ЛЕЧЕБНО-ПРОФИЛАКТИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫМ И СПЕРМИЦИДНЫМ ДЕЙСТВИЕМ Российский патент 2008 года по МПК A61K9/20 A61K31/155 A61P31/02 

Изобретение относится к медицине и фармацевтической промышленности, в частности к созданию нового лечебно-профилактического средства, обладающего антибактериальным и спермицидным действием, которое может быть использовано в гинекологии.

В настоящее время распространение гинекологических заболеваний и заболеваний, передающихся половым путем (ЗППП), имеет тенденцию к увеличению и приобретает все возрастающую социальную значимость.

Для лечения и профилактики гинекологических заболеваний широко используются лекарственные средства, обладающие антибактериальным и антисептическим действием в виде дозированных форм, содержащих хлоргексидин.

Хлоргексидин является одним из наиболее активных антибактериальных и антисептических средств. Он оказывает быстрое и сильное бактерицидное влияние на грамположительные и грамотрицательные бактерии. Также известно, что хлоргексидин обладает спермицидной активностью. Поэтому он может применяться не только в качестве агента, предотвращающего заболевания, передаваемые половым путем (ЗППП), но и в качестве спермицидного средства.

Так, известен женский тампон с пролонгированным лечебно-профилактическим действием, выполненный из адсорбирующего материала и имеющий лечебную оболочку, которая представляет собой композицию из биосовместимых гелеобразующих полимеров и лекарственных препаратов антисептического и антимикробного действия, в частности хлоргексидина (патент РФ №2178312 на «Тампон женский с пролонгированным лечебно-профилактическим действием»).

Данный тампон обеспечивает пролонгированное лечебное и/или профилактическое действие для лечения гинекологических заболеваний и профилактики ЗППП. Однако применение тампона ведет к уменьшению снабжения слизистой влагалища кислородом, что приводит к нарушению естественного баланса влагалищной микрофлоры и, как следствие, развитию вагинозов, а также при содержании в препарате хлоргексидина ˜55% увеличивает риск возникновения побочных эффектов.

Известен химический состав для нанесения на тампон, обладающий спермицидной, бактерицидной и вируцидной активностью, содержащий хлоргексидин и/или оксид полиэтилена и ноноксинол-9 (заявка РСТ №0003682 на «Химическую композицию, обладающую спермицидной, бактерицидной и вируцидной активностью, и препарат для ввода в вагинальный канал»).

Данный состав обладает спермицидной, бактерицидной и вируцидной активностью для внутривагинального применения в качестве контрацептивного, а также предотвращающего передачу ЗППП средства. Однако применение в составе двух действующих веществ антибактериального действия приводит к повреждению клеток слизистой влагалища.

Известна фармакологическая композиция пролонгированного действия для лечения различных воспалительных заболеваний, в частности в дерматовенерологии, выполненная в виде геля или пленки, содержащая хлоргексидин, димексид и стабилизирующий агент (патент РФ №2201219 «Фармакологическая композиция пролонгированного действия»).

Данная фармацевтическая композиция обеспечивает пролонгированное воздействие лекарственного вещества - хлоргексидина - для лечения воспалительных заболеваний различной этиологии. Однако недостатком данной композиции, выполненной в виде геля или пленки, является неудобство применения для лечения воспалительных заболеваний в дерматовенерологии, а также использование димексида ведет к ожогам слизистой влагалища.

Известно вагинальное средство, выполненное в виде суппозитория, содержащее эффективное количество, по меньшей мере, одного антимикробного агента местного применения, выбранного из группы, содержащей, в частности, хлоргексидина глюконат и жизнеспособную колонию микрокапсулированных молочнокислых бактерий (патент РФ №2147431 на «Вироцидный, бактерицидный и сперматоцидный суппозиторий»).

Данный вагинальный суппозиторий высокоэффективен для предотвращения заражения практически всеми заболеваниями, передающимися половым путем, и одновременно является противозачаточным средством, а также делает его пользователей невосприимчивыми к дрожжевым инфекциям. Однако известно, что совместное применение антибактериальных агентов и бактерий нежелательно, а также содержание хлоргексидина в количестве от 10 до 2000 мг на суппозиторий увеличивает риск возникновения побочных эффектов.

Наиболее близким к заявляемому средству, по совокупности существенных признаков, является лечебно-профилактическое средство «Гексикон», обладающее антибактериальным и антисептическим действием (патент РФ №2166314 на «Лечебно-профилактическое средство «Гексикон», обладающее антибактериальным и антисептическим действием).

Известное средство, выполненное в виде суппозитория для интравагинального введения, содержащее хлоргексидина биглюконат и гидрофильную основу, широко применяется для лечения таких заболеваний, как сифилис, гонорея и трихомоназ.

Однако недостатком данного суппозитория является то, что при применении суппозитория эффект достигается не в полном объеме за счет снижения биодоступности хлоргексидина, обусловленного тем, что вагинальные инфекции связаны с обильными влагалищными выделениями, которые приводят к снижению высвобождения хлоргексидина из данной основы.

В то же время применение данного средства приводит и к угнетению роста нормальной микрофлоры влагалища, что повышает риск развития вагинального дисбактериоза. Из практики также известно, что при применении данного средства иногда наблюдается негативное влияние основы на слизистую влагалища, которое проявляется в виде ожога.

Кроме того, вытекание основы суппозитория создает у потребителей чувство дискомфорта.

Задачей изобретения является создание лечебно-профилактического средства, выполненного в твердой дозированной форме - в виде таблетки для интравагинального применения, содержащего хлоргексидин или его соль, обладающего высоким терапевтическим эффектом за счет повышения биологической доступности, с хорошими потребительскими свойствами и способностью стимулировать рост нормальной микрофлоры, а кроме того, расширяющего арсенал средств с хлоргексидином для интравагинального введения, обладающих антибактериальным и спермицидным действием.

