мин и фильтруют надосадочную жидкость через фильтр обеззоленный ФБ красная лента. Далее смешивают 1:1 экстракт чаги и экстракт плодовых тел Pleurotus ostreatus. Исследуемый образец содержит 2 мг экстракта Inonotus ohliquus и 2 мг экстракта Pleurotus ostreatus в 1 мл стерильной воды. Пример 9. Результаты исследования токсичности и анти-ВИЧ активности образцов противовирусного средства, полученного на основе базидиальных грибов.

В качестве чувствительных к ВИЧ-1 клеток использовали лимфоидную культуру клеток человека МТ-4. Клетки МТ-4 получены из коллекции клеточных культур ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора. Клетки МТ-4 культивировали на среде RPMI-1640, содержащей 0,2% бикарбоната натрия с добавлением 10% инактивированной фетальной сыворотки, 2 mM L-глютамина и 20 мкг/мл гентамицина. Культивирование суспензионной клеточной культуры МТ-4 проводили в закрытой культуральной посуде при 37°С. Каждые 3-4 дня урожай клеток определяли в камере Горяева, после чего клетки пересевали с концентрацией 400-500 тысяч клеток в 1 мл среды.

В работе использовали лабораторный штамм ВИЧ-1 субтипа А (при репродукции на МТ-4 вызывает 100%) гибель клеток) из лабораторной коллекции ФБУН ГНЦ ВБ Вектор. Препараты ВИЧ-1 предварительно нарабатывали на культуре клеток МТ-4 с концентрацией 400 000 клеток в 1 мл среды. Урожай инфекционного вируса получали на 5 сутки культивирования. Культуральную среду отбирали, клеточный дебрис удаляли центрифугированием, а супернатант разливали в криопробирки по 0,5 - 1,0 мл, замораживали при - 70°С и хранили в жидком азоте до использования.

Токсичность исследуемых соединений определяли МТТ-методом.

Жизнеспособность и биохимическую активность клеток оценивали по интенсивности превращения ими растворимого МТТ (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) в кристаллы формазана. После растворения кристаллов в изопропаноле интенсивность синего окрашивания измеряли с помощью спектрофотометра.

Живые клетки преобразуют МТТ-реагент желтого цвета в химическое соединение (формазан) синего цвета. Формазан локализуется внутри выживших клеток, поэтому его количество пропорционально количеству живых клеток. После лизирования клеток и растворения формазана в лизирующем буфере интенсивность синего окрашивания может быть измерена с помощью спектрофотометра. Оптическая плотность раствора коррелирует с количеством живых клеток, что используется для количественной оценки степени их жизнеспособности.

Определение токсичности исследуемых препаратов МТТ-методом проводили в 96-луночном планшете. В лунки планшета вносили по 40 000 клеток МТ-4 в 100 мкл полной среды RPMI-1640. Затем в отдельной посуде готовили разведения исследуемого препарата с 3-х кратным шагом разведения. Далее по 3 повтора каждого разведения препарата в объеме 50 мкл добавляли в соответствующие лунки планшета с культурой клеток. Объем жидкости в каждой лунке доводили до 200 мкл путем добавления 150 мкл полной среды RPMI-1640.

Инкубирование клеток МТ-4 с исследуемыми разведениями препарата проводили 5 суток в CO2 инкубаторе при температуре 37°С и 5% CO2. После этого в каждую лунку с образцами препарата и в контроль клеток добавляли раствор МТТ-реагента в объеме 20 мкл. Через 1,5 часа дополнительного инкубирования в термостате из лунок планшета удаляли культуральную среду, а образовавшийся осадок формазана растворяли в изопропаноле при встряхивании в течение 10-15 минут.Интенсивность полученного синего окрашивания раствора измеряли с помощью Varioskan LUX (Thermo Fisher Scientific, Finland) на двух длинах волн (540 и 690 нм).

По результату тестирования токсичности препарата для культуры клеток МТ-4 определяли максимально возможную нетоксичную и ТС50 концентрацию препарата (концентрация, при которой жизнеспособными остаются 50% клеток). В дальнейшем определяли способность препарата, начиная от этой концентрации ТС50, ингибировать размножение ВИЧ-1.

Оценку подавления репродукции ВИЧ/защиты клеток человека исследуемыми препаратами от ВИЧ проводили путем определения изменения концентрации живых клеток в экспериментальных лунках с клетками МТ-4, инфицированных ВИЧ-1, с добавлением разных концентраций исследуемых веществ и без их добавления.

