СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ АЛЛОГЕННЫХ T-КЛЕТОК С CAR Российский патент 2024 года по МПК C12N5/00 C12N5/783 A61K35/17 A61P35/00 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА

[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет предварительной заявки на патент США №62/839449, поданной 26 апреля 2019 года, содержание которой включено в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0002] Настоящее изобретение относится к средам для выращивания клеток и к способам получения сконструированных иммунных клеток, в том числе клеток, содержащих химерные антигенные рецепторы (CAR) и сконструированные рецепторы Т-клетки (TCR), а также к способам лечения рака у пациента с их использованием.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

[0003] Данная заявка содержит перечень последовательностей, который был представлен в электронном виде в формате ASCII и включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. Указанная копия ASCII, созданная 17 апреля 2020 года, называется АТ-025_02WO_ST25.txt и имеет размер 15405 байт.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0004] Адоптивный перенос иммунных клеток, генетически модифицированных для распознавания антигенов, ассоциированных со злокачественными новообразованиями, является многообещающим новым подходом к лечению рака (см., например, Brenner et al., Current Opinion in Immunology, 22(2): 251-257 (2010); Rosenberg et al., Nature Reviews Cancer, 8(4): 299-308 (2008)). Иммунные клетки могут быть генетически модифицированы для экспрессии химерных антигенных рецепторов (CAR) (см., например, Eshhar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90(2): 720-724 (1993), и Sadelain et al., Curr. Opin. Immunol, 21(2): 215-223 (2009)). Иммунные клетки, содержащие CAR, например Т-клетки с CAR (CAR-T), сконструированы с приданием им антигенной специфичности при сохранении или усилении их способности распознавать и уничтожать целевую клетку. Эффективные среды для роста иммунных клеток и способы их применения могут быть особенно применимы для получения сконструированных иммунных клеток, таких как CAR-T. В настоящем документе представлены среды для выращивания клеток и способы получения, удовлетворяющие эту потребность.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ

[0005] В данном документе описываются улучшенные среды для культивирования иммунных клеток и способы применения. Например, в данном документе описываются среды, которые особенно подходят для размножения Т-клеток, которые могут быть использованы для получения клеток, применимых в видах адоптивной клеточной терапии, в том числе видах терапии с использованием химерных антигенных рецепторов (например, в терапии с помощью Т-клеток с CAR).

[0006] В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает среду для выращивания клеток для размножения Т-клеток, содержащую: первый стимулятор и второй стимулятор клеточной пролиферации, каждый из которых независимо выбран из группы, состоящей из IL-4, IL-7, IL-10, IL-12 и IL-15, и где первый стимулятор и второй стимулятор присутствуют при отношении концентраций от приблизительно 1000:1 до приблизительно 4:1.

[0007] В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает среду для выращивания клеток для размножения Т-клеток, содержащую внеклеточный модулятор клеточного метаболизма, который представляет собой внеклеточный калий, в концентрации от приблизительно 4 мМ до приблизительно 40 мМ.

[0008] В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает среду для выращивания клеток для размножения Т-клеток, содержащую первый стимулятор и второй стимулятор клеточной пролиферации, каждый из которых независимо выбран из группы, состоящей из IL-4, IL-7, IL-10, IL-12 и IL-15; и внеклеточный модулятор клеточного метаболизма, который представляет собой внеклеточный калий, в концентрации от приблизительно 4 мМ до приблизительно 40 мМ; и при этом первый стимулятор и второй стимулятор присутствуют при отношении концентраций от приблизительно 1000:1 до приблизительно 4:1.

[0009] В некоторых вариантах осуществления первый стимулятор клеточной пролиферации представляет собой IL-7.

[0010] В некоторых вариантах осуществления второй стимулятор клеточной пролиферации представляет собой IL-15.

[0011] В некоторых вариантах осуществления первый стимулятор и второй стимулятор присутствуют при отношении концентраций от приблизительно 500:1 до приблизительно 10:1, от приблизительно 250:1 до приблизительно 10:1, от приблизительно 200:1 до приблизительно 10:1, от приблизительно 150:1 до приблизительно 10:1, от приблизительно 100:1 до приблизительно 10:1, от приблизительно 500:1 до приблизительно 50:1, от приблизительно 250:1 до приблизительно 50:1, от приблизительно 200:1 до приблизительно 50:1, от приблизительно 150:1 до приблизительно 50:1, от приблизительно 100:1 до приблизительно 50:1, от приблизительно 500:1 до приблизительно 75:1, от приблизительно 250:1 до приблизительно 75:1, от приблизительно 200:1 до приблизительно 75:1, от приблизительно 150:1 до приблизительно 75:1, от приблизительно 100:1 до приблизительно 75:1, от приблизительно 10:1 до приблизительно 4:1, от приблизительно 8:1 до приблизительно 4:1 или от приблизительно 7:1 до приблизительно 6:1.

[0012] В некоторых вариантах осуществления первый стимулятор и второй стимулятор присутствуют при отношении концентраций приблизительно 150:1, приблизительно 140:1, приблизительно 130:1, приблизительно 120:1, приблизительно 110:1, приблизительно 100:1, приблизительно 90:1, приблизительно 80:1 или приблизительно 70:1.

[0013] В некоторых вариантах осуществления первый стимулятор представляет собой IL-7, присутствующий при концентрации от приблизительно 100 МЕ/мл до приблизительно 5000 МЕ/мл; и второй стимулятор представляет собой IL-15, присутствующий при концентрации от приблизительно 1 МЕ/мл до приблизительно 100 МЕ/мл.

[0014] В некоторых вариантах осуществления IL-7 присутствует в концентрации от приблизительно 300 МЕ/мл до приблизительно 5000 МЕ/мл, и IL-15 присутствует в концентрации, которая составляет от приблизительно 25 МЕ/мл до приблизительно 50 МЕ/мл.

[0015] В некоторых вариантах осуществления IL-7 присутствует в концентрации приблизительно 5000 МЕ/мл, и IL-15 присутствует в концентрации, которая составляет приблизительно 50 МЕ/мл.

[0016] В некоторых вариантах осуществления первый стимулятор и второй стимулятор добавляют в клеточную культуру одновременно или последовательно.

[0017] В некоторых вариантах осуществления внеклеточный калий присутствует в концентрации от приблизительно 4 мМ до приблизительно 40 мМ; от приблизительно 10 мМ до приблизительно 35 мМ; от приблизительно 10 мМ до приблизительно 25 мМ; от приблизительно 20 мМ до приблизительно 35 мМ; от приблизительно 20 мМ до приблизительно 25 мМ или от приблизительно 20 мМ до приблизительно 30 мМ.

[0018] В некоторых вариантах осуществления внеклеточный калий присутствует в концентрации приблизительно 20 мМ или приблизительно 25 мМ.

[0019] В некоторых вариантах осуществления внеклеточный калий присутствует в концентрации менее чем 40 мМ и более чем 4 мМ; менее чем 40 мМ и более чем 10 мМ; менее чем 40 мМ и более чем 20 мМ или менее чем 40 мМ и равной или более чем 25 мМ.

[0020] В некоторых вариантах осуществления внеклеточный калий присутствует в виде KCl.

[0021] В некоторых вариантах осуществления полученную популяцию Т-клеток обогащают T_CM- и/или T_SCM-клетками.

[0022] В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает способ получения популяции Т-клеток in vitro, включающему культивирование исходной популяции Т-клеток со средой для выращивания клеток, содержащей первый стимулятор и второй стимулятор клеточной пролиферации, каждый из которых независимо выбран из группы, состоящей из IL-4, IL-7, IL-10, IL-12 и IL-15; и внеклеточный модулятор клеточного метаболизма, который представляет собой внеклеточный калий, в концентрации от приблизительно 4 мМ до приблизительно 40 мМ; и при этом первый стимулятор и второй стимулятор присутствуют при отношении концентраций от приблизительно 1000:1 до приблизительно 4:1, и при этом полученную популяцию Т-клеток обогащают T_CM- и/или T_SCM-клетками.

[0023] В некоторых вариантах осуществления среда для выращивания клеток представляет собой среду для выращивания клеток, описанную выше.

[0024] В некоторых вариантах осуществления полученная популяция Т-клеток содержит по меньшей мере приблизительно 30%, 35%, 40% или 45% T_SCM-клеток.

[0025] В некоторых вариантах осуществления полученная популяция Т-клеток содержит по меньшей мере приблизительно 40% T_SCM-клеток.

[0026] В некоторых вариантах осуществления полученная популяция Т-клеток в от приблизительно 100 раз до приблизительно 1000 раз больше исходной популяции Т-клеток, как измерено за период приблизительно 7-16 дней.

[0027] В некоторых вариантах осуществления полученная популяция Т-клеток в от приблизительно 100 раз до приблизительно 1000 раз больше исходной популяции Т-клеток, как измерено за период приблизительно 10-14 дней.

[0028] В некоторых вариантах осуществления полученная популяция Т-клеток в по меньшей мере приблизительно 100 раз или в приблизительно 200 раз больше исходной популяции Т-клеток.

[0029] В некоторых вариантах осуществления полученная популяция Т-клеток обогащена в от приблизительно 100 раз до приблизительно 1000 раз большим количеством T_CM- и/или T_SCM-клеток, чем количество T_CM- и/или T_SCM-клеток в исходной популяции Т-клеток, как измерено за период приблизительно 7-16 дней.

[0030] В некоторых вариантах осуществления полученная популяция Т-клеток обогащена в от приблизительно 100 раз до приблизительно 1000 раз большим количеством T_CM- и/или T_SCM-клеток, чем количество T_CM- и/или T_SCM-клеток в исходной популяции Т-клеток, как измерено за период приблизительно 10-14 дней.

[0031] В некоторых вариантах осуществления полученная популяция Т-клеток обогащена по меньшей мере в приблизительно 100 раз или по меньшей мере в приблизительно 200 раз большим количеством T_CM- и/или T_SCM-клеток, чем количество T_CM- и/или T_SCM-клеток в исходной популяции Т-клеток.

[0032] В некоторых вариантах осуществления исходная популяция Т-клеток представляет собой популяцию сконструированных Т-клеток.

[0033] В некоторых вариантах осуществления исходная популяция Т-клеток представляет собой популяцию Т-клеток, экспрессирующих один или более химерных антигенных рецепторов.

[0034] В некоторых вариантах осуществления Т-клетки представляют собой аллогенные Т-клетки.

[0035] В некоторых вариантах осуществления Т-клетки представляют собой аутологичные Т-клетки.

[0036] В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает популяцию сконструированных иммунных клеток, где указанная популяция содержит Т-клетки, экспрессирующие один или более химерных антигенных рецепторов (Т-клетки с CAR), и где указанные Т-клетки с CAR получают с использованием среды для выращивания клеток, описанной выше.

[0037] В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает популяцию сконструированных иммунных клеток, где указанная популяция содержит Т-клетки, экспрессирующие один или более химерных антигенных рецепторов (Т-клетки с CAR), и где указанные Т-клетки с CAR получают с использованием способа, описанного выше.

[0038] В некоторых вариантах осуществления Т-клетки с CAR включают по меньшей мере приблизительно 30%, 35%, 40% или 45% T_SCM-клеток.

[0039] В некоторых вариантах осуществления Т-клетки с CAR включают по меньшей мере приблизительно 40% T_SCM-клеток.

[0040] В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает фармацевтическую композицию, содержащую популяцию сконструированных иммунных клеток, описанных выше.

[0041] В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает способ лечения заболевания или нарушения у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение субъекту сконструированной иммунной клетки, описанной выше, или фармацевтической композиции, описанной выше.

[0042] В некоторых вариантах осуществления заболевание или нарушение представляет собой рак.

[0043] В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает изделие, содержащее сконструированную иммунную клетку, описанную выше, или фармацевтическую композицию, описанную выше.

[0044] Все варианты осуществления, представленные в данном документе, применимы ко всем аспектам, раскрытым в настоящем изобретении.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[0045] На фиг. 1А показано сравнение CAR Т⁺ фенотипов с использованием способов, включающих: последовательную стимуляцию с помощью IL-2; стимуляцию с помощью IL-2 с последующей стимуляцией с помощью IL-7 + IL-15 и последовательную стимуляцию с помощью IL-7 + IL-15. Способы, основанные на использовании IL-7 + IL-15 обеспечивают увеличение количества T_SCM Т-клеток с CAR.

[0046] На фиг. 1В показана способность CD19-специфических Т-клеток с CAR к высвобождению цитокинов при воздействии на целевые клетки, где Т-клетки с CAR получали с использованием способов получения, включающих последовательную стимуляцию с помощью IL-2; стимуляцию с помощью IL-2 с последующей стимуляцией с помощью IL-7 + IL-15 и последовательную стимуляцию с помощью IL-7 + IL-15.

[0047] На фиг. 2А показан эффект повышения уровня внеклеточного калия (40 мМ, незакрашенные столбцы) на увеличение количества T_SCM-клеток в процессах IL-2- и IL-7 + 15 по сравнению с нормальными (4 мМ) концентрациями калия (закрашенные столбцы).

[0048] На фиг. 2В показан эффект повышения уровня внеклеточного калия (40 мМ, незакрашенные столбцы) на способность размножения аллогенных Т-клеток с CAR в пспособах с использованием IL-2- и IL-7+15 по сравнению с нормальными (4 мМ) концентрациями калия (4 мМ, закрашенные столбцы).

[0049] На фиг. 3 показан эффект концентраций внеклеточного калия 25 мМ и 10 мМ: эти концентрации не оказывали отрицательного воздействия на размножение Т-клеток человека в ходе получения аллогенных Т-клеток с CAR по сравнению с более высокими концентрациями.

[0050] На фиг. 4 показано, что максимальное сохранение T_SCM-клеток достигали при 25 мМ внеклеточного калия.

[0051] На фиг. 5 показано, что улучшенную эффективность Flt3-специфических Т-клеток с CAR (Allo-819) получали с использованием комбинации способа, основанного на использовании IL-7+15, с добавлением 25 мМ внеклеточного калия.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

[0052] В данном документе описываются среды для выращивания клеток и способы, особенно применимые для культивирования иммунных клеток.

[0053] Адоптивная клеточная терапия с использованием сконструированных иммунных клеток является одним из типов иммунотерапии, который стал особенно многообещающим новым подходом к лечению рака. Получение и изготовление сконструированных иммунных клеток предусматривает сбор иммунных клеток (например, Т-клеток) у субъекта с последующим размножением клеток in vitro. Успешное размножение иммунных клеток in vitro (например, Т-клеток) характеризуется как достаточной клеточной пролиферацией, так и получением необходимых клеточных фенотипов.

[0054] Например, размножение Т-клеток может приводить к образованию смеси Т-клеток, которая включает подгруппы интактных Т-клеток (T_N), Т-клеток памяти (в том числе подобных стволовым клеткам Т-клеток памяти (T_SCM), центральных Т-клеток памяти (T_CM) и эффекторных Т-клеток памяти (T_CM)), и эффекторных (T_EFF) Т-клеток. Варьирующие количества различных подгрупп Т-клеток могут влиять на терапевтический профиль и эффективность полученных сконструированных Т-клеток. В частности, с терапевтической точки зрения необходимы способы размножения Т-клеток, которые обеспечивают повышенные количества Т-клеток на ранних стадиях дифференциации.

[0055] Следовательно, среды для выращивания клеток, описанные в данном документе, могут быть особенно полезны для размножения Т-клеток, в которых повышается доля T_SCM- и/или T_CM-клеток. T_SCM-клетки представляют собой наименее дифференцированный тип Т-клеток памяти и в адоптивной Т-клеточной терапии могут быть особенно полезными для обеспечения пролонгированной пролиферации Т-клеток in vivo после введения сконструированных клеток пациенту. Следовательно, использование таких среды для культивирования клеток и иммунных клеток (например, Т-клеток), полученных с использованием таких сред, может обеспечивать более эффективные виды клеточной терапии на основе адоптивного переноса клеток, включая виды терапии с использованием Т-клеток с CAR, описанных в данном документе.