Поставленная задача достигается предлагаемым средством, обладающим антибактериальным и спермицидным действием, содержащим хлоргексидин или его соль и основу, выполненным в дозированной форме для интравагинального введения, согласно изобретению, средство выполнено в виде таблетки, основа которой в качестве главной составляющей содержит лактозу, а также другие фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Хлоргексидин или соль1,0-4,0Основа: Лактоза60,0-95,0Другие фармацевтически приемлемыедо 100вспомогательные вещества 

Предпочтительно, что в качестве соли хлоргексидина используют биглюконат или ацетат, или дигидрохлорид.

Предпочтительно, что средство дополнительно может содержать регенерирующее вещество, выбранное из декспантенола, метилурацила, масла облепихового в количестве 0,5-10 мас.%.

Технический результат предлагаемого состава заключается в создании лечебно-профилактического средства в виде таблетки, позволяющей

- повысить эффективность за счет повышения биодоступности хлоргексидина;

- стимулировать после применения средства рост нормальной микрофлоры;

- улучшить потребительские свойства.

То, что предлагаемое средство с хлоргексидином обладает высокой терапевтической эффективностью и хорошими потребительскими свойствами, обусловлено тем, что средство выполнено в виде дозированной формы для интравагинального введения - в виде таблетки, содержащей лактозу в качестве главной составляющей основы, которая способствует полному высвобождению хлоргексидина из основы, что позволяет повысить его биодоступность и, как следствие, повысить его антибактериальное и спермицидное действие. Полное высвобождение хлоргексидина из основы обусловлено введением лактозы в качестве главного составляющего компонента основы (при ее содержании 60,0-95,0 мас.%) и позволяет равномерно распределить хлоргексидин по таблеточной массе (см. таблицу 1), что приводит к равномерному распределению хлоргексидина в слизистой влагалища.

Кроме того, лактоза стимулирует рост нормальной микрофлоры влагалища, что приводит к уменьшению риска развития дисбактериоза влагалища на фоне использования предлагаемого средства.

То, что предлагаемое средство выполнено в виде таблетки, приводит к отсутствию вытекания основы и, как следствие, отсутствию чувства дискомфорта.

Дополнительное введение в состав регенерирующих веществ, способных стимулировать восстановление тканей, поврежденных в результате развития инфекции, приводит к быстрому восстановлению клеток слизистой влагалища и снижает риск вторичного инфицирования, что нивелирует негативное действие хлоргексидина на слизистую влагалища.

Таблица 1
Равномерность распределения хлоргексидина по таблеточной массе№ серииСодержание хлоргексидинаСреднее отклонение от номиналаminmaxminmax49060695,0 (1,9)99,6 (2,7)2,12,650060693,6 (2,6)98,9 (2,7)51060699,7 (2,4)104,2 (2,0)52060695,3(1,6)99,7 (2,9)

Таким образом, предлагаемое средство является эффективным как при лечении бактериального воспаления, так и при его использовании как спермицидного препарата, при минимальном риске развития вагинального дисбактериоза. Кроме того, предлагаемое средство обладает улучшенными потребительскими свойствами.

Содержание компонентов в предлагаемом средстве установлено экспериментально.

Содержание хлоргексидина или его солей менее 1 мас.% не обеспечивает требуемого антибактериального и спермицидного действия.

Содержание хлоргексидина или его соли более 4 мас.% увеличивает риск возникновения побочных эффектов.

Содержание лактозы менее 60,0 мас.% не обеспечивает равномерного распределения хлоргексидина, а значит достижения максимального уровня биодоступности хлоргексидина, а также не обеспечивает достаточной стимуляции роста нормальной микрофлоры влагалища.

Содержание лактозы более 95,0 мас.% не позволяет получить таблетку с соответствующими к таблеткам требованиями.

В качестве других фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ используют антифрикционное вещество или смесь антифрикционных веществ, наполнители, связующие, дезинтеграторы, буферные агенты, позволяющие получить таблетку.

В качестве антифрикционного вещества предлагаемое средство может содержать, в частности, стеариновую кислоту или ее соли, тальк, аэросил.

В качестве солей стеариновой кислоты предлагаемое средство может содержать, в частности, магниевую и/или кальциевую соли.

В качестве наполнителя предлагаемое средство может содержать, в частности крахмал, микрокристаллическую целлюлозу (МКЦ), магния карбонат.

В качестве связующего предлагаемое средство может содержать, в частности, поливинилпирролидон, оксипропилметилцеллюлозу, желатин, натрия альгинат.

В качестве дезинтегратора средство может содержать, в частности, твин-80, кросповидон.

В качестве буферного агента средство может содержать, в частности, кислоту адипиновую или молочную.

Способ получения предлагаемого средства.

Расчетное количество раствора хлоргексидина или его соли, лактозы и других фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ смешивают. Полученную массу высушивают, калибруют, после чего опудривают антифрикционным веществом или смесью антифрикционных веществ, или смесью антифрикционного вещества и наполнителя, затем таблетируют.

Ниже приведены примеры изготовления предлагаемого средства в виде вагинальных таблеток.

Пример 1.

В раствор, содержащий 10,0 г хлоргексидина (в пересчете на сухое вещество), вводят 30,0 г метилцеллюлозы. В полученную смесь добавляют 950,0 г лактозы, массу перемешивают, высушивают, калибруют, опудривают 10,0 г аэросила и таблетируют.

Получают таблеточную массу, имеющую следующий состав, мас.%:

Хлоргексидин - 1,0

Лактоза - 95,0

Аэросил - 1,0

Метилцеллюлоза - 3,0

Пример 2.

В раствор, содержащий 40,0 г хлоргексидина (в пересчете на сухое вещество), вводят 9,0 г молочной кислоты. В полученную смесь добавляют 950,0 г лактозы, массу перемешивают, высушивают, калибруют, опудривают 1,0 г стеариновой кислоты и таблетируют.

Получают таблеточную массу, имеющую следующий состав, мас.%:

Хлоргексидин - 4,0

Молочная кислота - 0,9

Лактоза - 95,0

Стеариновая кислота - 0,1

Пример 3.

