СПОСОБ ПРОГНОЗА ИСХОДА СЕПСИСА С ПОМОЩЬЮ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АБСОЛЮТНОГО КОЛИЧЕСТВА НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ЛОВУШЕК Российский патент 2023 года по МПК G01N33/49 G01N1/30 G06M11/00 

Изобретение относится к области медицины, в частности к клинической лабораторной диагностике, к диагностике состояния воспалительного процесса при сепсисе и найдет использование для прогноза исхода сепсиса. 1 табл., 1 фиг.

Глобальное эпидемиологическое бремя сепсиса не поддается точной оценке. По приблизительной оценке, рассчитанной на основе экстраполяции данных, собранных в США, ежегодное число случаев сепсиса во всем мире может составлять 15-19 миллионов. По другим данным, число случаев сепсиса и септического шока в мире может составлять до 31 миллиона и до 24 миллионов, соответственно. При этом из-за клинических состояний, приводящих к сепсису, умирают примерно 6 миллионов человек. Эти расчеты основаны исключительно на данных из стран с высоким уровнем доходов; в странах с низким и средним уровнем доходов эпидемиологическое бремя сепсиса, вероятно, намного выше [1]. Недавно на основе международного консенсуса было рекомендовано использовать следующее определение сепсиса - «опасная для жизни дисфункция внутренних органов, вызванная нарушением регуляции ответа организма на инфекцию» [2]. Если сепсис не распознать на ранней стадии и не обеспечить своевременное лечение, он может вызвать септический шок, полиорганную недостаточность и смерть. Учитывая, что сепсис имеет особое и критическое по времени клиническое течение, которое на ранних стадиях в значительной мере поддается лечению благодаря ранней и точной диагностике и своевременному и надлежащему клиническому ведению поиск методов ранней и точной диагностики и прогноза сепсиса, а также специфического лечения по-прежнему актуален [3].

В настоящее время известны следующие методы лабораторной диагностики прогноза исхода сепсиса.

Известен способ прогнозирования исхода сепсиса путем исследования плазмы крови, отличающийся тем, что у больного с абдоминальным сепсисом берут венозную кровь из кубитальной вены дважды с интервалом от 1 до 7 суток, определяют уровень васкулярного эндотелиального фактора роста (VEGF), оцениваемый в пг/мл с помощью иммуноферментного анализа, вычисляют индекс прогноза (ИП) исхода абдоминального сепсиса и при величине ИП меньше 100% прогнозируют неблагоприятный исход абдоминального сепсиса [Патент РФ №2517523, МПК G01N 33/48, G01N 33/68, опубл. 27.05.2014].

Недостатками данного способа являются необходимость неоднократного забора крови у пациента, высокая стоимость исследования, основанного на повторном применении метода иммуноферментного анализа, время исследования (длительность получения результата может составлять от 30 до 60 мин).

Известен способ прогнозирования вероятности летального исхода у больных с хирургическим сепсисом, заключающийся в оценке показателей клинических и лабораторных исследований, отличающийся тем, что в до-, интра- и послеоперационном периоде у больных с абдоминальным сепсисом дополнительно учитывают относительное содержание (%) лимфоцитов, соотношение CD4+/CD8+ (ИРИ), уровень рецепторного антагониста интерлейкина-1 (РА ИЛ-1), а также данные интраоперационных исследований, психологический статус пациента и прогнозируют вероятность летального исхода [Патент РФ № 2385150, МПК A61B 5/0402, G01N 33/48, опубл. 27.03.2010].

Недостатками данного способа являются трудоемкость технологии, связанная с суммарным подсчетом всех исследуемых показателей, необходимость повторных ежесуточных исследований, длительность и стоимость исследования (определение РА ИЛ-1 занимает методом ИФА 3 часа, а средняя стоимость набора реактивов на сегодняшний день составляет ≈63600 руб.).

Известен способ прогнозирования вероятности летального исхода у больных с сепсисом, заключающийся в том, что проводят клинико-лабораторные исследования и оценку состояния больного по шкале APACHE II через каждые пять дней. При этом дополнительно одновременно определяют резервную связывающую способность альбумина. На основании этих показателей определяют прогностический индекс [Патент РФ № 2495621, МПК A61B 5/145, G01N 33/48, опубл. 20.10.2013].

