КОСТНОЗАМЕЩАЮЩИЙ МАТЕРИАЛ Российский патент 2023 года по МПК A61F2/28 A61L27/12 A61L27/32 A61L27/58 

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к новому двухфазному костнозамещающему материалу, обладающему двуслойной структурой на основе фосфата кальция/гидроксиапатита (ФКА/ГАП), который обладает однородной шероховатой наружной поверхностью, к способу получения этого материала и к его применению в качестве имплантата или протеза для поддержки образования кости, регенерации кости, восстановления кости и/или замены кости на содержащем дефект участке у человека или животного.

Дефекты в структуре кости возникают в целом ряде случае, например, вследствие травмы, заболевания и хирургической операции, и в разных областях хирургии сохраняется необходимость эффективного устранения дефектов кости.

Для стимулирования заживления на содержащем дефект участке использовали многочисленные природные и синтетические материалы и композиции. Хорошо известным природным остеокондуктивным костнозамещающим материалом, который способствует росту кости при дефектах околозубных и челюстно-лицевых костей, является Geistlich Bio-Oss®, выпускающийся фирмой Geistlich Pharma AG. Этот материал изготавливают из натуральной кости способом, описанном в патенте US №5167961, который обеспечивает сохранение трабекулярной конфигурации и нанокристаллической структуры натуральной кости, что обеспечивает получение превосходной остеокондуктивной матрицы, которая не резорбируется или очень медленно резорбируется.

Системы трикальцийфосфат/гидроксиапатит (ТКФ/ГАП) и их применение в качестве костнозамещающих материалов описаны, например, в US 6338752, в котором раскрыт способ получения двухфазного цемента α-ТКФ/ГАП путем нагревания порошкообразной смеси фосфата аммония и ГАП при 1200-1500°С.

В Европейском патенте ЕР 285826 описан способ получения слоя ГАП на металлических и неметаллических основах для имплантатов путем нанесения слоя α-ТКФ и полного превращения слоя α-ТКФ в ГАП по реакции с водой, обладающей значением рН, равным от 2 до 7, при 80-100°С. Полученный продукт представляет собой металлическую или неметаллическую основу, покрытую слоем ГАП.

В WO 97/41273 описан способ нанесения на подложку, предпочтительно на такую как гидроксиапатит (ГАП) или другие фосфаты кальция (ФКА), покрытия из карбонизированного гидроксиапатита, т.е. гидроксиапатита, в котором фосфатные и/или гидроксильные ионы частично заменены бикарбонатными ионами, способ включает (а) погружение подложки в раствор, обладающий значением рН, равным от 6,8 до 8,0, содержащий ионы кальция, фосфатные ионы и бикарбонатные ионы, при температуре ниже 50°С, (b) нагревание части раствора, находящегося в соприкосновении с подложкой, до температуры, равной от 50 до 80°С, до обеспечения значения рН, равного более 8, (с) выдерживание подложки в соприкосновении с щелочным раствором, полученным на стадии (b), с получением покрытия из карбонизированного гидроксиапатита, и (d) извлечение подложки из раствора и сушку покрытия. Раскрыто, что бикарбонатные ионы действуют, как ингибиторы роста кристаллов гидроксиапатита, что приводит к получению нестехиометрических кристаллов, содержащих дефекты и обладающих довольно небольшими размерами, а именно, длиной, равной 10-40 нм, и шириной, равной 3-10 нм (см. стр. 7, строки 1-7).

Термодинамическая стабильность компонентов систем фосфат кальция/гидроксиапатит (ФКА/ГАП), в особенности, систем ТКФ/ГАП, является разной. Вследствие этого различия, если системы ФКА/ГАП имплантируют млекопитающему, в частности, являющемуся человеком пациенту, растворимость ТКФ и других фосфатов кальция в жидкости организма выше, чем растворимость ГАП. Различия растворимостей фосфатов кальция и ГАП вызывает разрушение неупорядоченной спеченной структуры системы ФКА/ГАП, поскольку обладающее лучшей растворимостью соединение, ФКА (например, ТКФ), удаляется быстрее, чем ГАП. Взаимосвязь между ФКА и ГАП, возникающая при спекании при высоких температурах, также вносит существенный вклад в более высокую растворимость изделия в физиологической среде. На ускоренное разложение in vivo таких керамических изделий влияют реакции двух разных типов: Ими являются химическое растворение и биологическая резорбция клетками. Обе реакции вызывают растворение керамического материала, которое к тому же вызывает локальное перенасыщение ионами кальция, при этом количество ионов кальция, которые выделяются, больше, чем количество ионов кальция, которые адсорбируются. Ни во внеклеточной матрице, ни в ткани, окружающей имплантат, больше не существует естественное равновесие ионов кальция. Локальное нарушение естественного равновесия ионов кальция, представляющее собой перенасыщение ионами кальция, приводит к повышению активности остеокластов и поэтому к ускоренной плохо контролируемой резорбции керамического материала и риску возникновения неблагоприятных воспалительных реакций, в особенности, в случае использования большого количества синтетического костнозамещающего материала.

Если костнозамещающий материал Geistlich Bio-Oss® имплантируют являющемуся человеком пациенту, то естественное равновесие ионов кальция практически не нарушается, концентрация ионов кальция на поверхности материала и в локальной окружающей его среде остается практически постоянной. Поэтому не происходит биологическая резорбция материала или она происходит при чрезвычайно низкой скорости без риска возникновения неблагоприятных воспалительных реакций.

В ЕР-В1-2445543 раскрыт крайне эффективный костнозамещающий материал на основе системы фосфат кальция/гидроксиапатит (ФКА/ГАП), который, как и костнозамещающий материал Geistlich Bio-Oss®, после помещения в условия in vivo обеспечивает поддержание практически постоянной концентрации ионов кальция на поверхности материала и в локальной окружающей его среде и, таким образом, не приводит к повышенной активности остеокластов.

В действительности, естественное равновесие ионов кальция, которое необходимо для оптимальной регенерации кости, не нарушено или не устранено. Кроме того, естественное равновесие концентрации кальция в течение длительного времени поддерживается с помощью костнозамещающего материала до завершения процесса регенерации. При соблюдении этих условий не происходит повышения активности остеокластов и поэтому не существует риска возникновения неблагоприятных воспалительных реакций.

Изобретение, описанное ЕР-В1-2445543, относится к двухфазному костнозамещающему материалу на основе системы фосфат

кальция/гидроксиапатит (ФКА/ГАП), включающему ядро из спеченного ФКА и по меньшей мере один однородный и сплошной эпитаксически выращенный слой нанокристаллического ГАП, нанесенный сверху на ядро из спеченного ФКА, где эпитаксически выращенные нанокристаллы обладают такими же размером и морфологией, как и костный минерал человека, т.е. длиной, равной от 30 до 46 нм, и шириной, равной от 14 до 22 нм.

Ядро из спеченного ФКА может включать трикальцийфосфат (ТКФ), предпочтительно α-ТКФ (α-Са₃(PO₄)₂) или β-ТКФ (β-Са₃(PO₄)₂), и/или тетракальцийфосфат (ТТКФ) Са₄(РО₄)₂О.

В соответствии с часто использующимся вариантом осуществления ядро из спеченного ФКА в основном состоит из ТКФ, причем предпочтительным является α-ТКФ.

Эпитаксически выращенный слой нанокристаллического ГАП по структуре и химическому составу практически идентичен натуральному костному минералу человека.

Эпитаксически выращенный слой нанокристаллического ГАП обычно обладает толщиной, равной по меньшей мере от 15 до 50 нм, предпочтительно по меньшей мере от 20 до 40 нм, более предпочтительно по меньшей мере от 25 до 35 нм. Эта минимальная толщина соответствует толщине одного слоя эпитаксиально ориентированных нанокристаллов ГАП.

Эпитаксически выращенный слой нанокристаллического ГАП может включать один или несколько слоев эпитаксиально ориентированных нанокристаллов ГАП. Толщину эпитаксически выращенного слоя нанокристаллического ГАП, которая зависит от количество таких слоев эпитаксиально ориентированных нанокристаллов ГАП, выбирают в соответствии с назначением костнозамещающего материала, использующегося в качестве имплантата или протеза в подвергающихся разной нагрузке частях тела. Костнозамещающий материал, предлагаемый в указанном выше изобретении, в действительности разработан для воздействия in vivo в качестве системы, подобной живой системе, постепенно превращающей ядро из спеченного ФКА в гидроксиапатит, по размеру и морфологии сходный с костным минералом человека, скорость такого превращения зависит от скорости выделения кальция из ядра из спеченного ФКА, которая в значительной степени регулируется толщиной эпитаксически выращенного слоя нанокристаллического ГАП.

Характеристики костнозамещающего материала на основе системы ФКА/ГАП в значительной степени регулируются толщиной эпитаксически выращенного слоя кристаллического ГАП. Термин "характеристики" включает способность костнозамещающего материала на основе системы ФКА/ГАП выделять in vitro и in vivo ионы кальция при постоянной концентрации в локальную окружающую среду.

Толщина эпитаксически выращенного слоя нанокристаллического ГАП зависит от отношения количества материала ядра из спеченного ФКА к количеству ГАП, значение указанного отношения обычно составляет от 5:95 до 95:5, предпочтительно от 10:90 до 90:10.

