СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ВАГИНИТА Российский патент 2023 года по МПК G09B23/28 

Изобретение относится к экспериментальной медицине и может быть использовано для моделирования вагинита.

Вагинит - это гинекологическое заболевание, связанное с воспалением во влагалище (Чеботарева Ю.Ю., Петров Ю.А. Детская и подростковая гинекология Москва, 2022, С. 96).

Вагинит занимает первое место в структуре детской гинекологической заболеваемости с частотой 42,2%-93,0% (Чеботарева Ю.Ю., Петров Ю.А. Детская и подростковая гинекология Москва, 2022, С. 96). Вагинит является не только распространенной, но и сложной гинекологической проблемой (Чеботарева Ю.Ю., Костоева З.А., Султанова Д.А. Клиническая картина и лечение хронического вульвовагинита у молодых женщин // Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. 2018. Т. 17. №2. С. 22).

Изучение патофизиологических, биохимических, молекулярных, генетических механизмов вагинита, определение эффективности его лечения, возможно благодаря моделированию вагинита на лабораторных животных (Самединов Р.С, Набиев А.Н., Туляганов С.Х. Эффективность препарата «Асфервон» при лечении неспецифического вагинита в эксперименте на крысах// В сб.: Наука, образование, инновации: актуальные вопросы и современные аспекты. Сборник статей VI Международной научно-практической конференции. Пенза, 2021. С. 229-231; De Bernardis F, Santoni G, Boccanera M, Lucciarini R et al. Protection against rat vaginal candidiasis by adoptive transfer of vaginal B-lymphocytes. FEMS Yeast Res. 2010 Jun; 10(4):432-40. doi: 10.1111/j.l567-1364.2010.00620.x. Epub, 2010 Mar 8. PMID: 20402794).

Несмотря на наличие различных способов моделирования вагинита, всем им присущ ряд недостатков, таких, как токсичность для экспериментатора и лабораторного животного, трудоемкость, связанная в необходимость оварэктомии у животных, низкая воспроизводимость вагинита, имеющего клинические признаки, как в практике (Ермоленко Е.И., Пунченко О.Е., Воропаева Л.С.и др. Пробиотики и аутопробиотики в терапии экспериментального вагинита // Антибиотики и химиотерапия. - 2022. - Т. 67, №11-12. - С. 29-35; De Bernardis F.D., Lucciarini R., Boccanera M., Amantini C. et al. Vaginitis Candida albicans of Vaginal Dendritic Cells in a Rat Model of Phenotypic and Functional Characterization// Infect. Immun, 74 (7): 4282).

Поэтому разработка новых способов моделирования вагинита, имеющего клинические признаки, максимально сходные с клинической картиной у пациенток, с целью изучения патогенеза, усовершенствования способов диагностики и лечения вагинита, является актуальной задачей современной экспериментальной медицины.

Проведенными исследованиями по научно-медицинской и патентной литературе выявлены различные способы моделирования вагинита.

Так, в работе Самединова Р.С.и соавт. описан способ моделирования вагинита (Самединов Р.С, Набиев А.Н., Туляганов С.Х. Эффективность препарата «Асфервон» при лечении неспецифического вагинита в эксперименте на крысах// В сб.: Наука, образование, инновации: актуальные вопросы и современные аспекты. - Сборник статей VI Международной научно-практической конференции. Пенза, 2021. С. 229-231). Способ предусматривает однократное интравагинальное введение экспериментальному животному - крысе 15% раствора формалина в дозе 0,2 мл.

Недостатками данного способа являются: тяжесть вагинального поражения, связанного с вторичным воспалением на фоне химической травмы слизистой влагалища, а также недостаточная воспроизводимость модели, так как в результате ее реализации, как правило, может возникать субтотальный язвенный дефект слизистой влагалища различной глубины и значительной протяженности, что не характерно для клиники вагинита (Юнусова И.А., Передерий Е.А., Телешова О.В., Бургело Е.В., Горяникова И.Н. Оценка эффективности новых вагинальных суппозиториев с густым экстрактом листьев шалфея лекарственного при лечении неспецифического вагинита в эксперименте // Journal of Siberian Medical Sciences. 2020. №1. С. 89-99). Из-за токсичности формалина нельзя исключить гибель животного, а также неблагоприятное влияние на верхние дыхательные пути и роговицу глаза экспериментатора (Зенин O.К., Калмин О.В. Способ сохранения биологического материала // Вестник Пензенского государственного университета №1(13). 2016 С. 23-25).

В патенте Степановой К.О. и соавт.(Пат. №62115 Украïни на корисну модель, Cnociб моделювання асептичного запалення слизовоï оболонки пiхви / Степанова К.О., Должикова О.В., Малоштан Л.М., Малоштан А.В.; заявник та патентовласник Нацiональний фармацевтичний унiверситет; опубл. 10.08.2011, Бюл. №15) описан способ моделирования вагинита.