Недостатками данного способа является большое количество показателей, трудных для суммарного подсчета; снижение информативности в динамике заболевания, начиная со вторых суток стационарного лечения пациентов; отсутствие развернутой оценки тяжести иммунологических нарушений. Кроме того, ряд показателей, таких как концентрации глюкозы и альбумина в плазме, центральное венозное давление или диурез, мало значимы в оценке тяжести по шкале, и больше отражают процесс лечения [4]. Эти недостатки снижают информативную значимость и ограничивают возможности его диагностического применения.

На сегодняшний день в качестве биомаркеров сепсиса, под которыми понимают отдельные молекулярные субстанции, указывающие на развитие и тяжесть патологического процесса [5] на экспериментальном уровне и в клиниках, рассматривают большое количество эндогенных субстанций, более подробно - прокальцитонин (ПКТ), С-реактивный белок (СРБ), проадреномедуллин, TREM-1, TNF, ИЛ-6, ИЛ-8, ЛПС-связывающий белок, эндотоксин, ST-фрагмент sCD-14 рецептора моноцитов (пресепсин).

К недостаткам изучаемых маркеров можно отнести недостаточно высокую чувствительность и специфичность (менее 90%), ограниченное количество клинических наблюдений, длительность и стоимость исследований, их труднодоступность для клинической практики. Например, прямое количественное определение данных маркеров нельзя отнести к экспресс-диагностике, так как их определение занимает от 30 до 180 минут, необходимо специальное оборудование и дорогостоящие наборы реактивов (средняя стоимость набора для определения ST-фрагмент sCD-14 рецептора моноцитов составляет ≈51000 руб.).

Задачей изобретения является разработка более точного, высокочувствительного и специфичного, быстрого и доступного метода прогноза исхода сепсиса у пациентов.

Поставленная задача решается тем, что у пациентов, поступивших в отделение реанимации или интенсивной терапии определяют абсолютное количество нейтрофильных внеклеточных ловушек (НВЛ) в динамике посуточно и при уровне абсолютного количества НВЛ на 3 сутки ≥2,808×10⁹/л прогнозируют летальный исход сепсиса.

Способ осуществляется следующим образом:

1. При поступлении в отделение реанимации и интенсивной терапии у пациентов проводят забор цельной периферической крови, проводят подсчет нейтрофильных внеклеточных ловушек в динамике посуточно. Для этого из цельной периферической крови готовят мазок на обезжиренном предметном стекле, фиксированный препарат окрашивают по методу Романовского-Гимзе, учет проводят с помощью светового микроскопа (внеклеточная ДНК представлена тонкими фиолетово - красными нитями, занимающие пространство, в 2-3 раза превосходящее диаметр неизмененного лейкоцита (Патент РФ №271555 Савочкина А.Ю., Пыхова Л.Р., Абрамовских О.С., Четвернина Е.А., Полторак А.Е. Способ обнаружения внеклеточной ДНК в цельной периферической крови. Заявка №2019119629, дата поступления 24.06.2019, приоритет 24.06.2019, зарегистрирован в Государственном реестре 02.03.2020).

2. Далее проводят подсчет общего количества лейкоцитов. Для подсчета общего количества лейкоцитов используют камеру Горяева. Перед проведением исследования 5 мкл цельной крови смешивают со 100 мкл 5% уксусной кислоты для разрушения оболочки лейкоцитов. Далее в 100 больших квадратах согласно правилу Егорова, считают лейкоциты при малом увеличении (окуляр ×10, объектив ×8). Производят подсчет по формуле: Л=В*250*20*10^6/100 (где Л - количество лейкоцитов в 1 л крови; В - сумма лейкоцитов в 100 больших квадратах; 250 - множитель, приводящий к объему крови 1 мкл (объем большого квадрата 1/250 мкл); 20 - разведение крови; 100 - число больших квадратов; 10^6 - количество мкл в одном литре).

3. Далее рассчитывают абсолютное количество нейтрофильных внеклеточных ловушек и при уровне НВЛ на 3 сутки ≥2,808×10⁹/л прогнозируют летальный исход сепсиса.

Оценку диагностической эффективности проводили по показателям

чувствительности, специфичности, а также площади под характеристической

кривой (ROC-кривой). Из табл.1 видно, что на первые сутки постановки диагноза площадь под характеристической ROC-кривой была близка к 0,5 и не отличалась от нее статистически значимо. На вторые сутки площадь увеличилась до 0,704, а к третьим - до 0,814. Рост диагностической эффективности проходил как за счет увеличения чувствительности, так и за счет роста специфичности. На 4 сутки чувствительность еще более выросла (с 70,6% до 78,6%), однако снизилась специфичность (с 83,3% до 61,5%) -это позволило трактовать результат только как тенденцию. Таким образом, максимальная диагностическая и прогностическая эффективность показателя абсолютного количества НВЛ была отмечена на 3 сутки заболевания (табл. 1, фиг. 1). AUC (Area Under Curve) для диагностики посредством определения абсолютного количества НВЛ на 3 сутки заболевания составила 0,814 (p=0,001), чувствительность теста 70,6%, специфичность теста 83,3%, все это свидетельствует о высоком качестве модели.