Костнозамещающий материал на основе системы ФКА/ГАП может находиться в форме частиц или гранул, частицы или гранулы обладают необходимыми размером и формой. Обычно частицы или гранулы являются почти сферическими и обладают диаметром, равным от 250 до 5000 мкм.

Костнозамещающий материал на основе системы ФКА/ГАП также может представлять собой формованное изделие, например, винт, гвоздь, стержень или структуру, обладающую профилем костной части тела, такой как предпочтительно часть бедра, ключицы, ребра, нижней челюсти или черепа. Такие винт, гвоздь или стержень можно использовать в восстановительной ортопедической хирургии для прикрепления связки к кости, например, в колене или локте. Такую структуру, обладающую профилем костной части тела, можно использовать в ортопедической хирургии в качестве протеза для замены отсутствующей или содержащей дефект кости или части кости.

Указано, что этот костнозамещающий материал на основе системы ФКА/ГАП, описанный в ЕР-В1-2445543, можно получить способом, включающим стадии

a) получения материала ядра из спеченного ФКА,

b) погружения материала ядра из спеченного ФКА в водный раствор при температуре, равной от 10 до 50°С, для инициирования реакции превращения ФКА в ГАП, при этом на поверхности материала ядра из спеченного ФКА образуется однородный и сплошной эпитаксически выращенный слой нанокристаллического гидроксиапатита, эпитаксически выращенные нанокристаллы обладают такими же размером и морфологией, как и костный минерал человека,

c) прекращения превращения путем извлечения твердого материала из водного раствора в момент времени, когда содержится однородное и сплошное покрытие, состоящее по меньшей мере из одного нанокристаллического слоя ГАП, но до полного завершения реакции превращения,

d) необязательно стерилизации извлеченного материала, полученного на стадии

Получение материала ядра из спеченного ФКА можно провести по методикам, известным в данной области техники, включающим проводимое сначала смешивания порошкообразных гидрофосфата кальция (СаНРОД карбоната кальция и/или гидроксида кальция, затем прокаливание и спекание смеси при температуре, находящейся в соответствующем диапазоне, с получением таким образом объемного материала ядра из спеченного ФКА (см., например, Mathew М. et al., 1977, Acta. Cryst. ВЗЗ: 1325; Dickens В. et al., 1974, J. Solid State Chemistry 10, 232; и Durucan C. et al., 2002, J. Mat. Sci., 37:963).

Таким образом, объемный материал ядра из спеченного ТКФ можно получить путем смешивания порошкообразных гидрофосфата кальция (CaHPO₄), карбоната кальция и/или гидроксида кальция при стехиометрическом отношении количеств, прокаливания и спекания смеси при температуре, находящейся в диапазоне 1200-1450°С, предпочтительно равной примерно 1400°С.

Объемный материал ядра из спеченного ТТКФ также можно получить по описанной выше методике.

Объемный материал из спеченного ФКА, полученный по таким методикам, может являться пористым и обладать пористостью, составляющей от 2 до 80 об. %, и широким распределением пор по размерам. Параметры пористости выбирают в соответствии с назначением костнозамещающего материала на основе системы ФКА/ГАП.

Материалом ядра из спеченного ФКА, использующимся на стадии b), может являться

- объемный материал ядра из спеченного ФКА, полученный так, как описано выше,

- материал ядра из спеченного ФКА в виде частиц или гранул, полученный из объемного материала ядра из спеченного ФКА, полученного так, как описано выше, с использованием обычных методик, таких как дробление, измельчение и/или размол, и просеивание, или

- заготовка материала ядра из спеченного ФКА, обладающая необходимой формой и размером, например, винт, гвоздь, стержень или структура, обладающая профилем костной части тела.

Такую заготовку, обладающую любой необходимой формой и размером, можно получить из объемного спеченного материала ядра, полученного так, как описано выше, с использованием хорошо известных методик изготовления прототипов, таких как размол с использованием ЧПУ (числовое программное управление) или 3D-печать (см., например, Bartolo P. et al., 2008, Bio-Materials and Prototyping Applications in Medicine, Springer Science New York, ISBN 978-0-387-47682-7; Landers R. et al., 2002, Biomaterials 23(23), 4437; Yeong W.-Y. et al., 2004, Trends in Biotechnology, 22 (12), 643; и Seitz H. et al., 2005, Biomed. Mater. Res. 74B (2), 782).

Указано, что водным раствором, использующимся на стадии b), является чистая вода, искусственная жидкость организма или буфер. Важным является то, что значение рН раствора для погружения, использующегося на стадии b), почти соответствует нейтральной среде и остается стабильным в ходе реакции превращения, предпочтительно, если значение рН находится в диапазоне от 5,5 до 9,0.

Термин "искусственная жидкость организма" означает любой раствор, который имитирует жидкость организма. Предпочтительно, если искусственная жидкость организма обладает концентрацией ионов, сходной с концентрацией в плазме крови.

Буфером может являться любой буфер, обладающий значением рН, находящимся в указанном выше диапазоне, однако предпочтительным является фосфатный буфер с добавлением или без добавления кальция, магния и/или натрия.

Буфером, использовавшимся в примерах (см. примеры 4 и 5), являлся водный фосфатный буфер.

Температура, использующаяся на стадии b), обычно находится в диапазоне от 10 до 50°С, предпочтительно от 25 до 45°С, более предпочтительно от 35 до 40°С.

Во время первой фазы стадии погружения b) происходит фазовое превращение первого рода материала ядра из ФКА и, следовательно, образование зародышей предшественников нанокристаллов ГАП. Во время второй фазы полученные предшественники ГАП, полученные на первой фазе, растут и образуют сплошной (т.е. сплошное покрытие) эпитаксический нанокристаллический слой композита. Первый нанокристаллический слой ГАП должен являться однородным и сплошным, и эпитаксически связанным с материалом ядра из спеченного ФКА.

Во время третьей фазы фазовое превращение первого рода может продолжаться в новом образовавшемся двуслойном композите и происходит дальнейшее превращение материала ядра из спеченного ФКА (ТКФ или ТТКФ) в нанокристаллический ГАП. Во время этой третьей фазы фазового превращения ионы кальция могут выделяться в течение регулируемого промежутка времени путем медленной регулируемой диффузии до тех пор, пока часть материала ядра из спеченного ФКА не превратится в нанокристаллический ГАП. Толщину слоя ГАП и, следовательно, скорость выделения кальция можно регулировать путем изменения продолжительности превращения.

Эпитаксически выращенный слой нанокристаллического ГАП, обладающий соответствующей толщиной, получают in vitro, причем превращение ФКА в ГАП прекращают до его полного завершения.

Как только костнозамещающий материал на основе системы ФКА/ГАП помещают in vivo, реакция превращения ФКА в ГАП реактивируется благодаря соприкосновению с жидкостями организма и костнозамещающий материал действует, как система, подобная живой системе, обеспечивая образование нового гидроксиапатита, по размеру и морфологии сходного с костным минералом человека.

Во время протекающего in vivo фазового превращения переносимые ионы кальция выделяются в локальную окружающую среду и поддерживают локальное равновесие ионов кальция, которое является важным и благоприятным для процессов регенерации кости.

Вследствие разных продолжительностей регенерации дефектов кости важно, чтобы можно было регулировать скорость выделения кальция. Это можно обеспечить путем изменения толщины эпитаксически выращенного слоя гидроксиапатита.

Поэтому стадия с) является критически важной стадией. Продолжительность обработки в водном растворе, использующемся на стадии b), зависит от необходимой толщины слоя ГАП. Необходим по меньшей мере один эпитаксиально ориентированный слой нанокристаллического ГАП. Необходимо, чтобы превращение ФКА в ГАП не было завершено.

Подходящую продолжительность обработки, соответствующую необходимой толщине, можно определить с использованием нескольких дифференциальных уравнений термодинамики, хорошо известных специалисту в области техники, относящейся к фосфатам кальция, к химии цемента и бетона.

См., например: Pommersheim, J.С; Clifton, J.R. (1979) Cem. Cone. Res.; 9:765; Pommersheim, J.C.; Clifton, J.R. (1982) Cem. Cone. Res.; 12:765; и Schlussler, K.H. Mcedlov-Petrosjan, O.P.; (1990): Der Baustoff Beton, VEB Verlag Bauwesen, Berlin.

Применение решений указанных выше дифференциальных уравнений к системам ФКА/ГАП обеспечивает возможность прогнозирования протекания фазового превращения ФКА в ГАП и толщины слоя, таким образом можно получить эпитаксический слой ГАП стабильным и воспроизводимым образом.

Извлечение твердого материала из водного раствора после завершения стадии с) обычно проводят путем фильтрования, промывки и сушки с использованием методик, хорошо известных в данной области техники.

В примерах, приведенных в ЕР-В1-2445543 (а именно, в примере 4 [0057] и в примере 5 [0058]), промывку проводят путем проводимой 3 раза промывки извлеченных гранул очищенной водой для удаления остаточных количеств забуференного раствора.

Необязательную стадию стерилизации d) можно провести по методикам, хорошо известным в данной области техники, таким как облучение гамма-лучами или обработка рентгеновским излучением.

