Способ определения в моче, слюне или плазме крови лекарственных веществ Российский патент 2024 года по МПК G01N33/15 G01N33/487 G01N30/90 G01N1/28 

Предлагаемое изобретение относится к области медицины и может быть использовано в химико-токсикологических и контрольно-аналитических лабораториях для разделения, идентификации и анализа перхлозона и рифабутина в комбинированных сочетаниях.

Исследуемые противотуберкулезные препараты применяются для лечения туберкулеза с широкой и множественной лекарственной устойчивостью. Распространение лекарственно устойчивых штаммов приводит к более частому включению резервных препаратов в схемы лечения. Одновременный прием нескольких противотуберкулезных препаратов и комбинирование их с препаратами из других фармакологических групп ведет к повышению риска возникновения побочных реакций и случаев острых отравлений. Кроме того, возникновение острых отравлений лекарственными препаратами, часто связано с ошибочным приемом неправильно подобранной дозировки, превышающей требуемую, длительным применением препаратов, повышенной чувствительностью к ним отдельных лиц, сочетанием их с другими лекарственными средствами, а также с суицидальной целью при намеренном приеме более высокой дозы.

Наиболее часто встречаются случаи отравления с фтивазидом, пиразинамидом, линезолидом, левофлоксацином, протионамидом, абакавиром, амитриптилином, аминазином, фенобарбиталом, циннаризином, метронидазолом, анальгином.

Одной из актуальных проблем химико-токсикологического и фармацевтического анализа является разработка новых и усовершенствование существующих способов идентификации комбинированных сочетаний лекарственных средств. Для химико-токсикологического и аналитического контроля целесообразно использовать простые, но надежные и производительные экспрессные методики анализа.

Среди современных методов химико-токсикологического и фармацевтического анализа важное место занимает хроматография в тонком слое сорбента, которая широко применяется как для целей разделения, так и для идентификации лекарственных средств в комбинированных сочетаниях.

Наиболее близким является способ определения офлоксацина, линезолида и эфавиренза в комбинированных сочетаниях в сочетании с антидепрессантами, анальгетиками, седативными, антигистаминными, противотуберкулезными лекарственными средствами - амитриптилином, мелипрамином, новокаином, морфином, фенобарбиталом, димедролом, рифампицином, путем изолирования определяемых веществ из мочи дихлорметаном и насыщенным раствором натрия хлорида при рН 4,0, и последующим хроматографированием в тонком слое сорбента на пластинках «Сорбфил» в системе растворителей диэтиловый эфир – хлороформ - 25% раствор аммиака в соотношении 15:2:1,5 и обнаружение зон веществ на хроматограмме в УФ-свете. (Пат. № 2019120127 Российская Федерация МПК G01N 30/90 (2019.08); G01N 30/00 (2019.08) Способ определения и обнаружения в моче фторсодержащих лекарственных средств в комбинированных сочетаниях / Тютрина В.А., Илларионова Е.А., Чмелевская Н.В. Заявитель и патентообладатель ФГБОУ ВО ИГМУ. - №2019120127; заявл. 26.06.2019, опубл. 25.12.2019, Бюл. №36 - 8 c.). В этой работе предложен способ хроматографирования в тонком слое сорбента для разделения и идентификации офлоксацина, линезолида и эфавиренза в комбинированных сочетаниях в сочетании с антидепрессантами, анальгетиками, седативными, антигистаминными, противотуберкулезными лекарственными средствами амитриптилином, мелипрамином, новокаином, морфином, фенобарбиталом, димедролом, рифампицином. Предложенные автором условия хроматографирования не позволяют разделить исследуемые комбинированные сочетания противотуберкулезных лекарственных средств после изолирования их из мочи, слюны и плазмы крови.

В предлагаемом способе авторы используют в качестве растворителя для изолирования испытуемых растворов из биологических жидкостей (мочи, слюны и плазмы крови) - этилацетат при последовательном создании рН 3,0 и 10,0 с помощью буферных растворов, чувствительность определения в 3 раза выше, чем в прототипе, показана возможность хроматографирования на пластинках «Сорбфил»в системе растворителей диоксан - хлороформ - ацетон - 25% раствор аммиака в соотношении 40:40:6:3 в объемном соотношении и идентификацией в УФ-свете при длине волны 254 нм.