[0056] В частности, среды для выращивания клеток, содержащие комбинации различных стимуляторов клеточной пролиферации (например, первого и второго фактора роста Т-клеток) в комбинации с внеклеточным модулятором клеточного метаболизма, могут приводить к необходимым клеточной пролиферации и фенотипам клеток.

[0057] В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает среду для выращивания клеток (например, среду, подходящую для размножения Т-клеток), содержащую:

первый стимулятор клеточной пролиферации (например, первый цитокин, который стимулирует Т-клеточную пролиферацию);

второй стимулятор клеточной пролиферации (например, второй цитокин, который стимулирует Т-клеточную пролиферацию) и

внеклеточный модулятор клеточного метаболизма (например, Т-клеточного метаболизма).

[0058] В частности, комбинации и концентрации цитокина и метаболических модуляторов, описанные в данном документе, обеспечивают новые среды для размножения Т-клеток, которые могут приводить к повышенной эффективности препаратов клеточной терапии на основе иммунных клеток, в том числе препаратов клеточной терапии на основе генетически модифицированных аллогенных клеток и препаратов клеточной терапии на основе аутологичных клеток. В одном варианте осуществления с помощью комбинации стимуляторов IL-7 и IL-15 вместе с повышенным содержанием внеклеточного калия можно достигать улучшений в получении необходимых фенотипов аллогенных Т-клеток с CAR (например, увеличенной популяции TSCM-клеток) и/или препаратов клеточной терапии на основе аутологичных клеток по сравнению с классическими условиями размножения, основанными на использовании IL-2.

1. Иммунные клетки

[0059] Клетки, подходящие для культивирования с использованием описанных в данном документе сред и способов, включают иммунные клетки.

[0060] До манипуляции in vitro или генетической модификации (например, как описано в данном документе) клетки для применения в описанных в данном документе способах (например, иммунные клетки) могут быть получены от субъекта. Клетки могут быть получены из ряда неограничивающих источников, включая мононуклеарные клетки периферической крови, костный мозг, ткань лимфатических узлов, пуповинную кровь, ткань тимуса, иммунные клетки, полученные из стволовых клеток или iPSC, ткань из очага инфекции, асциты, плевральный выпот, ткань селезенки и опухоли. В некоторых вариантах осуществления можно использовать любое количество доступных и известных специалистам в данной области техники линий Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления клетки могут быть получены от здорового донора, от пациента, у которого диагностирован рак, или от пациента, у которого диагностирована инфекция. В некоторых вариантах осуществления клетки могут быть частью смешанной популяции клеток, которые обладают разными фенотипическими характеристиками.

[0061] В некоторых вариантах осуществления иммунные клетки получают от субъекта, который в конечном итоге получит сконструированные иммунные клетки. В некоторых вариантах осуществления иммунные клетки получают от донора, который является индивидуумом, отличным от субъекта, который получит сконструированные иммунные клетки.

[0062] В некоторых вариантах осуществления иммунные клетки включают Т-клетки. Т-клетки могут быть получены из ряда источников, включая мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС), костный мозг, ткань лимфатических узлов, пуповинную кровь, ткань тимуса, Т-клетки, полученные из стволовых клеток или iPSC, ткань из очага инфекции, асциты, плевральный выпот, ткань селезенки и опухоли. В некоторых определенных вариантах осуществления Т-клетки можно получать из объема крови, взятой у субъекта, с использованием любого числа методик, известных специалисту, таких как разделение с помощью FICOLL™.

[0063] Клетки можно получать из циркулирующей крови индивидуума посредством афереза. Продукт, полученный посредством афереза, обычно содержит лимфоциты, включая Т-клетки, моноциты, гранулоциты, В-клетки, другие ядерные лейкоциты, эритроциты и тромбоциты. В некоторых определенных вариантах осуществления клетки, собранные посредством афереза, можно промыть для удаления фракции плазмы крови и поместить в соответствующие буфер или среды для последующей обработки.

[0064] РВМС можно использовать непосредственно для генетической модификации иммунными клетками (такими как CAR или TCR) с использованием способов, описанных в данном документе. В некоторых определенных вариантах осуществления после выделения РВМС далее могут быть выделены Т-лимфоциты, и как цитотоксические, так и хелперные Т-лимфоциты могут быть отсортированы на субпопуляции интактных, Т-клеток памяти и эффекторных Т-клеток либо до, либо после генетической модификации и/или размножения.

[0065] В некоторых определенных вариантах осуществления Т-клетки выделяют из РВМС путем лизирования эритроцитов и истощения моноцитов, например, посредством центрифугирования в градиенте PERCOLL™. Определенные субпопуляции Т-клеток, такие как Т-клетки CCR7+, CD95+, CD122, CD27+, CD69+, CD127+, CD28+, CD3+, CD4+, CD8+, CD25+, CD62L+, CD45RA+и CD45RO+, могут быть далее выделены посредством известных из уровня техники методик положительного или отрицательного отбора. Например, обогащение популяции Т-клеток путем отрицательного отбора может быть достигнуто с помощью комбинации антител, направленных на поверхностные маркеры, уникальные для полученных отрицательным отбором клеток. Одним из способов применения в данном документе является сортировка и/или отбор клеток с помощью отрицательной магнитной иммуноадгезии или проточной цитометрии, в которой используют коктейль моноклональных антител, направленных на маркеры клеточной поверхности, присутствующие на полученных отрицательным отбором клетках. Например, для обогащения клетками CD4+ путем отрицательного отбора коктейль моноклональных антител обычно включает антитела к CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR и CD8. Проточная цитометрия и сортировка клеток также могут быть использованы для выделения представляющих интерес популяций клеток для применения в настоящем изобретении.

[0066] В некоторых вариантах осуществления популяцию Т-клеток обогащают клетками С4+.

[0067] В некоторых вариантах осуществления популяцию Т-клеток обогащают клетками CD8+.

[0068] В некоторых вариантах осуществления клетки CD8+ далее сортируют на интактные, центральные клетки памяти и эффекторные клетки путем идентификации антигенов клеточной поверхности, которые ассоциированы с каждым из этих типов клеток CD8+. В некоторых вариантах осуществления экспрессия фенотипических маркеров центральных Т-клеток памяти включает экспрессию CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3 и CD127 и является отрицательной в отношении гранзима В. В некоторых вариантах осуществления центральные Т-клетки памяти представляют собой Т-клетки CD45RO+, CD62L+ и/или CD8+. В некоторых вариантах осуществления эффекторные Т-клетки являются отрицательными в отношении CD62L, CCR7, CD28 и/или CD127 и положительными в отношении гранзима В и перфорина. В некоторых определенных вариантах осуществления Т-клетки CD4+ дополнительно сортируют по субпопуляциям. Например, Т-хелперные клетки CD4+ можно сортировать на интактные, центральные клетки памяти и эффекторные клетки путем идентификации клеточных популяций, которые имеют антигены клеточной поверхности.

[0069] Следует учитывать, что РВМС могут дополнительно включать другие цитотоксические лимфоциты, такие как NK-клетки или NKT-клетки. Вектор экспрессии, несущий кодирующую последовательность химерного рецептора, как раскрыто в данном документе, может быть введен в популяцию донорских Т-клеток человека, NK-клеток или NKT-клеток. Успешно трансдуцированные Т-клетки, несущие вектор экспрессии, могут быть отсортированы с использованием проточной цитометрии для выделения CD3-положительных Т-клеток, а затем размножены для увеличения количества этих экспрессирующих CAR Т-клеток в дополнение к активации клеток с использованием антител к CD3 и IL-2 или других способов, известных из уровня техники, как описано в других местах в данном документе. Стандартные процедуры используют для криоконсервации Т-клеток, экспрессирующих CAR, для хранения и/или получения для использования в отношении субъекта-человека. В одном варианте осуществления трансдукцию, культивирование и/или размножение Т-клеток in vitro проводят в отсутствие продуктов, полученных от животных, отличных от человека, таких как фетальная телячья сыворотка и фетальная бычья сыворотка.

2. Сконструированные иммунные клетки

[0070] Среды для выращивания клеток и способы применения, описанные в данном документе, могут быть особенно применимы в размножении иммунных клеток in vitro, в том числе сконструированных иммунных клеток (например, Т-клеток с CAR).

[0071] Сконструированные иммунные клетки могут быть аллогенными или аутологичными.

[0072] В некоторых вариантах осуществления сконструированная иммунная клетка представляет собой Т-клетку (например, воспалительный Т-лимфоцит, цитотоксический Т-лимфоцит, регуляторный Т-лимфоцит, хелперный Т-лимфоцит, инфильтрующий опухоль лимфоцит (TIL)), NK-клетку, NK-T-клетку, TCR-экспрессирующую клетку, дендритную клетку, дендритную клетку-киллер, тучную клетку или В-клетку. В некоторых вариантах осуществления клетка может быть получена из группы, состоящей из Т-лимфоцитов CD4+ и Т-лимфоцитов CD8+. В некоторых иллюстративных вариантах осуществления сконструированная иммунная клетка представляет собой Т-клетку.

[0073] В некоторых вариантах осуществления сконструированная иммунная клетка может быть получена, например, без ограничения из стволовой клетки. Стволовые клетки могут быть зрелыми стволовыми клетками, не являющимися человеческими эмбриональными стволовыми клетками, более конкретно не являющимися человеческими стволовыми клетками, стволовыми клетками пуповинной крови, клетками-предшественниками, стволовыми клетками костного мозга, индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками, тотипотентными стволовыми клетками или гематопоэтическими стволовыми клетками.

[0074] В некоторых вариантах осуществления клетку получают или выделяют из периферической крови. В некоторых вариантах осуществления клетку получают или выделяют из мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС). В некоторых вариантах осуществления клетку получают или выделяют из костного мозга. В некоторых вариантах осуществления клетку получают или выделяют из пуповинной крови. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой клетку человека. В некоторых вариантах осуществления клетку трансфицируют или трансдуцируют вектором нуклеиновой кислоты с использованием способа, выбранного из группы, состоящей из электропорации, сонопорации, биолистики (например, генной пушки), липидной трансфекции, полимерной трансфекции, наночастиц или полиплексов.

а. Связывающие средства (в том числе антитела)

[0075] В некоторых вариантах осуществления сконструированные иммунные клетки содержат антигенсвязывающее средство (например, содержащее антигенсвязывающий домен или содержащее антитело или его фрагмент).

[0076] Используемый в данном документе термин «антитело» относится к полипептиду, который включает элементы канонической последовательности иммуноглобулина, достаточные для обеспечения специфического связывания с конкретным целевым антигеном. Как известно из уровня техники, интактные антитела, продуцируемые в природе, представляют собой тетрамерные средства массой приблизительно 150 кДа, состоящие из двух идентичных полипептидов тяжелой цепи (приблизительно 50 кДа каждый) и двух идентичных полипептидов легкой цепи (приблизительно 25 кДа каждый), которые связываются друг с другом в то, что обычно называют «Y-образной» структурой. Каждая тяжелая цепь состоит по меньшей мере из четырех доменов (каждый длиной приблизительно 110 аминокислот) - аминоконцевого вариабельного (VH) домена (расположенного на концах Y-образной структуры), за которым следуют три константных домена: CHI, СН2 и карбоксиконцевой CH3 (расположенный в основании «ствола» Y). Короткая область, известная как «переключатель», соединяет вариабельную и константную области тяжелой цепи. «Шарнир» соединяет домены СН2 и CH3 с остальной частью антитела. Две дисульфидные связи в этой шарнирной области соединяют два полипептида тяжелой цепи друг с другом в интактном антителе. Каждая легкая цепь состоит из двух доменов - амино-концевого вариабельного (VL) домена, за которым следует карбокси-концевой константный (CL) домен, отделенных друг от друга другим «переключателем». Специалисты в данной области техники хорошо знакомы со структурой антитела и элементами последовательностей, распознают «вариабельные» и «константные» области в представленных последовательностях и понимают, что может существовать некоторая гибкость в определении «границы» между такими доменами, так что разные представления одной и той же последовательности цепи антитела могут, например, указывать на такую границу в положении, которое сдвинуто на один или более остатков относительно другого представления той же последовательности цепи антитела.

[0077] Тетрамеры интактных антител состоят из двух димеров тяжелая цепь-легкая цепь, в которых тяжелая и легкая цепи связаны друг с другом одной дисульфидной связью; две другие дисульфидные связи соединяют шарнирные области тяжелой цепи друг с другом, так что димеры соединяются друг с другом и образуется тетрамер. Антитела, продуцируемые естественным путем, также гликозилируются, как правило, по домену СН2. Каждый домен в природном антителе имеет структуру, характеризующуюся «иммуноглобулиновой складкой», образованной двумя бета-листами (например, 3-, 4- или 5-нитевыми листами), упакованными друг против друга в сжатый бета-цилиндр в антипараллельной ориентации. Каждый вариабельный домен содержит три гипервариабельные петли, известные как «определяющие комплементарность области» (CDR1, CDR2 и CDR3), и четыре в некоторой степени инвариантные «каркасные» области (FR1, FR2, FR3 и FR4). При сворачивании природных антител FR-области образуют бета-листы, которые обеспечивают структурную основу для доменов, а области петель CDR как тяжелой, так и легкой цепей объединяются вместе в трехмерном пространстве, так что они создают единый гипервариабельный антигенсвязывающий сайт, расположенный на вершине Y-образной структуры. Fc-область встречающихся в природе антител связывается с элементами системы комплемента, а также с рецепторами на эффекторных клетках, в том числе, например, на эффекторных клетках, которые опосредуют цитотоксичность. Как известно из уровня техники, аффинность и/или другие свойства связывания Fc-областей с Fc-рецепторами можно модулировать посредством гликозилирования или другой модификации. В некоторых вариантах осуществления антитела, получаемые и/или используемые в соответствии с настоящим изобретением, включают гликозилированные Fc-домены, в том числе Fc-домены, модифицированные или сконструированные посредством такого гликозилирования.

[0078] В контексте настоящего изобретения в некоторых определенных вариантах осуществления любой полипептид или комплекс полипептидов, который включает достаточные последовательности доменов иммуноглобулина, обнаруженных в природных антителах, может называться и/или использоваться как «антитело», независимо от того, продуцируется ли такой полипептид в естественных условиях (например, создается организмом, реагирующим на антиген), или получен посредством рекомбинантной инженерией, химического синтеза или с помощью других искусственной системой или методики. В некоторых вариантах осуществления антитело является поликлональным; в некоторых вариантах осуществления антитело является моноклональным. В некоторых вариантах осуществления антитело имеет последовательности константной области, которые характерны для антител мыши, кролика, приматов или человека. В некоторых вариантах осуществления элементы последовательности антитела являются гуманизированными, приматизированными, химерными и т.д., как известно из уровня техники.

[0079] Более того, используемый в данном документе термин «антитело» может относиться в соответствующих вариантах осуществления (если не указано иное или ясно из контекста) к любым из известных из уровня техники или разработанных конструкций или форматов для использования структурных и функциональных признаков антитела в альтернативном представлении. Например, в некоторых вариантах осуществления антитело в соответствии с настоящим изобретением имеет формат, выбранный без ограничения интактных антител IgA, IgG, IgE или IgM; би- или мультиспецифических антител (например, Zybodies® и т.п.); фрагментов антител, таких как Fab-фрагменты, Fab'-фрагменты, F(ab')2-фрагменты, Fd'-фрагменты, Fd-фрагменты и выделенные CDR или их наборы; одноцепочечных Fv; слияний полипептид-Fc; однодоменных антител (например, однодоменных антител акулы, таких как IgNAR или его фрагменты); верблюжьих антител; маскированных антител (например, Probodies®); иммунофармацевтических средств на основе малого модульного белка (SMIP™); одноцепочечных или тандемных диател (TandAb®); VHH; Anticalin®; минител Nanobodies®; BiTE®; белков с анкириновым повтором или DARPIN®; Avimer®; DART; TCR-подобных антител; Adnectin®; Affilin®; Trans-bodies®; Affibodies®; TrimerX®; микробелка; Fynomer®, Centyrin® и KALBITOR®. В некоторых вариантах осуществления в антителе может отсутствовать ковалентная модификация (например, присоединение гликана), которая у него была бы, если бы оно было продуцировано естественным путем. В некоторых вариантах осуществления антитело может содержать ковалентную модификацию (например, присоединение гликана), нагрузку (например, выявляемый фрагмент, терапевтический фрагмент, каталитический фрагмент и т.д.) или другую боковую группу (например, полиэтиленгликоль и т.д.).