С использованием, как это описано в примерах 4 и 5, приведенных в ЕР-В1-2445543, водного фосфатного буфера для приготовления водного раствора, использующегося на стадии b), и очищенной воды для проводимой 3 раза промывки извлеченных гранул после завершения стадии с), получают двухфазный костнозамещающий материал на основе системы фосфат кальция/гидроксиапатит (ФКА/ГАП), содержащий ядро из спеченного ФКА и сплошной эпитаксически выращенный слой нанокристаллического ГАП, находящийся на наружной поверхности ядра из спеченного ФКА, причем эпитаксически выращенные нанокристаллы обладают такими же размером и морфологией, как и костный минерал человека, т.е. длиной, равной от 30 до 46 нм, и шириной, равной от 14 до 22 нм, где сплошной эпитаксически выращенный слой нанокристаллического ГАП, находящийся на наружной поверхности ядра из спеченного ФКА, обладает неоднородной наружной поверхностью, включающей отдельные (разделенные) кластеры плоских кристаллических пластинок, состоящих из эпитаксически выращенных нанокристаллов ГАП, и гладкие области между отдельными кластерами плоских кристаллических пластинок, выраженная в % доля наружной поверхности, занятой гладкими областями, находящимися между отдельными кластерами плоских кристаллических пластинок, зависит от продолжительности превращения при заданных условиях проведения превращения.

См. фиг. 1А, на котором представлено полученное с помощью СЭМ (сканирующая электронная микроскопия) изображение прототипа 1 (гранулы размером 1-2 мм), полученного при продолжительности превращения, составляющей 30 мин, где по данным СЭМ гладкие области занимают примерно 70% от полной наружной поверхности, и фиг. 1Б, на котором представлено полученное с помощью СЭМ изображение прототипа 2 (гранулы размером 1-2 мм), полученного при продолжительности превращения, составляющей 40 мин, где по данным СЭМ гладкие области занимают примерно 50% от полной наружной поверхности.

В WO 2015/009154 раскрыт способ получения остеокондуктивного материала, обладающего улучшенной остеоиндуктивной способностью, который включает гидротермическую обработку спеченного двухфазного материала на основе системы фосфат кальция/гидроксиапатит (ФКА/ГАП), обладающего топографией поверхности, состоящей из зерен, при давлении, равном 2-4 бар, и при температуре, равной 125°С или выше, без регулирования значения рН в течение времени, достаточного для превращения зерен фосфата кальция, находящихся на поверхности исходного материала, в иголки фосфата кальция, обладающие диаметром, равным 10-1500 нм. Температура, равная не ниже 125°С, и давление, равное не менее 2 бар, существенно отличаются от условий (близких к физиологическим условиям в организме человека), использовавшихся в ЕР-В1-2445543 (температура равна 35-40°С, рН=5,5-9,0, давление равно давлению окружающей среды), которые обеспечивают эпитаксический рост нанокристаллов ГАП. Эти иголки не выращены эпитаксическим образом, но присоединены к материалу-основе ядра или находятся на нем и лишь частично (обычно на 40-90%) покрывают последний, при этом увеличивается удельная поверхность и емкость содержащихся белков, таким образом улучшается остеоиндуктивная способность.

Согласно настоящему изобретению было установлено, что путем добавления от 10 до 90%, предпочтительно от 20 до 60% обладающего короткой цепью алифатического спирта, включая, но не ограничиваясь только ими, метанол, этанол, пропанол или бутанол, к водному фосфатному буферу, использующемуся на стадии b), при получении двухфазного костнозамещающего материала на основе системы фосфат кальция/гидроксиапатит (ФКА/ГАП), в соответствии с ЕР-В1-2445543, неоднородная наружная поверхность сплошного эпитаксически выращенного слоя нанокристаллического ГАП, находящегося на наружной поверхности ядра из спеченного ФКА, двухфазного костнозамещающего материала на основе системы фосфат кальция/гидроксиапатит (ФКА/ГАП), которая включает отдельные кластеры плоских кристаллических пластинок и расположенные между ними гладкие области, заменяется на однородную шероховатую наружную поверхность, включающую плоские кристаллические пластинки без каких-либо отдельных кластеров кристаллов плоских кристаллических пластинок. Эта однородная шероховатая наружная поверхность обычно включает эпитаксически выращенные пластинки из нанокристаллического гидроксиапатита и они образуют взаимосвязанную сеть пластинок при размерах отдельных пластинок, определенных с помощью СЭМ, равных от 0,2 до 20 мкм, предпочтительно от 0,5 до 5 мкм, в зависимости от использующегося количества алифатического спирта.

Как показано в проведенных in vitro исследованиях остеогенной дифференциации эмбриональных мезенхимных стволовых клеток человека (hMSC), остеогенный ответ in vivo в случае двухфазного костнозамещающего материала на основе системы фосфат кальция/гидроксиапатит (ФКА/ГАП), обладающего этой однородной шероховатой наружной поверхностью, включающей плоские кристаллические пластинки, вероятно, сильнее, чем в случае двухфазного костнозамещающего материала на основе системы фосфат кальция/гидроксиапатит (ФКА/ГАП), описанного в ЕР-В1-2445543, который обладает неоднородной наружной поверхностью, включающей отдельные кластеры плоских кристаллических пластинок и расположенные между ними гладкие области.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Таким образом, настоящее изобретение относится к двухфазному костнозамещающему материалу на основе системы фосфат кальция/гидроксиапатит (ФКА/ГАП), включающему ядро из спеченного ФКА и сплошной эпитаксически выращенный слой нанокристаллического ГАП, находящийся на наружной поверхности ядра из спеченного ФКА, причем эпитаксически выращенные нанокристаллы обладают такими же размером и морфологией, как и костный минерал человека, где сплошной эпитаксически выращенный слой нанокристаллического ГАП, находящийся на наружной поверхности ядра из спеченного ФКА, обладает однородной шероховатой наружной поверхностью, включающей плоские кристаллические пластинки.

Этот двухфазный костнозамещающий материал на основе системы фосфат кальция/гидроксиапатит (ФКА/ГАП) обеспечивает усиленную остеогенную дифференциацию эмбриональных мезенхимных стволовых клеток человека (hMSC), что является надежным указанием на усиленный остеогенный ответ in vivo.

Термин "сплошной эпитаксически выращенный слой нанокристаллического ГАП, находящийся на наружной поверхности ядра из спеченного ФКА" означает, что эпитаксически выращенный слой нанокристаллического ГАП полностью покрывает всю наружную поверхность ядра из спеченного ФКА.

Термин "однородная шероховатая наружная поверхность, включающая плоские кристаллические пластинки" означает, что видимая невооруженным взглядом шероховатость наружной поверхности, вызванная наличием плоских кристаллических пластинок, статистически равномерно распределена по поверхности ядра из ФКА без наличия отдельных кластеров кристаллов плоских кристаллических пластинок. См. фиг. 2, на котором представлены полученные с помощью СЭМ изображение прототипов 3-7 двухфазного костнозамещающего материала на основе системы фосфат кальция/гидроксиапатит (ФКА/ГАП), предлагаемого в настоящем изобретении, обладающего однородной шероховатой наружной поверхностью, при разной степени шероховатости.

Термин "плоские кристаллические пластинки" означает группы кристаллов, высота (толщина) которых существенно меньше, чем ширина и длина при рассмотрении в трех перпендикулярных направлениях. Такие плоские кристаллические пластинки явно видны на фиг. 3Б.

Однородная шероховатая наружная поверхность обычно включает эпитаксически выращенные пластинки нанокристаллического гидроксиапатита, образующие взаимосвязанную сеть пластинок, обладающих размерами, определенными с помощью СЭМ (ширина и длина), равными от 0,2 до 20 мкм. Чем больше размеры пластинок, тем больше шероховатость наружной поверхности.

Предпочтительно, если однородная шероховатая наружная поверхность включает эпитаксически выращенные пластинки нанокристаллического гидроксиапатита, образующие взаимосвязанную сеть пластинок, обладающих размерами, определенными с помощью СЭМ, равными от 0,5 до 5 мкм.

Эта однородная шероховатая наружная поверхность обычно включает эпитаксически выращенные пластинки гидроксиапатита, образующие взаимосвязанную сеть, содержащую поры, обладающие размером, определенным с помощью ртутной порометрии (РПМ), равным от 0,03 до 2 мкм. Чем больше объем пор, обладающих размером, равным от 0,03 до 2 мкм, тем больше шероховатость наружной поверхности.

Эту однородную шероховатую наружную поверхность обычно можно охарактеризовать с помощью АСМ (атомно-силовая микроскопия), причем полученное с помощью АСМ значение среднеквадратичной шероховатости (R_q) находится в диапазоне от 50 до 400 нм и средняя максимальная высота профиля (R_z) находится в диапазоне от 500 до 2000 нм.

Предпочтительно, если однородная шероховатая наружная поверхность может отличаться полученным с помощью АСМ значением среднеквадратичной шероховатости (R_q), находящимся в диапазоне от 110 до 150 нм, и средней максимальной высотой профиля (R_z), находящейся в диапазоне от 550 до 750 нм.

Обычно определенное с помощью ПРГ (порошковая рентгенография) выраженное в процентах количество ГАП, содержащегося в двухфазном костнозамещающем материале на основе системы фосфат кальция/гидроксиапатит (ФКА/ГАП), составляет от 1 до 90%.

Предпочтительно, если это определенное с помощью ПРГ выраженное в процентах количество составляет от 1,5 до 30%, более предпочтительно от 2 до 15%.