Определение концентрации живых клеток, не разрушенных ВИЧ-1, в присутствии ВИЧ и исследуемых соединений проводили в 96-луночном планшете МТТ-методом. В лунки планшета вносили по 40 000 клеток МТ-4 в 100 мкл полной среды RPMI-1640.

В тесте «противовирусная активность» в качестве вируссодержащего материала использовалась культуральная среда с предварительно разведенным в ней вирусом (50 мкл/лунку). Противовирусная активность препаратов определялась по отношению к ВИЧ-1 субтипа А при инфицировании культуры клеток постоянной дозой вируса, соответствующей 300 CCID50.

Затем в отдельной посуде готовили разведения исследуемого препарата с 3-х кратным шагом разведения, используя нетоксические для клеток концентрации веществ. Далее по 3 повтора каждого разведения препарата в объеме 50 мкл добавляли в соответствующие лунки планшета с культурой клеток. Объем жидкости в каждой лунке составил 200 мкл.

Инкубирование клеток МТ-4 с исследуемыми разведениями препарата проводили 5 суток в CO2 инкубаторе при температуре 37°С и 5% CO2. После этого в каждую лунку с образцами препарата и в контроль клеток добавляли раствор МТТ-реагента в объеме 20 мкл. Через 1,5 часа дополнительного инкубирования в термостате из лунок планшета удаляли культуральную среду, а образовавшийся осадок формазана растворяли в изопропаноле при встряхивании в течение 10-15 минут.Интенсивность полученного синего окрашивания раствора измеряли с помощью Varioskan LUX (Thermo Fisher Scientific Oy, Finland) на двух длинах волн (540 и 690 нм).

По результату определения концентрации живых клеток в экспериментальных лунках (с добавлением препаратов) и в контрольных лунках, содержащих культуру клеток МТ-4, инфицированную ВИЧ-1 по литическому типу, определяли 50% противовирусную активность препарата (концентрация препарата, при которой ингибируется размножение ВИЧ-1 и защищены от ВИЧ остаются 50% клеток).

В дальнейшем для препаратов с выявленной защитой от ВИЧ проводили дополнительно определение способности препарата блокировать размножение ВИЧ по степени снижения репродукции вирусного белка р24 в культуральной жидкости. Для количественного определения белка р24 ВИЧ-1 использовали иммуноферментные наборы ВектоВИЧ-1 р24-антиген-подтверждающий тест производства ЗАО ВекторБест.

Учет и обработку полученных результатов проводили с помощью специальной программы SoftMax Pro 4,0. Данные оптической плотности для каждого разведения препарата (540-690 нм) в тесте «токсичность» или «противовирусная активность» вводили в программу, которая строит графики зависимости оптической плотности раствора от концентрации препарата с использованием 4-параметрового алгоритма. Одновременно программа автоматически рассчитывает значение ТС50 или IC50 при условии, если кривая зависимости получается S-образной формы.

Результаты исследования препарата №23-19. Проведено скрининговое исследование препарата МТТ-методом с шагом разведения 1:3. Исследование проведено на суспензионной культуре клеток МТ-4, как описано ранее. Противовирусная активность определена по отношению к ВИЧ-1 субтипа А. Максимальная исследованная концентрация препарата в тесте составила 0,5 мг/мл.

Концентрация препаратов при предварительной подготовке их последовательных разведений рассчитывалась с учетом фактора конечного разведения при внесении в 96-луночный планшет. Общий объем жидкости в каждой лунке планшета составлял 200 мкл.

На графике Фиг. 1,а представлены значения токсичности и противовирусной активности исследуемого препарата 23-19. 50%-ная токсическая концентрация (ТС50) для клеток МТ-4 - 0,23 мг/мл. Противовирусная активность препарата в отношении ВИЧ-1 (IC50) - 0,02 мг/мл. На фиг. 1,б представлен результат исследования препарата методом ИФА. 50%-ная ингибирующая концентрация (IC50) для ВИЧ-1 - 0,024 мг/мл.

Результаты скринингового исследования препарата №23-42.

Проведено скрининговое исследование препарата МТТ-методом с шагом разведения 1:3. Исследование проведено на суспензионной культуре клеток МТ-4, как описано ранее. Противовирусная активность определена по отношению к ВИЧ-1 субтипа А. Максимальная исследованная концентрация препарата в тесте составила 0,5 мг/мл.

