Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии, и может быть использовано для сохранения бактерий во влагалищной жидкости человека и бактерий в условиях низких температур, в том числе в условиях криоконсервации [С12N1/00, С12N1/04].
Известен СПОСОБ ЗАМОРАЖИВАНИЯ МОЛОЧНО-КИСЛЫХ БАКТЕРИЙ [RU 2427624, опубликовано: 27.08.2011], предусматривающий смешивание в соотношении 1:1 молочно-кислых бактерий с защитной средой, содержащей глицерин и лимонно-кислый натрий, замораживание полученной смеси в жидком азоте в виде гранул. Защитную среду готовят на основе фосфатного буфера с рН 7,2, дополнительно вводят в нее лактозу и желатин. После смешивания молочно-кислых бактерий с защитной средой полученную смесь выдерживают при температуре от 17 до 27°С в течение 15-20 мин., затем еще раз перемешивают и подают на замораживание.
Однако данный способ обладает недостатками:
- невозможность выделения чистых культур протективных лактобактерий из вагинальной микробиоты для криоконсервирования;
- не в полной мере обеспечивается качественное длительное хранение материала для последующего его использования в трансплантации.
Известен СПОСОБ КРИОКОНСЕРВАЦИИ МУЛЬТИПОТЕНТНЫХ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК [RU 2433173, опубликовано: 10.11.2011], включающий подготовку смеси культуры в культуральной среде, смешивание культуры клеток в культуральной среде с криопротектором, ступенчатое контролируемое охлаждение и замораживание смеси культуральной среды с криопротектором до температуры хранения и последующее хранение замороженной смеси при низких температурах. При этом в качестве криопротектора для насыщения смеси используют газ ксенон, вводимый до насыщения в подготовленную смесь клеточной культуры ММСК в среде DMEM, находящуюся в открытых криопробирках путем продувания культуральной среды ксеноном при 0°С с дальнейшим охлаждением и образованием первичного монолита культуральной среды с криопротектором, направляемым затем на замораживание до температуры хранения.
Однако данный способ обладает недостатками:
- невозможность выделения чистых культур протективных лактобактерий из вагинальной микробиоты для криоконсервирования;
- не в полной мере обеспечивается качественное длительное хранение материала для последующего его использования в трансплантации.
Наиболее близким аналогом является СПОСОБ ДЛИТЕЛЬНОГО ХРАНЕНИЯ ЕСТЕСТВЕННЫХ СИМБИОТИЧЕСКИХ АССОЦИАЦИЙ МИКРООРГАНИЗМОВ ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ [RU 2123044, опубликовано: 10.12.1998], заключающийся в приготовлении суспензии биоматериала с содержанием микроорганизмов не менее 109°КОЕ/мл с последующим замораживанием и хранением. В качестве источника естественных симбиотических ассоциаций микроорганизмов используют суспензию содержимого толстой кишки человека или животных, подвергают ее селективной деконтаминации, а замораживание осуществляют путем криоконсервации с последующим хранением при температуре - 196°C. В качестве криопротектора также могут быть использованы вещества белково-полисахаридной природы, например муцин, леван, агароза, желатина.
Основной технической проблемой прототипа является то, что он не обеспечивает возможность выделения чистых культур протективных лактобактерий из вагинальной микробиоты для криоконсервирования и не в полной мере обеспечивает качественное длительное хранение материала для последующего его использования в трансплантации.
Технический результат изобретения заключается в выделении чистых культур протективных лактобактерий из вагинальной микробиоты для криоконсервирования и их длительного хранения для последующего их использования в трансплантации.