Ядро из спеченного ФКА включает трикальцийфосфат (ТКФ), предпочтительно α-ТКФ (α-Са₃(PO₄)₂) или β-ТКФ (β-Са₃(PO₄)₂), и/или тетракальцийфосфат (ТТКФ) Са₄(PO₄)₂О.

В соответствии с часто использующимся вариантом осуществления ядро из спеченного ФКА в основном состоит из ТКФ, причем предпочтительным является α-ТКФ.

Эпитаксически выращенный слой нанокристаллического ГАП по структуре практически идентичен натуральному костному минералу человека.

Костнозамещающий материал на основе системы ФКА/ГАП может находиться в форме частиц или гранул, частицы или гранулы обладают необходимыми размером и формой. Обычно частицы или гранулы обладают размером, равным от 250 до 5000 мкм, предпочтительно от 1000 до 2000 мкм.

Костнозамещающий материал на основе системы ФКА/ГАП также может представлять собой формованное изделие, например, винт, гвоздь, стержень или структуру, обладающую профилем костной части тела, такой как предпочтительно часть бедра, ключицы, ребра, нижней челюсти или черепа. Такие винт, гвоздь или стержень можно использовать в восстановительной ортопедической хирургии для прикрепления связки к кости, например, в колене или локте. Такую структуру, обладающую профилем костной части тела, можно использовать в ортопедической хирургии в качестве протеза для замены отсутствующей или содержащей дефект кости или части кости.

Настоящее изобретение также относится к замазке, содержащей частицы или гранулы определенного выше костнозамещающего материала на основе системы ФКА/ГАП в подходящей матрице, обычно включающей натуральные или синтетические полимеры. Обычно частицы или гранулы обладают размером, равным от 250 до 5000 мкм, предпочтительно от 1000 до 2000 мкм.

Настоящее изобретение также относится к способу получения определенного выше костнозамещающего материала на основе системы ФКА/ГАП, включающему стадии

a) получения материала ядра из спеченного ФКА,

b) погружения материала ядра из спеченного ФКА в буферный раствор, содержащий от 10 до 90% обладающего короткой цепью алифатического спирта, при температуре, равной от 10 до 50°С, для инициирования реакции превращения ФКА в ГАП, при этом на поверхности материала ядра из спеченного ФКА образуется сплошной эпитаксически выращенный слой нанокристаллического гидроксиапатита, причем эпитаксически выращенные нанокристаллы обладают такими же размером и морфологией, как и костный минерал человека, где сплошной эпитаксически выращенный слой нанокристаллического ГАП, образовавшийся на поверхности материала ядра из спеченного ФКА, обладает однородной наружной поверхностью, включающей плоские кристаллические пластинки,

c) прекращения превращения путем извлечения твердого материала из водного раствора в момент времени, когда содержится сплошное покрытие, состоящее по меньшей мере из одного нанокристаллического слоя ГАП, но до полного завершения реакции превращения, и

d) необязательно стерилизации извлеченного материала, полученного на стадии c).

Подходящий обладающий короткой цепью алифатический спирт может быть выбран из группы, состоящей из следующих: метанол, этанол, пропанол и бутанол.

Предпочтительно если обладающим короткой цепью алифатическим спиртом является этанол.

Предпочтительно, если буферный раствор, использующийся на стадии b), содержит от 20 до 60%, более предпочтительно от 30 до 50 обладающего короткой цепью алифатического спирта.

Параметрами шероховатости однородной шероховатой наружной поверхности сплошного эпитаксически выращенного слоя нанокристаллического ГАП, находящегося на наружной поверхности ядра из спеченного ФКА, предпочтительно

- параметры, полученные с помощью АСМ: полученное с помощью АСМ значение среднеквадратичной шероховатости (R_q) и средняя максимальная высота профиля (R_z),

- размеры эпитаксически выращенных пластинок нанокристаллического гидроксиапатита, определенные с помощью СЭМ, и

- объем пор, обладающих размером, равным от 0,03 до 2 мкм, определенный с помощью РПМ,

можно легко регулировать путем изменения выраженного в процентах количества обладающего короткой цепью алифатического спирта в буферном растворе, использующемся для реакции превращения.

Чем больше это выраженное в процентах количество, тем меньше полученное с помощью АСМ значение среднеквадратичной шероховатости (R_q) и средняя максимальная высота профиля (R_z), тем меньше размеры эпитаксически выращенных пластинок нанокристаллического гидроксиапатита, определенные с помощью СЭМ, и тем меньше объем пор, обладающих размером, равным от 0,03 до 2 мкм, определенный с помощью РПМ.

Буферный раствор, использующийся на стадии b), содержащий от 10 до 90% обладающего короткой цепью алифатического спирта, получают путем смешивания водного буферного раствора с обладающим короткой цепью алифатическим спиртом при разных количествах. Водный буферный раствор выбирают таким образом, чтобы значение рН раствора для погружения, использующегося на стадии b), который дополнительно содержит от 10 до 90% обладающего короткой цепью алифатического спирта, является близким к соответствующему нейтральной среде и остается стабильным во время реакции превращения, предпочтительно, если значение рН находится в диапазоне от 5,5 до 9,0, более предпочтительно от 7,0 до 8,0.

Буфером может являться любой буфер, обладающий значением рН, находящимся в указанном выше диапазоне, однако предпочтительным является фосфатный буфер с добавлением или без добавления кальция, магния и/или натрия.

Подходящим буферным раствором является, например, 0,05-0,3 М водный раствор дигидрофосфата натрия (NaH₂PO₄), обладающий значением рН, равным от 7,3 до 7,6.

Температура, использующаяся на стадии b), обычно находится в диапазоне от 10 до 50°С, предпочтительно от 25 до 45°С, более предпочтительно от 35 до 40°С.

Предпочтительно, если стадию b) проводят при температуре, равной от 35 до 40°С, в растворе фосфатного буфера, обладающем значением рН, равным от 7,0 до 8,0, содержащем от 20 до 60% обладающего короткой цепью алифатического спирта.

Получение материала ядра из спеченного ФКА можно провести по методикам, известным в данной области техники, включающим проводимое сначала смешивания порошкообразных гидрофосфата кальция (СаНРОД карбоната кальция и/или гидроксида кальция, затем прокаливание и спекание смеси при температуре, находящейся в соответствующем диапазоне, с получением таким образом объемного материала ядра из спеченного ФКА (см., например, Mathew М. et al., 1977, Acta. Cryst. ВЗЗ: 1325; Dickens В. et al., 1974, J. Solid State Chemistry 10, 232; и Durucan C. et al., 2002, J. Mat. Sci., 37:963).

Таким образом, объемный материал ядра из спеченного ТКФ можно получить путем смешивания порошкообразных гидрофосфата кальция (СаНРС^), карбоната кальция и/или гидроксида кальция при стехиометрическом отношении количеств, прокаливания и спекания смеси при температуре, находящейся в диапазоне 1200-1450°С, предпочтительно равной примерно 1400°С.

Объемный материал ядра из спеченного ТТКФ также можно получить по описанной выше методике.

Объемный материал из спеченного ФКА, полученный по таким методикам, может являться пористым и обладать пористостью, составляющей от 2 до 80 об. %, и широким распределением пор по размерам. Параметры пористости выбирают в соответствии с назначением костнозамещающего материала на основе системы ФКА/ГАП.

Материалом ядра из спеченного ФКА, использующимся на стадии b) может являться

- объемный материал ядра из спеченного ФКА, полученный так, как описано выше,

- материал ядра из спеченного ФКА в виде частиц или гранул, полученный из объемного материала ядра из спеченного ФКА, полученного так, как описано выше, с использованием обычных методик, таких как дробление, измельчение и/или размол, и просеивание, или

- заготовка материала ядра из спеченного ФКА, обладающая необходимой формой и размером, например, винт, гвоздь, стержень или структура, обладающая профилем костной части тела.

Такую заготовку, обладающую любой необходимой формой и размером, можно получить из объемного спеченного материала ядра, полученного так, как описано выше, с использованием хорошо известных методик изготовления прототипов, таких как размол с использованием ЧПУ или ЗЭ-печать (см., например, Bartolo P. et al., 2008, Bio-Materials and Prototyping Applications in Medicine, Springer Science New York, ISBN 978-0-387-47682-7; Landers R. et al., 2002, Biomaterials 23(23), 4437; Yeong W.-Y. et al., 2004, Trends in Biotechnology, 22 (12), 643; и Seitz H. et al., 2005, Biomed. Mater. Res. 74B (2), 782).

Во время первой фазы стадии погружения b) происходит фазовое превращение первого рода материала ядра из ФКА и, следовательно, образование зародышей предшественников нанокристаллов ГАП. Во время второй фазы полученные предшественники ГАП, полученные на первой фазе, растут и образуют сплошной (т.е. сплошное покрытие) эпитаксический нанокристаллический слой композита. Первый нанокристаллический слой ГАП должен являться однородным и сплошным, и эпитаксически связанным с материалом ядра из спеченного ФКА.

Во время третьей фазы фазовое превращение первого рода может продолжаться в новом образовавшемся двуслойном композите и происходит дальнейшее превращение материала ядра из спеченного ФКА (ТКФ или ТТКФ) в нанокристаллический ГАП. Во время этой третьей фазы фазового превращения ионы кальция могут выделяться в течение регулируемого промежутка времени путем медленной регулируемой диффузии до тех пор, пока часть материала ядра из спеченного ФКА не превратится в нанокристаллический ГАП. Толщину слоя ГАП и, следовательно, скорость выделения кальция можно регулировать путем изменения продолжительности превращения.