Способ предусматривает введение во влагалище опытных животных тампона с 10% раствором азотнокислого серебра и его экспозицией в течение 5 мин.

Недостатками данного способа являются недостаточная воспроизводимость модели, так как в результате ее реализации, как правило, отмечают ожоги и некроз поверхностного слоя слизистой оболочки влагалища, а также повреждения во влагалище, неотягощенные инфекцией, что не соответствует клинической картине вагинита (Должикова Е.В., Малоштан Л.Н. Влияние суппозиториев вагинальных "меланизол" на течение экспериментального вагинита у крыс // Медицина и образование в Сибири. 2015. №1. С. 46; Nizhenkovska I., Onyshchuk L., Savosko S. Efficacy study of vaginal suppositories with anti-inflammatory and antimicrobial effect on a model of experimental vaginitis "Recipe", 2018, volume 21, №6 p. 834-842). Также нитрат серебра, как правило, депривирует штаммы вагинальных микроорганизмов, при этом прижигает слизистую, включая формирование глубоких ожогов, что не соответствует клинической картине вагинита (Привольнев В.В., Забросаев B.C., Даниленков Н.В. Препараты серебра в местном лечении инфицированных ран Вестник Смоленской государственной академии 2015, Т. 14 С. 1-7).

В работе Степановой К.О. и соавт. описан способ моделирования вагинита путем однократной внутривлагалищной аппликации ирританта (скипидар + диметилсульфоксид в соотношении 1:1) в дозе 0,5 мл/100 г массы тела крысы (Пат. №61038 Ukrayini na korisnu model. Zasib u formi pesariyiv dlya likuvannya infektsiyno-zapalnih ginekologichnih zahvoryuvan / Stepanova K.O., Dolzhykova О.V., Maloshtan L. M., Levachkova Yu.V., Chushenko V.M, Yarnih T.G. № u 2010 13780; Zayavl. 19. 11. 2010; Opubl. 11.07. 2011, Byul. №13.-5 s.)

Недостатками данного способа являются недостаточная воспроизводимость модели, так как в результате ее реализации, как правило, происходит смещение рН влагалища в щелочную сторону, истощение пула лактобактерий и замещение их условно-патогенной и патогенной флорой, а не штаммами Candida, что более характерно для вагинита (Должикова Е.В., Малоштан Л.Н. Изменение уровня ЦИК под влиянием суппозиториев "Меланизол" и "Климедекс" на модели экспериментального вагинита у крыс. Фармация Казахстана. 2019. №6. С. 14-19).

В работе Пунченко О.Е. описан способ моделирования вагинита, при котором самкам беспородных белых мышей в возрасте 10-12 недель и весом 18-20 г вводят в вагинальную полость 20 мкл взвеси гетеробиотического штамма Staphylococcus aureus в концентрации 10⁹ КОЕ/мл (Пунченко О.Е., Воропаева Л.С., Орлова В.В., Ермоленко Е.И. Аутопробиотические, гетерологичные и пробиотические энтерококки и гетерологичные лактобациллы в терапии экспериментального стафилококкового вагинита у мышей // Проблемы медицинской микологии. 2022. Т. 24. №2. С. 122).

Недостатком данного способа является трудоемкость, связанная с выполнением овариоэктомии и последующей гормонизацией цикла (Ермоленко Е.И., Пунченко О.Е., Воропаева Л.С.и соавт .Пробиотики и аутопробиотики в терапии экспериментального вагинита //Антибиотики и химиотерапия. 2022. Т. 67. №11-12. С. 29-35).

Наиболее близким по технической сущности и принятым за прототип является способ моделирования вагинита, описанный в работе De Bernardis F.D., Lucciarini R., Boccanera M., Amantini С.et al. Vaginitis Candida albicans of Vaginal Dendritic Cells in a Rat Model of Phenotypic and Functional Characterization // Infect. Immun, №74 (7): 2006).

Способ включает выполнение воздействия на экспериментально животное - самку крысы Wistar. Проводят оофорэктомию, после чего во влагалище экспериментального животного трижды вводят штаммы С. albicans SA-40, полученные из вагинальных выделений женщин с острым вагинитом. Крысу поддерживают в состоянии псевдоэструса путем инъекции эстрадиола бензоата.

Недостатками прототипа являются: недостаточная воспроизводимость вагинита, поскольку использование гетерологичных штаммов микроорганизмов не всегда эффективно (Пунченко О.Е., Воропаева Л.С., Орлова В.В., Ермоленко Е.И. Аутопробиотические, гетерологичные и пробиотические энтерококки и гетерологичные лактобациллы в терапии экспериментального стафилококкового вагинита у мышей // Проблемы медицинской микологии. 2022. Т. 24. №2. С. 122), а также инвазивность способа, поскольку экспериментальному животному необходимо выполнять оофорэктомию - удаление яичников.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка эффективного способа моделирования вагинита.