Указанный технический результат достигается за счет того, что способ криоконсервации вагинальной микробиоты, включающий приготовление суспензии биоматериала, замораживание суспензии биоматериала с последующим хранением, отличающийся тем, что предварительно осуществляют отбор проб вагинальной жидкости в нативном варианте, содержащих биологически активные виды Lactobacillus spp., приготовление суспензии биоматериала включает операции фракционирования вагинальной жидкости в нативном варианте и низкоскоростное препаративное центрифугирование вагинальной жидкости в нативном варианте, удаление надосадочной жидкости, отбор образцов осадка вагинальной жидкости, выделение из осадка вагинальной жидкости чистых культур протективных лактобактерий - суспензии биоматериала, подготовки суспензии биоматериала к замораживанию, фракционирование вагинальной жидкости в нативном варианте выполняют при температуре окружающей среды 20-25°С и относительной влажности воздуха 30-70 %, низкоскоростное препаративное центрифугирование вагинальной жидкости в нативном варианте осуществляют с частотой вращения ротора центрифуги 5000 мин-1 в течение 10-11 минут с обеспечением ускорения свободного падения вагинальной жидкости в нативном варианте в пределах 500-750 g, удаляют надосадочную жидкость из каждого образца микропипеткой путем аспирации, отбор образцов осадка вагинальной жидкости осуществляют путем аспирации микропипеткой, выделение из осадка вагинальной жидкости чистых культур протективных лактобактерий осуществляют путем посева осадка вагинальной жидкости на питательные среды с последующим выделением из этого осадка чистых культур протективных лактобактерий, подготовка суспензии биоматериала к замораживанию включает суспендирование чистых культур протективных лактобактерий в комбинированной криопротективной среде и смешивание полученной суспензии биоматериала в криопробирке с криозащитной средой, замораживание суспензии биоматериала осуществляют до температуры минус 86°С в условиях низкотемпературного холодильника с последующим хранением суспензии биоматериала при температуре окружающей среды минус 86°С.
В частности, отбор проб вагинальной жидкости в нативном варианте осуществляют с общей бактериальной массой в отобранных пробах вагинальной жидкости в нативном варианте не менее 1×107 КОЕ/мл (ГЭ/мл), содержащих 50-90% биологически активных видов Lactobacillus spp. в количестве 1×107-9 КОЕ/мл (ГЭ/мл).
В частности, отбор проб вагинальной жидкости осуществляют путем аспирации нативной вагинальной жидкости в количестве 1 - 4 мл.
В частности, отбор проб вагинальной жидкости осуществляют путем смыва редуцированным физиологическим раствором в количестве 1 - 4 мл.
В частности, отбор проб вагинальной жидкости осуществляют путем соскоба ватным тампоном.
В частности, фракционирование вагинальной жидкости в нативном варианте выполняют путем проведения фракционной кристаллизации.
В частности, фракционирование вагинальной жидкости в нативном варианте выполняют путем проведения фракционной дистилляции.
В частности, замораживание суспензии биоматериала осуществляют за одну стадию путем плавного уменьшения температуры воздуха со скоростью 1-3°С/мин до температуры окружающей среды минус 86°С.
В частности, замораживание суспензии биоматериала осуществляют постепенно до температуры минус 196°С с последующим хранением в парах жидкого азота.
Осуществление изобретения.
Способ криоконсервации вагинальной микробиоты включает приготовление суспензии биоматериала и замораживание суспензии биоматериала с последующим хранением.
Для этого предварительно осуществляют отбор проб вагинальной жидкости в нативном варианте путем аспирации нативной вагинальной жидкости в количестве 1 - 4 мл (при наличии достаточно жидкой фракции выделений), либо путем смыва редуцированным физиологическим раствором (0,9% NaCl), либо путем соскоба ватным тампоном.
Общая бактериальная масса в отобранных пробах вагинальной жидкости в нативном варианте составляет, как правило, не менее 1×107 КОЕ/мл (ГЭ/мл), содержащих 50-90% биологически активных видов Lactobacillus spp. в количестве 1×107-9 КОЕ/мл (ГЭ/мл).