[0080] В некоторых вариантах осуществления антитело или связывающее средство может быть «симметричным». Под «симметричным» подразумевается, что антитело или связывающее средство имеет один и тот же тип Fv-областей (например, антитело имеет две Fab-области). В некоторых вариантах осуществления антитело или связывающее средство может быть «асимметричным». Под «асимметричным» подразумевается, что антитело или связывающее средство имеет по меньшей мере два разных типа Fv-областей (например, антитело имеет Fab- и scFv-области, Fab- и scFv2-области или области Fab-VHH). Из уровня техники известны различные асимметричные структуры антител или связывающих средств (Brinkman and Kontermann et al. 2017 Mabs (9)(2): 182-212).

[0081] Используемый в данном документе термин «средство на основе антитела» относится к средству, которое специфически связывается с конкретным антигеном. В некоторых вариантах осуществления данный термин охватывает любой полипептид или полипептидный комплекс, который включает структурные элементы иммуноглобулина, достаточные для обеспечения специфического связывания. Иллюстративные средства на основе антител включают без ограничения моноклональные антитела или поликлональные антитела. В некоторых вариантах осуществления средство на основе антитела может включать одну или более последовательностей константной области, которые характерны для антител мыши, кролика, приматов или человека. В некоторых вариантах осуществления средство на основе антитела может включать один или более элементов последовательности, которые являются гуманизированными, приматизированными, химерными и т.д., как известно из уровня техники. Во многих вариантах осуществления термин «средство на основе антитела» используют в отношении одной или более из известных из уровня техники или разработанных конструкций или форматов для использования структурных и функциональных признаков антитела в альтернативном представлении. Например, средство на основе антитела, используемое в соответствии с настоящим изобретением, имеет формат, выбранный без ограничения из интактных антител IgA, IgG, IgE или IgM; би- или мультиспецифических антител (например, Zybodies^® и т.п.); фрагментов антител, таких как Fab-фрагменты, Fab'-фрагменты, F(ab')2-фрагменты, Fd'-фрагменты, Fd-фрагменты и выделенные CDR или их наборы; одноцепочечных Fv; слияний полипептид-Fc; однодоменных антител (например, однодоменных антител акулы, таких как IgNAR или его фрагменты); верблюжьих антител; маскированных антител (например, Probodies^®); иммунофармацевтических средств на основе малого модульного белка ("SMIP™); одноцепочечных или тандемных диател (TandAb^®); VHH; Anticalin^®; минител Nanobodies^®; BiTE^®; белков с анкириновым повтором или DARPIN^®; Avimer^®; DART; TCR-подобных антител; Adnectin^®; Affilin^®; Trans-bodies^®; Affibodies^®; TrimerX^®; микробелков; Fynomer^®, Centyrin^® и KALBITOR^®.

[0082] Антитело или антигенсвязывающая молекула, кодируемые в соответствии с настоящим изобретением, могут быть одноцепочечными или двухцепочечными. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающая молекула являются одноцепочечными. В некоторых определенных вариантах осуществления антигенсвязывающая молекула выбрана из группы, состоящей из scFv, Fab, Fab', Fv, F(ab')₂, dAb и любой их комбинации.

[0083] Антитела включают фрагменты антител. Фрагмент антитела содержит часть интактного антитела, такуюкак антигенсвязывающая или вариабельная область интактного антитела. Фрагменты антител включают без ограничения Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂, Fv, диатело, линейные антитела, мультиспецифические, образованные из фрагментов антител антитела и scFv-фрагменты, а также другие фрагменты, описанные ниже. Антитела также включают без ограничения поликлональное, моноклональное, химерное dAb (доменное антитело), одноцепочечное, F_ab, F_a, F_(ab)2-фрагменты, scFv и библиотеки экспрессии F_ab. Антитело может быть целым антителом, или иммуноглобулином, или фрагментом антитела. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой полноразмерное антитело, например, интактное антитело IgG1 или другой класс или изотип антител, описанных в данном документе. (См., например, Hudson et al., Nat. Med., 9: 129-134 (2003); Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, pp. 269-315 (1994); Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993); WO93/01161 и патенты США №№5571894, 5869046, 6248516 и 5587458). Полноразмерное антитело, интактное антитело или целое антитело представляет собой антитело, имеющее структуру, по сути аналогичную структуре нативного антитела, или имеющее тяжелые цепи, которые содержат Fc-область, как определено в данном документе. Фрагменты антител могут быть получены различными методиками, включая без ограничения протеолитическое расщепление интактного антитела, а также продуцирование рекомбинантными клетками-хозяевами (например, Е. coli или фагом), как известно из уровня техники.

[0084] В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой или включает моноклональное антитело, в том числе химерное, гуманизированное или антитело человека.

[0085] В некоторых вариантах осуществления антигенспецифическое средство на основе антитела, представленное в данном документе, может быть химерным антителом (см., например, патент США №4816567 и Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)). Химерное антитело может представлять собой антитело, в котором часть тяжелой и/или легкой цепи получена из определенного источника или вида, а остальная часть тяжелой и/или легкой цепи получена из другого источника или вида. В одном примере химерное антитело может содержать не являющуюся человеческой вариабельную область (например, вариабельную область, полученную из мыши, крысы, хомяка, кролика или отличного от человека примата, такого как обезьяна) и константную область человека. В дополнительном примере химерное антитело может представлять собой антитело «переключенного класса», класс или подкласс которого был изменен по сравнению с таковым родительского антитела. Химерные антитела включают их антигенсвязывающие фрагменты.

[0086] В некоторых вариантах осуществления химерное антитело может представлять собой гуманизированное антитело (см., например, Almagro and Fransson, Front. Biosci., 13: 1619-1633 (2008); Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 86: 10029-10033 (1989); патенты США №№5821337, 7527791, 6982321 и 7087409; Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005); Padlan, Mol. Immunol, 28:489-498 (1991); Dall'Acqua et al., Methods, 36:43-60 (2005); Osbourn et al., Methods, 36:61-68 (2005); и Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000)). Гуманизированное антитело представляет собой химерное антитело, содержащее аминокислотные остатки из не являющихся человеческими гипервариабельных областей и аминокислотные остатки из FR человека. В некоторых определенных вариантах осуществления гуманизированное антитело будет включать по сути все из по меньшей мере одного, а обычно двух вариабельных доменов, в которых все или по сути все гипервариабельные области (например, CDR) соответствуют таковым не являющегося человеческим антитела, и все или по сути все FR, соответствующие таковым антитела человека. Гуманизированное антитело необязательно может содержать по меньшей мере часть константной области антитела, полученной из антитела человека.

[0087] Не являющееся человеческим антитело может быть гуманизировано для снижения иммуногенности для людей при сохранении специфичности и аффинности исходного не являющегося человеческим антитела. Гуманизированное антитело может содержать один или более вариабельных доменов, содержащих одну или более CDR или их частей, полученных из не являющегося человеческим антитела. Гуманизированное антитело может содержать один или более вариабельных доменов, содержащих одну или более FR или их частей, полученных из последовательностей антитела человека. Гуманизированное антитело может необязательно содержать по меньшей мере часть константной области человека. В некоторых вариантах осуществления один или более остатков FR в гуманизированном антителе заменены соответствующими остатками из не являющегося человеческим антитела (например, антитела, из которого получены остатки CDR) для восстановления или улучшения специфичности или аффинности антитела.

[0088] Каркасные области человека, которые могут быть использованы для гуманизации, включают без ограничения каркасные области, отобранные с использованием способа «наилучшего соответствия»; каркасные области, полученные из консенсусной последовательности антител человека конкретной подгруппы вариабельных областей легкой или тяжелой цепи; зрелые (соматически мутированные) каркасные области человека или каркасные области зародышевой линии человека, а также каркасные области, полученные из скрининговых библиотек FR (см., например, Sims et al., J. Immunol, 151:2296 (1993); Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol, 151:2623 (1993); Baca et al., J. Biol. Chem., 272: 10678-10684 (1997); и Rosok et al., J. Biol. Chem., 271: 22611-22618(1996)).

[0089] В некоторых вариантах осуществления средство на основе антитела, представленное в данном документе, представляет собой антитело человека. Антитела человека могут быть получены с использованием различных методик, известных из уровня техники (см., например, van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol, 5: 368-74 (2001); и Lonberg, Curr. Opin. Immunol, 20:450-459 (2008)). Антитело человека может представлять собой антитело, которое обладает аминокислотной последовательностью, соответствующей таковой антитела, продуцируемого человеком или клеткой человека, или полученного из не являющегося человеческим источника, который использует репертуар антител человека, или других последовательностей, кодирующих антитело человека. Это определение антитела человека специально исключает гуманизированное антитело, содержащее не являющиеся человеческими антигенсвязывающие остатки. Антитела человека могут быть получены путем введения иммуногена трансгенному животному, которое было модифицировано для продуцирования интактных антител человека или интактных антител с вариабельными областями человека в ответ на антигенную стимуляцию (см., например, Lonberg, Nat. Biotech., 23: 1117-1125 (2005); патенты США №№6075181, 6150584, 5770429 и 7041870, а также публикацию заявки на патент США № US 2007/0061900). Вариабельные области человека из интактных антител, образуемых такими животными, можно дополнительно модифицировать, например, путем комбинирования с другой константной областью человека.

[0090] Антитела человека также можно получать способами на основе использования гибридом. Например, антитела человека могут быть получены из линий клеток миеломы человека и гетеромиеломы мыши и человека с использованием технологии гибридомы В-клеток человека и других способов (см., например, Kozbor, J. Immunol, 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (1987); Boerner et al., J. Immunol, 147: 86(1991); Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006); патент США №7189826; Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4): 265-268 (2006); Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3): 927-937 (2005); и Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3): 185-91 (2005)). Антитела человека также могут быть созданы путем выделения последовательностей вариабельного домена клона Fv, выбранных из библиотек фаговых дисплеев, полученных от человека. Такие последовательности вариабельного домена затем можно комбинировать с необходимой константной областью человека.

[0091] Модификации олигосахарида в антителе могут быть выполнены, например, для создания вариантов антитела с определенными улучшенными свойствами. Например, варианты гликозилирования антител могут иметь улучшенную CDC функцию. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение может предусматривать вариант антитела, который обладает некоторыми, но не всеми эффекторными функциями, что делает его необходимым кандидатом для применений, при которых важен период полужизни антитела in vivo, но некоторые эффекторные функции (такие как комплемент) являются ненужными или вредными. Анализы цитотоксичности in vitro и/или in vivo могут быть проведены для подтверждения снижения/истощения CDC-активности.

[0092] В некоторых вариантах осуществления средство на основе антитела, представленное в данном документе, можно дополнительно модифицировать с содержанием дополнительных небелковых фрагментов, которые известны из уровня техники и легко доступны. Фрагменты, подходящие для дериватизации антитела, могут включать без ограничения водорастворимые полимеры. Неограничивающие примеры водорастворимых полимеров могут включать без ограничения полиэтиленгликоль (ПЭГ), сополимеры этиленгликоля и пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлозу, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, поли-1,3-диоксолан, поли-1,3,6-триоксан, сополимер этилена и малеинового ангидрида, полиаминокислоты (либо гомополимеры, либо статистические сополимеры) и декстран или поли(н-винилпирролидон)полиэтиленгликоль, гомополимеры полипропиленгликоля, сополимеры полипропиленоксида и этиленоксида, полиоксиэтилированные многоатомные спирты (например, глицерин), поливиниловый спирт и их смеси. Пропиональдегид полиэтилен гликоля может иметь преимущества при получении благодаря своей стабильности в воде.

[0093] Полимер может иметь любую молекулярную массу и может быть разветвленным или неразветвленным. Количество полимеров, присоединенных к антителу, может варьировать, и если присоединены два или более полимера, они могут быть одинаковыми или разными молекулами.

[0094] В некоторых вариантах осуществления представлены конъюгаты антитела и небелкового фрагмента, которые можно селективно нагревать под воздействием излучения. В некоторых вариантах осуществления небелковый фрагмент может представлять собой углеродную нанотрубку (см., например, Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102: 11600-11605 (2005)). Излучение может иметь любую длину волны и может характеризоваться без ограничения длинами волн, при которых не происходит повреждение обычных клеток, но происходит нагревание небелкового фрагмента до температуры, при которой гибнут клетки, проксимальные к антителу-небелковому фрагменту.

b. Химерные антигенные рецепторы

[0095] В некоторых вариантах осуществления сконструированная иммунная клетка содержит популяцию CAR, при этом каждый CAR содержит внеклеточный антигенсвязывающий домен. В некоторых вариантах осуществления иммунная клетка содержит популяцию CAR, при этом каждый CAR содержит внеклеточные антигенсвязывающие домены.

[0096] Как используется в данном документе, химерные антигенные рецепторы (CAR) представляют собой белки, которые специфически распознают целевые антигены (например, целевые антигены на раковых клетках). При связывании с целевым антигеном CAR может активировать иммунную клетку, чтобы атаковать и разрушить клетку, несущую этот антиген (например, раковую клетку). CAR могут включать костимулятрные или сигнальные домены для повышения их эффективности. См. Krause et al., J. Exp.Med., Volume 188, No. 4, 1998 (619 626); Finney et al., Journal of Immunology, 1998, 161: 2791 2797, Song et al, Blood 119:696-706 (2012); Kalos et al, Sci. Transl. Med. 3:95 (2011); Porter et al, N. Engl J. Med. 365:725-33 (2011), и Gross et al., Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 56:59-83 (2016); патенты США №№7741465 и 6319494.

[0097] Химерные антигенные рецепторы, описанные в данном документе, содержат внеклеточный домен, трансмембранный домен и внутриклеточный домен, где внеклеточный домен включает антигенсвязывающий домен, который специфически связывается с мишенью.

[0098] В некоторых вариантах осуществления антигенспецифические CAR дополнительно содержат переключатели безопасности и/или один или более специфических в отношении моноклонального антитела эпитопов.

i. Антигенсвязывающие домены

[0099] Как обсуждалось выше, CAR, описанные в данном документе, содержат антигенсвязывающий домен. Используемый в данном документе термин «антигенсвязывающий домен» означает любой полипептид, который связывает определенный целевой антиген. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен связывается с антигеном на опухолевой клетке. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен связывается с антигеном на клетке, вовлеченной в гиперпролиферативное заболевание.

[00100] В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен содержит вариабельную тяжелую цепь, вариабельную легкую цепь и/или одну или более CDR, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), содержащий CDR легкой цепи - CDR1, CDR2 и CDR3, а также CDR тяжелой цепи - CDR1, CDR2 и CDR3.

[00101] Варианты антигенсвязывающих доменов (например, варианты CDR, VH и/или VL) также попадают в объем настоящего изобретения, например, каждая из вариабельной легкой и/или вариабельной тяжелой цепей характеризуется по меньшей мере 70-80%, 80-85%, 85-90%, 90-95%, 95-97%, 97-99% или более чем 99% идентичностью с аминокислотными последовательностями последовательностей антигенсвязывающего домена. В некоторых случаях такие молекулы включают по меньшей мере одну тяжелую цепь и одну легкую цепь, тогда как в других случаях вариантные формы содержат две вариабельные легкие цепи и две вариабельные тяжелые цепи (или их подчасти). Специалист в данной области техники сможет определить подходящие варианты антигенсвязывающих доменов, изложенных в данном документе, с использованием хорошо известных методик. В некоторых определенных вариантах осуществления специалист в данной области техники может идентифицировать подходящие участки молекулы, которые могут быть изменены без нарушения активности путем нацеливания на области, которые, как считается, не являются важными для активности.

[00102] В некоторых определенных вариантах осуществления полипептидная структура антигенсвязывающих доменов основана на антителах, в том числе без ограничения моноклональных антителах, биспецифических антителах, минителах, доменных антителах, синтетических антителах (иногда называемых в данном документе «миметиками антител»), химерных антителах, гуманизированных антителах, антителах человека, слитых антителах (иногда называемых в данном документе «конъюгатами антител») и их фрагментах соответственно. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен содержит авимеры или состоит из них.