Пример 1.

Больной П., 64 года поступил в отделение реанимации областной клинической больницы 26.02.2019 г. с диагнозом: рецидивная послеоперационная вентральная грыжа, перфорация тонкой кишки, тяжелый сепсис, флегмона передней брюшной стенки. Состояние при поступлении крайне тяжелое, обусловлено выраженным синдромом эндогенной интоксикации, сепсисом. Для определения внеклеточных ловушек была взята кровь из локтевой вены для общего анализа крови. При подсчете формулы крови, также было оценено количество внеклеточных сетей, образованных гранулоцитами. В первые сутки их количество составило 7,43×10⁹/л, в последующие сутки - 3,34×10⁹/л, на третьи сутки - 3,33×10⁹/л, что дало возможность оценить прогноз исхода как неблагоприятный. Комплексная интенсивная терапия была неэффективной, летальный исход был зафиксирован на 5 сутки.

Пример 2.

Больной С., 43 года поступил в отделение реанимации областной клинической больницы 03.06.2019 г. с диагнозом: стриктура верхней трети правого мочеточника, перитонит, септический шок. Количество НВЛ в первые сутки после постановки диагноза сепсис составило 2,4×10⁹/л, на вторые сутки - 0,7×10⁹/л, на третьи - 0,75×10⁹/л, что дало возможность оценить прогноз исхода как благоприятный. Через 7 суток состояние стабилизировалось, больной переведен в хирургическое отделение.

Исходя из вышеизложенного, предлагаемый способ прогноза исхода сепсиса по сравнению с существующими имеет следующие преимущества: проведение измерения не требует длительного времени (время выполнения не более 1 часа), что также позволяет отслеживать эффективность проводимой терапии, не трудоемок, не требует дорогостоящей аппаратуры и тест-систем, базируется на определении одного показателя.

Предлагаемый способ прост и доступен, может достаточно широко применяться в условиях клинико-диагностических лабораторий. Применение способа в значительной степени облегчит задачу клиницистов в оценке тяжести септического процесса, что дает возможность своевременно скорректировать проводимую терапию, увеличивая тем самым вероятность благоприятного исхода заболевания.

Список литературы

1. Семидесятая сессия всемирной ассамблеи здравоохранения. - A70/13 - 13 апреля 2017. - C. 9.

2. Singer, M. The third international consensus definitions for sepsis and septic shock (Sepsis-3) / M. Singer, C.S. Deutschman, C.W. Seymour [et al.] // JAMA. - 2016. - Vol. 315, № 8. - P. 801-810.

3. Семидесятая сессия всемирной ассамблеи здравоохранения. - WHA70.7. - 29 мая 2017. - C. 5.

4. Александрович Ю.С., Гордеев В.И. Оценочные и прогностические шкалы в медицине критических состояний Изд-во «Сотис». - 2007. - 140 с.

5. Marshall J.С, Reinhart K. Biomarkers of sepsis // Crit. Care Med. - 2009. - 37. - P. 2290-2298.

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической лабораторной диагностике, и может быть использовано для прогноза исхода сепсиса. На 3 сутки заболевания определяют абсолютное количество внеклеточных ловушек, образованных нейтрофильными гранулоцитами в периферической крови. При уровне абсолютного количества внеклеточных ловушек, равном или более 2,808×10⁹/л, прогнозируют летальный исход сепсиса. Способ обеспечивает быстрый и доступный, более точный, высокочувствительный и специфичный прогноз исхода сепсиса у пациентов за счет определения абсолютного количества нейтрофильных внеклеточных ловушек на 3 сутки заболевания. 1 ил., 1 табл., 2 пр.

Способ прогноза исхода сепсиса, характеризующийся тем, что на 3 сутки заболевания определяют абсолютное количество внеклеточных ловушек, образованных нейтрофильными гранулоцитами в периферической крови, и при уровне абсолютного количества внеклеточных ловушек, равном или более 2,808×10⁹/л, прогнозируют летальный исход сепсиса.