Концентрация препаратов при предварительной подготовке их последовательных разведений рассчитывалась с учетом фактора конечного разведения при внесении в 96-луночный планшет. Общий объем жидкости в каждой лунке планшета составлял 200 мкл.

На графике фиг. 2,а представлены значения токсичности и противовирусной активности исследуемого препарата №23-42. 50%-ная токсическая концентрация (ТС50) для клеток МТ-4 - 4,1 мг/мл. Противовирусная активность препарата в отношении ВИЧ-1 (IC50) - 0,01 мг/мл.

На фиг. 2,б приведены результаты исследования препарата 23-42 методом ИФА. 50%-ная ингибирующая концентрация (IC50) для ВИЧ - 1-0,01 мг/мл.

Результаты скринингового исследования препарата №23-43.

Проведено скрининговое исследование препарата МТТ-методом с шагом разведения 1:3. Исследование проведено на суспензионной культуре клеток МТ-4, как описано ранее. Противовирусная активность определена по отношению к ВИЧ-1 субтипа А. Максимальная исследованная концентрация препарата в тесте составила 0,5 мг/мл.

Концентрация препаратов при предварительной подготовке их последовательных разведений рассчитывалась с учетом фактора конечного разведения при внесении в 96-луночный планшет. Общий объем жидкости в каждой лунке планшета составлял 200 мкл.

На графике фиг. 3,а представлены значения токсичности и противовирусной активности исследуемого препарата №23-43. 50%-ная токсическая концентрация (ТС50) для клеток МТ-4 - 0,54 мг/мл.

Противовирусная активность препарата в отношении ВИЧ-1 (IC50) - 0,014 мг/мл.

Результат исследования препарата методом ИФА. На фиг. 3,б представлены результаты исследования препарата №23-43. 50%-ная ингибирующая концентрация (IC50) для ВИЧ-1 - 0,014 мг/мл.

Результаты скринингового исследования препарата №23-44.

Проведено скрининговое исследование препарата МТТ-методом с шагом разведения 1:3. Исследование проведено на суспензионной культуре клеток МТ-4, как описано ранее. Противовирусная активность определена по отношению к ВИЧ-1 субтипа А. Максимальная исследованная концентрация препарата в тесте составила 0,5 мг/мл.

Концентрация препаратов при предварительной подготовке их последовательных разведений рассчитывалась с учетом фактора конечного разведения при внесении в 96-луночный планшет. Общий объем жидкости в каждой лунке планшета составлял 200 мкл.

На графике фиг. 4, представлены значения токсичности и противовирусной активности исследуемого препарата №23-44. 50%-ная токсическая концентрация (ТС50) для клеток МТ-4 - 0,87 мг/мл. Противовирусная активность препарата в отношении ВИЧ-1 (IC50) - 0,015 мг/мл.

Результаты скринингового исследования препарата №23-62

Проведено скрининговое исследование препарата МТТ-методом с шагом разведения 1:3. Исследование проведено на суспензионной культуре клеток МТ-4, как описано ранее. Противовирусная активность определена по отношению к ВИЧ-1 субтипа А. Максимальная исследованная концентрация препарата в тесте составила 1 мг/мл.

Концентрация препаратов при предварительной подготовке их последовательных разведений рассчитывалась с учетом фактора конечного разведения при внесении в 96-луночный планшет. Общий объем жидкости в каждой лунке планшета составлял 200 мкл.

На графике фиг. 5,а - представлены значения токсичности и противовирусной активности исследуемого препарата №23-62. 50%-ная токсическая концентрация (ТС50) для клеток МТ-4 - 1,4 мг/мл.

Противовирусная активность препарата в отношении ВИЧ-1 (IC50) - 0,04 мг/мл.

Результат исследования препарата №23-62 методом ИФА. На фиг.5,6 приведены результаты исследования препарата №23-62. 50%-ная ингибирующая концентрация (IC50) для ВИЧ-1 - 0,03 мг/мл.

Примечание: В графах, в которых установлен прочерк означает, что исследования на противовирусную активность этих препаратов не проводились.

Результаты скринингового исследования препарата №23-63

Проведено скрининговое исследование препарата МТТ-методом с шагом разведения 1:3. Исследование проведено на суспензионной культуре клеток МТ-4, как описано ранее. Противовирусная активность определена по отношению к ВИЧ-1 субтипа А. Максимальная исследованная концентрация препарата в тесте составила 1 мг/мл.