В раствор, содержащий 10,0 г хлоргексидина (в пересчете на сухое вещество), вводят 50,0 г поливинилпирролидона, 30,0 г твина-80, 20,0 г кислоты молочной. В полученную смесь добавляют 600,0 г лактозы и 289,1 г крахмала, массу перемешивают, высушивают, калибруют, опудривают 0,9 г кальция стеарата и таблетируют.

Получают таблеточную массу, имеющую следующий состав, мас.%:

Хлоргексидин - 1,0

Лактоза - 60,0

Кальция стеарат - 0,09

Поливинилпирролидон - 5,0

Твин-80 - 3,0

Кислота молочная - 2,0

Крахмал - до 100

Пример 4.

В раствор, содержащий 40,0 г хлоргексидина (в пересчете на сухое вещество), вводят 20,0 г желатина. В полученную смесь добавляют 20,0 г кросповидона, 309,1 г МКЦ и 600,0 г лактозы, массу перемешивают, высушивают, калибруют, опудривают 0,9 г талька и 10,0 г кислоты адипиновой, таблетируют.

Получают таблеточную массу, имеющую следующий состав, мас.%:

Хлоргексидин - 4,0

Лактоза - 60,0

Тальк - 0,09

Желатин - 2,0

Кросповидон - 2,0

Кислота адипиновая - 1,0

МКЦ - до 100

Примеры 5-8.

Проводят аналогично примерам №1-4, но в качестве действующего вещества используют хлоргексидина биглюконат.

Примеры 9-12.

Проведены аналогично примерам №1-4, но в качестве действующего вещества используют хлоргексидина ацетат.

Примеры 13-16.

Проведены аналогично примерам №1-4, но в качестве действующего вещества используют хлоргексидина дигидрохлорид.

Пример 17.

В раствор, содержащий 10,0 г хлоргексидина (в пересчете на сухое вещество), вводят 5,0 г декспантенола, 10,0 г натрия альгината, 10,0 г твина-80. В полученную смесь добавляют 14,1 г крахмала и 950,0 г лактозы, массу перемешивают, высушивают, калибруют, опудривают 0,9 г магния стеарата и таблетируют.

Получают таблеточную массу, имеющую следующий состав, мас.%:

Хлоргексидин - 1,0

Декспантенол - 0,5

Лактоза - 95,0

Магния стеарат - 0,09

Натрия альгинат - 1,0

Твин-80 - 1,0

Крахмал - до 100

Пример 18.

В раствор, содержащий 40,0 г хлоргексидина (в пересчете на сухое вещество), вводят 5,0 г декспантенола. В полученную смесь добавляют 4,1 г МКЦ и 950,0 г лактозы, массу перемешивают, высушивают, калибруют, опудривают 0,9 г стеариновой кислоты и таблетируют.

Получают таблеточную массу, имеющую следующий состав, мас.%:

Хлоргексидин - 4,0

Декспантенол - 0,5

Лактоза - 95,0

Стеариновая кислота - 0,09

МКЦ - до 100

Пример 19.

В раствор, содержащий 10,0 г хлоргексидина (в пересчете на сухое вещество), вводят 10,0 г желатина и 5,0 г декспантенола. В полученную смесь добавляют 5,0 г кросповидона, 349,0 г МКЦ и 600,0 г лактозы, массу перемешивают, высушивают, калибруют, опудривают 20,0 г кислоты адипиновой и 1,0 г смеси стеарата магния и стеарата кальция (в соотношении 1:1) и таблетируют.

Получают таблеточную массу, имеющую следующий состав, мас.%:

Хлоргексидин - 1,0

Декспантенол - 0,5

Лактоза - 60,0

Стеарат магния/стеарат кальция - 0,1

Желатин - 1,0

Кросповидон - 0,5

Кислота адипиновая - 2,0

МКЦ - до 100

Пример 20.

В раствор, содержащий 40,0 г хлоргексидина (в пересчете на сухое вещество), вводят 50,0 г поливинилпирролидона, 15,0 г твина-80, 5,0 г декспантенола. В полученную смесь добавляют 600,0 г лактозы и 265,0 г магния карбоната, массу перемешивают, высушивают, калибруют, опудривают 10,0 г аэросила и 15,0 г кислоты адипиновой, таблетируют.

Получают таблеточную массу, имеющую следующий состав, мас.%:

Хлоргексидин - 4,0

Декспантенол - 0,5

Лактоза - 60,0

Аэросил - 1,0

Поливинилпирролидон - 5,0

Твин-80 - 1,5

Кислота адипиновая - 1,5

Магния карбонат - до 100

Пример 21.

В раствор, содержащий 10,0 г хлоргексидина (в пересчете на сухое вещество), вводят 100,0 г декспантенола. В полученную смесь добавляют 880,0 г лактозы, массу перемешивают, высушивают, калибруют, опудривают 10,0 г талька и таблетируют.

Получают таблеточную массу, имеющую следующий состав, мас.%:

Хлоргексидин - 1,0

Декспантенол - 10,0

Лактоза - 88,0

Тальк - 1,0

Пример 22.

В раствор, содержащий 40,0 г хлоргексидина (в пересчете на сухое вещество), вводят 100,0 г декспантенола. В полученную смесь добавляют 850,0 г лактозы, массу перемешивают, высушивают, калибруют, опудривают 10,0 г стеарата кальция и таблетируют.

Получают таблеточную массу, имеющую следующий состав, мас.%:

Хлоргексидин - 4,0

Декспантенол - 10,0

Лактоза - 85,0

Кальция стеарат - 1,0

Примеры 23.

В раствор, содержащий 10,0 г хлоргексидина (в пересчете на сухое вещество), вводят 100,0 г декспантенола, 10,0 г поливинилпирролидона, 5,0 г твина-80, 10,0 г кислоты молочной. В полученную смесь добавляют 600,0 г лактозы и 264,0 г крахмала, массу перемешивают, высушивают, калибруют, опудривают 1,0 г стеарата магния и таблетируют.

Получают таблеточную массу, имеющую следующий состав, мас.%:

Хлоргексидин - 1,0

Декспантенол - 10,0

Лактоза - 60,0

Стеарат магния - 0,1

Поливинилпирролидон - 1,0

Твин-80 - 0,5

Кислота молочная - 1,0

Крахмал - до 100

Пример 24.