Приготовление суспензии биоматериала включает операции фракционирования вагинальной жидкости в нативном варианте и низкоскоростного препаративного центрифугирования вагинальной жидкости в нативном варианте, удаления надосадочной жидкости, отбор образцов осадка вагинальной жидкости, выделение из осадка вагинальной жидкости чистых культур протективных лактобактерий - суспензии биоматериала, и подготовки биоматериала к замораживанию.
Фракционирование вагинальной жидкости в нативном варианте выполняют путем проведения фракционной кристаллизации или фракционной дистилляции при температуре окружающей среды 20-25°С и относительной влажности воздуха 30-70 %, а низкоскоростное препаративное центрифугирование вагинальной жидкости в нативном варианте осуществляют в центрифугах в течение 10-11 минут, с частотой вращения ротора центрифуги 5000 мин-1 с обеспечением ускорения свободного падения вагинальной жидкости в нативном варианте в пределах 500-750 g. Далее удаляют надосадочную жидкость из пробирки путем аспирации микропипеткой.
Отбор образцов осадка вагинальной жидкости осуществляют путем аспирации микропипеткой.
Выделение из осадка вагинальной жидкости чистых культур протективных лактобактерий осуществляют путем посева осадка вагинальной жидкости на питательные среды с последующим выделением из этого осадка чистых культур протективных лактобактерий.
Подготовка суспензии биоматериала к замораживанию включает суспендирование чистых культур протективных лактобактерий в комбинированной криопротективной среде и смешивание полученной суспензии биоматериала в криопробирке, как правило, в соотношении 1:2-1:5, с криозащитной средой.
Далее, закрытые криопробирки с помещенной в них суспензией биоматериала замораживают до температуры минус 86°С в условиях низкотемпературного холодильника и оставляют на хранение при температуре окружающей среды внутри низкотемпературного холодильника минус 86°С.
Замораживание суспензии биоматериала в закрытых криопробирках возможно осуществить за одну стадию в условиях низкотемпературного холодильника путем плавного уменьшения температуры воздуха со скоростью 1-3 °С/мин до температуры окружающей среды минус 86°С.
Замораживание суспензии биоматериала в закрытых криопробирках возможно осуществить постепенно до температуры минус 196°С в сосуде Дьюара с последующим хранением закрытых криопробирок в отдельном криохранилище в парах жидкого азота.
Размораживают криопробирки с суспензией биоматериала путем нагревания в водяной бане при температуре до 37°С в течение 10-30 минут непосредственно перед проведением их применением.
Пример осуществления способа.
Пациентка А., 28 лет обратилась в клинику для прохождения ежегодного диспансерного обследования. При гинекологическом обследовании никаких жалоб не предъявляла. Из анамнеза известно, что росла и развивалась нормально. Менархе наступило в 14 лет. Менструации установились сразу, по 4 дня, безболезненные, умеренные. На момент осмотра был 8-й день менструального цикла. Половая жизнь с 19 лет, состоит в браке. Беременностей не было. Контрацепция презервативами или прерванным половым актом. Гинекологические заболевания, оперативные вмешательства на органах брюшной полости отрицает. При гинекологическом осмотре в зеркалах и бимануальном исследовании патологии со стороны органов репродуктивной системы не выявлено. рН влагалищной жидкости 4,3.
Соматически здорова.
Для предварительного анализа состояния микробиоты влагалища ватным (дакроновым) тампоном выполнен отбор пробы вагинальной жидкости и помещение ее в пробирку со специальной транспортной средой. Пробирку транспортировали в лабораторию, где выполнена полимеразно-цепная реакция (ПЦР) в реальном времени для идентификации основных бактериальных родов вагинальной микробиоты и определения их количества. В конкретном случае была установлена нормальная микробиота влагалища (см.таблицу 1).
Микробиота пациентки А. до замораживания и криохранения
После установления типа микробиоты влагалища пациентка А. приглашена на повторный визит для отбора проб вагинальной жидкости с целью ее дальнейшей криоконсервации.
На гинекологическом кресле в зеркалах выполнена аспирация 3 мл жидкой фракции влагалищной жидкости и помещена в специальную пробирку №1 со стерильной селективной криопротективной средой, содержащей глицерин до 20%.