Использование в качестве растворителя этилацетата при последовательном создании рН 3,0 и 10,0 с помощью буферных растворов и системы растворителей диоксан - хлороформ - ацетон - 25% раствор аммиака в объемном соотношении 40:40:6:3 позволяет четко разделить пятна определяемых веществ, что повышаетселективность, объективность и чувствительность анализа, которая составила 0,01 мкг/мл.

Технический результат достигается путем изолирования из биологических жидкостей (мочи, слюны и плазмы крови) определяемых веществ и приготовления растворов стандартных образцов сравнения с последующим их хроматографированием и обнаружением УФ-светом.

Новым в достижении технического результата является то, что изолирование испытуемых веществ из мочи, слюны и плазмы крови осуществляют при последовательном создании рН 3,0 и 10,0 с помощью буферных растворов.

Новым является также то, что в качестве подвижной фазы используют систему растворителей диоксан - хлороформ - ацетон - 25% раствор аммиака 40:40:6:3 в объемном соотношении.

Исследуемые лекарственные вещества характеризуются наличием в молекулах различных функциональных групп и поэтому отличаются физико-химическими свойствами. Исходя из этого, оптимальным методом их разделения следует считать метод хроматографии в тонком слое сорбента, который характеризуется экспрессностью, селективностью, высокой чувствительностью, несложным аппаратурным оснащением, простотой выполнения.

Тонкослойная хроматография (ТСХ) является наиболее распространенным методом анализа лекарственных, наркотических веществ и их метаболитов в биологических объектах и на этапе скрининга служит преобладающим источником информации. Данный метод применяется в общем и частном скрининге.

Для выбора условий разделения исследуемых веществ методом ТСХ использовали пластины на основе силикагеля «Сорбфил», которые имеют высокую степень активности, стандартизированную толщину сорбента.

Детекцию пятен проводили путем просмотра пластин в УФ-свете при длине волны 254 нм.

Предварительно нами была определена хроматографическая подвижность исследуемых веществ в общих системах растворителей, наиболее часто применяемых для веществ основного характера в химико-токсикологическом анализе.

В качестве общих систем использовали:

I. Бензол - диоксан - 25% раствор аммиака 12:7:1 в объемном соотношении.

II. Этилацетат - хлороформ - 25% раствор аммиака 17:2:1 в объемном соотношении.

III. Хлороформ - этанол - 25% раствор аммиака 30:30:1 в объемном соотношении.

IV. Толуол - ацетон - 25% раствор аммиака 50:50:1 в объемном соотношении.

V. Этилацетат - ацетон - этанол - 25% раствор аммиака 50:45:4:1 в объемном соотношении.

VI. Этанол - 25% раствор аммиака 49,25:0,75 в объемном соотношении.

VII. Этилацетат - метанол - ацетон - 25% раствор аммиака 7:1:1: 1в объемном соотношении.

VIII. Диоксан - хлороформ - ацетон - 25% раствор аммиака 47,5:45:5:2,5 в объемном соотношении.

Система диоксан - хлороформ - ацетон - 25% раствор аммиака в объемном соотношении 47,5:45:5:2,5 является наиболее подходящей из вышеперечисленных сочетаний для разделения исследуемыхлекарственных веществ. Данная система может быть рекомендована в скрининге при проведении ненаправленного анализа. В остальных общих системах, разделение исследуемых веществ идет недостаточно четко, наблюдается размытие зон адсорбции, а также наличие «хвостов».

Для увеличения значения ΔR_f между зонами исследуемых веществ провели варьирование количеством частей подвижной фазы диоксан - хлороформ - ацетон - 25% раствор аммиака 47,5:45:5:2,5, в объемном соотношении (базовая система).

Варьирование начинали с изменения содержания диоксана (50; 45; 42,5; 40). Увеличение количества диоксана в системе до 50 частей, что привело к резкому увеличению подвижности всех веществ и размыванию зон адсорбции. Последовательное уменьшение до 40 частей позволило уменьшить хроматографическую подвижность перхлозона, линезолида, абакавира, аминазина, фенобарбитала, амитриптилина, метронидазола и анальгина. Увеличение отмечалось у пиразинамида и циннаризина, у других веществ подвижность не изменилась.

На следующем этапе варьировали количеством хлороформа (50; 47; 43; 40). Увеличение его содержания в системе до 50 частей ухудшает подвижность и снижает разделяющую способность системы, приводя к размыванию пятен и уменьшению ΔR_f. Уменьшение до 45; 43 и 40 частей увеличивает подвижность только рифабутина, остальные препараты остаются на прежнем уровне.