[00103] Антигенсвязывающий домен считается «селективным», когда он связывается с одной мишенью более прочно, чем со второй мишенью.

[00104] В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающая домен представляет собой scFv.

[00105] В некоторых вариантах осуществления селективный в отношении антигена CAR содержит лидерный или сигнальный пептид.

[00106] В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к выделенным полинуклеотидам, кодирующим любой из антигенсвязывающих доменов, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к выделенным полинуклеотидам, кодирующим CAR. Также в данном документе представлены векторы, содержащие полинуклеотиды, и способы их получения.

ii. Переключатели безопасности и специфические в отношении моноклонального антитела эпитопы

[00107] Следует принимать во внимание, что нежелательные явления могут быть минимизированы путем трансдуцирования иммунных клеток (содержащих один или более CAR) с «суицидальным» геном. Также необходимо включать в иммунные клетки индуцибельный переключатель «включения» или «ускорения». Подходящие методики включают использование индуцибельной каспазы-9 (заявка на патент США №2011/0286980) или тимидинкиназы до, после или одновременно с трансдукцией клеток конструкцией CAR по настоящему изобретению. Дополнительные способы введения «суицидальных» генов и/или переключателей «включения» включают использование TALENS, цинковых пальцев, RNAi, siRNA, shRNA, антисмысловую технологию и другие методики, известные из уровня техники.

[00108] В соответствии с настоящим изобретением в данный документ могут быть включены дополнительные переключатели включения-выключения или другие типы методик контролируемого переключения. В этих методиках можно реализовать применение доменов димеризации и необязательных активаторов димеризации таких доменов. Эти методики включают, например, методики, описанные Wu et al., Science 2014 350 (6258), с использованием систем димеризации FKBP/Rapalog в определенных клетках, содержания которых включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. Дополнительная технология димеризации описана, например, в Fegan et al. Chem. Rev. 2010, 110, 3315-3336, a также в патентах США №№5830462, 5834266, 5869337 и 6165787, содержания которых включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. Дополнительные пары димеризации могут включать циклоспорин-А/рецептор циклофилина, эстроген/рецептор эстрогена (необязательно с использованием тамоксифена), глюкокортикоиды/рецептор глюкокортикоида, тетрациклин/рецептор тетрациклина, витамин D/рецептор витамина D. Дополнительные примеры технологии димеризации можно найти, например, в WO 2014/127261, WO 2015/090229, US2014/0286987, US2015/0266973, US2016/0046700, патенте США №8486693, US2014/0171649 и US2012/0130076, содержания которых дополнительно включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

[00109] В некоторых вариантах осуществления CAR-иммунная клетка (например, Т-клетка с CAR) по настоящему изобретению содержит полинуклеотид, кодирующий «суицидальный» полипептид, такой как, например, RQR8. См., например, WO2013153391A, который тем самым включен посредством ссылки во всей своей полноте. В CAR-иммунной клетке (например, Т-клетке с CAR), содержащей полинуклеотид, «суицидальный» полипептид экспрессируется на поверхности CAR-иммунной клетки (например, Т-клетки с CAR). В некоторых вариантах осуществления «суицидальный» полипептид содержит аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 1.

[00110] «Суицидальный» полипептид также может содержать сигнальный пептид на аминоконце, например, MGTSLLCWMALCLLGADHADA (SEQ ID NO: 2). В некоторых вариантах осуществления «суицидальный» полипептид содержит аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 3, которая включает сигнальную последовательность SEQ ID NO: 2.

[00112] Если «суицидальный» полипептид экспрессируется на поверхности CAR-иммунной клетки (например, Т-клетки с CAR), то связывание ритуксимаба с эпитопами R полипептида вызывает лизис клетки. Более чем одна молекула ритуксимаба может связываться в пересчете на один полипептид, экспрессированный на поверхности клетки. Каждый эпитоп R полипептида может связывать отдельную молекулу ритуксимаба. Делеция антигенспецифической CAR-иммунной клетки (например, Т-клетки с CAR) может происходить in vivo, например, при введении ритуксимаба пациенту. Решение о делеции перенесенных клеток может быть обусловлено выявлением у пациента нежелательных эффектов, связанных с перенесенными клетками, таких как, например, выявление неприемлемых уровней токсичности.

[00113] В некоторых вариантах осуществления «суицидальный» полипептид экспрессируется на поверхности клетки. В некоторых вариантах осуществления «суицидальный» полипептид включен в конструкцию CAR. В некоторых вариантах осуществления «суицидальный» полипептид не является частью конструкции CAR.

[00114] В некоторых вариантах осуществления внеклеточный домен антигенспецифических CAR может содержать один или более эпитопов, специфических в отношении моноклонального антитела (т.е. специфически распознаваемых им). Эти эпитопы также называются в данном документе mAb-специфическими эпитопами. Иллюстративные mAb-специфические эпитопы раскрыты в международной патентной публикации № WO 2016/120216, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. В таких вариантах осуществления внеклеточный домен CAR включает антигенсвязывающие домены, которые специфически связываются с антигеном, и один или более эпитопов, которые связываются с одним или более моноклональными антителами (mAb). CAR, содержащие mAb-специфические эпитопы, могут быть одноцепочечными или многоцепочечными.

[00115] Включение эпитопов, специфических в отношении моноклональных антител, во внеклеточный домен CAR, описанный в данном документе, позволяет сортировать и истощать сконструированные иммунные клетки, экспрессирующие CAR. В некоторых вариантах осуществления эта особенность также способствует восстановлению эндогенных экспрессирующих антиген клеток, которые были истощены путем введения сконструированных иммунных клеток, экспрессирующих CAR. В некоторых вариантах осуществления возможность истощения обеспечивает переключатель безопасности в случае вредных эффектов, например, при введении субъекту.

[00116] Следовательно, в некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает способ сортировки и/или истощения сконструированных иммунных клеток, имеющих CAR, содержащих mAb-специфические эпитопы, и способ обеспечения восстановления эндогенных экспрессирующих антиген клеток.

[00117] Несколько пар эпитоп-моноклональное антитело могут быть использованы для создания CAR, содержащих эпитопы, специфические в отношении моноклональных антител; в частности, те, которые уже одобрены для медицинского применения, такие как эпитоп CD20/ритуксимаб, в качестве неограничивающего примера.

[00118] Антиген также охватывает способы сортировки сконструированных иммунных клеток, имеющих антигенспецифические CAR и экспрессирующих mAb-специфический(-ие) эпитоп(-ы), и терапевтические способы, при которых активация сконструированных иммунных клеток, имеющих эти CAR, модулируется путем истощения клеток с использованием антитела, которое нацелено на внешний лигандсвязывающий домен указанных CAR. В таблице 1 представлены иллюстративные мимотопные последовательности, которые могут быть вставлены во внеклеточные домены любого из CAR по настоящему изобретению.

[00119] В некоторых вариантах осуществления внеклеточный связывающий домен CAR содержит следующую последовательность

V₁-L₁-V₂-(L)_x-эпитоп1-(L)_x-;

V₁-L₁-V₂-(L)_x-эпитоп1-(L)_х-эпитоп2-(L)_х-;

V₁-L₁-V₂-(L)_x-эпитоп1-(L)х-эпитоп2-(L)_х-эпитоп3-(L)_х-;

(L)_х-эпитоп1-(L)_x-V₁-L₁-V₂;

(L)_x-эпитоп1-(L)_x-эпитоп2-(L)_x-V₁-L₁-V₂;

эпитоп1-(L)_х-эпитоп2-(L)_х-эпитоп3-(L)_х-V₁-L₁-V₂;

(L)_х-эпитоп1-(L)_x-V₁-L₁-V₂-(L)_х-эпитоп2-(L)_х;

(L)_х-эпитоп1-(L)_x-V₁-L₁-V₂-(L)_х-эпитоп2-(L)_х-эпитоп3-(L)_x-;

(L)_x-эпитоп1-(L)_x-V₁-L₁-V₂-(L)_x-эпитоп2-(L)_x-эпитоп3-(L)_x-эпитоп4-(L)x-;

(L)_x-эпитоп1-(L)_x-эпитоп2-(L)_x-V₁-L₁-V₂-(L)_x-эпитоп3-(L)_x-;

(L)_x-эпитоп1-(L)_x-эпитоп2-(L)_x-V₁-L₁-V₂-(L)_x-эпитоп3-(L)_x-эпитоп4-(L)_x-;

V₁-(L)_х-эпитоп1-(L)_x-V₂;

V₁-(L)_x-эпитоп1-(L)_x-V₂-(L)_x-эпитоп2-(L)_x;

V₁-(L)_х-эпитоп1-(L)_х-V₂-(L)_х-эпитоп2-(L)_х-эпитоп3-(L)_х;

V₁-(L)_х-эпитоп1-(L)_х-V₂-(L)_х-эпитоп2-(L)_х-эпитоп3-(L)_х-эпитоп4-(L)х;

(L)_х-эпитоп1-(L)_x-V₁-(L)_x-эпитоп2-(L)_x-V₂ или

(L)_х-эпитоп1-(L)_х-V₁-(L)_х-эпитоп2-(L)_х-V₂-(L)_х-эпитоп3-(L)_х;

где

V₁ представляет собой V_L, и V₂ представляет собой V_H, или V₁ представляет собой V_H, и V₂ представляет собой V_L;

L₁ представляет собой линкер, подходящей для связи цепи V_H с цепью V_L;

эпитоп 1, эпитоп 2, эпитоп 3 и эпитоп 4 представляют собой mAb-специфические эпитопы и могут быть идентичными или разными, и при этом V_H представляет собой вариабельный фрагмент тяжелой цепи, a V_L представляет собой вариабельный фрагмент легкой цепи.

iii. Шарнирный домен

[00120] Внеклеточный домен CAR по настоящему изобретению может включать «шарнирный» домен (или шарнирную область). Термин обычно относится к любому полипептиду, который функционирует, чтобы связать трансмембранный домен в CAR с внеклеточным антигенсвязывающим доменом в CAR. В частности, шарнирные домены можно использовать для обеспечения большей гибкости и доступности внеклеточного антигенсвязывающего домена.

[00121] Шарнирный домен может содержать до 300 аминокислот, в некоторых вариантах осуществления от 10 до 100 аминокислот, или в некоторых вариантах осуществления от 25 до 50 аминокислот. Шарнирный домен может быть получен из всех или части встречающихся в природе молекул, например, из всей или части внеклеточной области CD8, CD4, CD28, 4-1ВВ или IgG (в частности, шарнирной области IgG; следует принимать во внимание, что шарнирная область может содержать часть или всех представителей семейства иммуноглобулинов, таких как IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgD, IgE, IgM или их фрагменты), или из всей или части константной области тяжелой цепи антитела. Альтернативно домен А может быть синтетической последовательностью, которая соответствует встречающейся в природе последовательности А, или может быть полностью синтетической последовательностью А. В некоторых вариантах осуществления указанный домен А является частью цепи CD8α человека (например, NP 001139345.1). В другом конкретном варианте осуществления указанные шарнирный и трансмембранный домены составляют часть цепи CD8α человека. В некоторых вариантах осуществления шарнирный домен CAR, описанных в данном документе, содержит подпоследовательность CD8α, IgG1, IgG4, PD-1 или FcγRIIIα, в частности шарнирную область любого из CD8α, IgG1, IgG4, PD-1 или FcγRIIIα. В некоторых вариантах осуществления шарнирный домен включает шарнир CD8α человека, шарнир IgG1 человека, шарнир IgG4 человека, PD-1 человека или FcγRIIIα человека. В некоторых вариантах осуществления CAR, раскрытые в данном документе, содержат scFv, шарнир CD8α человека и трансмембранные домены, сигнальный домен CD3ζ и сигнальный домен 4-1ВВ. В таблице 2 представлены аминокислотные последовательности для иллюстративных шарниров, представленных в данном документе.

iv. Трансмембранный домен

[00122] CAR по настоящему изобретению сконструированы с трансмембранным доменом, который слит с внеклеточным доменом CAR. Аналогичным образом он может быть слит с внутриклеточным доменом CAR. В некоторых случаях трансмембранный домен может быть выбран или модифицирован путем аминокислотной замены, чтобы избежать связывания таких доменов с трансмембранными доменами тех же или разных поверхностных мембранных белков, чтобы минимизировать уровни взаимодействия с другими представителями рецепторного комплекса. В некоторых вариантах осуществления короткие линкеры могут образовывать связи между любыми или некоторыми из внеклеточных, трансмембранных и внутриклеточных доменов CAR.

[00123] Подходящие трансмембранные домены для CAR, раскрытые в данном документе, обладают способностью (а) экспрессироваться на поверхности иммунной клетки, такой как, например, без ограничения лимфоцит, такой как хелперная (T_h) Т-клетка, цитотоксическая (Т_с) Т-клетка, регуляторная (T_reg) Т-клетка или натуральные киллерные (NK) клетки, и/или (L) взаимодействовать с внеклеточным антигенсвязывающим доменом и внутриклеточным сигнальным доменом для управления клеточным ответом иммунной клетки против целевой клетки.

[00124] Трансмембранный домен может быть получен либо из природного, либо из синтетического источника. Если источник является природным, домен может быть получен из любого связанного с мембраной или трансмембранного белка.

[00125] Трансмембранные области, особенно применимые в настоящем изобретении, могут быть получены из CD28, ОХ-40,4-1BB/CD137, CD2, CD7, CD27, CD30, CD40, белка 1 программированной гибели клетки (PD-1), индуцибельного Т-клеточного костимулятора (ICOS), функционально-ассоциированного антигена-1 лимфоцитов (LFA-1, CD1-1a/CD18), CD3 гамма, CD3 дельта, CD3 эпсилон, CD247, CD276 (В7-Н3), LIGHT, (TNFSF14), NKG2C, Ig альфа (CD79a), DAP-10, Fc гамма-рецептора, молекулы МНС 1 класса, белков рецептора TNF, белка иммуноглобулина, рецептора цитокина, интегринов, сигнальных активирующих лимфоцит молекул (белков SLAM), активирующих NK-клеточных рецепторов, BTLA, Toll-подобных рецепторов, ICAM-1, В7-Н3, CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8 альфа, CD8 бета, IL-2R бета, IL-2R гамма, IL-7R альфа, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD1 1d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD1 1a, LFA-1, ITGAM, CD1 1b, ITGAX, CD1 1c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRT AM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Lyl08), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, лиганда, который специфически связывается с CD83, или любой их комбинации (могут содержаться в таковых или могут соответствовать таковым).

[00126] В качестве неограничивающих примеров, трансмембранная область может быть получена из или может быть частью Т-клеточного рецептора, такого как α, β, γ или δ, полипептида, составляющего комплекс CD3, IL-2 рецептора р55 (цепи), р75 (β-цепи) или γ-цепи, цепи субъединицы Fc-рецепторов, в частности, Fcγ-рецептора III, или белков CD. Альтернативно трансмембранный домен может быть синтетическим и может содержать преимущественно гидрофобные остатки, такие как лейцин и валин. В некоторых вариантах осуществления указанный трансмембранный домен получен из цепи CD8α человека (например, NP_001139345.1).

[00127] В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен в CAR по настоящему изобретению представляет собой трансмембранный домен CD8α. В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен в CAR по настоящему изобретению представляет собой трансмембранный домен CD8α, содержащий аминокислотную последовательность IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT (SEQ ID NO: 17). В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен CD8α содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует трансмембранную аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 17. В некоторых вариантах осуществления шарнир и трансмембранный домен в CAR по настоящему изобретению представляют собой шарнир CD8α и трансмембранный домен, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 17.

[00128] В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен в CAR по настоящему изобретению представляет собой трансмембранный домен CD28. В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен в CAR по настоящему изобретению представляет собой трансмембранный домен CD28, содержащий аминокислотную последовательность FWVLVWGGVLACYSLLVTVAFIIFWV (SEQ ID NO: 18). В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен CD28 содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует трансмембранную аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 18.

v. Внутриклеточный домен

[00129] Внутриклеточный (цитоплазматический) домен CAR по настоящему изобретению может обеспечивать активацию по меньшей мере одной из нормальных эффекторных функций иммунной клетки, содержащей CAR. Эффекторная функция Т-клетки, например, может относиться к цитолитической активности или хелперной активности, в том числе к секреции цитокинов.