Также выполнен смыв редуцированным 0,9% физиологическим раствором в количестве 3 мл. Пробирку №2 со смывом вагинальной жидкости центрифугировали со скоростью 5000 мин-1, в течение 10 минут удалили надосадочную часть. Осадок поместили в пробирку с криозащитной средой аналогичного состава.
Криозащитная пробирка №1 с внесенной в нее вагинальной жидкостью и криопробирка №2 со смывом вагинальной жидкости были помещены в специализированную морозильную камеру. Заморозка происходила путем постепенного понижения температуры окружающей среды до минус 86°С без каких-либо специальных режимов.
Тестовое хранение образца вагинальной жидкости пациентки А. осуществляли в морозильной камере в течение 6 мес. при температуре окружающей среды минус 86°С.
Образцы вагинальной жидкости размораживали постепенным оттаиванием при комнатной температуре (плюс 23-25°С) в течение 3-х часов. Непосредственно перед проведением следующего этапа исследований пробирки легко встряхивали.
После полного размораживания влагалищной жидкости для заключительного анализа состояния микробиоты влагалища после криоконсервации производили контрольную ПЦР в реальном времени для идентификации основных бактериальных родов вагинальной микробиоты и определения их количества. В конкретном случае после криоконсервации и размораживания вагинальной жидкости была установлена нормальная микробиота влагалища (см.таблицы 2, 3), идентичная результатам первичного анализа.
Микробиота пациентки А. после криохранения и размораживания (пробирка №1)
Микробиота пациентки А. после криохранения и размораживания (пробирка №2)
Предлагаемый способ сохранения аутологичных штаммов лактобацилл: заморозки, хранения и разморозки (восстановления), позволяет сохранить видовой спектр индигенных микроорганизмов (протективных лактобацилл) в высоком титре и увеличить возможность восстановления жизнеспособности и функциональную активность бактерий после хранения в условиях низких температур.
Предварительный отбор проб вагинальной жидкости в нативном варианте с общей бактериальной массой в отобранных пробах вагинальной жидкости в нативном варианте должен быть не менее 1×107 КОЕ/мл (ГЭ/мл), содержащих 50-90% биологически активных видов Lactobacillus spp. в количестве 1×107-9 КОЕ/мл (ГЭ/мл), т.е. пороговое оптимальное значение показателя нормального содержания колониеобразующих единиц и, соответственно, характеризующее нормальное физиологическое состояние организма. Показатели отбора проб вагинальной жидкости в нативном варианте с общей бактериальной массой в отобранных пробах вагинальной жидкости менее 1×107 КОЕ/мл (ГЭ/мл) и содержащих менее 50 % биологически активных видов Lactobacillus spp. - характеризуют недостаточный уровень микрофлоры и, соответственно, применению дополнительных процедур в отношении пациента по увеличению его пробиотических показателей.
Выполнение фракционирования вагинальной жидкости в нативном варианте путем проведения фракционной кристаллизации или фракционной дистилляции при температуре окружающей среды 20-25°С и относительной влажности воздуха 30-70% позволяет исключить процессы теплообмена, теплоотдачи и испарение влаги из лабораторных проб вагинальной жидкости, тем самым обеспечить точность исследований.
Выполнение низкоскоростного препаративного центрифугирования вагинальной жидкости в нативном варианте в центрифуге с частотой вращения ротора 5000 мин-1 и обеспечением ускорения свободного падения вагинальной жидкости в нативном варианте в пределах 500-750 g в течение 10-11 минут гарантированно обеспечит разделение вагинальной жидкости в нативном варианте на мелкодисперсные многокомпонентные смеси, в частности, на надосадочную жидкость и необходимый осадок вагинальной жидкости.
Исследования показали, что обеспечение вращения ротора центрифуги более 5000 мин-1 и ускорения свободного падения более 500-750 g нецелесообразно из-за разделения клеточных органелл на излишне мелкие компоненты.