Техническим результатом, проявляющимся при реализации данного способа, является устранение инвазивности способа за счет исключения травматизации животных при выполнении оофорэктомии.

Указанный технический результат достигается, тем, что в качестве экспериментальных животных используют неполовозрелых самок крыс линии Wistar. Все манипуляции с экспериментальным животным выполняют в соответствии с принципами Хельсинской декларации о гуманном отношении к животным. В первый день эксперимента поверхность брюшной стенки крысы очищают от шерстного покрова. После этого на поверхность брюшной стенки равномерно однократно наносят 5,0 г препарата «Эстрожель». Крысу кормят два раза в день утром и вечером. В первые три дня эксперимента крысе дают по 15 г сухого корма для грызунов. В четвертый день - кормят смесью, содержащей по 10 г манной крупы и 2,5 мг порошка препарата «Амоксициллин».

Препарат «Эстрожель® (Oestrogel), BESINS HEALTHCARE (Бельгия). Произведено: BESINS MANUFACTURING BELGIUM, SA (Бельгия). Активное вещество: эстрадиол (estradiol). Гель трансдермальный 600 мкг/г: туба 80 г с аппликатором-дозатором. Per. №П N013773/01 от 29.12.09. Одна доза соответствует 2,5 г геля и содержит 1,5 мг эстрадиола (в форме гемигидрата) (https://www.vidal.ru/drugs/oestrogel_23864).

Препарат «Амоксициллин», ВАЛЕНТА ФАРМАЦЕВТИКА, АО (Россия). Активное вещество: амоксициллин (amoxicillin). Таб. 250 мг. Рег. №ЛС-000176 от 18.07.08 (https://www.vidal.ru/drugs/amoxicillin_8935).

Подробное описание способа. Неполовозрелую самку крысы линии Wistar помещают в клетку на время всего эксперимента со свободным доступом к воде. В первый день эксперимента поверхность брюшной стенки животного очищают от шерстного покрова, после чего на нее равномерно однократно наносят 5,0 г препарата «Эстрожель». Крысу кормят два раза в день утром и вечером. В первые три дня эксперимента крысе дают: утром - 15 г сухого корма для грызунов, например, специализированный корм для мелких грызунов «Султан», производства компании «Технология успеха», г. Ростов-на-Дону, вечером - 15 г сухого корма для грызунов, например, специализированный корм для мелких грызунов «Султан», производства компании «Технология успеха», г. Ростов-на-Дону. В четвертый день эксперимента крысу кормят: утром - смесью, содержащей 10 г манной крупы и 2,5 мг порошка препарата «Амоксициллин», вечером - смесью, содержащей 10 г манной крупы и 2,5 мг порошка препарата «Амоксициллин».

Смесь получают следующим образом: одну таблетку Амоксицилина, содержащую 250 мг активного вещества Амоксициллин, растирают и получают порошок. Дозу 2,5 мг порошка препарата «Ампициллин» отмеряют путем взвешивания на аналитических весах. Затем 2,5 мг порошка препарата «Ампициллин» тщательно перемешивают с 10 г манной крупы.

Для подтверждения реализации модели вагинита на пятый день эксперимента проводят визуальную оценку и забор вагинальных выделений у крысы, готовят мазки и исследуют их под микроскопом. Наличие при осмотре обильных творожистых вагинальных выделений, а при микроскопии мазка - лейкоцитов ≥20 в поле зрения, зернистых эпителиальных клеток ≥10 в поле зрения, присутствие мицелия, слизи свидетельствует о развитии вагинита у экспериментального животного, что подтверждает реализацию модели.

Практическая реализуемость заявляемого способа иллюстрируется примерами моделирования вагинита.

Пример 1: неполовозрелую самку крысы линии Wistar в возрасте 66 дней, весом 74 г на время проведения эксперимента помещают в клетку со свободным доступом к воде.

В первый день эксперимента поверхность брюшной стенки крысы очистили от шерстного покрова, после этого на поверхность брюшной стенки равномерно однократно нанесли 5,0 г препарата «Эстрожель» (BESINS MANUFACTURING BELGIUM, SA (Бельгия)).

Крысу кормили два раза в день утром и вечером. В первые три дня эксперимента крысе давали по 15 г сухого корма для грызунов «Султан» («Технология успеха», г. Ростов-на-Дону). В четвертый день - кормили смесью, содержащей по 10 г манной крупы и 2,5 мг порошка препарата «Амоксициллин» (ВАЛЕНТА ФАРМАЦЕВТИКА, АО (Россия)).