В раствор, содержащий 40,0 г хлоргексидина (в пересчете на сухое вещество), вводят 100,0 г декспантенола, 40,0 г оксипропилметилцеллюлозы и 30,0 г твина-80. В полученную смесь добавляют 600,0 г лактозы и 184,0 г МКЦ, массу перемешивают, высушивают, калибруют, опудривают 5,0 г кислоты адипиновой и 1,0 г смеси стеарата кальция и стеарата магния (в соотношении 1:1), таблетируют.

Получают таблеточную массу, имеющую следующий состав, мас.%:

Хлоргексидин - 4,0

Декспантенол - 10,0

Лактоза - 60,0

Стеарат кальция/стеарат магния - 0,1

Оксипропилметилцеллюлоза - 4,0

Твин-80 - 3,0

Кислота адипиновая - 0,5

МКЦ - до 100

Примеры 25-28.

Проведены аналогично примерам №17-20, но в качестве регенерирующего вещества используют метилурацил.

Примеры 29-32.

Проведены аналогично примерам №17-20, но в качестве регенерирующего вещества используют масло облепиховое.

Пример 33-36.

Проведены аналогично примерам №21-24, но в качестве регенерирующего вещества используют метилурацил.

Примеры 37-40.

Проведены аналогично примерам №21-24, но в качестве регенерирующего вещества используют масло облепиховое.

Количественное определение хлоргексидина или его соли в таблетках осуществляют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на жидкостном хроматографе фирмы Waters (или аналогичном) со спектрофотометрическим детектором.

Испытание на микробиологическую чистоту таблеток проводят в соответствии с требованиями ГФ XI, вып.2, с.193, и Изменениями №3 (категория 2). Полученные результаты соответствуют нормативным требованиям.

Полученные таблетки по внешнему виду соответствуют требованиям ГФ XI, вып.2, с.154.

Ниже приведены результаты доклинических исследований предлагаемого средства, состоящие из двух частей.

С целью определения общетоксического действия и доказательства эффективности предлагаемого средства и его спермицидной активности были проведены его доклинические испытания на базе центральной научно-исследовательской лаборатории Нижегородской государственной медицинской академии.

Результаты экспериментов были обработаны на IBM PC/AT с помощью пакетов прикладных программ Statistica 5.5. Для всех количественных данных вычисляли групповое среднее арифметическое (М) и среднеквадратичное отклонение (SD), парные внутригрупповые и межгрупповые сравнения средних определяли по критериям Уилкоксона. Различия считали достоверными при уровне значимости р<0,05.

1. В данной части отчета представлены результаты по доклиническому исследованию предлагаемого средства на основе хлоргексидина, таблетки вагинальные, разработанные ОАО «Нижфарм» (Россия), по параметрам бактерицидного действия, гистологии слизистой влагалища, рН вагинальной слизи при моделировании бактериального вагинита у крыс. Содержание компонентов представлено в таблице 2.

Таблица 2
Состав предлагаемого средства (содержание на одну таблетку)КомпонентыВарианты составов (мас.%)123Хлоргексидин2,92,90Твин 800,500,500,50Декспантенол0100ПВП222МКЦ555Стеарат кальция111Молочная кислота010Лактозадо 100до 100до 100

Токсикологические исследования проводили в соответствии с методическими рекомендациями «Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ», 2000.

В экспериментах было использовано 70 половозрелых крыс самок Wistar массой 220±3,2 г.

Животных распределяли по группам случайным образом, используя в качестве критерия массу тела, так, чтобы индивидуальная масса животных не отличалась более чем на 20% от средней массы животных одного пола.

Каждому животному был присвоен индивидуальный номер, в соответствии с которым животному ставилась метка либо проколом ушной раковины, либо окраской красителями (эозин и метиленовый синий) поверхности хвоста по разработанным схемам. На этикетке клетки определенного цвета указывали группу, номер животного, метку, код исследования, руководителя.

Основные правила содержания и ухода соответствовали нормативам, данным в руководстве Guide for care and use of laboratory animals. ILAR publication, 1996, National Academy Press. Все процедуры по рутинному уходу за животными выполняли в соответствии с СОП лаборатории.

Животных содержали в поликарбонатных клетках по 5-7 животных на клетку на подстиле. Клетки оборудованы стальными решетчатыми крышками с кормовым углублением.

В качестве подстилки использовались опилки деревьев нехвойных пород.

Комбикорм полнорационный для лабораторных животных давался ad libitum в кормовое углубление крышки клетки.

Профильтрованная водопроводная вода давалась в стандартных автоклавированных питьевых бутылочках.

Не было контаминации подстилки, корма и воды, способной повлиять на результаты исследования. В лаборатории проводится периодический анализ воды, подстилки и корма на микробиологическую контаминацию.

Для оценки эффективности изучено действие предлагаемого средства при интравагинальном применении.

Расчет доз исходил из учета массы и поверхности тела животных, рекомендации заказчика по применению препарата.

Расчетная суточная доза хлоргексидина для человека составила 0,46 мг/кг, с использованием коэффициента для площади поверхности тела для крыс 2,6 мг/кг. На крысу массой 200 г - 0,54 мг/сутки, учитывая 2-разовое применение (см. таблицу 3).

Предлагаемое средство применялось 2 раза в сутки в течение 10 дней. Использовались таблетки массой 0,1 г, содержание хлоргексидина в которой составило 2,6 мг. Для разового введения таблетку делили на части и инвагинально вводили часть таблетки.

Для человека: max ТД=0,46 мг/кг (две таблетки)/сут. Для крыс при пересчете доз с учетом поверхности тела: max ТД=0,46 мг/кг×39/7=2,6 мг/кг.

Таблица 3
Коэффициенты пересчета доз (в мг/кг на мг/м²) для крысы и человека в зависимости от веса тела (Freireich E.J., 1966; Уланова И.П. с соавт., 1968)Вид животногоВес тела (кг)Коэффициент пересчетаКрыса0,2006,5Человек7039

Животным группы плацебо интравагинально вводились аналогичные по размеру частички таблетки, состоящие из основы таблеток.