Кроме того, исследования показали, что длительность центрифугирования более 11 минут нецелесообразна из-за неизменности показателей разделяемой смеси и, соответственно, непреднамеренных затрат на реализацию процесса.
Смешивание полученной суспензии биоматериала в криопробирке в соотношении 1:2-1:5 с криозащитной средой позволяет защитить чистые культуры протективных лактобактерий от повреждающего действия замораживания.
Замораживание закрытых криопробирок с помещенной в них суспензией биоматериала (чистых культур протективных лактобактерий) до температуры минус 86°С в условиях низкотемпературного холодильника, в том числе путем плавного уменьшения температуры воздуха со скоростью 1-3 °С/мин до температуры окружающей среды минус 86°С, позволяет обеспечить сохранность титра чистых культур протективных лактобактерий при хранении, а также восстановить свою жизнеспособность после размораживания.
Постепенное замораживание суспензии биоматериала в закрытых криопробирках до температуры минус 196°С в сосуде Дьюара с последующим хранением закрытых криопробирок в отдельном криохранилище в парах жидкого азота позволяет дополнительно увеличить возможность восстановления жизнеспособности чистых культур протективных лактобактерий после хранения в условиях низких температур.
Таким образом, заявляемый способ криоконсервации микробиоты позволит выделить чистые культуры протективных лактобактерий из вагинальной микробиоты для криоконсервирования и обеспечить их длительное хранение для последующего их использования в трансплантации, а также обеспечить сохранность полноценных биологических свойств микроорганизмов.
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| Способ криоконсервации аутологичных вагинальных лактобацилл | 2022 |
|
RU2802074C1 |
| Способ лечения вагинальной атрофии у женщин в постменопаузе с учетом состояния эпителия и микробиоценоза влагалища | 2017 |
|
RU2636619C1 |
| Способ сохранения бактерий в фекальной микробиоте и бактериальных культур, выращенных на плотных агаризованных питательных или дифференциальных средах в условиях низких температур с использованием составной среды для заморозки | 2019 |
|
RU2737321C1 |
| Способ центильной оценки микроценоза слизистой влагалища у девочек в зависимости от стадии полового созревания с учетом шкалы Таннера | 2016 |
|
RU2671561C2 |
| СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕРСОНИФИЦИРОВАННОГО АУТОПРОБИОТИЧЕСКОГО ПРОДУКТА И СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ СИНДРОМА РАЗДРАЖЕННОЙ КИШКИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЭТОГО ПРОДУКТА | 2013 |
|
RU2546253C2 |
| СПОСОБ ОЦЕНКИ МИКРОБНОГО СПЕКТРА ЭНДОМЕТРИЯ ДЛЯ ЭТИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ХРОНИЧЕСКОГО ЭНДОМЕТРИТА | 2015 |
|
RU2599479C1 |
| Способ восстановления собственной кишечной микробиоты после антибиотикотерапии | 2021 |
|
RU2775887C1 |
| Способ выделения и сохранения тотальной микробиоты кишечника человека для трансплантации | 2019 |
|
RU2727444C1 |
| Защитная среда для криохранения для анаэробных, аэробных, факультативно анаэробных и микроаэрофильных микроорганизмов в фекальной микробиоте | 2019 |
|
RU2726299C1 |
| Способ лечения синдрома раздражённого кишечника | 2017 |
|
RU2661624C1 |
Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии. Предложен способ криоконсервации вагинальной микробиоты, включающий отбор проб нативной вагинальной жидкости с общей бактериальной массой в пробах не менее 1×107 КОЕ/мл (ГЭ/мл), содержащих 50-90% биологически активных видов Lactobacillus spp., с дальнейшим низкоскоростным препаративным центрифугированием. Затем из осадка вагинальной жидкости путем посева на питательные среды выделяют чистые культуры протективных лактобактерий и суспендируют в комбинированной криопротективной среде в криопробирке. Замораживание суспензии биоматериала осуществляют за одну стадию путем уменьшения температуры со скоростью 1-3°С/мин до температуры окружающей среды минус 86°С в условиях низкотемпературного холодильника с последующим хранением суспензии биоматериала при минус 86°С. Изобретение обеспечивает сохранность видового спектра протективных лактобактерий в пробах нативной вагинальной жидкости и повышает возможность восстановления их жизнеспособности после хранения в условиях низких температур. 3 з.п. ф-лы, 3 табл., 1 пр.