Эпитаксически выращенный слой нанокристаллического ГАП, обладающий соответствующей толщиной, получают in vitro, причем превращение ФКА в ГАП прекращают до его полного завершения.

Как только костнозамещающий материал на основе системы ФКА/ГАП помещают in vivo, реакция превращения ФКА в ГАП реактивируется благодаря соприкосновению с жидкостями организма и костнозамещающий материал действует, как система, подобная живой системе, обеспечивая образование нового гидроксиапатита, по размеру и морфологии сходного с костным минералом человека.

Во время протекающего in vivo фазового превращения переносимые ионы кальция выделяются в локальную окружающую среду и поддерживают локальное равновесие ионов кальция, которое является важным и благоприятным для процессов регенерации кости.

Вследствие разных продолжительностей регенерации дефектов кости важно, чтобы можно было регулировать скорость выделения кальция. Это можно обеспечить путем изменения толщины эпитаксически выращенного слоя гидроксиапатита.

Поэтому стадия с) является критически важной стадией. Продолжительность обработки в водном растворе, использующемся на стадии b), зависит от необходимой толщины слоя ГАП. Необходим по меньшей мере один эпитаксиально ориентированный слой нанокристаллического ГАП. Необходимо, чтобы превращение ФКА в ГАП не было завершено.

Соответствующую продолжительность обработки, соответствующую необходимой толщине, можно определить с использованием нескольких дифференциальных уравнений термодинамики, хорошо известных специалисту в области техники, относящейся к фосфатам кальция и к химии цемента и бетона.

См., например: Pommersheim, J.С; Clifton, J.R. (1979) Cem. Cone. Res.; 9:765; Pommersheim, J.C.; Clifton, J.R. (1982) Cem. Cone. Res.; 12:765; и Schlüssler, K.H. Mcedlov-Petrosjan, O.P.; (1990): Der Baustoff Beton, VEB Verlag Bauwesen, Berlin.

Применение решений указанных выше дифференциальных уравнений к системам ФКА/ГАП обеспечивает возможность прогнозирования протекания фазового превращения ФКА в ГАП и толщины слоя, таким образом можно получить эпитаксический слой ГАП стабильным и воспроизводимым образом.

Извлечение твердого материала из водного раствора обычно проводят путем фильтрования, промывки и сушки с использованием методик, хорошо известных в данной области техники.

Необязательную стадию стерилизации d) можно провести по методикам, хорошо известным в данной области техники, таким как облучение гамма-лучами или обработка рентгеновским излучением.

Настоящее изобретение также относится к применению определенного выше костнозамещающего материала на основе системы ФКА/ГАП, обычно в форме частиц, замазки или формованного изделия в качестве имплантата или протеза для поддержки образования кости, регенерации кости, восстановления кости и/или замены кости на содержащем дефект участке у человека или животного.

Настоящее изобретение также относится к способу поддержки образования кости, регенерации кости и/или восстановления кости на содержащем дефект участке у человека или животного путем имплантации определенного выше костнозамещающего материала на основе системы ФКА/ГАП, обычно в форме частиц, замазки или формованного изделия.

Преимущества костнозамещающего материала на основе системы ФКА/ГАП, предлагаемого в настоящем изобретении, и способ его получения.

Этот двухфазный костнозамещающий материал на основе системы фосфат кальция/гидроксиапатит (ФКА/ГАП), предлагаемый в настоящем изобретении, обладающий однородной шероховатой наружной поверхностью, включающей плоские кристаллические пластинки, обеспечивает усиленную остеогенную дифференциацию эмбриональных мезенхимных стволовых клеток человека (hMSC), в частности, более сильную экспрессией маркеров дифференциации, остеопонтина (ОПН) и остеокальцина (ОКН), чем двухфазный костнозамещающий материал на основе системы фосфат кальция/гидроксиапатит (ФКА/ГАП), описанный в ЕР-В1-2445543, который обладает неоднородной поверхностью, включающей отдельные кластеры плоских кристаллических пластинок и расположенные между ними гладкие области. Это является надежным указанием на усиленный остеогенный ответ in vivo.

Это согласуется с результатами, описанными в публикации R.A. Gittens et al. in Biomaterials 2011 May, 32(13): 3395-3403, в которой показано, что включение наноразмерных структур в комбинации с микронной-субмикронной шероховатостью улучшает дифференциацию остеобластов и степень локального продуцирования, что, в свою очередь, указывает на возможность улучшенной остеоинтеграции имплантата in vivo.

Способ получения двухфазного костнозамещающего материала на основе системы фосфат кальция/гидроксиапатит (ФКА/ГАП), предлагаемого в настоящем изобретении, позволяет легко регулировать параметры шероховатости однородной шероховатой наружной поверхности сплошного эпитаксически выращенный слой нанокристаллического ГАП, находящегося на наружной поверхности ядра из спеченного ФКА, предпочтительно

- параметры, полученные с помощью АСМ: полученное с помощью АСМ значение среднеквадратичной шероховатости (R_q) и средняя максимальная высота профиля (R_z),

- размеры эпитаксически выращенных пластинок нанокристаллического гидроксиапатита, определенные с помощью СЭМ, и

- объем пор, обладающих размером, равным от 0,03 до 2 мкм, определенный с помощью РПМ,

путем изменения выраженного в процентах количества обладающего короткой цепью алифатического спирта в буферном растворе, использующемся для реакции превращения.

Чем больше это выраженное в процентах количество, тем меньше полученное с помощью АСМ значение среднеквадратичной шероховатости (R_q) и средняя максимальная высота профиля (R_z), тем меньше размеры эпитаксически выращенных пластинок нанокристаллического гидроксиапатита, определенные с помощью СЭМ, и тем меньше объем пор, обладающих размером, равным от 0,03 до 2 мкм, определенный с помощью РПМ.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Настоящее изобретение более подробно описано ниже со ссылкой на иллюстративные примеры предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения и прилагаемые чертежи, где:

На фиг. 1А представлено полученное с помощью СЭМ изображение прототипа 1 (гранулы размером 1-2 мм) костнозамещающего материала, раскрытого в ЕР-В1-2445543 и полученного в примере 1, при продолжительности превращения, составляющей 30 мин, где по данным СЭМ гладкие области занимают примерно 70% от полной наружной поверхности.

На фиг. 1Б представлено полученное с помощью СЭМ изображение прототипа 2 (гранулы размером 1-2 мм) костнозамещающего материала, раскрытого в ЕР-В1-2445543 и полученного в примере 1, при продолжительности превращения, составляющей 40 мин, где по данным СЭМ гладкие области занимают примерно 50% от полной наружной поверхности.

На фиг. 2А-2Д представлены полученные с помощью СЭМ изображения прототипа 3 ((фиг. 2А): 20% этанола, гранулы размером 1-2 мм), прототипа 4 ((фиг. 2Б): 30% этанола, гранулы размером 1-2 мм), прототипа 5 ((фиг. 2В): 40% этанола, гранулы размером 1-2 мм), прототипа 6 ((фиг. 2Г): 50% этанола, гранулы размером 1-2 мм) и прототипа 7 ((фиг. 2Д): 60% этанола, гранулы размером 1-2 мм) костнозамещающих материалов, предлагаемых в настоящем изобретении.

Все представленные на фиг. 1 и фиг. 2А-2Д полученные с помощью СЭМ изображения обладают увеличением, составляющим 3500.

На фиг. 3А представлено изображение поперечного сечения прототипа 5 (40% этанола, гранулы размером 1-2 мм), полученное с помощью СЭМ при низком увеличении (1000×). В правом нижнем углу показана наружная поверхность гранулы и центр гранулы расположен в направлении к левому верхнему углу.

На фиг. 3Б представлено изображение поперечного сечения прототипа 5 (40% этанола, гранулы размером 1-2 мм), полученное с помощью СЭМ при более высоком увеличении (14000×).

На фиг. 4 представлены полученные с помощью СЭМ изображения (расположенные сверху изображения) и полученные с помощью АСМ изображения (расположенные снизу изображения) прототипов 3а (слева: 20% этанола) и 6а (справа: 50% этанола) не содержащих поры дисков из костнозамещающих материалов, предлагаемых в настоящем изобретении, полученных в примере 2.

На фиг. 5А-5Б представлено сопоставление полученных при исследовании in vitro ответов остеокальцина (ОКН, фиг. 5А) и остеопонтина (ОПН, фиг. 5Б) эмбриональных мезенхимных стволовых клеток человека (hMSC), находящихся в соприкосновении с костнозамещающими материалами, предлагаемыми в настоящем изобретении, и с костнозамещающими материалами предшествующего уровня.

На фиг. 6 представлены полученные с помощью РПМ зависимости для обладающих размером 1-2 мм гранул прототипов 3 (20% этанола), 5 (40% этанола) и 7 (60% этанола) костнозамещающих материалов, предлагаемых в настоящем изобретении, полученных в примере 2, и чистого α-ТКФ, полученного так, как описано в примере 1.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Приведенные ниже примеры иллюстрируют настоящее изобретение, не ограничивая его объем.