[00130] В некоторых вариантах осуществления активирующий внутриклеточный сигнальный домен для применения в CAR может представлять собой цитоплазматические последовательности, например, без ограничения Т-клеточного рецептора и корецепторов, которые действуют совместно, инициируя передачу сигнала после соединения с антигенным рецептором, а также любое производное или вариант этих последовательностей и любую синтетическую последовательность, которая имеет такие же функциональные возможности.

[00131] Следует принимать во внимание, что подходящие (например, активирующие) внутриклеточные домены включают без ограничения сигнальные домены, полученные из CD28, ОХ-40,4-1BB/CD137, CD2, CD7, CD27, CD30, CD40, белка 1 программированной гибели клетки (PD-1), индуцибельного Т-клеточного костимулятора (ICOS), функционально-ассоциированного антигена-1 лимфоцитов (LFA-1, CD1-1a/CD18), CD3 гамма, CD3 дельта, CD3 эпсилон, CD247, CD276 (В7-Н3), LIGHT, (TNFSF14), NKG2C, Ig альфа (CD79a), DAP-10, Fc гамма-рецептора, молекулы МНС 1 класса, белков рецептора TNF, белка иммуноглобулина, рецептора цитокина, интегринов, сигнальных активирующих лимфоцит молекул (белков SLAM), активирующих NK-клеточных рецепторов, BTLA, Toll-подобных рецепторов, ICAM-1, В7-Н3, CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8 альфа, CD8 бета, IL-2R бета, IL-2R гамма, IL-7R альфа, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD1 1d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD1 1a, LFA-1, ITGAM, CD1 1b, ITGAX, CD1 1c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRT AM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, лиганда, который специфически связывается с CD83, или любой их комбинации (или соответствующие таковым).

[00132] Внутриклеточные домены CAR по настоящему изобретению могут включать, помимо активирующих доменов, описанных выше, костимуляторные сигнальные домены (взаимозаменяемо называемые в данном документе костимуляторными молекулами) для повышения их эффективности. Костимуляторные домены могут обеспечивать сигнал в дополнение к первичному сигналу, обеспечиваемому активирующей молекулой, как описано в данном документе.

[00133] Следует принимать во внимание, что подходящие костимуляторные домены в объеме настоящего изобретения могут быть получены, например, из CD28, ОХ40, 4-1BB/CD137, CD2, CD3 (альфа, бета, дельта, эпсилон, гамма, зета), CD4, CD5, CD7, CD9, CD16, CD22, CD27, CD30, CD33, CD37, CD40, CD45, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, PD-1, ICOS, функционально-ассоциированного антигена-1 лимфоцитов (LFA-1 (CD1 1a/CD18), CD247, CD276 (В7-Н3), LIGHT (представителя 14 суперсемейства фактора некроза опухоли; TNFSF14), NKG2C, Ig альфа (CD79a), DAP-10, Fc гамма-рецептора, молекулы МНС 1 класса, TNFR, интегрина, сигнальной активирующей лимфоцит молекулы, BTLA, Toll-подобных рецепторов, ICAM-1, В7-Н3, CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8 альфа, CD8 бета, IL-2R бета, IL-2R гамма, IL-7R альфа, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD1-1d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD1-1a, LFA-1, ITGAM, CD1-1b, ITGAX, CD1-1c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRT AM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, лиганда CD83, или их фрагментов или комбинаций (или могут соответствовать таковым). Следует принимать во внимание, что дополнительные костимуляторные молекулы или их фрагменты, не перечисленные выше, попадают в объем настоящего изобретения.

[00134] В некоторых вариантах осуществления

внутриклеточный/цитоплазматический домен CAR может быть сконструирован с возможностью содержания домена 4-1BB/CD137 самого по себе или в комбинации с любым(-и) другим(-и) необходимым(-и) внутриклеточным(-и) доменом(-ами), применимым(-и) в контексте CAR по настоящему изобретению. Полная нативная аминокислотная последовательность 4-1BB/CD137 описана в базе данных об эталонных последовательностях NCBI: NP 001552.2. Полная нативная последовательность нуклеиновой кислоты 4-1BB/CD137 описана в базе данных об эталонных последовательностях NCBI: NM_001561.5.

[00135] В некоторых вариантах осуществления

внутриклеточный/цитоплазматический домен CAR может быть сконструирован с возможностью содержания домена CD28 самого по себе или в комбинации с любым(-и) другим(-и) необходимым(-и) внутриклеточным(-и) доменом(-ами), применимым(-и) в контексте CAR по настоящему изобретению. Полная нативная аминокислотная последовательность CD28 описана в базе данных об эталонных последовательностях NCBI: NP 006130.1. Полная нативная последовательность нуклеиновой кислоты CD28 описана в базе данных об эталонных последовательностях NCBI: NM 006139.1.

[00136] В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный/цитоплазматический домен CAR может быть сконструирован с возможностью содержания домена CD3 зета самого по себе или в комбинации с любым(-и) другим(-и) необходимым(-и) внутриклеточным(-и) доменом(-ами), применимым(-и) в контексте CAR по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен CAR может предусматривать сигнальный домен CD3ζ, который имеет аминокислотную последовательность с по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, 95%, 97% или 99% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, показанной под SEQ ID NO: 19 или SEQ ID NO: 26.

Например, внутриклеточный домен CAR может содержать часть цепи CD3 зета и часть костим у ляторной сигнальной молекулы. Внутриклеточные сигнальные последовательности во внутриклеточной сигнальной части CAR по настоящему изобретению могут быть связаны друг с другом в произвольном или определенном порядке. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный домен конструируют с возможностью содержания активирующего домена CD3 зета и сигнального домена CD28. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный домен конструируют с возможностью содержания активирующего домена CD3 зета и сигнального домена 4-1ВВ.

[00137] В некоторых вариантах осуществления 4-1ВВ (внутриклеточный домен) содержит аминокислотную последовательность

(SEQ ID NO: 20). В некоторых вариантах осуществления 4-1ВВ (внутриклеточный домен) кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты

[00138] В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный домен в CAR конструируют с возможностью содержания части CD28 и CD3 зета, где внутриклеточный CD28 содержит последовательность нуклеиновой кислоты, изложенную под SEQ ID NO: 22.

[00139] В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный домен в CAR конструируют с возможностью содержания аминокислотной последовательности . Аминокислотная последовательность CD3 зета может содержать SEQ ID NO: 23, а последовательность нуклеиновой кислоты может содержать SEQ ID NO: 24:

[00140] В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен CAR по настоящему изобретению содержит домен кости муляторной молекулы. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен CAR по настоящему изобретению содержит часть костимуляторной молекулы, выбранную из группы, состоящей из фрагмента 4-1ВВ (GenBank: ААА53133) и CD28 (NP 006130.1). В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен CAR по настоящему изобретению содержит аминокислотную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, 95%, 97% или 99% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, показанной под SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 22. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен CAR по настоящему изобретению содержит аминокислотную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, 95%, 97% или 99% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, показанной под SEQ ID NO: 20, и/или по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, 95%, 97% или 99% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, показанной под SEQ ID NO: 22.

с. Иммунные клетки, содержащие CAR

[00141] В данном документе представлены сконструированные иммунные клетки, экспрессирующие CAR по настоящему изобретению (например, Т-клетки с CAR).

[00142] В некоторых вариантах осуществления сконструированная иммунная клетка содержит популяцию CAR, при этом каждый CAR содержит внеклеточные антигенсвязывающие домены. В некоторых вариантах осуществления сконструированная иммунная клетка содержит популяцию CAR, при этом каждый CAR содержит разные внеклеточные антигенсвязывающие домены. В некоторых вариантах осуществления иммунная клетка содержит популяцию CAR, при этом каждый CAR содержит внеклеточные антигенсвязывающие домены.

[00143] Сконструированные иммунные клетки могут быть аллогенными или аутологичными.

[00144] В некоторых вариантах осуществления сконструированная иммунная клетка представляет собой Т-клетку (например, воспалительный Т-лимфоцит, цитотоксический Т-лимфоцит, регуляторный Т-лимфоцит, хелперный Т-лимфоцит, инфильтрующий опухоль лимфоцит (TIL)), NK-клетку, NK-T-клетку, TCR-экспрессирующую клетку, дендритную клетку, дендритную клетку-киллер, тучную клетку или В-клетку. В некоторых вариантах осуществления клетка может быть получена из группы, состоящей из Т-лимфоцитов CD4+ и Т-лимфоцитов CD8+. В некоторых иллюстративных вариантах осуществления сконструированная иммунная клетка представляет собой Т-клетку. В некоторых иллюстративных вариантах осуществления сконструированная иммунная клетка представляет собой гамма дельта Т-клетку. В некоторых иллюстративных вариантах осуществления сконструированная иммунная клетка представляет собой макрофаг.

[00145] В некоторых вариантах осуществления сконструированная иммунная клетка может быть получена, например, без ограничения из стволовой клетки. Стволовые клетки могут быть зрелыми стволовыми клетками, не являющимися человеческими эмбриональными стволовыми клетками, более конкретно не являющимися человеческими стволовыми клетками, стволовыми клетками пуповинной крови, клетками-предшественниками, стволовыми клетками костного мозга, индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками, тотипотентными стволовыми клетками или гематопоэтическими стволовыми клетками.

[00146] В некоторых вариантах осуществления клетку получают или выделяют из периферической крови. В некоторых вариантах осуществления клетку получают или выделяют из мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС). В некоторых вариантах осуществления клетку получают или выделяют из костного мозга. В некоторых вариантах осуществления клетку получают или выделяют из пуповинной крови. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой клетку человека. В некоторых вариантах осуществления клетку трансфицируют или трансдуцируют вектором нуклеиновой кислоты с использованием способа, выбранного из группы, состоящей из электропорации, сонопорации, биолистики (например, генной пушки), липидной трансфекции, полимерной трансфекции, наночастиц, вирусной трансфекции (например, с помощью ретровируса, лентивируса, AAV) или полиплексов.

[00147] В некоторых вариантах осуществления сконструированные иммунные клетки, экспрессирующие на поверхности своей клеточной мембраны антигенспецифический CAR по настоящему изобретению, предусматривают процент стволовых клеток памяти и центральных клеток памяти, больший чем 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, или составляющий 100%.

[00148] В некоторых вариантах осуществления сконструированные иммунные клетки, экспрессирующие на поверхности своей клеточной мембраны мембранный антигенспецифический CAR по настоящему изобретению, предусматривают процент стволовых клеток памяти и центральных клеток памяти от приблизительно 10% до приблизительно 100%, от приблизительно 10% до приблизительно 90%, от приблизительно 10% до приблизительно 80%, от приблизительно 10% до приблизительно 70%, от приблизительно 10% до приблизительно 60%, от приблизительно 10% до приблизительно 50%, от приблизительно 10% до приблизительно 40%, от приблизительно 10% до приблизительно 30%, от приблизительно 10% до приблизительно 20%, от приблизительно 15% до приблизительно 100%, от приблизительно 15% до приблизительно 90%, от приблизительно 15% до приблизительно 80%, от приблизительно 15% до приблизительно 70%, от приблизительно 15% до приблизительно 60%, от приблизительно 15% до приблизительно 50%, от приблизительно 15% до приблизительно 40%, от приблизительно 15% до приблизительно 30%, от приблизительно 20% до приблизительно 100%, от приблизительно 20% до приблизительно 90%, от приблизительно 20% до приблизительно 80%, от приблизительно 20% до приблизительно 70%, от приблизительно 20% до приблизительно 60%, от приблизительно 20% до приблизительно 50%, от приблизительно 20% до приблизительно 40%, от приблизительно 20% до приблизительно 30%, от приблизительно 30% до приблизительно 100%, от приблизительно 30% до приблизительно 90%, от приблизительно 30% до приблизительно 80%, от приблизительно 30% до приблизительно 70%, от приблизительно 30% до приблизительно 60%, от приблизительно 30% до приблизительно 50%, от приблизительно 30% до приблизительно 40%, от приблизительно 40% до приблизительно 100%, от приблизительно 40% до приблизительно 90%, от приблизительно 40% до приблизительно 80%, от приблизительно 40% до приблизительно 70%, от приблизительно 40% до приблизительно 60%, от приблизительно 40% до приблизительно 50%, от приблизительно 50% до приблизительно 100%, от приблизительно 50% до приблизительно 90%, от приблизительно 50% до приблизительно 80%, от приблизительно 50% до приблизительно 70%, от приблизительно 50% до приблизительно 60%, от приблизительно 60% до приблизительно 100%, от приблизительно 60% до приблизительно 90%, от приблизительно 60% до приблизительно 80%, от приблизительно 60% до приблизительно 70%, от приблизительно 70% до приблизительно 90%, от приблизительно 70% до приблизительно 80%, от приблизительно 80% до приблизительно 100%, от приблизительно 80% до приблизительно 90%, от приблизительно 90% до приблизительно 100%, от приблизительно 25% до приблизительно 50%, от приблизительно 75% до приблизительно 100% или от приблизительно 50% до приблизительно 75%.

[00149] В некоторых вариантах осуществления сконструированные иммунные клетки, экспрессирующие на поверхности своей клеточной мембраны антигенспецифический CAR по настоящему изобретению, предусматривают процент стволовых клеток памяти и центральных клеток памяти, больший чем 10%, 20%, 30%, 40%, 50% или 60%.

[00150] В некоторых вариантах осуществления сконструированные иммунные клетки, экспрессирующие на поверхности своей клеточной мембраны антигенспецифический CAR по настоящему изобретению, предусматривают процент стволовых клеток памяти и центральных клеток памяти от приблизительно 10% до приблизительно 60%, от приблизительно 10% до приблизительно 50%, от приблизительно 10% до приблизительно 40%, от приблизительно 15% до приблизительно 50%, от приблизительно 15% до приблизительно 40%, от приблизительно 20% до приблизительно 60% или от приблизительно 20% до приблизительно 70%.

[00151] В некоторых вариантах осуществления сконструированные иммунные клетки, экспрессирующие на поверхности своей клеточной мембраны антигенспецифический CAR по настоящему изобретению, обогащены T_CM- и/или T_SCM-клетками, так что сконструированные иммунные клетки предусматривают по меньшей мере приблизительно 60%, 65%, 70%, 75% или 80% объединенных T_CM- и T_SCM-клеток. В некоторых вариантах осуществления сконструированные иммунные клетки, экспрессирующие на поверхности своей клеточной мембраны антигенспецифический CAR по настоящему изобретению, обогащены T_CM- и/или T_SCM-клетками, так что сконструированные иммунные клетки предусматривают по меньшей мере приблизительно 70% объединенных T_CM- и T_SCM-клеток. В некоторых вариантах осуществления сконструированные иммунные клетки, экспрессирующие на поверхности своей клеточной мембраны антигенспецифический CAR по настоящему изобретению, обогащены T_CM- и/или T_SCM-клетками, так что сконструированные иммунные клетки предусматривают по меньшей мере приблизительно 75% объединенных T_CM- и/или T_SCM-клеток.

[00152] В некоторых вариантах осуществления сконструированные иммунные клетки, экспрессирующие на поверхности своей клеточной мембраны антигенспецифический CAR по настоящему изобретению, обогащены T_CM- и/или T_SCM-клетками, так что сконструированные иммунные клетки предусматривают по меньшей мере приблизительно 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55% или 60% T_SCM-клеток. В некоторых вариантах осуществления сконструированные иммунные клетки, экспрессирующие на поверхности своей клеточной мембраны антигенспецифический CAR по настоящему изобретению, обогащены T_CM- и/или T_SCM-клетками, так что сконструированные иммунные клетки предусматривают по меньшей мере приблизительно 30%, 35%, 40% или 45% TSCM-клеток.

