Способ определения и обнаружения в биологических жидкостях лекарственных средств ингибиторов протеазы ВИЧ в комбинированных сочетаниях Российский патент 2023 года по МПК G01N1/28 G01N30/90 A61K38/55 

Предлагаемое изобретение относится к области медицины и может быть использовано в химико-токсикологических и судебно-химических лабораториях для разделения, идентификации и анализа саквинавира и ритонавира в комбинированных сочетаниях.

Исследуемые лекарственные средства представляют собой антиретровирусные препараты. По механизму действия относятся к ингибиторам протеазы вируса иммунодефицита человека тип 1 (ВИЧ-1) и тип 2 (ВИЧ-2). Возникновение острых отравлений лекарственными препаратами, в том числе антиретровирусными, часто связано с ошибочным приемом неправильно подобранной дозировки, превышающей требуемую, длительным применением препаратов, повышенной чувствительностью к ним отдельных лиц, сочетанием их с другими лекарственными средствами, а также с суицидальной целью при намеренном приеме более высокой дозы.

Наиболее часто встречаются случаи отравления саквинавиром и ритонавиром в сочетании с антиретровирусными, противотуберкулезными, психотропными, седативными, сердечно-сосудистыми лекарственными средствами - тенофовиром, лопинавиром, изониазидом, феназепамом, диазепамом, фенобарбиталом, циннаризином, пикамилоном,

Одной из актуальных проблем химико-токсикологического и судебно-химического анализа является разработка новых и усовершенствование существующих способов идентификации комбинированных сочетаний лекарственных средств. Для химико-токсикологического и судебно-химического контроля целесообразно использовать простые, но надежные и производительные экспрессные методики анализа.

Среди современных методов химико-токсикологического и судебно-химического анализа важное место занимает хроматография в тонком слое сорбента, которая широко применяется как для целей разделения, так и для идентификации лекарственных средств в комбинированных сочетаниях.

Наиболее близким является способ обнаружения и определения в моче антиретровирусных лекарственных средств (абакавира, ламивудина, зидовудина и ставудина) в комбинированных сочетаниях с амитриптилином, респеридином, азалептином, галоперидолом, неулетилом, мелинпрамином, хлорпротиксеном, флуоксетином, ибупрофеном, фенобарбиталом путем хроматографирования в тонком слое сорбента на пластинках «Сорбфил» раствора определяемых веществ и стандартных образцом веществ-свидетелей и идентификацией в УФ-свете при длине волны 254 нм (Пат. № 2655804, Российская Федерация, МПК G01N 1/28, G01N 30/90. Способ определения и обнаружения в моче антиретровирусных лекарственных средств в комбинированных сочетаниях/ Ю.А. Гончикова, Н.В. Чмелевская, Е.А. Илларионова, В.В. Тыжигирова; Заявитель и патентообладатель ФГБОУ ВО ИГМУ. – № 2017112451; заявл. 11.04.2017, опубл. 29.05.2018, Бюл. №16. – 6 с.). В этой работе предложен способ хроматографирования в тонком слое сорбента для разделения и идентификации абакавира, ламавулина, зидовудина и ставудина в сочетании с амитриптилином, рисперидином, азалептином, галоперидилом, неулетилом, мелинпрамином, хлорпротиксеном, флуоксетином, ибупрофеном, фенобарбиталом, который оказался неселективным для определения саквинавира и ритонавира в сочетании с антиретровирусными, противотуберкулезными, психотропными, седативными, сердечно-сосудистыми лекарственными средствами – тенофовиром, лопинавиром, изониазидом, феназепамом, диазепамом, фенобарбиталом, циннаризином, пикамилоном. Предложенные автором условия хроматографирования не позволяют разделить исследуемые комбинированные сочетания лекарственных средств ингибиторов ВИЧ после изолирования их из биологических жидкостей.

В предлагаемом способе авторы используют в качестве растворителя для изолирования испытуемых растворов из биологических жидкостей (моча, плазма, слюна) - бутилацетат и раствор натрия хлорида 20% при рН 3, чувствительность определения в 4 раза выше, чем в прототипе, показана возможность хроматографирования в системе растворителей эти л ацетат - ацетон - этанол 95% - ледяная уксусная кислота в объёмном соотношении 40:40:2:1 и идентификацией в УФ-свете.