Пример 1. Получение двухфазного костнозамещающего материала на основе системы фосфат кальция/гидроксиапатит (ФКА/ГАП) в соответствии с ЕР-В1-2445543

Объемный спеченный материал альфа-ТКФ, полученные из него пористые гранулы, обладающие размером, равным 1,0-2,0 мм, и подвергнутые превращению гранулы, содержащие эпитаксически выращенное покрытие ГАП, получали по аналогии с примерами 1, 2 и 4, описанными в ЕР-В 1-2445543.

364 г Безводного порошкообразного дикальцийфосфата, 136 г порошкообразного карбоната кальция и 220 мл деионизированной воды перемешивали в течение 5 мин при скорости, равной 700 об/мин, с использованием лабораторного перемешивающего устройства. Полученную после перемешивания суспензию сразу переносили в устойчивую к воздействию высокой температуры платиновую чашку. Заполненную платиновую чашку помещали в холодную печь. Печь нагревали до 1400°С с использованием скорости нагрева, равной 100°С/ч. Эту температуру поддерживали в течение 12 ч и затем печь охлаждали до 800°С при скорости охлаждения, равной 500°С/ч, затем охлаждали до 300°С при скорости охлаждения, равной 125°С/ч, и в заключение охлаждали до комнатной температуры путем выключения печи. Чашку извлекали из печи и объемный спеченный материал (чистая фаза α-Са₃(PO₄)₂) извлекали из платиновой чашки. Определение чистоты фазы определяли путем анализа с помощью порошковой рентгенографии.

Объемный продукт измельчали с помощью щековой дробилки (расстояние между щеками меняли от 10 до 1 мм). Полученные гранулы просеивали с использованием машины для просеивания и вставных сит, обладающих размером ячеек, равным 2 мм и 1 мм. После просеивания гранулы промывали этанолом для отделения остаточных количеств тонкодисперсного порошка, прилипшего к гранулам. Пористые гранулы сушили в сушильном шкафу при 80°С в течение 1 ч. Чистоту поверхности частиц после промывки определяли путем исследования поверхности с помощью сканирующей электронной микроскопии.

Буферный раствор, подходящий для получения покрытия и реакции фазового превращения, получали путем растворения 0,4 моль/л дигидрофосфата натрия (NaH₂PO₄) в дистиллированной воде. При комнатной температуре значение рН раствора устанавливали равным 7,45 с использованием гидроксида натрия (NaOH). Гранулы, полученные так, как описано в предыдущих абзацах, погружали в полученный раствор и выдерживали на водяной бане с водой при тщательно регулируемой температуре (40°С) в течение 30 мин (прототип 1) и 40 мин (прототип 2) соответственно. После погружения гранулы 3 раза промывали дистиллированной водой для прекращения реакции фазового превращения и остатки извлекали из забуференного раствора. Пористые гранулы сушили в сушильном шкафу при 100°С в течение 2 ч.

С помощью СЭМ при увеличении, равном 3500×, получали изображения гранул - прототипа 1 и прототипа 2.

Как видно из фиг. 1А и 1Б, на которых представлены полученные с помощью СЭМ изображения прототипов 1 и 2, наружная поверхность гранул является неоднородной и включает отдельные (разделенные) кластеры плоских кристаллических пластинок, состоящих из эпитаксически выращенных нанокристаллов ГАП, и гладкие области между кристаллами.

Путем определения площади поверхности, занятой отдельными кластерами и гладкими областями на полученных с помощью СЭМ изображениях для каждого образца, прототипа 1 и прототипа 2, установлено, что гладкие области занимают примерно 70% наружной поверхности в случае прототипа 1 и примерно 50% наружной поверхности в случае прототипа 2.

Пример 2. Получение двухфазных костнозамещающих материалов на основе системы фосфат кальция/гидроксиапатит (ФКА/ГАП), предлагаемых в настоящем изобретении

1) Получение гранул костнозамещающего материала

Пористые гранулы размером 1-2 мм из чистой фазы α-ТКФ получали так, как описано выше в примере 1.

Фазовое превращение и стадию получения покрытия проводили в стеклянных колбах, помещенных на водяную баню, температуру которой устанавливали равной 40°С. Буфером для проведения превращения являлся водный раствор дигидрофосфата натрия (NaH₂PO₄), смешанный с этанолом при разных количествах. Молярную концентрацию водного раствора дигидрофосфата натрия меняли от 0,05 до 0,ЗМ и содержание этанола меняли от 20 до 60% (мае./мае). Значение рН раствора для проведения превращения составляло от 7,3 до 7,6.

Стеклянные колбы заполняли буфером для проведения превращения и добавляли гранулы альфа-ТКФ при отношении количеств, составляющем от 1:40 до 1:80 (количество гранул к количеству раствора для проведения превращения). Гранулы погружали в раствор для проведения превращения при 40°С и выдерживали в течение промежутка времени, равного от 24 до 72 ч. После погружения гранулы 5 раз промывали деионизированной водой (отношение массы гранул к массе воды составляло 1:10) и 2 раза этанолом (99,9%, отношение массы гранул к массе этанола составляло 1:10) для прекращения фазового превращения и удаления остатков из забуференного раствора. Пористые гранулы сушили в сушильном шкафу при 100°С в течение 2 ч.

Морфологию поверхности после получения покрытия и реакции фазового превращения изучали с использованием СЭМ.

На фиг. 2 представлены полученные с помощью СЭМ изображения при увеличении, равном 3500×, для прототипа 3 (20% этанола), прототипа 4 (30% этанола), прототипа 5 (40% этанола), прототипа 6 (50% этанола) и прототипа 7 (60% этанола) костнозамещающих материалов, предлагаемых в настоящем изобретении. При сравнении фиг. 1А и 1Б с фиг. 2 видно, что неоднородная наружная поверхность прототипов 1 и 2, содержащая отдельные кластеры плоских кристаллических пластинок и расположенные между ними гладкие области, заменяется на однородную шероховатую наружную поверхность, не содержащую отдельных кластеров кристаллов. Однородная шероховатая наружная поверхность состоит из взаимосвязанной сети эпитаксически выращенных пластинок гидроксиапатита. Как показано путем анализа с помощью СЭМ, размеры отдельных пластинок уменьшаются при увеличении содержания этанола в растворе для проведения превращения, таким образом уменьшается шероховатость или неровность наружной поверхности.

На фиг. 3А представлено изображение поперечного сечения прототипа 5 (40% этанола, гранулы размером 1-2 мм), полученное с помощью СЭМ при низком увеличении (1000×). В правом нижнем углу показана наружная поверхность гранулы и центр гранулы расположен в направлении к левому верхнему углу.

На фиг. 3Б представлено изображение поперечного сечения прототипа 5 (40% этанола, гранулы размером 1-2 мм), полученное с помощью СЭМ при более высоком увеличении (14000×), на котором явно видны отдельные плоские кристаллические пластинки, которые являются составными элементами шероховатой поверхности. Не существует различия между шероховатой наружной поверхностью в центре гранулы и шероховатой наружной поверхностью внешней поверхности гранулы.

Определения распределения пор по размерам с помощью ртутной порометрии (РПМ)

Распределения пор по размерам в гранулах определяли с использованием ртутной порометрии (РПМ). РПМ является стандартной методикой характеризации, использующейся для определения распределения пор по размерам в пористых материалах. Методика хорошо известна в данной области техники и описана, например, в публикации Gregg, S.J. and Sing, K.S.W., Adsorption, Surface Area and Porosity, 2nd ed., Academic Press Inc. (1982), 173-190.

На фиг. 6 представлено сопоставление полученных с помощью РПМ зависимостей для прототипов 3, 5 и 7 костнозамещающих материалов, предлагаемых в настоящем изобретении, и чистого α-ТКФ (полученного в соответствии с примером 1 и являющегося материалом ядра для прототипов 3, 5 и 7). Все исследования проводили с использованием гранул размером 1-2 мм.

Можно видеть, что образец чистого α-ТКФ не содержит никаких пор, обладающих размером, находящимся в диапазоне от 0,03 до 2 мкм, вследствие его гладкой поверхности. Все костнозамещающие материалы, предлагаемые в настоящем изобретении, содержат поры, обладающие размером, находящимся в диапазоне от 0,03 до 2 мкм, вследствие пористой природы однородной шероховатой наружной поверхности, которая состоит из взаимосвязанной сети эпитаксически выращенных пластинок гидроксиапатита. Объем пор обладающих размером, находящимся в диапазоне от 0,03 до 2 мкм, для шероховатой наружной поверхности, который соответствует площади под кривой полученной с помощью РПМ, зависит от размеров отдельных пластинок, образующих взаимосвязанную сеть. Чем больше размер отдельных пластинок, тем больше объем включенных пор во взаимосвязанной сети. Таким образом, объем включенных пор во взаимосвязанной сети может быть непосредственно связан с шероховатостью поверхности. Чем больше определенный по зависимости, полученной с помощью РПМ, объем пор, обладающих размером, находящимся в диапазоне от 0,03 до 2 мкм, тем больше шероховатость поверхности. В случае представленных прототипов прототип 3 обладает наибольшим объемом пор (площадь под кривой), обладающих размером, находящимся в диапазоне от 0,03 до 2 мкм, прототипы 5 и 7 обладают меньшим объемом пор. Путем анализа с помощью СЭМ, результаты которого представлены фиг. 2А-2Д, подтверждено, что шероховатость прототипов уменьшается при переходе от прототипа 3 к прототипу 5 и 7.