Концентрация препаратов при предварительной подготовке их последовательных разведений рассчитывалась с учетом фактора конечного разведения при внесении в 96-луночный планшет. Общий объем жидкости в каждой лунке планшета составлял 200 мкл. На графике фиг. 6,а представлены значения токсичности и противовирусной активности исследуемого соединения препарата №23-63. 50%-ная токсическая концентрация (ТС50) для клеток МТ-4 - 1,0 мг/мл. Противовирусная активность препарата в отношении ВИЧ-1 (IC50) - 0,02 мг/мл. Результат исследования препарата методом ИФА. На фиг. 6,б приведены результаты исследования препарата №23-63. 50%-ная ингибирующая концентрация (IC50) для ВИЧ-1 - 0,03 мг/мл.

Результаты исследования образцов препаратов против ВИЧ-1 представлены в таблице 1.

Пример 10. Данные исследования токсичности и противовирусной активности в отношении коронавируса SARS-CoV-2 штамма hCoV-19/Australia/VIC01/2020 (схема профилактическая) образцов средства, полученного на основе базидиальных грибов.

Культуры клеток. В работе использовали культуру клеток Vero Е6 (клетки эпителия почки африканской зеленой мартышки) (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора). Клетки культивировали при 37°С в питательной среде ДМЕМ (Биолот) с L-глутамином, с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Биолот), Antibiotic-Antimycotic (Gibco) в атмосфере с 5% СО₂.

Вирусы. Исследование проводили с использованием штаммов коронавируса SARS-CoV-2, депонированных в Государственной коллекции возбудителей вирусных инфекций и риккетсиозов ФБУН ГНЦ БВ «Вектор» Роспотребнадзора: hCoV-19/Australia/VIC01/2020 (генетическая линия В, (EPI_ISL_406844)).

Анализ ингибирующей активности и цитотоксичности.

Определение полуэффективных концентраций исследуемых препаратов было проведено в тесте снижения цитопатического действия на клетки. Готовили последовательные трехкратные разведения препаратов, начиная с концентрации 0,25 мг/мл. Определение ингибирующей активности и токсической концентрации препаратов проводили одновременно. В культуральный планшет с монослоем клеток вносили разведения препаратов, затем вносили поддерживающую среду без вируса (для определения 50% цитотоксических концентраций (СС₅₀)). Для определения 50% ингибирующих концентраций (IC50) в лунки с разведениями экстрактов вносили жидкость, содержащую вирус в дозе 100 ТЦД₅₀/лунку. Культуральные планшеты инкубировали при 37°С в течение 4-х суток, затем окрашивали МТТ (NeoFroxx) согласно инструкции производителя. Учет результатов проводили на планшетном анализаторе MultiskanFC (Thermo Scientific), обработку данных осуществляли при помощи программы SOFTmax PRO 4.0 с использованием четырех параметрического метода анализа. Были определены 50% токсическая концентрация (СС₅₀) и концентрации 50%) ингибирования (IC₅₀), рассчитан индекс селективности (SI) по формуле: SI=CC₅₀/IC₅₀ (таблица 2). Для статистической обработки все анализы in vitro проводили и фиксировали в четырех повторах в двух независимых экспериментах.

Таблица 2. Результаты исследования образцов препаратов, полученных из базидиальных грибов, на токсичность и противовирусную активность в отношении коронавируса SARS-CoV-2 штамма hCoV-19/Australia/VIC01/2020 (схема профилактическая)

Примечание: В графах, в которых установлен прочерк означает, что исследования на противовирусную активность этих препаратов не проводились.

Пример 11. Результаты исследования образцов препаратов, полученных из базидиальных грибов, на токсичность и противовирусную активность в отношении вирусов гриппа A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) и California/07/09(H1N1)pdm09

Колориметрический метод определения цитотоксичности и противовирусной активности образцов in vitro

Оценку цитотоксичности и противовирусной эффективности исследуемых образцов проводили колориметрическим методом путем определения оптической плотности (ОП) раствора красителя, поглощенного живыми клетками в монослое [Smee D.F., Morrison А.С., Barnard D.L., Sidwell R.W. Comparison of colorimetric and visual methods for determining anti-influenza (H1N1 and H3N2) viruses activities and toxicities of compounds. Journal of Virological Methods. 2002; 106: 71-79].

Используемые образцы и препарат сравнения oseltamivir carboxylate были исследованы в диапазоне концентраций 1,6 ±1000,0 мкг/мл.