Использование в качестве растворителя бутилацетата и раствора натрия хлорида 20% при рН 3 и системы растворителей этилацетат - ацетон - этанол 95% - ледяная уксусная кислота с объёмным соотношением 40:40:2:1 позволяет четко разделить пятна определяемых веществ, что повышает селективность, объективность и чувствительность анализа, которая составила 0,008 мкг/мл.

Технический результат достигается путем изолирования из биологических жидкостей (моча, плазма, слюна) определяемых веществ и приготовления растворов стандартных образцов сравнения с последующим их хроматографированием и обнаружением УФ-светом.

Новым в достижении технического результата является то, что изолирование испытуемых веществ из 10 мл биологических жидкостей (моча, плазма, слюна) осуществляют 30 мл бутилацетата и 10 мл раствора натрия хлорида 20% при рН 3.

Новым является также то, что в качестве подвижной фазы используют систему растворителей этилацетат - ацетон - этанол 95% - ледяная уксусная кислота с объёмным соотношением растворителей 40:40:2:1.

Исследуемые лекарственные вещества характеризуются наличием в молекулах различных функциональных групп и поэтому отличаются физико-химическими свойствами. Исходя из этого, оптимальным методом их разделения следует считать метод хроматографии в тонком слое сорбента, который характеризуется экспрессностью, селективностью, высокой чувствительностью, несложным аппаратурным оснащением, простотой выполнения.

Тонкослойная хроматография (ТСХ) является наиболее распространенным методом анализа лекарственных, наркотических веществ и их метаболитов в биологических объектах и на этапе скрининга служит преобладающим источником информации. Данный метод применяется в общем и частном скрининге.

Для выбора условий разделения исследуемых веществ методом ТСХ использовали пластины на основе силикагеля «Сорбфил», которые имеют высокую степень активности, стандартизированную толщину сорбента.

Детекцию пятен проводили путем просмотра пластин в УФ-свете при длине волны 254 нм.

Предварительно нами была определена хроматографическая подвижность исследуемых веществ в общих системах растворителей, наиболее часто применяемых для веществ основного характера в химико-токсикологическом анализе.

В качестве общих систем использовали:

I. Этилацетат - хлороформ - 25% раствор аммиака (17:2:1, объемное соотношение);

II. Хлороформ - этанол 95% - 25% раствор аммиака (30:30:1, объемное соотношение);

III. Толуол - ацетон - 25% раствор аммиака (50:50:1, объемное соотношение);

IV. Этилацетат - ацетон - этанол 95% - 25% раствор аммиака (50:45:4:1, объемное соотношение);

V. Этанол 95% - 25% раствор аммиака (49,25:0,75, объемное соотношение);

VI. Этилацетат - метанол - 25% раствор аммиака (17:2:1, объемное соотношение).

Система этилацетат - ацетон - этанол 95% - 25% раствор аммиака с объёмным соотношением растворителей 50:45:4:1 является наиболее подходящей из вышеперечисленных сочетаний для разделения исследуемых лекарственных веществ. Данная система может быть рекомендована в скрининге при проведении ненаправленного анализа. В остальных общих системах, разделение исследуемых веществ идет недостаточно четко, наблюдается размытие зон адсорбции, а также наличие «хвостов».

Для увеличения значения ΔR_f между зонами исследуемых веществ провели варьирование количеством частей подвижной фазы этилацетат - ацетон - этанол 95% - 25% раствор аммиака с объёмным соотношением растворителей 50:45:4:1 (базовая система).

В первую очередь варьировали объемом аммиака (0,5; 1,0; 1,5; 2,0 объемных частей). При проведении испытания было выяснено, что при увеличении объема аммиака в системе подвижность лекарственных веществ не увеличилась, а стало наблюдаться наложение зон адсорбции. При уменьшении объема аммиака до 0,5 объемных частей разделительная способность также не улучшилась. В связи с этим, оптимальным количеством аммиака 25% является 1 объемная часть, так как наблюдается наилучшее разделение веществ.