2) Получение непористых дисков костнозамещающего материала

Гранулы чистой фазы α-ТКФ размером 1-2 мм, полученные так, как описано выше в примере 1, размалывали с помощью планетарной мельницы при скорости, равной 150 об/мин, в течение 20 ч и получали мелкодисперсный порошок. Мелкодисперсный порошок помещали в пресс-форму и уплотняли с помощью ручного пресса при нагрузке, равной 1 т. Сырец извлекали из формы и переносили в высокотемпературную печь. Печь нагревали до 1450°С с использованием скорости нагрева, равной 250°С/ч. Эту температуру поддерживали в течение 24 ч и затем печь охлаждали до 800°С при скорости охлаждения, равной 500°С/ч, и затем охлаждали до комнатной температуры при скорости охлаждения, равной 150°С/ч. Объемный спеченный непористый материал (чистая фаза α-Са₃(PO₄)₂) извлекали из печи. Определение чистоты фазы определяли путем анализа с помощью порошковой рентгенографии и характеристики поверхности исследовали с помощью СЭМ.

Фазовое превращение и получение покрытия с использованием полученных дисков проводили так, как описано выше в параграфе 1), с тем единственным отличием, что отношение массы α-ТКФ к массе раствора для проведения превращения составляло от 1 до 3,5.

Таким образом получали прототипы 3а (20% этанола) и 6а (50% этанола) костнозамещающих материалов, предлагаемых в настоящем изобретении.

Морфологию поверхности после получения покрытия и реакции фазового превращения исследовали с помощью СЭМ. Соответствующие параметры шероховатости определяли с использованием атомно-силовой микроскопии, АСМ.

Представленные на фиг. 4 полученные с помощью СЭМ изображения подтверждают, что морфология однородной шероховатой наружной поверхности непористых дисков идентична шероховатой наружной поверхности гранул, полученных при соответствующем содержании этанола в примере 2, параграф 1 (прототипы 3 и 3а, и прототипы 6 и 6а).

Атомно-силовая микроскопия (АСМ)

Исследование поверхности в нанометровом диапазоне проводили с использованием атомно-силовой микроскопии (TT-AFM, AFM Workshop) в режиме постукивания. Анализ с помощью АСМ проводили при давлении окружающей среды с использованием непористых цилиндрических дисков диаметром 11 мм и высотой 1 мм. Использовали резонансную частоту, равную 190 кГц, и иглу, обладающую радиусом, равным 10 нм. Каждое исследование с помощью АСМ проводили на области 50 мкм × 50 мкм и исследовали по три образца каждой группы. Исходные изображения выравнивали на плоскости для устранения наклона с использованием численной поправки и с помощью программного обеспечения Gwyddion определяли средние значения среднеквадратичной шероховатости (R_q) и средней максимальной высоты профиля (R_z).

Аналогичная методика характеризации поверхности описана, например, в US-2013-0045360-A1.

На фиг. 4 представлены полученные с помощью АСМ изображения прототипов 3а (20% этанола, слева) и 6а (50% этанола, справа) непористых дисков, полученных в соответствии с настоящим изобретением. Определенные с помощью АСМ значения шероховатости для прототипов 3а и 6а приведены в представленной ниже таблице 1.

Как видно из таблицы 1, среднее значения среднеквадратичной шероховатости (R_q) уменьшается от 237 до 130 нм и средняя максимальная высота профиля (R_z) уменьшается от 1391 до 630 нм при увеличении содержания этанола от 20 до 50%.

Пример 3. Исследование остеогенной дифференциации эмбриональных мезенхимных стволовых клеток человека (hMSC) in vitro

Для исследования того, способствуют ли прототипы костнозамещающего материала, полученные в примерах 1 и 2, остеогенной дифференциации, примерно 200000 клеток hMSC, выделенных из бедренной кости эмбриона человека через 22 недели беременности (выпускаются фирмой ScienCell: Cat#7500, Lot# 6890), высевали на 320 мг гранул этих прототипов костнозамещающего материала и культивировали в течение 3 недель. В первые 7 дней культивирования для оптимальной поддержки пролиферации клеток использовали имеющуюся в продаже среду для роста клеток hMSC (среда MSCM, Cat# 7501, ScienCell). Для последующих 14 дней среду заменяли на МДСИ (модифицированная по методике Дульбекко среда Игла) с добавлением 10% ФБС (фетальная бычья сыворотка) и смеси пенициллин/стрептомицин. К среде для клеточных культур не добавляли дополнительных остеогенных средств. После культивирования hMSC в течение 3 недель выделяли всю мРНК (матричная рибонуклеиновая кислота), транскрибировали в кДНК комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота) и проводили количественную ПЦР (полимеразная цепная реакция) в реальном времени. Экспрессию гена определяли по методике ΔΔСТ (см. Livak K.J. and Schmittgen T.D., Analysis of relative gene expression data using real time quantitative PCR and the 2-ΔΔСТ method, 2001, Methods 25, pp. 402-408) с использованием ГАФДГ (глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа) в качестве гена жизненно важной функции. Экспрессию маркеров остеогенной дифференциации, остеопонтина (ОПН) и остеокальцина (ОКН), определяли для всех прототипов костнозамещающих материалов, находящихся в форме гранул (1-2 мм), полученных в примерах 1 и 2.

В этих исследованиях показано, что в случае прототипов костнозамещающих материалов, предлагаемых в настоящем изобретении, полученных в примере 2, обеспечивается существенно более сильная экспрессия маркеров остеогенной дифференциации, ОПН и ОКН, чем в случае прототипов костнозамещающих материалов предшествующего уровня техники, полученных в примере 1 (см. фиг. 5А-5Б).

На основании этих полученных in vitro результатов в случае прототипов костнозамещающих материалов, предлагаемых в настоящем изобретении, ожидается усиленный остеогенный ответ in vivo.

Пример 4. Сопоставление размера кристаллов и морфологии нанокристаллов ГАП для двухфазного костнозамещающего материала на основе системы ФКА/ГАП, предлагаемого в настоящем изобретении, и костного минерала человека

Определение размера кристаллов в образцах прототипа 3 и натурального костного минерала человека проводили так же, как и в ЕР-В1-2445543, путем уточнения полученных с помощью рентгенографии данных с использованием методики Брэгга.

Таким образом, показано, что двухфазный костнозамещающий материал на основе системы ФКА/ГАП, предлагаемый в настоящем изобретении, и костный минерал человека обладают одинаковой морфологией и одинаковым размером кристаллов. См. приведенную ниже таблицу 2.

Группа изобретений относится к области костнозамещающих материалов для имплантации и протезирования. Двухфазный фосфат кальциевый/гидроксиапатитовый (ФКА/ГАП) костнозамещающий материал, включающий ядро из спеченного ФКА и сплошной эпитаксически выращенный слой нанокристаллического ГАП, находящийся на наружной поверхности ядра из спеченного ФКА, причем эпитаксически выращенные нанокристаллы обладают такими же размером и морфологией, как и костный минерал человека, где сплошной эпитаксически выращенный слой нанокристаллического ГАП, находящийся на поверхности материала ядра из спеченного ФКА, обладает однородной шероховатой наружной поверхностью, включающей плоские кристаллические пластинки. Также раскрывается замазка, содержащая гранулы двухфазного фосфата кальциевого/гидроксиапатитового (ФКА/ГАП) костнозамещающего материала, способ получения ФКА/ГАП костнозамещающего материала, а также имплантат и протез, включающие двухфазный фосфат кальциевый/гидроксиапатитовый (ФКА/ГАП) костнозамещающий материал. Группа изобретений обеспечивает усиленную остеогенную дифференциацию эмбриональных мезенхимных стволовых клеток человека (hMSC), что является надежным указанием на усиленный остеогенный ответ in vivo. 5 н. и 27 з.п. ф-лы, 4 пр., 2 табл., 6 ил.

1. Двухфазный фосфат кальциевый/гидроксиапатитовый (ФКА/ГАП) костнозамещающий материал, включающий ядро из спеченного ФКА и сплошной эпитаксически выращенный слой нанокристаллического ГАП, находящийся на наружной поверхности ядра из спеченного ФКА, причем эпитаксически выращенные нанокристаллы обладают такими же размером и морфологией, как и костный минерал человека, где сплошной эпитаксически выращенный слой нанокристаллического ГАП, находящийся на поверхности материала ядра из спеченного ФКА, обладает однородной шероховатой наружной поверхностью, включающей плоские кристаллические пластинки.

2. Двухфазный фосфат кальциевый/гидроксиапатитовый (ФКА/ГАП) костнозамещающий материал по п. 1, в котором шероховатая поверхность включает эпитаксически выращенные пластинки нанокристаллического гидроксиапатита, образующие взаимосвязанную сеть пластинок, обладающих размерами, определенными с помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ), равными от 0,2 до 20 мкм.

3. Двухфазный фосфат кальциевый/гидроксиапатитовый (ФКА/ГАП) костнозамещающий материал по п. 1, в котором шероховатая поверхность включает эпитаксически выращенные пластинки нанокристаллического гидроксиапатита, образующие взаимосвязанную сеть пластинок, обладающих размерами, определенными с помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ), равными от 0,5 до 5 мкм.