Специфическое фармакологическое действие препарата изучено при моделировании бактериального вагинита.

Для испытания предлагаемого средства использовали типовые штаммы Staphylococcus aureus штамм 7М (ННИЭМ, Н.Новгород), и клинический изолят Esherichia coli штамм 782-2. Для выращивания стафилококков и кишечной палочки мясо-пептонный агар (МПА).

Суспензию микроорганизмов, содержащую 10⁷ микробных тел в 1 мл (начальная концентрация) готовили путем смыва забуференным физиологическим раствором (рН 7,2-7,4) 18-часовой агаровой культуры. Стандартизация микробной взвеси проводиласть по стандарту мутности Государственного контрольного института медицинских биологических прпаратов имени Л.А.Тарасовича для бактерий и спектрофотометрически - для кандид.

Крыс инфицировали интравагинально введением по 0,025 мл S. aureus и 0,025 мл Е. coli. Через сутки после инфицирования начинали введение предлагаемого средства в течение 10 суток.

Через 10 дней после применения предлагаемого средства делали высевы из вагинальной полости для обнаружения Staphylococcus aureus, Esherichia coli. Для чего стерильным тампоном отбирали материал из вагинальной полости, помещали в 1 мл стерильного физиологического раствора и тщательно ресуспендировали, разводили 1 к 10 в стерильном физиологическом растворе. Полученную суспензию (0,1 мл) помещали на селективные плотные среды для обнаружения соответствующих микроорганизмов. Для культивирования стафилококков использовали желточно-солевой агар (ЖСА), для культивирования кишечной палочки - среду Эндо. Материал на чашках Петри растирали шпателем, инкубировали в термостате (37°С, 24-48 ч).

Подсчитывали количество характерных для данных микроорганизмов колониеобразующих единиц (КОЕ) на чашках Петри с селективными средами. Все посевы проводили в 2-повторах.

Через 15 мин после применения предлагаемого средства, а также через 6 и 12 часов проводили исследование рН интравагинальной слизи. Подобный режим измерения вызван 2-кратным введением предлагаемого средства в сутки.

Перед экспериментом крыс самок отбирали с одинаковым по времени эстральным циклом по тесту «цитология влагалищного мазка» таким образом, чтобы крысы до инфицирования и в период забора гистологических анализов находились на стадии проэструс. В течение эксперимента ежедневно брали влагалищный мазок для цитологических исследований. На 10-е сутки эксперимента забирали образцы слизистой влагалища для гистологического исследования. Экспериментальный материал фиксировали в 10% нейтральном формалине, обезвоживали в спиртах восходящей концентрации и заливали в парафин. Парафиновые срезы толщиной 5-7 мкм получали на микротоме Leica SM 2000R, окрашивали гематоксилином и эозином и рассматривали с помощью микроскопа Leica DMLS. Видеоизображения получали на видеосистеме с помощью CCD-камеры.

Бактерицидная активность предлагаемого средства. В течение всего периода наблюдений септических явлений не обнаружено, масса животных достоверно не снижалась. У ряда крыс разных групп наблюдались влагалищные выделения. За весь период наблюдения животные оставались подвижными, внешне выглядели здоровыми. Данные клинического осмотра свидетельствуют об отсутствии генерализованной системной реакции организма при интравагинальном инфицировании.

После лечения наблюдали снижение количества КОЕ в некоторых группах (см. таблицы 4, 5).

Таблица 4
Сравнительное количество S. aureus штамм 7М в вагинальной полости крыс после интравагинального применения различных вариантов состава предлагаемого средства (М±SD)Группы животных (серии препаратов)Количество S. aureus штамм 7М (KOE, M±SD) Нативный материалРазведение 1:50Предлагаемое средство, вариант №169,7±21,9*5,8±2,4*Предлагаемое средство, вариант №216,5±7,8*0,2±0,1*Предлагаемое средство, вариант №3 (плацебо)302,5±85,675,3±14,2Контроль (вагинит без лечения)314,2±94,373,8±12,4* Достоверное снижение относительно контроля (плацебо) (р<0,05)Таблица 5
Сравнительное количество Е. coli штамм 782-2 (КОЕ) в вагинальной полости крыс после интравагинального применения различных вариантов состава предлагаемого средства (M±SD)Группы животных (серии препаратов)Количество Е. coli штамм 782-2Нативный материалРазведение 1:50Предлагаемое средство, вариант №18,3±4,5*1,2±0,9*Предлагаемое средство, вариант №23,5±1,2*0,2±0,1*Предлагаемое средство, вариант №3 (плацебо)333,3±94,170,2±34,9Контроль (вагинит без лечения)345,6±83,595,2±28,5* Достоверное снижение относительно контроля (плацебо) (р<0,05)

Наблюдали снижение количества КОЕ как S. aureus, так и Е. coli в группах вариант состава №1 и №2 по сравнению с группой плацебо. Наиболее выраженное снижение микробной обсемененности было отмечено в группе с применением серии №2 (табл.4, 5).

Таким образом, наблюдалось достоверное снижение количества Staphylococcus aureus и Esherichia coli наблюдали только в группах с применением предлагаемого средства вариант №1 и вариант №2. При этом наиболее выраженный бактерицидный эффект характерен для группы «вариант №2».

Влияние предлагаемого средства на реакцию среды вагинальной слизи. Данные по измерению рН вагинальной слизи представлены в таблице 6.

Таблица 6
Изменение рН среды после интравагинального применения предлагаемого средства (M±SD)Группы животных (серии препаратов)pHДоЧерез 15 минЧерез 6 часовЧерез 12 часовПредлагаемое средство, вариант №17,00±0,25,5±0,22*6,00±0,307,0±0,28Предлагаемое средство, вариант №27,20±0,228,5±0,22*8,2±0,207,5±0,26Предлагаемое средство, вариант №3 (плацебо)7,20±0,206,0±0,30*7,0±0,247,5±0,28Контроль (вагинит без лечения)7,00±0,207,0±0,287,2±0,207,0±0,28* Достоверное снижение относительно контроля (плацебо) (р<0,05)

Следует отметить, что в норме рН влагалищной слизи у крыс колеблется в пределах 7,0-7,2. В течение всего периода лечения и в контроле не было выявлено значимых отличий.