[00153] В некоторых вариантах осуществления иммунная клетка представляет собой воспалительный Т-лимфоцит, который экспрессирует любой из CAR, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления иммунная клетка представляет собой цитотоксический Т-лимфоцит, который экспрессирует любой из CAR, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления иммунная клетка представляет собой регуляторный Т-лимфоцит, который экспрессирует любой из CAR, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления иммунная клетка представляет собой хелперный Т-лимфоцит, который экспрессирует любой из CAR, описанных в данном документе.

[00154] Также в данном документе представлены клеточные линии, полученные из трансформированной иммунной клетки (например, Т-клетки) согласно любому из описанных выше способов. Также в данном документе представлены модифицированные клетки, устойчивые к иммуносупрессивному лечению. В некоторых вариантах осуществления выделенная клетка по настоящему изобретению содержит полинуклеотид, кодирующий CAR.

[00155] В некоторых вариантах осуществления сконструированная иммунная клетка по настоящему изобретению может содержать один или более нарушенных или инактивированных генов. В некоторых вариантах осуществления сконструированная иммунная клетка по настоящему изобретению содержит один нарушенный или инактивированный ген, выбранный из группы, состоящей из CD52, DLL3, GR, PD-1, CTLA-4, LAG3, TIM3, BTLA, BY55, TIGIT, В7Н5, LAIR1, SIGLEC10, 2В4, HLA, TCRα и TCRβ, и/или экспрессирует CAR, многоцепочечный CAR и/или трансген рТα. В некоторых вариантах осуществления выделенная клетка содержит полинуклеотиды, кодирующие полипептиды, содержащие многоцепочечный CAR. В некоторых вариантах осуществления выделенная клетка по настоящему изобретению содержит два нарушенных или инактивированных гена, выбранных из группы, состоящей из CD52 и GR, CD52 и TCRα, CDR52 и TCRβ, DLL3 и CD52, DLL3 и TCRα, DLL3 и TCRβ, GR и TCRα, GR и TCRβ, TCRα и TCRβ, PD-1 и TCRα, PD-1 и TCRβ, CTLA-4 и TCRα, CTLA-4 и TCRβ, LAG3 и TCRα, LAG3 и TCRβ, TIM3 и TCRα, Tim3 и TCRβ, BTLA и TCRα, BTLA и TCRβ, BY55 и TCRα, BY55 и TCRβ, TIGIT и TCRα, TIGIT и TCRβ, B7H5 и TCRα, B7H5 и TCRβ, LAIR1 и TCRα, LAIR1 и TCRβ, SIGLEC10 и TCRα, SIGLEC10 и TCRβ, 2B4 и TCRα, 2B4 и TCRβ, и/или экспрессирует CAR, многоцепочечный CAR и трансген pTa. В некоторых вариантах осуществления способ предусматривает нарушение или инактивирование одного или более генов путем введения в клетки эндонуклеазы, способной селективно инактивировать ген путем селективного расщепления ДНК. В некоторых вариантах осуществления эндонуклеаза может представлять собой, например, нуклеазу с «цинковыми пальцами» (ZFN), нуклеазу megaTAL, мегануклеазу, подобную активатору транскрипции эффекторную нуклеазу (TALE-нуклеаза) или CRIPR (например, Cas9) эндонуклеазу.

[00156] В некоторых вариантах осуществления TCR становится нефункциональным в клетках по настоящему изобретению из-за нарушения или инактивации гена TCRα и/или гена(-ов) TCRβ. В некоторых вариантах осуществления предусмотрен способ получения модифицированных клеток, полученных от индивидуума, при этом клетки могут пролиферировать независимо от пути передачи сигнала главного комплекса гистосовместимости (МНС). Модифицированные клетки, которые могут пролиферировать независимо от пути передачи сигнала МНС, которые могут быть получены этим способом, входят в объем настоящего изобретения. Модифицированные клетки, раскрытые в данном документе, могут быть использованы в лечении пациентов, нуждающихся в этом, от отторжения «хозяин против трансплантата» (HvG) и болезни «трансплантат против хозяина» (GvHD); поэтому способ лечения пациентов, нуждающихся в этом, против отторжения «хозяин против трансплантата» (HvG) и болезни «трансплантат против хозяина» (GvHD), включающий лечение указанного пациента путем введения указанному пациенту эффективного количества модифицированных клеток, содержащих нарушенные или инактивированные гены TCRα и/или TCRβ, входит в объем настоящего изобретения.

[00157] В некоторых вариантах осуществления иммунные клетки сконструированы так, чтобы быть устойчивыми к одному или нескольким химиотерапевтическим лекарственным средствам. Химиотерапевтическое лекарственное средство может представлять собой, например, аналог пуринового нуклеотида (PNA), что таким образом делает иммунную клетку подходящей для лечения рака, сочетающего адоптивную иммунотерапию и химиотерапию. Иллюстративные PNA включают, например, клофарабин, флударабин, циклофосфамид и цитарабин, по отдельности или в комбинации. PNA метаболизируются дезоксицитидинкиназой (dCK) в моно-, ди- и трифосфатные PNA. Их трифосфатные формы конкурируют с АТФ за синтез ДНК, действуют как проапоптотические средства и являются мощными ингибиторами рибонуклеотидредуктазы (RNR), которая участвует в продуцировании тринуклеотидов.

[00158] В некоторых вариантах осуществления выделенные клетки или клеточные линии по настоящему изобретению может могут содержать рТα или его функциональный вариант. В некоторых вариантах осуществления выделенная клетка или клеточная линия может быть дополнительно генетически модифицирована путем нарушения или инактивации гена TCRα.

[00159] В настоящем изобретении также представлены сконструированные иммунные клетки, содержащие любой из полинуклеотидов CAR, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления CAR может быть введен в иммунную клетку в виде трансгена с помощью плазмидного вектора. В некоторых вариантах осуществления плазмидный вектор может также содержать, например, маркер отбора, который обеспечивает идентификацию и/или отбор клеток, которые получили вектор.

[00160] Полипептиды CAR можно синтезировать in situ в клетке после введения в клетку полинуклеотидов, кодирующих полипептиды CAR. Альтернативно полипептиды CAR могут быть получены вне клеток, а затем введены в клетки. Способы введения полинуклеотидной конструкции в клетки известны из уровня техники. В некоторых вариантах осуществления можно использовать способы стабильной трансформации (например, с использованием лентивирусного вектора) для интеграции полинуклеотидной конструкции в геном клетки. В других вариантах осуществления могут использоваться способы временной трансформации для временной экспрессии полинуклеотидной конструкции, и полинуклеотидная конструкция не интегрирована в геном клетки. В других вариантах осуществления могут быть использованы способы, с использованием эффектов, опосредованных вирусом. Полинуклеотиды можно вводить в клетку с помощью любых подходящих средств, таких как, например, рекомбинантные вирусные векторы (например, ретровирусные, аденовирусные), липосомы и т.п. Способы временной трансформации включают, например, без ограничения микроинъекцию, электропорацию или бомбардировку частицами. Полинуклеотиды могут быть включены в векторы, такие как, например, плазмидные векторы или вирусные векторы.

[00161] В некоторых вариантах осуществления представлены выделенные нуклеиновые кислоты, содержащие промотор, функционально связанный с первым полинуклеотид ом, кодирующим антигенсвязывающий домен, по меньшей мере, одну костимуляторную молекулу и активирующий домен. В некоторых вариантах осуществления конструкция нуклеиновой кислоты содержится в вирусном векторе. В некоторых вариантах осуществления вирусный вектор выбран из группы, состоящей из ретровирусных векторов, векторов вируса мышиного лейкоза, векторов SFG, аденовирусных векторов, лентивирусных векторов, векторов аденоассоциированного вируса (AAV), векторов вируса герпеса и векторов вируса осповакцины. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота содержится в плазмиде.

3. Среды для выращивания клеток для размножения иммунных клеток in vitro

[00162] Размножение клеток in vitro (в том числе размножение иммунных клеток, таких как генетически модифицированные Т-клетки) может быть достигнуто с использованием среды для выращивания клеток, содержащей:

первый стимулятор клеточной пролиферации (например, первый цитокин, который стимулирует Т-клеточную пролиферацию);

второй стимулятор клеточной пролиферации (например, второй цитокин, который стимулирует Т-клеточную пролиферацию) и

внеклеточный модулятор клеточного метаболизма (например, Т-клеточного метаболизма).

[00163] Иммунные клетки по настоящему изобретению могут быть активированы и размножены до или после генетической модификации иммунных клеток с использованием общеизвестных и в целом описанных в данном документе способов. В некоторых вариантах осуществления иммунные клетки (например, Т-клетки) активируют и размножают до генетической модификации иммунных клеток. В некоторых вариантах осуществления иммунные клетки (например, Т-клетки) активируют и размножают после генетической модификации иммунных клеток (например, сконструированных иммунных клеток, в том числе клеток, описанных в данном документе).

[00164] Следовательно, условия, подходящие для размножения Т-клеток, включают подходящие среды (например, минимальные поддерживающие среды, или среды RPMI 1640, или Х-vivo 15, (Lonza)), которые содержат первый и второй стимуляторы клеточной пролиферации (например, IL-7 и IL-15), а также внеклеточный модулятор клеточного метаболизма (например, внеклеточный калий), и которые могут содержать дополнительные факторы, необходимые для пролиферации и жизнеспособности, включая сыворотку крови (например, фетальную бычью или сыворотку крови человека), IL-2, инсулин, IFN-γ, IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-2, IL-15, TGF бета и TNF, или любые другие добавки для выращивания клеток, известные специалисту в данной области техники. В некоторых вариантах осуществления среда для культивирования Т-клеток не включает экзогенный IL-2. Другие добавки для выращивания клеток включают без ограничения поверхностно-активное вещество, плазманат и восстанавливающие средства, такие как N-ацетилцистеин и 2-меркаптоэтанол. Среды могут включать RPMI 1640, A1M-V, DMEM, MEM, а-МЕМ, F-12, Х-Vivo 15 и Х-Vivo 20, Optimizer с добавленными аминокислотами, пируватом натрия и витаминами, либо без сыворотки крови, либо дополненные соответствующим количеством сыворотки крови (или плазмы) или определенного набора гормонов, и/или количества цитокина(-ов), достаточного для роста и размножения Т-клеток (например, IL-7 и/или IL-15). Антибиотики, например, пенициллин и стрептомицин, включены только в экспериментальные культуры, а не в культуры клеток, которые подлежат введению субъекту. Целевые клетки поддерживают в условиях, необходимых для поддержания роста, например, при соответствующей температуре (например, 37°C) и атмосфере (например, воздух плюс 5% СО₂).

[00165] Т-клетки, подвергшиеся воздействию стимуляции с варьирующий значениями времени, могут проявлять разные характеристики.

[00166] Способы, описанные в данном документе, могут дополнительно включать приведение в контакт клеток со средством, которое стимулирует комплекс CD3 TCR, и костимуляторной молекулой на поверхности Т-клеток для создания сигнала активации для Т-клетки. Например, химические вещества, такие как ионофор кальция А23187, форбол-12-миристат-13-ацетат (РМА) или митогенные лектины, такие как фитогемагглютинин (РНА), могут использоваться для создания сигнала активации для Т-клетки.

[00167] В некоторых вариантах осуществления популяции Т-клеток также можно стимулировать in vitro путем приведения в контакт, например, с антителом к CD3 или его антигенсвязывающим фрагментом, или с антителом к CD2, иммобилизованным на поверхности, или путем приведения в контакт с активатором протеинкиназы С (например, бриостатином) в сочетании с ионофором кальция. Для совместной стимуляции вспомогательной молекулы на поверхности Т-клеток используют лиганд, который связывает вспомогательную молекулу. Например, популяция Т-клеток может быть приведена в контакт с антителом к CD3 и антителом к CD28 в условиях, подходящих для стимуляции пролиферации Т-клеток. Антитело к CD3 и антитело к CD28 могут быть расположены на грануле, планшете или другом субстрате.

[00168] В некоторых вариантах осуществления клетки по настоящему изобретению могут быть размножены путем совместного культивирования с тканью или клетками. Клетки также могут быть размножены in vivo, например, в крови субъекта после введения клетки субъекту.

[00169] В частности, среды для выращивания клеток и способы их применения могут быть особенно применимы при получении Т-клеток, в том числе Т-клеток с CAR, таких как аллогенные Т-клетки с CAR.

а. Стимуляторы клеточной пролиферации

[00170] В некоторых вариантах осуществления первый и второй стимулятор выбраны из средства, которое стимулирует комплекс CD3 TCR; антитела к CD3 или его антигенсвязывающего фрагмента; антитела к CD2 или его антигенсвязывающего фрагмента; активатора протеинкиназы С или фактора роста (например, фактор роста Т-клеток), или любых их комбинаций.

[00171] В некоторых вариантах осуществления стимулятор иммунных клеток (например, Т-клеток или сконструированных иммунных клеток) представляет собой средство, которое стимулирует комплекс CD3 TCR и костимуляторную молекулу на поверхности Т-клеток, для создания сигнала активации для Т-клетки. Например, химические вещества, такие как ионофор кальция А23187, форбол-12-миристат-13-ацетат (РМА) или митогенные лектины, такие как фитогемагглютинин (РНА), могут использоваться для создания сигнала активации для Т-клетки.

[00172] В некоторых вариантах осуществления стимулятор иммунных клеток (например, Т-клеток или сконструированных иммунных клеток) представляет собой антитело к CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент, или антитело к CD2, иммобилизованное на поверхности, или активатор протеинкиназы С (например, бриостатин) в сочетании с ионофором кальция. Для совместной стимуляции вспомогательной молекулы на поверхности Т-клеток используют лиганд, который связывает вспомогательную молекулу. Например, популяция Т-клеток может быть приведена в контакт с антителом к CD3 и антителом к CD28 в условиях, подходящих для стимуляции пролиферации Т-клеток. Антитело к CD3 и антитело к CD28 могут быть расположены на грануле, планшете или другом субстрате.

[00173] В некоторых вариантах осуществления стимулятор клеток представляет собой фактор роста. В некоторых вариантах осуществления стимулятор клеток представляет собой фактор роста Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления фактор роста Т-клетки представляет собой цитокин. В некоторых вариантах осуществления первый стимулятор представляет собой первый цитокин, а второй стимулятор представляет собой второй цитокин. В некоторых вариантах осуществления цитокин представляет собой интерлейкин (например, IL-2, IL-4, IL-7, IL-10, IL-12 или IL-15). В некоторых вариантах осуществления первый стимулятор и второй стимулятор выбраны из группы, состоящей из IL-4, IL-7, IL-10, IL-12 и IL-15.

[00174] В некоторых вариантах осуществления первый стимулятор представляет собой IL-7, а второй стимулятор представляет собой IL-15.

[00175] В некоторых вариантах осуществления среда для выращивания клеток исключает IL-2 (например, среда для выращивания клеток исключает экзогенный IL-2, и IL-2 не присутствует в среда для выращивания клеток в качестве первого стимулятора и/или второго стимулятора).

[00176] В некоторых вариантах осуществления количества используемых первого и второго стимуляторов описаны в концентрациях (например, с использованием МЕ/мл). Следовательно, фраза «отношение концентраций х:у» может быть использована для описания отношения концентрации первого стимулятора (например, х МЕ/мл IL-7) к концентрации второго стимулятора (например, у МЕ/мл IL-15).

[00177] В некоторых вариантах осуществления первый стимулятор (например, первый цитокин, такой как IL-7) и второй стимулятор (например, второй цитокин, такой как IL-15) присутствуют при отношении концентраций от приблизительно 10000:1 до приблизительно 1:10000, от приблизительно 1000:1 до приблизительно 1:1000, от приблизительно 100:1 до приблизительно 1:100 или от приблизительно 10:1 до приблизительно 1:10.