4. Двухфазный фосфат кальциевый/гидроксиапатитовый (ФКА/ГАП) костнозамещающий материал по любому из пп. 1-3, в котором однородная шероховатая наружная поверхность включает эпитаксически выращенные пластинки гидроксиапатита, образующие взаимосвязанную сеть, содержащую поры, обладающие размером, определенным с помощью ртутной порометрии (РПМ), равным от 0,03 до 2 мкм.

5. Двухфазный фосфат кальциевый/гидроксиапатитовый (ФКА/ГАП) костнозамещающий материал по любому из пп. 1-4, где однородную шероховатую наружную поверхность характеризуют с помощью атомно-силовой микроскопии (АСМ), причем полученное с помощью АСМ значение среднеквадратичной шероховатости R_q находится в диапазоне от 50 до 400 нм и средняя максимальная высота профиля R_z находится в диапазоне от 500 до 2000 нм.

6. Двухфазный фосфат кальциевый/гидроксиапатитовый (ФКА/ГАП) костнозамещающий материал по любому из пп. 1-4, где однородную шероховатую наружную поверхность характеризуют с помощью атомно-силовой микроскопии (АСМ), причем полученное с помощью АСМ значение среднеквадратичной шероховатости (R_q) находится в диапазоне от 110 до 150 нм и средняя максимальная высота профиля (R_z) находится в диапазоне от 550 до 750 нм.

7. Двухфазный фосфат кальциевый/гидроксиапатитовый (ФКА/ГАП) костнозамещающий материал по любому из пп. 1-6, в котором ядро из спеченного ФКА в основном состоит из α-трикальцийфосфата (α-ТКФ).

8. Двухфазный фосфат кальциевый/гидроксиапатитовый (ФКА/ГАП) костнозамещающий материал по любому из пп. 1-7, в котором определенное с помощью ПРГ выраженное в процентах количество ГАП составляет от 1,5 до 30%.

9. Двухфазный фосфат кальциевый/гидроксиапатитовый (ФКА/ГАП) костнозамещающий материал по любому из пп. 1-8, который находится в форме частиц или гранул.

10. Двухфазный фосфат кальциевый/гидроксиапатитовый (ФКА/ГАП) костнозамещающий материал по любому из пп. 1-8, который представляет собой формованное изделие.

11. Замазка, содержащая гранулы двухфазного фосфат кальциевого/гидроксиапатитового (ФКА/ГАП) костнозамещающего материала по любому из пп. 1-9 в матрице.

12. Способ получения ФКА/ГАП костнозамещающего материала по любому из пп. 1-10, включающий стадии

a) получения материала ядра из спеченного ФКА,

b) погружения материала ядра из спеченного ФКА в буферный раствор, содержащий от 10 до 90% обладающего короткой цепью алифатического спирта, при температуре, равной от 10 до 50°С, для инициирования реакции превращения ФКА в ГАП, при этом на поверхности материала ядра из спеченного ФКА образуется сплошной эпитаксически выращенный слой нанокристаллического гидроксиапатита, причем эпитаксически выращенные нанокристаллы обладают такими же размером и морфологией, как и костный минерал человека, где сплошной эпитаксически выращенный слой нанокристаллического ГАП, образовавшийся на поверхности материала ядра из спеченного ФКА, обладает однородной шероховатой наружной поверхностью, включающей плоские кристаллические пластинки, и

c) прекращения превращения путем извлечения твердого материала из водного раствора в момент времени, когда содержится сплошное покрытие, состоящее по меньшей мере из одного нанокристаллического слоя ГАП, но до полного завершения реакции превращения.

13. Способ по п. 12, дополнительно включающий стерилизацию извлеченного материала, полученного на стадии с).

14. Способ по п. 12 или 13, в котором обладающим короткой цепью алифатическим спиртом является этанол.

15. Способ по любому из пп. 12-14, в котором буферный раствор, использующийся на стадии b), содержит от 30 до 50% обладающего короткой цепью алифатического спирта.

16. Способ по любому из пп. 12-15, в котором стадию b) проводят при температуре, равной от 35 до 40°С, в растворе фосфатного буфера, обладающем значением рН, равным от 7,0 до 8,0, содержащем от 20 до 60% обладающего короткой цепью алифатического спирта.

17. Имплантат, включающий двухфазный фосфат кальциевый/гидроксиапатитовый (ФКА/ГАП) костнозамещающий материал, включающий ядро из спеченного ФКА и сплошной эпитаксически выращенный слой нанокристаллического ГАП, находящийся на наружной поверхности ядра из спеченного ФКА, причем эпитаксически выращенные нанокристаллы обладают такими же размером и морфологией, как и костный минерал человека, где сплошной эпитаксически выращенный слой нанокристаллического ГАП, находящийся на поверхности материала ядра из спеченного ФКА, обладает однородной шероховатой наружной поверхностью, включающей плоские кристаллические пластинки, и причем имплантат обладает формой, пригодной для поддержки образования кости, регенерации кости, восстановления кости на содержащем дефект участке.

18. Имплантат по п. 17, в котором шероховатая поверхность включает эпитаксически выращенные пластинки нанокристаллического гидроксиапатита, образующие взаимосвязанную сеть пластинок, обладающих размерами, определенными с помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ), равными от 0,2 до 20 мкм.

19. Имплантат по п. 17, в котором шероховатая поверхность включает эпитаксически выращенные пластинки нанокристаллического гидроксиапатита, образующие взаимосвязанную сеть пластинок, обладающих размерами, определенными с помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ), равными от 0,5 до 5 мкм.

20. Имплантат по любому из пп. 17-19, в котором однородная шероховатая наружная поверхность включает эпитаксически выращенные пластинки гидроксиапатита, образующие взаимосвязанную сеть, содержащую поры, обладающие размером, определенным с помощью ртутной порометрии (РПМ), равным от 0,03 до 2 мкм.

21. Имплантат по любому из пп. 17-20, где однородную шероховатую наружную поверхность характеризуют с помощью атомно-силовой микроскопии (АСМ), причем полученное с помощью АСМ значение среднеквадратичной шероховатости R_q находится в диапазоне от 50 до 400 нм и средняя максимальная высота профиля R_z находится в диапазоне от 500 до 2000 нм.

22. Имплантат по любому из пп. 17-20, где однородную шероховатую наружную поверхность характеризуют с помощью атомно-силовой микроскопии (АСМ), причем полученное с помощью АСМ значение среднеквадратичной шероховатости (Rq) находится в диапазоне от 110 до 150 нм и средняя максимальная высота профиля (R_z) находится в диапазоне от 550 до 750 нм.

23. Имплантат по любому из пп. 17-22, в котором ядро из спеченного ФКА в основном состоит из α-трикальцийфосфата (α-ТКФ).

24. Имплантат по любому из пп. 17-23, в котором определенное с помощью ИРГ выраженное в процентах количество ГАП составляет от 1,5 до 30%.

25. Протез, включающий двухфазный фосфат кальциевый/гидроксиапатитовый (ФКА/ГАП) костнозамещающий материал, включающий ядро из спеченного ФКА и сплошной эпитаксически выращенный слой нанокристаллического ГАП, находящийся на наружной поверхности ядра из спеченного ФКА, причем эпитаксически выращенные нанокристаллы обладают такими же размером и морфологией, как и костный минерал человека, где сплошной эпитаксически выращенный слой нанокристаллического ГАП, находящийся на поверхности материала ядра из спеченного ФКА, обладает однородной шероховатой наружной поверхностью, включающей плоские кристаллические пластинки, и причем протез обладает формой, пригодной для замены кости на содержащем дефект участке.

26. Протез по п. 25, в котором шероховатая поверхность включает эпитаксически выращенные пластинки нанокристаллического гидроксиапатита, образующие взаимосвязанную сеть пластинок, обладающих размерами, определенными с помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ), равными от 0,2 до 20 мкм.

27. Протез по п. 25, в котором шероховатая поверхность включает эпитаксически выращенные пластинки нанокристаллического гидроксиапатита, образующие взаимосвязанную сеть пластинок, обладающих размерами, определенными с помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ), равными от 0,5 до 5 мкм.

28. Протез по любому из пп. 25-27, в котором однородная шероховатая наружная поверхность включает эпитаксически выращенные пластинки гидроксиапатита, образующие взаимосвязанную сеть, содержащую поры, обладающие размером, определенным с помощью ртутной порометрии (РПМ), равным от 0,03 до 2 мкм.

29. Протез по любому из пп. 25-28, где однородную шероховатую наружную поверхность характеризуют с помощью атомно-силовой микроскопии (АСМ), причем полученное с помощью АСМ значение среднеквадратичной шероховатости R_q находится в диапазоне от 50 до 400 нм и средняя максимальная высота профиля R_z находится в диапазоне от 500 до 2000 нм.

30. Протез по любому из пп. 25-28, где однородную шероховатую наружную поверхность характеризуют с помощью атомно-силовой микроскопии (АСМ), причем полученное с помощью АСМ значение среднеквадратичной шероховатости (R_q) находится в диапазоне от 110 до 150 нм и средняя максимальная высота профиля (R_z) находится в диапазоне от 550 до 750 нм.

31. Протез по любому из пп. 25-30, в котором ядро из спеченного ФКА в основном состоит из α-трикальцийфосфата (α-ТКФ).

32. Протез по любому из пп. 25-31, в котором определенное с помощью ПРГ выраженное в процентах количество ГАП составляет от 1,5 до 30%.