Влияние препаратов на структуру слизистой влагалища. В контрольной серии экспериментов и плацебо на 10-е сутки отмечался выраженный воспалительный инфильтрат, распределяющийся диффузно в собственной пластинке слизистой оболочки, что проиллюстрировано фиг.1. В толще эпителиального пласта наблюдались скопления лейкоцитов.

На фиг.1 изображена структура влагалища в стадии проэструс на 11 сутки моделирования бактериального вагинита в контрольной серии без применения предлагаемого средства (окрашивание гематоксилином и эозином; увеличение ×200).

При лечении животных предлагаемым средством, вариант №1 и вариант №2, не отмечалось каких-либо патологических изменений в структуре влагалища: слизистая оболочка покрыта многослойным плоским эпителием кожного типа, в котором различаются три слоя - базальный, промежуточный и поверхностный. Основу собственной пластинки слизистой оболочки составляет рыхлая неоформленная соединительная ткань. Подслизистая основа во влагалище не выражена, и собственная пластинка слизистой непосредственно переходит в мышечную оболочку, которая в основном состоит из продольно идущих пучков гладких мышечных клеток, что проиллюстрировано фиг.2. Определяются кровеносные сосуды, имеющие открытый просвет.

На фиг.2 изображена структура влагалища в стадии проэструс при лечении животных предлагаемым средством: а - вариант №1 - отсутствие структурных нарушений в слизистой оболочке; б - вариант №2 - отсутствие воспалительных проявлений в структуре слизистой оболочки (окрашивание гематоксилином и эозином; увеличение ×200).

Таким образом, при гистологическом исследовании влагалища выявлена нормализация структуры при лечении животных предлагаемым средством, варианты №1 и №2.

Заключение. По степени выраженности бактерицидного действия варианты составов предлагаемого средства по сравнению с контролем располагались в следующем порядке: №2-1-3.

На доклиническое изучение разработчиком предоставлены различные варианты предлагаемого средства на основе хлоргексидина в виде вагинальных таблеток, разработанных ОАО «Нижфарм», Россия.

Данное исследование было проведено с целью изучения специфического фармакологического действия препаратов при интравагинальном применении.

Тестируемое вещество (как лекарственное средство) применяли в эквитерапевтической дозе. В качестве контрольного вещества применяли основу таблетки.

Эффективность препаратов оценивали по параметрам бактерицидного действия, гистологии слизистой влагалища, рН вагинальной слизи при моделировании бактериального вагинита у крыс.

Показано, что достоверное снижение количества Staphylococcus aureus и Esherichia coli наблюдали в группах с предлагаемым средством, варианты №1 и №2. При этом наиболее выраженный бактерицидный эффект характерен для варианта №2.

При гистологическом исследовании влагалища выявлена нормализация структуры при лечении животных предлагаемым средством, варианты №1 и №2.

По степени выраженности бактерицидного действия предлагаемого средства по сравнению с контролем варианты располагались в следующем порядке: №2-1-3.

В данной части отчета представлены данные по доклиническому исследованию таблеток вагинальных, разработанных ОАО «Нижфарм» (Россия), по параметрам спермицидной активности предлагаемого средства. Содержание компонентов представлено в таблице 2.

В исследовании использовался эякулят здоровых мужчин возраста 18-20 лет.

Процедура введения вещества. Для оценки эффективности изучено действие исследуемого средства in vitro в эякуляте.

Доза применения предлагаемого средства в тестовой системе составляла - 1 таблетка на порцию эякулята донора (3,5 мл).

Изучение спермицидного действия in vitro. Методика получения и оценки эякулята. Эякулят для анализа получали после 4 дней воздержания, отказа от курения и алкоголя от молодых мужчин в возрасте 19-20 лет. Перед взятием эякулята каждым обследуемым заполнялась форма информированного согласия.

Эякулят собирали в чистую стеклянную градуированную емкость с широким горлышком в специальном помещении лаборатории непосредственно перед анализом. На контейнере указывают фамилию донора, дату и время получения эякулята. Эякулят представляет собой взвесь сперматозоидов в секрете яичек и их придатков, которая к моменту эякуляции смешивается с секретом предстательной железы, семенных пузырьков и луковично-уретальных желез. В целом эякулят представляет собой вязкую жидкость.

При работе с эякулятом в лаборатории соблюдались правила безопасности, общепринятые в лабораторной практике (ВОЗ, 1983).

Первоначальная макроскопическая оценка эякулята. Оценка эякулята осуществлялась сразу после разжижения. В норме при комнатной температуре образец эякулята разжижается в течение 15-30 минут.

Образец был перемещен в том же контейнере, в котором он был получен. Так как оценку подвижности сперматозоидов проводили при температуре 37°С, то во время разжижения и помешивания образец постепенно доводили до этой температуры.

Объем эякулята измеряли с помощью градуированной конической пробирки.

Приготовление препарата для рутинной спермограммы. Объем наносимого на предметное стекло эякулята и размеры покровного стекла были стандартными. Фиксированный объем эякулята наносили на чистое предметное стекло и накрывали покровным стеклом (22×22 мм), следя за тем, чтобы между стеклами не было пузырьков воздуха.

Свежеприготовленный препарат оставляли приблизительно на одну минуту для стабилизации. Оценку подвижности сперматозоидов проводили при температуре 37°С на предметном столике с подогревом, так как температура сильно влияет на подвижность и скорость движения сперматозоидов.

Препарат исследовали под микроскопом сначала при 100-кратном совокупном увеличении, при этом получали общее представление о формировании нитей слизи, агрегации и равномерности распределения сперматозоидов на стекле. Затем препарат исследовали при 400-кратном совокупном увеличении.