1. Способ криоконсервации вагинальной микробиоты, включающий приготовление суспензии биоматериала, замораживание суспензии биоматериала с последующим хранением, отличающийся тем, что предварительно осуществляют отбор проб нативной вагинальной жидкости с общей бактериальной массой в отобранных пробах нативной вагинальной жидкости не менее 1×107 КОЕ/мл (ГЭ/мл), содержащих 50-90% биологически активных видов Lactobacillus spp., приготовление суспензии биоматериала включает операции низкоскоростного препаративного центрифугирования нативной вагинальной жидкости, удаление надосадочной жидкости, отбор образцов осадка вагинальной жидкости, выделение из осадка вагинальной жидкости чистых культур протективных лактобактерий – суспензии биоматериала, подготовки суспензии биоматериала к замораживанию; низкоскоростное препаративное центрифугирование нативной вагинальной жидкости осуществляют с частотой вращения ротора центрифуги 5000 мин-1 в течение 10-11 мин с обеспечением ускорения свободного падения нативной вагинальной жидкости в пределах 500-750 g, удаляют надосадочную жидкость из каждого образца микропипеткой путем аспирации; отбор образцов осадка вагинальной жидкости осуществляют путем аспирации микропипеткой; выделение из осадка вагинальной жидкости чистых культур протективных лактобактерий осуществляют путем посева осадка вагинальной жидкости на питательные среды с последующим выделением из этого осадка чистых культур протективных лактобактерий; подготовка суспензии биоматериала к замораживанию включает суспендирование чистых культур протективных лактобактерий в комбинированной криопротективной среде в криопробирке, а далее замораживание суспензии биоматериала осуществляют за одну стадию путем плавного уменьшения температуры воздуха со скоростью 1-3°С/мин до температуры окружающей среды минус 86°С в условиях низкотемпературного холодильника с последующим хранением суспензии биоматериала при температуре окружающей среды минус 86°С.
2. Способ криоконсервации вагинальной микробиоты по п.1, отличающийся тем, что отбор проб вагинальной жидкости осуществляют путем аспирации нативной вагинальной жидкости в количестве 1-4 мл.
3. Способ криоконсервации вагинальной микробиоты по п.1, отличающийся тем, что отбор проб вагинальной жидкости осуществляют путем смыва редуцированным физиологическим раствором в количестве 1-4 мл.
4. Способ криоконсервации вагинальной микробиоты по п.1, отличающийся тем, что отбор проб вагинальной жидкости осуществляют путем соскоба ватным тампоном.
| СПОСОБ ДЛИТЕЛЬНОГО ХРАНЕНИЯ ЕСТЕСТВЕННЫХ СИМБИОТИЧЕСКИХ АССОЦИАЦИЙ МИКРООРГАНИЗМОВ ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ. | 1998 |
|
RU2123044C1 |
| СИДОРЕНКО А., НОВИК Г | |||
| "Жизнеспособность бактерий рода Bifidobacterium в зависимости от условий криоконсервации"; Наука и Инновации, 2011, N 8(102), с.62-66 | |||
| КИРА Е.Ф | |||
| "Пробиотики в гинекологической практике", Журнал РОАГ, 2008, N 3, с.6-11 | |||
| СПОСОБ ЗАМОРАЖИВАНИЯ МОЛОЧНО-КИСЛЫХ БАКТЕРИЙ | 2010 |
|
RU2427624C1 |