На пятый день эксперимента у экспериментального животного визуально оценивали характер вагинальных выделений и проводили их забор, готовили мазки и исследовали их под микроскопом. У крысы отмечались обильные вагинальные творожистые выделения. При микроскопическом исследовании вагинальных мазков экспериментального животного были выявлены лейкоциты в количестве 25-27 в поле зрения, зернистые эпителиальные клетки - 15-18 в поле зрения, присутствие мицелия и слизи. Полученные данные подтвердили наличие вагинита у экспериментального животного и достоверность заявляемого способа моделирования.

Пример 2: неполовозрелую самку крыс линии Wistar в возрасте 93 дней с весом 88 г на время проведения эксперимента помещали в клетку со свободным доступом к воде.

В первый день эксперимента поверхность брюшной стенки крысы очистили от шерстного покрова, после этого на поверхность брюшной стенки равномерно однократно нанесли 5,0 г препарата «Эстрожель» (BESINS MANUFACTURING BELGIUM, SA (Бельгия)).

Крысу кормили два раза в день утром и вечером. В первые три дня эксперимента крысе давали по 15 г сухого корма для грызунов «Султан» («Технология успеха», г. Ростов-на-Дону). В четвертый день - кормили смесью, содержащей по 10 г манной крупы и 2,5 мг порошка препарата «Амоксициллин» (ВАЛЕНТА ФАРМАЦЕВТИКА, АО (Россия)).

На пятый день эксперимента у экспериментального животного визуально оценивали характер вагинальных выделений и проводили их забор, готовили мазки и исследовали их под микроскопом. У крысы имелись обильные творожистые выделения из влагалища. При микроскопическом исследовании вагинальных мазков отмечались микроскопические признаки вагинального воспаления, включая наличие лейкоцитов в количестве 48-50 в поле зрения, зернистых эпителиальных клеток - 18-20 в поле зрения, присутствие мицелия и слизи. Полученные данные подтвердили наличие вагинита у экспериментального животного и достоверность заявляемого способа моделирования.

Согласно предлагаемому способу, было проведено моделирование вагинита у 30 неполовозрелых самок крыс линии Wistar. На время проведения эксперимента крыс поместили в отдельные клетки со свободным доступом к воде.

В первый день эксперимента поверхность брюшной стенки крыс очистили от шерстного покрова, после этого на поверхность брюшной стенки каждого животного равномерно однократно нанесли 5,0 г препарата «Эстрожель».

Крыс кормили два раза в день утром и вечером. В первые три дня эксперимента каждой крысе давали по 15 г сухого корма для грызунов. В четвертый день - каждого экспериментального животного кормили смесью, содержащей по 10 г манной крупы и 2,5 мг порошка препарата «Амоксициллин».

На пятый день эксперимента у всех 30 экспериментальных животных проводили визуальную оценку характера вагинальных выделений и их забор с последующим микроскопическим исследованием.

У всех 30 (100%) экспериментальных крыс визуально отмечались обильные творожистые выделения, а при микроскопии вагинальных мазков - лабораторные признаки вагинального воспаления: количество лейкоцитов от 20 до 56 в поле зрения, зернистых эпителиальных клеток от 10 до 22 в поле зрения, наличие мицелия во всех 30 (100%) случаях и слизи во всех 30 (100%) случаях. Все это соответствовало клинической картине вагинита у всех 30 (100%) экспериментальных животных и свидетельствовало о достоверности способа моделирования.

Таким образом, предлагаемый способ моделирования вагинита неинвазивен, так как не требует удаления яичников у экспериментальных животных, достоверен, подтверждается результатами визуального осмотра вагинальных выделений у самок крыс и микроскопического исследования их вагинальных мазков.

Изобретение относится к экспериментальной медицине и может быть использовано для моделирования вагинита. Для этого в первый день эксперимента поверхность брюшной стенки неполовозрелой самки крысы линии Wistar очищают от шерстного покрова, после чего на нее равномерно однократно наносят 5,0 г препарата «Эстрожель». Крысу кормят два раза в день: утром и вечером. В первые три дня эксперимента крысе дают по 15 г сухого корма для грызунов. В четвертый день - кормят смесью, содержащей по 10 г манной крупы и 2,5 мг порошка препарата «Амоксициллин». Изобретение обеспечивает неинвазивный способ моделирования вагинита. 2 пр.

Способ моделирования вагинита, включающий воздействие на экспериментальное животное - самку крысы линии Wistar, отличающийся тем, что используют неполовозрелое экспериментальное животное, которому в первый день эксперимента поверхность брюшной стенки очищают от шерстного покрова, после чего на нее равномерно однократно наносят 5,0 г препарата «Эстрожель»; при этом крысу кормят два раза в день, утром и вечером: первые три дня эксперимента по 15 г сухого корма для грызунов, в четвертый день - смесью, содержащей по 10 г манной крупы и 2,5 мг порошка препарата «Амоксициллин».