В процессе варьирования содержанием ацетона (7; 6; 4) выяснено, что уменьшение количества частей практически не влияетна подвижность, а при увеличении до 6 частей пятна имеют более правильную форму. Дальнейшее увеличение эффекта не имеет.

Таким образом изменение количества хлороформа до 40 частей и ацетона до 6 частей в системе не оказывает значительного влияния на подвижность веществ, но способствует более «четкому» разделению.

Последним этапом эксперимента стало варьирование содержанием раствора аммиака 25%. Уменьшение с 2,5 до 2 привело к незначительному уменьшению подвижности и наложению зон адсорбции. Увеличение до 3,0 улучшило разделяющую способность. Однако дальнейшее увеличение до 3,5 частей способствует так же увеличению подвижности, что уменьшает ΔR_f. В связи с этим наилучшей разделяющей способностью обладает система содержащая 3 объемные части раствора аммиака.

Обобщая результаты проведенных экспериментов выбрана подвижная фаза диоксан - хлороформ - ацетон - 25% раствор аммиака в объемном соотношении 40:40:6:3, позволяющая наиболее эффективно разделить комбинированные сочетания перхлозона и рифабутина с другими противотуберкулезными противомикробными, антиретровирусными, психотропными, седативными и обезболивающими средствами наиболее часто применяемых совместно, и получить зоны веществ правильной формы.

Сопоставительный анализ с прототипом показывает, что заявляемое техническое решение отличается тем, что в качестве растворителя для изолирования перхлозона и рифабутина используют этилацетат при рН 3,0 и рН 10,0 соответственно, хроматографирование проводят в системе диоксан - хлороформ -ацетон - 25% раствор аммиака в соотношении 40:40:6:3, что соответствует критерию изобретения «новизна».

Новая совокупность признаков обеспечивает повышение селективности, объективности и чувствительности анализа, что соответствует критерию «промышленная применимость».

При анализе известных решений было выявлено, что в них отсутствуют сведения о влиянии отличительных признаков на достижение поставленного технического результата, следовательно, изобретение соответствует критерию «изобретательский уровень». Способ осуществляют следующим образом: к 10 мл биологической жидкости (10 мл слюны, предварительно замороженной в течение суток или 10 мл плазмы, обработанных 5 мл 50% раствора трихлоруксусной кислоты и очищенных от белков центрифугированием; 10 мл мочи) содержащих смесь исследуемых веществ, подкисляют с помощью 5 мл ацетатного буфера до рН 3,0 переносят в делительную воронку, добавляют 40 мл этилацетата и затем проводят экстракцию однократно в течение 7 минут. Далее к водной фазе добавляют 8 мл аммиачного буфера до рН 10,0 и экстрагируют трехкратно в течении 3 минут. Извлечения объединяют, переносят в фарфоровую чашку, и оставляют до удаления органического растворителя при комнатной температуре. Полученный сухой остаток растворяют в 2 мл этанола 95% и перемешивают.

На линию старта пластинки «Сорбфил» размером 10×10 см микропипеткой наносят по 0,4 мл раствора смеси. Рядом наносят по 0,4 мл растворов стандартных образцов веществ-свидетелей (СОВС) в хлороформе, содержащихся в смеси. Пластинку сушат на воздухе в течение 5 минут, а затем помещают в хроматографическую камеру сосмесью растворителей: диоксан - хлороформ - ацетон - 25% раствор аммиака в объемном соотношении 40:40:6:3 и хроматографируют восходящим методом. Когда фронт растворителя пройдет почти до конца пластинки, ее вынимают из камеры, сушат на воздухе в течение 20 минут и просматривают в УФ-свете при длине волны 254 нм.

Для приготовления растворов стандартных образцов веществ-свидетелей (СОВС) берут 0,1 мкг СОВС и растворяют в 10 мл этанола 95%.

Предлагаемый способ поясняется следующими примерами.

Пример 1. Готовят растворы извлечения из мочи, плазмы и слюны и растворы веществ-свидетелей описанным выше способом. Хроматографируют испытуемые растворы, используя оптимальную систему растворителей. Далее обнаруживают зоны веществ на хроматограмме УФ-светом.