Оценку концентрации сперматозоидов проводили с помощью гемоцитометра при разведении эякулята 1:20. Концентрацию сперматозоидов выражали в 1·10⁶/мл.

Оценку подвижности сперматозоидов осуществляли после последовательного просмотра 200 сперматозоидов не менее чем в 5 полях зрения микроскопа. Подвижность каждого сперматозоида классифицируют по категориям (а), (b) и (с), используя следующие критерии:

a) быстрое поступательное движение (т.е. ≥25 μм/сек при 37°С, 25 μм приблизительно соответствует длине 5 головок или половине длины хвоста сперматозоида);

b) колебательное (медленное и вялопоступательное движение) и непоступательное движение;

c) неподвижные сперматозоиды.

Вторичная макроскопическая оценка эякулята. Окрашивание препарата для оценки жизнеспособности сперматозоидов. Под жизнеспособностью подразумевали долю (в процентах) «живых» сперматозоидов, которые определялись либо по исключению красителя, либо по гипоосмотическому набуханию. Пропорцию живых и мертвых сперматозоидов определяли с помощью методов окрашивания препарата, основанных на принципе поглощения мертвыми клетками с поврежденными плазматическими мембранами определенных красителей. В световом микроскопе производили подсчет 200 сперматозоидов, дифференцируя живые (неокрашенные) и мертвые (окрашенные) сперматозоиды.

Оценка морфологии сперматозоидов. Приготовление мазка. Приготавливали не менее двух мазков из образца свежего эякулята для двукратной оценки и на случай проблем при окрашивании. На поверхность чистого обезжиренного сухого стекла наносили небольшую каплю эякулята. При концентрации сперматозоидов более 20×10⁶ мл достаточно 5 μм эякулята. Для приготовления мазков для неразведенного эякулята использовали метод «размазывания стеклом».

Метод окрашивания. Препараты окрашивали по Папаниколау. Головка сперматозоида в акросомальной области окрашивалась в бледно-синий, а в постакросомной - в темно-синий цвет. Средняя часть сперматозоида окрашивалась в красный цвет. Хвост также окрашивался в синий или красноватый оттенки.

Морфологическая классификация сперматозоидов. Размеры головок сперматозоидов в окрашенных препаратах слегка меньше, чем размеры головок живых сперматозоидов в эякуляте, однако их форма существенно не меняется. Для определения понятия морфологической «нормы» сперматозоида применяли строгие критерии.

Сперматозоид рассматривали, как нормальный, если его головка, шейка, средняя часть и хвост являлись нормальными, т.е. морфологическое описание соответствовало следующим критериям:

1. Головка сперматозоида овальной формы, длина головки сперматозоида 4,0-5,5 μм, ширина 2,5-3,5 μм, отношение длины к ширине от 1,50 до 1,75. Длину и ширину сперматозоидов измеряли при помощи окуляр-микрометра.

2. Хорошо очерченная акросомная область, составляющая 40-70% площади головки.

3. Средняя часть (шейка) тонкая, менее 1 μм в ширину, составляет 1,5 длины головки и прикрепляется к головке вдоль ее оси.

4. Хвост сперматозоида прямой, одинаковой толщины на всем протяжении, меньше по ширине средней части, не закрученный, длинной около 45 μм.

Сперматозоид рассматривали как патологический, если его головка, шейка, средняя часть и хвост имели нарушения:

1. Дефекты головки, а именно большие, маленькие, конические, грушевидные, круглые и аморфные головки, головки с вакуолями (>20% площади головки заполнена неокрашенными вакуолями), головки с маленькой акросомной областью (<40% площади головки) и с двойными головками или любая их комбинация.

2. Дефекты шейки и средней части, а именно «склоненная» шейка (шейка и хвост образуют угол более 90° к длинной оси головки), асимметричное прикрепление средней части к головке, утолщенная или неравномерная средняя часть, патологически тонкая средняя часть или любая их комбинация. Если головки подвергались абсорбции, в эякуляте обнаруживались только отдельные хвосты или так называемые «булавочные головки». «Булавочные головки» не учитывали при подсчете как дефект головки, а подсчитывались как дефект шейки и средней части.

3. Дефекты хвоста: короткие, множественные, в виде шпильки, сломанные, наклонные (угол больше 90°), хвосты неравномерной толщины, закрученные или любая их комбинация.

Порядок подсчета сперматозоидов при оценке их морфологии. При исследовании окрашенных препаратов под микроскопом с иммерсией использовали объектив с увеличением ×100 с ярко освещенным полем зрения и окуляр с увеличением не менее ×10.

Морфологическую оценку проводили в нескольких последовательно выбранных участках мазка. По мере того как препарат систематически просматривали от одного поля зрения к другому, производили оценку и подсчет всех нормальных сперматозоидов, а также отмечали все их дефекты. Не учитывали сперматозоиды, наслоившиеся друг на друга, и с головками, лежащими на ребре. Их можно было оценить при изменении фокуса микроскопа. Нормативы представлены в таблице 7.

Таблица 7
Нормативные значения показателей эякулятаПоказатели эякулятаНормативные значенияОбъем≥2,0 млКонцентрация сперматозоидов≥20·10⁶/млПодвижность≥50% подвижных или ≥25% с поступательным движением в течение 60 мин после эякуляцииМорфология<15% морфологически нормальных сперматозоидов ассоциируется со снижением частоты оплодотворения in vitroЖизнеспособность≥50% живых, т.е. не окрашенных

Образец бланка анализа эякулятаДата получения эякулятаИсходныйЧерез 30 минЧерез 60 мин1234Продолжительность воздержания   Интервал между эякуляцией и началом анализа (мин)   Объем (мл)   Подвижность   а) быстрое поступательное движение;b) колебательное (медленное и вялопоступательное движение) и непоступательное движение;с) неподвижные сперматозоидыЖизнеспособность (% живых)   Концентрация (10⁶/мл)   Морфология   - нормальные- дефект головки- дефект шейки или средней части- дефект хвоста

После определения параметров эякулята доноров в те же пробирки с эякулятом при температуре 37°С добавляли необходимое количество предлагаемого средства, равное разовой дозе при интравагинальном применении. Для последовательного наблюдения оставляли в термостате на 30 и 60 мин при 37°С.