Далее в хроматографической системе заменили аммиак на ледяную уксусную кислоту, что связано с проявлением веществами и основных, и кислотных свойств, а это в свою очередь может отразиться на разделительной способности веществ. Одновременно в систему вводилась ледяная уксусная кислота и раствор аммиака 25%. Исходя из полученных данных, можно сделать вывод, что совместное присутствие ледяной уксусной кислоты и аммиака 25% повысило подвижность лекарственных веществ незначительно. При варьировании объемом ледяной уксусной кислоты улучшилась разделительная способность веществ, в частности при добавлении 1 объемной части кислоты увеличилось расстояние между зонами адсорбции, что в свою очередь, позволяет нам сделать заключение о том, что для ТСХ анализа представленных веществ необходима кислая рН среды. Поэтому дальнейшие испытания проводили в присутствии ледяной уксусной кислоты в количестве 1 объемной части.

Далее варьировали количеством этилацетата (40, 45, 50 объемных частей). Наилучшее разделение лекарственных веществ наблюдается при введении в систему 40 объемных частей этилацетата, однако при этом происходит наложение пятен тенофовира и лопинавира; при добавлении 45 объемных частей подвижность веществ значительно ухудшилась.

Следующим этапом испытания явилось варьирование объемом ацетона (40, 45, 50 объемных частей). По полученным данным было установлено, что наиболее рациональным количеством ацетона является 40 объемных частей, так как при увеличении объема ацетона наблюдается наложение зон адсорбции и их сближение.

На последнем этапе исследования варьировали количеством этанола 95% в системе (2, 4, 6 объемных частей). Оптимальным объемом этанола для улучшения хроматографической подвижности лекарственных веществ является 2 объемных части.

В результате проведенных экспериментов найдена подвижная фаза этилацетат - ацетон - этанол 95% - ледяная уксусная кислота (40:40:2:1, объемное соотношение), позволяющая разделить комбинированные сочетания саквинавира и ритонавира с антиретровирусными, противотуберкулезными, психотропными, седативными, сердечно-сосудистыми лекарственными средствами - тенофовиром, лопинавиром, изониазидом, феназепамом, диазепамом, фенобарбиталом, циннаризином, пикамилоном, наиболее часто применяемых совместно, и получить зоны веществ правильной формы.

Сопоставительный анализ с прототипом показывает, что заявляемое техническое решение отличается тем, что в качестве растворителя для изолирования саквинавира и ритонавира из мочи, слюны или плазмы используют 30 мл бутилацетата и 10 мл раствора натрия хлорида 20% при рН 3 соответственно, хроматографирование проводят в системе этилацетат - ацетон - этанол 95% - ледяная уксусная кислота с объёмным соотношением растворителей 40:40:2:1, что соответствует критерию изобретения «новизна».

Новая совокупность признаков обеспечивает повышение селективности, объективности и чувствительности анализа, что соответствует критерию «промышленная применимость».

При анализе известных решений было выявлено, что в них отсутствуют сведения о влиянии отличительных признаков на достижение поставленного технического результата, следовательно, изобретение соответствует критерию «изобретательский уровень».

Способ осуществляют следующим образом.

При изолировании из мочи: 10 мл мочи, содержащей смесь исследуемых веществ, переносят в делительную воронку, доводят раствор до рН 3 хлористоводородной кислоты раствором 0,1 М, добавляют 10 мл натрия хлорида раствора 20% и 30 мл бутилацетата и затем проводят экстракцию однократно в течение 3 минут. Извлечения переносят в фарфоровую чашку и оставляют при комнатной температуре до удаления органического растворителя. Полученный сухой остаток растворяют в 2 мл этанола 95% и перемешивают.

При изолировании из плазмы и слюны: в 20 мл плазмы или слюны, содержащей смесь исследуемых веществ, добавляют 5 мл трихлоруксусной кислоты раствор 50% с целью осаждения белков. Центрифугируют.10 мл центрифугата переносят в делительную воронку, доводят раствор до рН 3 хлористоводородной кислоты раствором 0,1 М, добавляют 10 мл натрия хлорида раствора 20% и 30 мл бутилацетата и затем проводят экстракцию однократно в течение 3 минут. Извлечения переносят в фарфоровую чашку и оставляют при комнатной температуре до удаления органического растворителя. Полученный сухой остаток растворяют в 2 мл этанола 95% и перемешивают.