[00178] В некоторых вариантах осуществления первый стимулятор (например, первый цитокин, такой как IL-7) присутствует в количестве, которое больше количества второго стимулятора (например, второго цитокина, такого как IL-15). В некоторых вариантах осуществления первый стимулятор (например, первый цитокин, такой как IL-7) и второй стимулятор (например, второй цитокин, такой как IL-15) присутствуют при отношении концентраций от приблизительно 1000:1 до приблизительно 10:1, от приблизительно 900:1 до приблизительно 10:1, от приблизительно 800:1 до приблизительно 10:1, от приблизительно 700:1 до приблизительно 10:1, от приблизительно 600:1 до приблизительно 10:1, от приблизительно 500:1 до приблизительно 10:1, от приблизительно 400:1 до приблизительно 10:1, от приблизительно 300:1 до приблизительно 10:1, от приблизительно 250:1 до приблизительно 10:1, от приблизительно 200:1 до приблизительно 10:1, от приблизительно 150:1 до приблизительно 10:1 или от приблизительно 100:1 до приблизительно 4:1. В некоторых вариантах осуществления первый стимулятор (например, первый цитокин, такой как IL-7) и второй стимулятор (например, второй цитокин, такой как IL-15) присутствуют при отношении концентраций от приблизительно 1000:1 до приблизительно 50:1, от приблизительно 900:1 до приблизительно 50:1, от приблизительно 800:1 до приблизительно 50:1, от приблизительно 700:1 до приблизительно 50:1, от приблизительно 600:1 до приблизительно 50:1, от приблизительно 500:1 до приблизительно 50:1, от приблизительно 400:1 до приблизительно 50:1, от приблизительно 300:1 до приблизительно 50:1, от приблизительно 250:1 до приблизительно 50:1, от приблизительно 200:1 до приблизительно 50:1, от приблизительно 150:1 до приблизительно 50:1 или от приблизительно 100:1 до приблизительно 50:1. В некоторых вариантах осуществления первый стимулятор (например, первый цитокин, такой как IL-7) и второй стимулятор (например, второй цитокин, такой как IL-15) присутствуют при отношении концентраций от приблизительно 200:1 до приблизительно 10:1, от приблизительно 150:1 до приблизительно 10:1, от приблизительно 125:1 до приблизительно 10:1 или от приблизительно 100:1 до приблизительно 4:1. В некоторых вариантах осуществления первый стимулятор (например, первый цитокин, такой как IL-7) и второй стимулятор (например, второй цитокин, такой как IL-15) присутствуют при отношении концентраций приблизительно 100:1. В некоторых вариантах осуществления первый стимулятор (например, первый цитокин, такой как IL-7) и второй стимулятор (например, второй цитокин, такой как IL-15) присутствуют при отношении концентраций приблизительно 5:1, приблизительно 6:1 или приблизительно 7.1. В некоторых вариантах осуществления первый стимулятор (например, первый цитокин, такой как IL-7) и второй стимулятор (например, второй цитокин, такой как IL-15) присутствуют при отношении концентраций 6,25:1.

[00179] В некоторых вариантах осуществления первый стимулятор (например, первый цитокин, такой как IL-7) присутствует в концентрации, которая составляет от приблизительно 100 МЕ/мл до приблизительно 20000 МЕ/мл. В некоторых вариантах осуществления второй стимулятор (например, второй цитокин, такой как IL-15) присутствует в концентрации, которая составляет от приблизительно 1 МЕ/мл до приблизительно 200 МЕ/мл.

[00180] В некоторых вариантах осуществления первый стимулятор (например, первый цитокин, такой как IL-7) присутствует в концентрации, которая составляет от приблизительно 100 МЕ/мл до приблизительно 10000 МЕ/мл. В некоторых вариантах осуществления второй стимулятор (например, второй цитокин, такой как IL-15) присутствует в концентрации, которая составляет от приблизительно 1 МЕ/мл до приблизительно 100 МЕ/мл.

[00181] В некоторых вариантах осуществления первый стимулятор (например, первый цитокин, такой как IL-7) присутствует в концентрации, которая составляет от приблизительно 100 МЕ/мл до приблизительно 1000 МЕ/мл, от приблизительно 300 МЕ/мл до приблизительно 5000 МЕ/мл или приблизительно 3000 МЕ/мл. В некоторых вариантах осуществления первый стимулятор (например, первый цитокин, такой как IL-7) присутствует в концентрации, которая составляет приблизительно 3000 МЕ/мл или приблизительно 5000 МЕ/мл.

[00182] В некоторых вариантах осуществления первый стимулятор (например, первый цитокин, такой как IL-7) присутствует в концентрации, которая составляет от приблизительно 2500 МЕ/мл до приблизительно 7500 МЕ/мл. В некоторых вариантах осуществления второй стимулятор (например, второй цитокин, такой как IL-15) присутствует в концентрации, которая составляет от приблизительно 25 МЕ/мл до приблизительно 75 МЕ/мл.

[00183] В некоторых вариантах осуществления первый стимулятор (например, первый цитокин, такой как IL-7) присутствует в концентрации, которая составляет от приблизительно 4000 МЕ/мл до приблизительно 6000 МЕ/мл. В некоторых вариантах осуществления второй стимулятор (например, второй цитокин, такой как IL-15) присутствует в концентрации, которая составляет от приблизительно 40 МЕ/мл до приблизительно 60 МЕ/мл. В некоторых вариантах осуществления второй стимулятор (например, второй цитокин, такой как IL-15) присутствует в концентрации, которая составляет от приблизительно 25 МЕ/мл до приблизительно 100 МЕ/мл или приблизительно 50 МЕ/мл.

[00184] В некоторых вариантах осуществления первый стимулятор (например, первый цитокин, такой как IL-7) присутствует в концентрации, которая составляет приблизительно 5000 МЕ/мл. В некоторых вариантах осуществления второй стимулятор (например, второй цитокин, такой как IL-15) присутствует в концентрации, которая составляет приблизительно 50 МЕ/мл.

[00185] В некоторых вариантах осуществления иммунные клетки (например, Т-клетки, такие как генетически модифицированные Т-клетки) приводят в контакт с первым стимулятором (например, первым цитокином, таким как IL-7) и вторым стимулятором (например, вторым цитокином, таким как IL-15) приблизительно один раз в день, два дня, три дня, четыре дня, пять дней, шесть дней, семь дней или восемь дней. В некоторых вариантах осуществления иммунные клетки (например, Т-клетки, такие как генетически модифицированные Т-клетки) приводят в контакт с первым стимулятором (например, первым цитокином, таким как IL-7) и вторым стимулятором (например, вторым цитокином, таким как IL-15) приблизительно один раз в неделю. В некоторых вариантах осуществления иммунные клетки (например, Т-клетки, такие как генетически модифицированные Т-клетки) приводят в контакт с первым стимулятором (например, первым цитокином, таким как IL-7) и вторым стимулятором (например, вторым цитокином, таким как IL-15) один раз, два раза, три раза, четыре раза, пять раз, шесть раз, семь раз или восемь раз в ходе процесса размножения, который длится приблизительно один день, два дня, три дня, четыре дня, пять дней, шесть дней, семь дней (например, приблизительно одну неделю), приблизительно две недели, приблизительно три недели или приблизительно четыре недели. В некоторых вариантах осуществления иммунные клетки (например, Т-клетки, такие как генетически модифицированные Т-клетки) приводят в контакт с первым стимулятором (например, первым цитокином, таким как IL-7) и вторым стимулятором (например, вторым цитокином, таким как IL-15) в течение приблизительно двух недель.

b. Внеклеточные модуляторы клеточного метаболизма

[00186] В некоторых вариантах осуществления среда для выращивания клеток дополнительно содержит внеклеточный модулятор клеточного метаболизма в дополнение к первому стимулятору (например, первому цитокину, такому как IL-7) и второму стимулятору (например, второму цитокину, такому как IL-15), как описано в данном документе.

[00187] В некоторых вариантах осуществления внеклеточный модулятор представляет собой внеклеточный калий (K⁺). В некоторых вариантах осуществления внеклеточный калий присутствует в концентрации, которая составляет от приблизительно 4 мМ до приблизительно 50 мМ, от приблизительно 4 мМ до приблизительно 40 мМ, от приблизительно 4 мМ до приблизительно 30 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 40 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 30 мМ, от приблизительно 15 мМ до приблизительно 40 мМ, от приблизительно 15 мМ до приблизительно 35 мМ, от приблизительно 15 мМ до приблизительно 30 мМ или от приблизительно 20 мМ до приблизительно 30 мМ. В некоторых вариантах осуществления внеклеточный калий присутствует в концентрации, которая составляет от приблизительно 10 мМ до приблизительно 30 мМ или от приблизительно 20 мМ до приблизительно 30 мМ.

[00188] В некоторых вариантах осуществления внеклеточный калий присутствует в концентрации, которая составляет приблизительно 8 мМ, 9 мМ, 10 мМ, 11 мМ, 12 мМ, 13 мМ, 14 мМ, 15 мМ, 16 мМ, 17 мМ, 18 мМ, 19 мМ, 20 мМ, 21 мМ, 22 мМ, 23 мМ, 24 мМ, 25 мМ, 26 мМ, 27 мМ, 28 мМ, 29 мМ или 30 мМ.

[00189] В некоторых вариантах осуществления внеклеточный калий присутствует в концентрации большей чем приблизительно 15 мМ. В некоторых вариантах осуществления внеклеточный калий присутствует в концентрации, которая превышает или равна приблизительно 20 мМ. В некоторых вариантах осуществления внеклеточный калий присутствует в концентрации, которая составляет приблизительно 20 мМ, 21 мМ, 22 мМ, 23 мМ, 24 мМ, 25 мМ, 26 мМ, 27 мМ, 28 мМ, 29 мМ или 30 мМ.

[00190] В некоторых вариантах осуществления внеклеточный калий присутствует в концентрации, которая составляет не менее чем приблизительно 10 мМ. В некоторых вариантах осуществления внеклеточный калий присутствует в концентрации, которая составляет не менее чем приблизительно 20 мМ. В некоторых вариантах осуществления внеклеточный калий присутствует в концентрации, которая составляет не более чем приблизительно 30 мМ. В некоторых вариантах осуществления внеклеточный калий присутствует в концентрации, которая составляет приблизительно 25 мМ.

[00191] В некоторых вариантах осуществления внеклеточный калий обеспечен в виде KCl.

с. Дополнительные признаки и компоненты сред для выращивания клеток

[00192] Среда для выращивания клеток, описанная в данном документе (например, среда для выращивания клеток, содержащая первый стимулятор, который представляет собой IL-7, второй стимулятор, который представляет собой IL-15, и внеклеточный модулятор, который представляет собой внеклеточный калий), могут быть использованы в разных способах активации и размножения Т-клеток, которые известны из уровня техники и описаны, например, в патенте США №6905874, патенте США №6867041, патенте США №6797514 и в РСТ WO2012/079000, содержания которых включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

[00193] В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает приведение в контакт РВМС или выделенных Т-клеток с дополнительной стимулирующей молекулой и костимулирующей молекулой, такой как антитела к CD3 и к CD28, как правило, присоединенной к грануле или другой поверхности, в культуральной среде с соответствующими цитокинами, такими как IL-2. Антитела к CD3 и к CD28, присоединенные к одной и той же грануле, служат «имитацией» антигенпрезентирующей клетки (АРС). Одним примером является система Dynabeads®, система CD3/CD28 активатор/стимулятор для физиологической активации Т-клеток человека. В других вариантах осуществления Т-клетки могут быть активированы и стимулированы для пролиферации питающими клетками и соответствующими антителами, а также другими цитокинами (например, в дополнение к IL-7 и IL-15) с использованием способов, таких как описанные в патенте США №6040177, патенте США №5827642 и в WO2012129514, содержания которых включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. В некоторых вариантах осуществления среды для выращивания клеток и способы их применения исключают экзогенный IL-2 в качестве фактора роста Т-клеток.

[00194] Другие условия, подходящие для культивирования Т-клеток включают подходящие среды (например, минимальные поддерживающие среды, или среды RPMI 1640, или среду X-vivo^™ (Lonza)), которые могут содержать дополнительные факторы, например, первый и второй стимуляторы для клеточной пролиферации, для пролиферации и жизнеспособности, включая сыворотку крови (например, фетальную бычью или сыворотку крови человека), инсулин, IFN-γ, GM-CSF, TGFβ и TNF, или любые другие добавки для выращивания клеток, известные специалисту в данной области техники. Другие добавки для выращивания клеток включают без ограничения поверхностно-активное вещество, плазманат и восстанавливающие средства, такие как N-ацетилцистеин и 2-меркаптоэтанол. Среды могут включать RPMI 1640, A1M-V, DMEM, MEM, а-МЕМ, F-12, Х-Vivo™ 10, Х-Vivo™ 15 и Х-Vivo™ 20, OpTmizer™, могут содержать добавленные аминокислоты, пируват натрия и/или витамины и могут либо не содержать сыворотку крови, либо быть дополненными соответствующим количеством сыворотки крови (или плазмы крови) и/или определенным набором гормонов. Антибиотики, например, пенициллин и стрептомицин, включены только в экспериментальные культуры, а не в культуры клеток, которые подлежат введению субъекту. Целевые клетки поддерживают в условиях, необходимых для поддержания роста, например, при соответствующей температуре (например, 37°C) и атмосфере (например, воздух плюс 5% СО₂). Т-клетки, подвергшиеся воздействию стимуляции с варьирующий значениями времени, могут проявлять разные характеристики.

[00195] В некоторых вариантах осуществления клетки по настоящему изобретению могут быть размножены путем совместного культивирования с тканью или клетками. Клетки также могут быть размножены in vivo, например, в крови субъекта после введения клетки субъекту.

[00196] В некоторых вариантах осуществления среда для выращивания клеток содержит сыворотку крови. В некоторых вариантах осуществления среда для выращивания клеток не содержит сыворотку крови. В некоторых вариантах осуществления среда для выращивания клеток не содержит ксеногенные компоненты. В некоторых вариантах осуществления среда для выращивания клеток является химически определенной.

d. Клеточная пролиферация

[00197] В некоторых вариантах осуществления культивирование клеток (в том числе иммунных клеток, таких как Т-клетки) для размножения in vitro с использованием среды для выращивания клеток, описанной в данном документе (например, среды для выращивания клеток, содержащей первый стимулятор, который представляет собой IL-7, второй стимулятор, который представляет собой IL-15, и внеклеточный модулятор, который представляет собой внеклеточный калий), или любых из способов, описанных в данном документе, имеет продолжительность, составляющую приблизительно один день, два дня, три дня, четыре дня, пять дней, шесть дней, семь дней (например, приблизительно одну неделю), приблизительно две недели, приблизительно три недели или приблизительно четыре недели. В некоторых вариантах осуществления продолжительность составляет от приблизительно одной недели до приблизительно трех недель или от приблизительно одной недели до приблизительно двух недель (например, приблизительно 7-15 дней или приблизительно 10-14 дней).

[00198] В некоторых вариантах осуществления среда для выращивания клеток, описанная в данном документе (например, среда для выращивания клеток, содержащая первый стимулятор, который представляет собой IL-7, второй стимулятор, который представляет собой IL-15, и внеклеточный модулятор, который представляет собой внеклеточный калий), или любые из способов, описанных в данном документе, обеспечивают размножение клеток в приблизительно 10 раз - приблизительно 10000 раз, как измерено за период от приблизительно одной недели до приблизительно трех недель. В некоторых вариантах осуществления размножение клеток в от приблизительно 100 раз до приблизительно 1000 раз наблюдают за приблизительно 7-15 дней (например, за приблизительно 10-14 дней или за приблизительно 2 недели). В некоторых вариантах осуществления размножение клеток в по меньшей мере приблизительно 100 раз наблюдают за приблизительно 7-15 дней (например, за приблизительно 10-14 дней или за приблизительно 2 недели). В некоторых вариантах осуществления размножение клеток в по меньшей мере приблизительно 200 раз наблюдают за приблизительно 7-15 дней (например, за приблизительно 10-14 дней или за приблизительно 2 недели).

[00199] В некоторых вариантах осуществления среда для выращивания клеток, описанная в данном документе (например, среда для выращивания клеток, содержащая первый стимулятор, который представляет собой IL-7, второй стимулятор, который представляет собой IL-15, и внеклеточный модулятор, который представляет собой внеклеточный калий), или любые из способов размножения клеток обеспечивают образование количества клеток, составляющего по меньшей мере от приблизительно 50×10⁶ до приблизительно 100×10⁶ за период приблизительно 8-16 дней. В некоторых вариантах осуществления количество клеток составляет по меньшей мере приблизительно 100×10⁶ за период приблизительно 10-14 дней (например, по меньшей мере приблизительно 100×10⁶, приблизительно 125×10⁶, приблизительно 150×10⁶ или приблизительно 100×10⁶ за период приблизительно 10-14 дней).