Экспериментальные группы (в каждой группе n=10):

1. Плацебо (основа таблеток).

2. Предлагаемое средство вариант №1.

3. Предлагаемое средство вариант №2.

Влияние предлагаемых средств на жизнеспособность сперматозоидов в эякуляте здоровых мужчин in vitro. При макроскопическом анализе эякулята здоровых мужчин молодого возраста были получены следующие результаты (см. таблицу 8).

Таблица 8
Данные макроскопической оценки эякулята здоровых молодых мужчин-доноров, n=30 (M±SD)Объем (мл)Концентрация (10⁶/мл)Подвижность (%)Жизнеспособность (% живых)аbс3,82±0,53352±14971,5±8,611,2±4,0416,3±8,185±7,1

При сравнении со стандартами (см. таблицу 7) можно сделать заключение, что исследуемые эякуляты соответствуют значениям нормальных показателей при макроскопическом описании.

После добавления предлагаемого средства как подвижность, так и жизнеспособность сперматозоидов значительно снизилась в отличие от групп-плацебо (см. таблицу 9) уже через 30 мин.

Таблица 9
Влияние предлагаемого средства на подвижность и жизнеспособность сперматозоидов в эякуляте здоровых молодых мужчин-доноров (M±SD)ГруппаПодвижность (30 мин) (%)Жизнеспособность (% живых)аbс30 мин60 минПлацебо таблетки45,8±8,215,0±6,739,0±22,474,25±7,8872,5±5,31Предлагаемое средство, вариант №1--1002,0±1,900Предлагаемое средство, вариант №2--1001,25±0,350

Таким образом, макроскопический анализ эякулята после применения предлагаемого средства, в виде таблеток вагинальных было выявлено 1-2% жизнеспособных сперматозоидов через 30 мин, хотя через 60 мин результаты были сравнимы с действием других препаратов - обездвиживание и гибель сперматозоидов.

Результаты морфологического анализа мазков, позволяющего выявить структурные изменения сперматозоидов, после применения предлагаемого средства в течение 30 и 60 мин представлены в таблице 10.

Добавление предлагаемого средства вариант №1 и вариант №2 к порции эякулята in vitro оказывает повреждающее действие на структуру сперматозоидов. Основной точкой приложения являлся хвост сперматозоида, морфология которого наиболее повреждена через 30 и 60 мин после воздействия.

Таблица 10
Влияние предлагаемого средства на морфологию сперматозоидов в эякуляте здоровых молодых мужчин-доноров через 30 и 60 мин после воздействия (M±SD)ГруппаНормаПатологияголовкишейкихвостаИсходные данные (n=30)94,3±2,92,2±1,90,9±0,82,7±1,5Плацебо таблеток (n=10)    30 мин66,25±20,22,5±1,299,5±4,3527,75±17,960 мин62,25±23,02,5±1,2910,0±9,5226,25±20,53Предлагаемое средство вариант №1 (n=10)    30 мин63,5±12,82,5±1,713,0±7,723,0±9,860 мин54,3±8,02,0±1,010,3±4,0434,3±10,5Предлагаемое средство вариант №2 (n=10)    30 мин68±12,82,3±0,576,6±4,0424,7±8,7160 мин52,3±5,032,6±0,578,6±3,738,3±2,08

При сравнении результатов микроскопического анализа с результатами макроскопического анализа можно предположить, что при воздействии препаратов с хлоргексидином обездвиживание и гибель сперматозоидов обусловлена нарушением проницаемости мембраны и метаболизма клетки, но не нарушением ее структурной целостности путем разрыва мембраны.

Заключение. В исследовании изучали эффективность спермицидного действия предлагаемого средства в виде таблеток для интравагинального введения, разработанных ОАО Нижфарм, Россия, in vitro с использованием спермы мужчин-доноров.

Предлагаемое средство применяли в дозе 1 таблетка однократно на порцию спермы человека (3,5 мл). В качестве контрольного вещества применяли основу таблеток.

Показано, что in vitro при применении различных вариантов №1 и №2 предлагаемого средства было выявлено 1-2% жизнеспособных сперматозоидов через 30 мин, хотя через 60 мин наблюдалось полное обездвиживание и гибель сперматозоидов (100%).

При оценке морфологии сперматозоидов в тесте in vitro основным механизмом нарушения их подвижности и гибели при действии предлагаемого средства на основе хлоргексидина явилось нарушение проницаемости мембраны и метаболизма сперматозоидов, но не структурной целостности.

Как показали проведенные исследования, предлагаемое средство в виде вагинальных таблеток является эффективным антибактериальным и спермицидным средством и удобным в применении.

Изобретение относится к медицине и фармацевтической промышленности, в частности к созданию новых лечебно-профилактических средств, обладающих антибактериальным и спермицидным действием, которое может быть использовано в гинекологии. Предлагаемое лечебно-профилактическое средство, обладающее антибактериальным и спермицидным действием, выполнено в виде таблетки для интравагинального введения и содержит хлоргексидин или его соль и основу, которая в качестве главной составляющей содержит лактозу и другие фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества. Средство дополнительно может содержать регенерирующее вещество, в частности декспантенол или метилурацил, или масло облепиховое. Средство в виде вагинальных таблеток обладает более эффективным антибактериальным и спермицидным действием и является более удобным в применении. 2 з.п. ф-лы, 2 ил., 10 табл.

1. Лечебно-профилактическое средство, обладающее антибактериальным и спермицидным действием, в дозированной форме для интравагинального введения, содержащее действующее вещество - хлоргексидин или его соль и основу, отличающееся тем, что оно выполнено в виде таблетки, основа которой в качестве главной составляющей содержит лактозу, а также другие фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, при следующем соотношении, мас.%:

Хлоргексидин или соль1,0-4,0

Основа:

Лактоза60,0-95,0Другие фармацевтически приемлемые вспомогательные веществадо 100