Для изучения токсичности препаратов в лунки 96-луночных планшетов с клетками MDCK вносили по 0,1 мл образца в концентрации 2 мг/мл и по 0,1 мл его 4-х последовательных разведений с шагом 5. В лунки с клеточным контролем вносили по 0,1 мл поддерживающей среды ДМЕМ. Спустя 2 часа в лунки вносили поддерживающую среду ДМЕМ, содержащую 2 мкг/мл трипсина ТРСК (Sigma, США), в объеме 0,1 мл. Далее планшеты инкубировали в течение 2 сут при 37°С и 5% СО₂.

Исследование противовирусной активности образцов было проведено по «лечебно-профилактической схеме». Для этого в лунки 96-луночных планшетов с клетками MDCK вносили по 0,1 мл образца в концентрации 2 мг/мл и по 0,1 мл его 4-х последовательных разведений с шагом 5, далее клетки инкубировали при 37°С и 5% СО₂. Спустя 2 часа производили инфицирование монослоя вируссодержащей жидкостью в дозе 100 ТЦД₅₀, содержащей 2 мкг/мл трипсина, в объеме 0,1 мл. В лунки с контролем вируса вместо исследуемых образцов вносили по 0,1 мл поддерживающей среды ДМЕМ.

Через 3-е суток инкубирования в атмосфере 5% СО₂ при 37°С, культуральную среду удаляли и в каждую лунку планшета вносили витальный (прижизненный) краситель МТТ в объеме 0,75 мл с концентрацией 1 мг/мл, растворенный в ФСБ-Д (фосфатно-солевом буфере Дульбекко). Планшеты инкубировали в течение 90 мин при 37°С, далее удаляли супернатант и вносили 0,1 мл ДМСО. Спустя 10 мин на многофункциональном спектрофотометре iMark (Bio-Rad, США) в 96-луночных планшетах при длине волны 540 нм измеряли ОП, которая является показателем количества жизнеспособных клеток в монослое, сохраненных при цитопатическом действии вируса или цитотоксическом эффекте образца.

Примечание: н.а. - образец не активен.

Результаты измерения ОП в зависимости от концентрации препарата представляли в полулогарифмической системе координат и рассчитывали 50%-ю токсическую концентрацию (ТС₅₀ в мкг/мл) и 50%-ю ингибирующую (эффективную) концентрацию (IC₅₀ в мкг/мл) препарата при помощи компьютерной программы SoftMaxPro-4.0. ТС₅₀ - это концентрация вещества в питательной среде, при которой разрушаются (теряют жизнеспособность) 50% клеток в неинфицированном монослое. IC₅₀ - это концентрация вещества в питательной среде, при которой не разрушаются (остаются жизнеспособными) 50% клеток в инфицированном монослое. На основании этих показателей рассчитывали индекс селективности (SI) исследуемого образца: SI=ТС₅₀ мкг/мл: IC₅₀ мкг/мл. Активными считаются соединения с SI выше 8 [Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств / Под ред. Миронова А.Н. Часть первая. - М.: Гриф и К, 2012. - 944 с].

Результаты исследования представлены в таблице 3. Таким образом, примеры 1-11 подтверждают достижение заявляемого технического результата, а именно: создан заявляемый способ получения средства на основе экстрактов из базидиальных грибов, который обладает ингибирующим действием в отношении более широкого спектра патогенных вирусов для человека и животных по сравнению с известными аналогами и прототипом.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения средства на основе экстрактов из базидиальных грибов, обладающего противовирусным действием, включающий измельчение биомассы гриба базидиомицета, выбранного из группы: биомасса природного гриба Inonotus obliquus, биомасса глубинной культуры вешенки устричной Pleurotus ostreatus, биомасса сухих плодовых тел вешенки устричной природной Pleurotus ostreatus, биомасса культуры вешенки легочной Pleurotus pulmonarius, биомасса культуры дедалеопсиса шершавого Daedaleopsis confragosa; затем биомассу каждого гриба смешивают с нагретой водой до 90-100°С в соотношении от 1:5 до 1:20, экстрагируют 0,5-3,0 ч, отделяют жидкие экстракты от осадка фильтрованием или центрифугированием и приготавливают противовирусное средство с заданным содержанием экстракта базидиальных грибов, раствора этилового спирта и/или воды. Изобретение обеспечивает расширение арсенала средств, обладающих ингибирующим действием в отношении патогенных вирусов человека и животных. 5 з.п. ф-лы, 11 ил., 3 табл., 11 пр.