На хроматограмме обнаружены зоны веществ со следующими значениями R_f: перхлозон 0,4±0,01, рифабутин 0,79±0,01, фтивазид 0,1±0,01, пиразинамид 0,46±0,01, линезолид 0,37±0,01, левофлоксацин 0,02±0,01, протионамид 0,56±0,01, абакавир 0,24±0,01, амитриптилин 0,71±0,01, фенобарбитал 0,3±0,01, аминазин 0,75±0,01, метронидазол 0,35±0,01, циннаризин 0,85±0,01, анальгин 0,5±0,01.

Данные примеры подтверждают, что предлагаемый способ может быть использован для химико-токсикологического и фармацевтического анализа перхлозона и рифабутина в комбинированных сочетаниях с другими противотуберкулезными, противомикробными, антиретровирусными, обезболивающими лекарственными средствами - фтивазидом, пиразинамидом, линезолидом, левофлоксацином, протионамидом, абакавиром, амитриптилином, аминазином, фенобарбиталом, циннаризином, метронидазолом, анальгином.

Таким образом, предлагаемый способ определения и обнаружения перхлозона и рифабутина в комбинированных сочетаниях после извлечения их из мочи, слюны и плазмы с использованием тонкослойной хроматографии позволяет повысить селективность, объективность и чувствительность анализа.

Изобретение относится к медицине, а именно к терапии, токсикологии, и может быть использовано для определения в моче, слюне или плазме крови лекарственных веществ. Осуществляют хроматографирование в тонком слое сорбента образцов определяемых веществ в растворе и образцов веществ-свидетелей. Готовят испытуемый раствор из 10 мл мочи, слюны или плазмы крови путем изолирования посредством 40 мл этилацетата при последовательном изменении показателя рН: рН=3,0, затем рН=10,0 с помощью буферных растворов. Проводят хроматографирование на пластинках «Сорбфил» в системе растворителей диоксан – хлороформ – ацетон – 25% раствор аммиака в объемном соотношении 40:40:6:3 и определение зон веществ на хроматограмме в УФ-свете при длине волны 254 нм. Определяют коэффициент подвижности R_f. При значениях R_f 0,4±0,01 определяют перхлозон, 0,79±0,01 – рифабутин, 0,1±0,01 – фтивазид, 0,46±0,01 – пиразинамид, 0,37±0,01 – линезолид, 0,02±0,01 – левофлоксацин, 0,56±0,01 – протионамид, 0,24±0,01 – абакавир, 0,71±0,01 – амитриптилин, 0,3±0,01 – фенобарбитал, 0,75±0,01 – аминазин, 0,35±0,01 – метронидазол, 0,85±0,01 – циннаризин, 0,5±0,01 – анальгин. Способ обеспечивает повышение селективности, объективности и чувствительности анализа в моче, слюне или плазме крови лекарственных веществ за счет того, что в качестве растворителя для изолирования лекарственных веществ используют этилацетат при последовательном изменении показателя рН: рН 3,0, затем рН 10,0, а хроматографирование проводят в системе диоксан – хлороформ – ацетон – 25% раствор аммиака в соотношении 40:40:6:3. 1 пр.

Способ определения в моче, слюне или плазме крови лекарственных веществ, включающий хроматографирование в тонком слое сорбента образцов определяемых веществ в растворе и образцов веществ-свидетелей, отличающийся тем, что готовят испытуемый раствор из 10 мл мочи, слюны или плазмы крови путем изолирования посредством 40 мл этилацетата при последовательном изменении показателя рН: рН=3,0, затем рН=10,0 с помощью буферных растворов, проводят хроматографирование на пластинках «Сорбфил» в системе растворителей диоксан – хлороформ – ацетон – 25% раствор аммиака в объемном соотношении 40:40:6:3 и определение зон веществ на хроматограмме в УФ-свете при длине волны 254 нм; определяют коэффициент подвижности R_f; и при значениях R_f 0,4±0,01 определяют перхлозон, 0,79±0,01 – рифабутин, 0,1±0,01 – фтивазид, 0,46±0,01 – пиразинамид, 0,37±0,01 – линезолид, 0,02±0,01 – левофлоксацин, 0,56±0,01 – протионамид, 0,24±0,01 – абакавир, 0,71±0,01 – амитриптилин, 0,3±0,01 – фенобарбитал, 0,75±0,01 – аминазин, 0,35±0,01 – метронидазол, 0,85±0,01 – циннаризин, 0,5±0,01 – анальгин.