На линию старта пластинки «Сорбфил» размером 10×10 см микрошприцем наносят по 1 мкл 0,1% раствора смеси. Рядом наносят по 1 мкл 0,1% растворов стандартных образцов веществ-свидетелей (СОВС) в этаноле 95%, содержащихся в смеси. Пластинку сушат на воздухе в течение 5 минут, а затем помещают в хроматографическую камеру со смесью растворителей: этилацетат - ацетон - этанол 95% - ледяная уксусная кислота (40:40:2:1, объемное соотношение) и хроматографируют восходящим методом. Когда фронт растворителя пройдет почти до конца пластинки, ее вынимают из камеры, сушат на воздухе в течение 20 минут и просматривают в УФ-свете при длине волны 254 нм.

Для приготовления растворов стандартных образцов веществ-свидетелей (СОВС) берут 0,01 г СОВС и растворяют в 10 мл этанола 95%.

Предлагаемый способ поясняется следующими примерами.

Пример 1. Готовят растворы извлечения из мочи, плазмы, слюны и растворы веществ-свидетелей описанным выше способом. Хроматографируют испытуемые растворы, используя оптимальную систему растворителей. Далее обнаруживают зоны веществ на хроматограмме УФ-светом.

На хроматограмме обнаружены зоны веществ со следующими значениями R_f: саквинавир 0,07±0,01; ритонавир 0,48±0,01; тенофовир 0,41±0,03; лопинавир 0,61±0,01; изониазид 0,18±0,01; феназепам 0,67±0,02; фенобарбитал 0,76±0,01; диазепам 0,55±0,02; циннаризин 0,32±0,02; пикамилон 0,26±0,01.

Данные примеры подтверждают, что предлагаемый способ может быть использован для химико-токсикологического и судебно-химического анализа саквинавира и ритонавира в сочетании с антиретровирусными, противотуберкулезными, психотропными, седативными, сердечно-сосудистыми лекарственными средствами - тенофовиром, лопинавиром, изониазидом, феназепамом, диазепамом, фенобарбиталом, циннаризином, пикамилоном.

Таким образом, предлагаемый способ определения и обнаружения саквинавира и ритонавира в комбинированных сочетаниях после извлечения их из мочи, плазмы или слюны с использованием тонкослойной хроматографии позволяет повысить селективность, объективность и чувствительность анализа.

Изобретение относится к области медицины, а именно к способу определения и обнаружения саквинавира и ритонавира в биологических жидкостях. Способ определения и обнаружения в моче, плазме или слюне саквинавира и ритонавира в комбинированных сочетаниях с тенофовиром, лопинавиром, изониазидом, феназепамом, диазепамом, фенобарбиталом, циннаризином, пикамилоном путем хроматографирования в тонком слое сорбента на пластинках «Сорбфил» раствора определяемых веществ и стандартных образцов веществ-свидетелей, при этом готовят испытуемый раствор путем изолирования определяемых веществ из 10 мл мочи, плазмы, слюны 30 мл бутилацетата и 10 мл раствора натрия хлорида 20% при рН 3,0, проводят хроматографирование в тонком слое сорбента в системе растворителей этилацетат - ацетон - этанол 95% - ледяная уксусная кислота с объёмным соотношением растворителей 40:40:2:1 и обнаружение зон веществ на хроматограмме в УФ-свете. Вышеописанное изобретение позволяет определять саквинавир и ритонавир, изолированные из биологических жидкостей бутилацетатом и раствором натрия хлорида 20% при рН 3, путём хроматографирования и обнаружением УФ-светом. 1 пр.

Способ определения и обнаружения в моче, плазме или слюне саквинавира и ритонавира в комбинированных сочетаниях с тенофовиром, лопинавиром, изониазидом, феназепамом, диазепамом, фенобарбиталом, циннаризином, пикамилоном путем хроматографирования в тонком слое сорбента на пластинках «Сорбфил» раствора определяемых веществ и стандартных образцов веществ-свидетелей, при этом готовят испытуемый раствор путем изолирования определяемых веществ из 10 мл мочи, плазмы, слюны 30 мл бутилацетата и 10 мл раствора натрия хлорида 20% при рН 3,0, проводят хроматографирование в тонком слое сорбента в системе растворителей этилацетат - ацетон - этанол 95% - ледяная уксусная кислота с объёмным соотношением растворителей 40:40:2:1 и обнаружение зон веществ на хроматограмме в УФ-свете.