1. Способ получения средства на основе экстрактов из базидиальных грибов, обладающего противовирусным действием, включающий измельчение биомассы гриба и его экстракцию на водяной бане в течение времени, достаточного для извлечения биологически активных веществ, обладающих противовирусным действием, с последующим отделением экстракта от осадка, отличающийся тем, что в качестве сырья для экстракции используют биомассу базидиомицета, выбранного из группы: биомасса природного гриба Inonotus obliquus, биомасса глубинной культуры вешенки устричной Pleurotus ostreatus, биомасса сухих плодовых тел вешенки устричной природной Pleurotus ostreatus, биомасса культуры вешенки легочной Pleurotus pulmonarius, биомасса культуры дедалеопсиса шершавого Daedaleopsis confragosa; биомассу сухих грибов измельчают до размера частиц 0,1-7 мм, а биомассы грибов, полученных культивированием, гомогенизируют после отделения от культуральной жидкости фильтрованием, подготовленную биомассу каждого гриба смешивают с нагретой водой до температуры 90-100°С в соотношении от 1:5 до 1:20 соответственно, экстрагируют биомассу каждого гриба в воде на водяной бане при указанной температуре 90-100°С в течение 0,5-3,0 ч, отделяют жидкие экстракты от осадка фильтрованием или центрифугированием и приготавливают следующее противовирусное средство в 1 мл:

экстракт биомассы природного гриба Inonotus obliquus 2 мг/мл 5%-ный раствор этилового спирта в воде остальное до 1 мл,

или:

экстракт биомассы природного гриба Inonotus obliquus 2 мг/мл 10%-ный раствор этилового спирта в воде остальное до 1 мл,

или:

экстракт биомассы природного гриба Inonotus obliquus 2 мг/мл экстракт биомассы глубинной культуры вешенки устричной Pleurotus ostreatus 2 мг/мл вода остальное до 1 мл,

или:

экстракт биомассы природного гриба Inonotus obliquus 2 мг/мл экстракт биомассы природных плодовых тел вешенки устричной Pleurotus ostreatus 2 мг/мл вода остальное до 1 мл,

или:

экстракт биомассы природного гриба Inonotus obliquus 2 мг/мл экстракт биомассы культуры вешенки легочной Pleurotus pulmonarius 2 мг/мл вода остальное до 1 мл,

или:

экстракт биомассы природного гриба Inonotus obliquus 2 мг/мл экстракт биомассы культуры дедалеопсиса шершавого Daedaleopsis confragosa 2 мг/мл вода остальное до 1 мл

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что биомассу природного гриба Inonotus obliquus с размером частиц 0,1-7 мм смешивают с нагретой водой до температуры 98°С в соотношении 1:5 и экстрагируют при указанной температуре на водяной бане в течение 3 ч с последующим отделением экстракта от осадка фильтрованием.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что отфильтрованную и гомогенизированную биомассу глубинной культуры вешенки устричной Pleurotus ostreatus смешивают с нагретой водой до температуры 100°С в соотношении 1:5 и экстрагируют при указанной температуре на водяной бане в течение 1 ч с последующим центрифугированием при 4000 об/мин в течение 20 мин и получением экстракта в виде надосадочной жидкости.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что биомассу природных плодовых тел вешенки устричной Pleurotus ostreatus со средним размером частиц 1 мм смешивают с нагретой водой до температуры 100°С в соотношении 1:19 и экстрагируют при указанной температуре на водяной бане в течение 30 мин, дополнительно охлаждают в холодильнике с последующим центрифугированием при 4000 об/мин в течение 20 мин и получением экстракта в виде надосадочной жидкости.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что отфильтрованную и гомогенизированную биомассу культуры вешенки легочной Pleurotus pulmonarius смешивают с нагретой водой до температуры 100°С в соотношении 1:5 и экстрагируют при указанной температуре на водяной бане в течение 1 ч с последующим центрифугированием при 4000 об/мин в течение 20 мин и получением экстракта в виде надосадочной жидкости.

6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что сухую измельченную биомассу культуры дедалеопсиса шершавого Daedaleopsis confragosa со средним размером частиц 1 мм смешивают с нагретой водой до температуры 90°С в соотношении 1:20 и экстрагируют при указанной температуре на водяной бане в течение 1 ч, дополнительно охлаждают в холодильнике с последующим центрифугированием при 4000 об/мин в течение 20 мин и получением экстракта в виде надосадочной жидкости.