е. Клеточные фенотипы

[00200] В некоторых вариантах осуществления среда для выращивания клеток, описанная в данном документе (например, среда для выращивания клеток, содержащая первый стимулятор, который представляет собой IL-7, второй стимулятор, который представляет собой IL-15, и внеклеточный модулятор, который представляет собой внеклеточный калий), или любой способ ее применения обеспечивают образование необходимого фенотипа для получения сконструированных иммунных клеток.

[00201] В некоторых вариантах осуществления среда для выращивания клеток, описанная в данном документе (например, среда для выращивания клеток, содержащая первый стимулятор, который представляет собой IL-7, второй стимулятор, который представляет собой IL-15, и внеклеточный модулятор, который представляет собой внеклеточный калий), или любой способ ее применения обеспечивают образование популяции Т-клеток (например, генетически модифицированных Т-клеток), обогащенную T_CM- и T_SCM-клетками.

[00202] В некоторых вариантах осуществления популяция Т-клеток (например, генетически модифицированных Т-клеток), обогащенная T_CM- и/или T_SCM-клетками, содержит по меньшей мере приблизительно 60%, 65%, 70%, 75% или 80% объединенных T_CM- и T_SCM-клеток. В некоторых вариантах осуществления популяция Т-клеток, обогащенная T_CM- и/или T_SCM-клетками, содержит по меньшей мере приблизительно 70% объединенных T_CM- и T_SCM-клеток. В некоторых вариантах осуществления популяция Т-клеток (например, генетически модифицированных Т-клеток), обогащенная T_CM- и T_SCM-клетками, содержит по меньшей мере приблизительно 75% объединенных T_CM- и/или T_SCM-клеток.

[00203] В некоторых вариантах осуществления популяция Т-клеток (например, генетически модифицированных Т-клеток), обогащенная T_CM- и/или T_SCM-клетками содержит по меньшей мере приблизительно 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55% или 60% T_SCM-клеток. В некоторых вариантах осуществления популяция Т-клеток, обогащенная T_CM- и/или T_SCM-клетками, содержит по меньшей мере приблизительно 30%, 35%, 40% или 45% T_SCM-клеток.

4. Получение сконструированных иммунных клеток (в том числе Т-клеток с CAR)

[00204] В данном документе предусмотрены способы применения сред для выращивания клеток, описанных в данном документе, для получения иммунных клеток (в том числе сконструированных иммунных клеток, таких как Т-клетки с CAR).

[00205] Ряд известных методик может быть использован в получении полинуклеотидов, полипептидов, векторов, антигенсвязывающих доменов, иммунных клеток, композиций и т.п. по настоящему изобретению.

[00206] До манипуляции in vitro или генетической модификации иммунных клеток, описанных в данном документе, клетки могут быть получены от субъекта. Клетки, экспрессирующие CAR, могут быть получены с помощью аллогенного или аутологичного способа.

а. Исходный материал

[0100] Среды для выращивания клеток, описанные в данном документе (например, содержащие IL-7 + IL-15 и повышенное количество внеклеточного калия), могут быть использованы для культивирования различных клеток, в том числе для размножения in vitro различных иммунных клеток (например, генетически модифицированных Т-клеток). В данном документе описаны иллюстративные клетки.

[0101] В некоторых вариантах осуществления иммунные клетки включают Т-клетки. Т-клетки могут быть получены из ряда источников, включая мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС), костный мозг, ткань лимфатических узлов, пуповинную кровь, ткань тимуса, ткань из очага инфекции, асциты, плевральный выпот, ткань селезенки и опухоли. В некоторых определенных вариантах осуществления Т-клетки можно получать из объема крови, взятой у субъекта, с использованием любого числа методик, известных специалисту, таких как разделение с помощью FICOLL™.

[0102] Клетки можно получать из циркулирующей крови индивидуума посредством афереза. Продукт, полученный посредством афереза, обычно содержит лимфоциты, включая Т-клетки, моноциты, гранулоциты, В-клетки, другие ядерные лейкоциты, эритроциты и тромбоциты. В некоторых определенных вариантах осуществления клетки, собранные посредством афереза, можно промыть для удаления фракции плазмы крови, а затем поместить в соответствующие буфер или среды для последующей обработки.

[0103] В некоторых определенных вариантах осуществления Т-клетки выделяют из РВМС путем лизирования эритроцитов и истощения моноцитов, например, посредством центрифугирования в градиенте PERCOLL™. Определенные субпопуляции Т-клеток (например, CD28+, CD4+, CD45RA и CD45RO+ Т-клеток или CD28+, CD4+, CDS+, CD45RA- CD45RO+ и CD62L+ Т-клеток) могут быть далее выделены посредством известных из уровня техники методик положительного или отрицательного отбора. Например, обогащение популяции Т-клеток путем отрицательного отбора может быть достигнуто с помощью комбинации антител, направленных на поверхностные маркеры, уникальные для полученных отрицательным отбором клеток. Одним из способов применения в данном документе является сортировка и/или отбор клеток с помощью отрицательной магнитной иммуноадгезии или проточной цитометрии, в которой используют коктейль моноклональных антител, направленных на маркеры клеточной поверхности, присутствующие на полученных отрицательным отбором клетках. Например, для обогащения клетками CD4+ путем отрицательного отбора коктейль моноклональных антител обычно включает антитела к CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR и CD8. Проточная цитометрия и сортировка клеток также могут быть использованы для выделения представляющих интерес популяций клеток для применения в настоящем изобретении.

[0104] РВМС можно использовать непосредственно для генетической модификации иммунными клетками (такими как CAR или TCR) с использованием способов, описанных в данном документе. В некоторых определенных вариантах осуществления после выделения РВМС далее могут быть выделены Т-лимфоциты, и как цитотоксические, так и хелперные Т-лимфоциты могут быть отсортированы на субпопуляции интактных, Т-клеток памяти и эффекторных Т-клеток либо до, либо после генетической модификации и/или размножения.

[0105] В некоторых вариантах осуществления клетки CD8+ далее сортируют на интактные, стволовые клетки памяти, центральные клетки памяти и эффекторные клетки путем идентификации антигенов клеточной поверхности, которые связаны с каждым из этих типов клеток CD8+. В некоторых вариантах осуществления экспрессия фенотипических маркеров центральных Т-клеток памяти включает CD27, CD45RA, CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3 и CD127 и является отрицательной в отношении гранзима В. В некоторых вариантах осуществления стволовые Т-клетки памяти представляют собой Т-клетки CD45RO-, CD62L+, CD8+. В некоторых вариантах осуществления центральные Т-клетки памяти представляют собой Т-клетки CD45RO+, CD62L+, CD8+. В некоторых вариантах осуществления эффекторные Т-клетки являются отрицательными в отношении CD62L, CCR7, CD28 и CD127 и положительными в отношении гранзима В и перфорина. В некоторых определенных вариантах осуществления Т-клетки CD4+ дополнительно сортируют по субпопуляциям. Например, Т-хелперные клетки CD4+ можно сортировать на интактные, центральные клетки памяти и эффекторные клетки путем идентификации клеточных популяций, которые имеют антигены клеточной поверхности.

b. Полученные из стволовых клеток иммунные клетки

[0106] В некоторых вариантах осуществления иммунные клетки могут быть получены из эмбриональных стволовых (ES) или индуцированных плюрипотентных стволовых (iPS) клеток. Подходящие HSC, мезенхимальные клетки, iPS клетки и другие типы стволовых клеток могут представлять собой культивируемые иммортализованные клеточные линии или могут быть выделены непосредственно у пациента. Различные способы выделения, разработки и/или культивирования стволовых клеток известны из уровня техники и могут быть использованы для осуществления настоящего изобретения на практике.

[0107] В некоторых вариантах осуществления иммунная клетка представляет собой индуцированную плюрипотентную стволовую клетку (iPSC), полученную из перепрограммированной Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления исходный материал может представлять собой индуцированную плюрипотентную стволовую клетку (iPSC), полученную из Т-клетки или клетки, отличной от Т-клетки. Исходным материалом может быть эмбриональная стволовая клетка. Исходным материалом может быть В-клетка или любая другая клетка из изолятов мононуклеарных клеток периферической крови, гематопоэтическая клетка-предшественник, гемопоэтическая стволовая клетка, мезенхимальная стволовая клетка, жировая стволовая клетка или любой другой тип соматических клеток.

с. Генетическая модификация выделенных клеток

[0108] Иммунные клетки, такие как Т-клетки, могут быть генетически модифицированы после выделения с использованием известных способов, или иммунные клетки могут быть активированы и размножены (или дифференцированы в случае предшественников) in vitro перед генетической модификацией. В некоторых вариантах осуществления выделенные иммунные клетки генетически модифицированы для снижения или устранения экспрессии эндогенных TCRa и/или CD52. В некоторых вариантах осуществления клетки генетически модифицированы с использованием технологии редактирования генов (например, CRISPR/Cas9, нуклеаза с «цинковыми пальцами» (ZFN), TALEN, MegaTAL, мегануклеаза) для снижения или устранения экспрессии эндогенных белков (например, TCRa и/или CD52). В другом варианте осуществления иммунные клетки, такие как Т-клетки, генетически модифицированы химерными антигенными рецепторами, описанными в данном документе (например, трансдуцированы вирусным вектором, содержащим одну или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих CAR), а затем активированы и/или размножены in vitro.

[0109] Определенные способы получения конструкций и сконструированных иммунных клеток по настоящему изобретению, описаны в заявке согласно РСТ PCT/US15/14520, содержание которой включено в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

[0110] Следует учитывать, что РВМС могут дополнительно включать другие цитотоксические лимфоциты, такие как NK-клетки или NKT-клетки. Вектор экспрессии, несущий кодирующую последовательность химерного рецептора, как раскрыто в данном документе, может быть введен в популяцию донорских Т-клеток человека, NK-клеток или NKT-клеток. Успешно трансдуцированные Т-клетки, несущие вектор экспрессии, могут быть отсортированы с использованием проточной цитометрии для выделения CD3-положительных Т-клеток, а затем размножены для увеличения количества этих экспрессирующих CAR Т-клеток в дополнение к активации клеток с использованием антител к CD3 и IL-2 или других способов, известных из уровня техники, как описано в других местах в данном документе. Стандартные процедуры используют для криоконсервации Т-клеток, экспрессирующих CAR, для хранения и/или получения для использования в отношении субъекта-человека. В одном варианте осуществления трансдукцию, культивирование и/или размножение Т-клеток in vitro проводят в отсутствие продуктов, полученных от животных, отличных от человека, таких как фетальная телячья сыворотка и фетальная бычья сыворотка.

[0111] Для клонирования полинуклеотидов вектор можно ввести в клетку-хозяина (выделенную клетку-хозяина), чтобы обеспечить репликацию самого вектора и таким образом амплифицировать копии содержащегося в нем полинуклеотида. Клонирующие векторы могут содержать компоненты последовательности, как правило, включающие без ограничения точку начала репликации, промоторные последовательности, последовательности инициации транскрипции, энхансерные последовательности и селектируемые маркеры. Эти элементы могут быть выбраны соответствующим образом специалистом в данной области техники. Например, точка начала репликации может быть выбрана так, чтобы способствовать автономной репликации вектора в клетке-хозяине.

[0112] В некоторых определенных вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает выделенные клетки-хозяева, содержащие вектор, предусмотренный в данном документе. Клетки-хозяева, содержащие вектор, можно использовать для экспрессии или клонирования полинуклеотида, содержащегося в векторе. Подходящие клетки-хозяева могут включать без ограничения прокариотические клетки, клетки грибов, дрожжевые клетки или клетки высших эукариот, такие как клетки млекопитающих, особенно клетки человека.

[0113] Вектор может быть введен в клетку-хозяина с использованием любых подходящих способов, известных из уровня техники, в том числе без ограничения доставки, опосредованной DEAE-декстраном, способа осаждения фосфата кальция, опосредованной катионными липидами доставки, трансфекции, опосредованной липосомами, электропорации, бомбардировки микрочастицами, опосредованной рецептором доставки гена, доставки, опосредованной полилизином, гистона, хитозана и пептидов. Стандартные способы трансфекции и трансформации клеток для экспрессии представляющего интерес вектора хорошо известны из уровня техники. В дополнительном варианте осуществления смесь различных векторов экспрессии может быть использована для генетической модификации донорной популяции иммунных эффекторных клеток, где каждый вектор кодирует различный CAR, как раскрыто в данном документе. Полученные трансдуцированные иммунные эффекторные клетки образуют смешанную популяцию сконструированных клеток, при этом часть сконструированных клеток экспрессирует более одного отличающегося CAR.

[0114] В одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает способ хранения генетически сконструированных клеток, экспрессирующих CAR или TCR. Он предусматривает криоконсервацию иммунных клеток так, чтобы клетки оставались жизнеспособными после оттаивания. Фракция иммунных клеток, экспрессирующих CAR, может быть криоконсервирована способами, известными из уровня техники, чтобы обеспечить постоянный источник таких клеток для будущего лечения пациентов, пораженных злокачественными новообразованиями. При необходимости криоконсервированные трансформированные иммунные клетки можно разморозить, вырастить и размножить для получения большего количества таких клеток.

[0115] В некоторых вариантах осуществления клетки составляют сначала собирая их из культуральной среды, а затем промывая и концентрируя клетки в среде и системе контейнеров, подходящей для введения («фармацевтически приемлемый» носитель) в эффективном для лечения количестве. Подходящей инфузионной средой может быть любой состав изотонической среды, обычный нормальный солевой раствор, Normosol™ R (Abbott) или Plasma-Lyte™ A (Baxter), но также можно использовать 5% декстрозу в воде или лактат Рингера. Инфузионная среда может быть дополнена человеческим сывороточным альбумином.

d. Аллогенные Т-клетки с CAR (ALLOCAR Т™)

[0116] Процесс получения средств терапии на основе аллогенных Т-клеток с CAR или AlloCARs™ предусматривает сбор здоровых, отобранных, подвергнутых скринингу и тестированных Т-клеток от здоровых доноров. Затем конструируют Т-клетки для экспрессии CAR, которые распознают определенные белки клеточной поверхности, экспрессируемые в гематологических или солидных опухолях. Аллогенные Т-клетки подвергают редактирования генов, чтобы снизить риск заболевания «трансплантат против хозяина» (GvHD) и предотвратить аллогенное отторжение. Ген рецептора Т-клеток (например, TCRα, TCRβ) нокаутируют, чтобы избежать GvHD. Ген CD52 может быть нокаутирован, чтобы сделать продукт на основе Т-клеток с CAR устойчивым к обработке антителом к CD52. Таким образом, обработка антителом к CD52 может быть использована для подавления иммунной системы хозяина и обеспечивает приживление Т-клеток с CAR для достижения полного терапевтического эффекта. Затем сконструированные Т-клетки подвергают стадии очистки и в конечном итоге криоконсервируют во флаконах для доставки пациентам.

e. Аутологичные Т-клетки с CAR (AUTOCAR Т™)

[0117] Терапия на основе аутологичных Т-клеток с химерным антигенным рецептором (CAR) включает сбор собственных клеток пациента (например, белых кровяных клеток, в том числе Т-клеток) и генетическое конструирование Т-клеток для экспрессии CAR, которые распознают мишень, экспрессируемую на клеточной поверхности одной или более специфических раковых клеток, и уничтожают раковые клетки. Затем сконструированные клетки криоконсервируют и впоследствии вводят пациенту.

5. Фармацевтические композиции и терапия

[00207] В некоторых вариантах осуществления клетки составляют сначала собирая их из культуральной среды, а затем промывая и концентрируя клетки в среде и системе контейнеров, подходящей для введения («фармацевтически приемлемый» носитель) в эффективном для лечения количестве. Подходящей инфузионной средой может быть любой состав изотонической среды, обычный нормальный солевой раствор, Normosol™ R (Abbott) или Plasma-Lyte™ A (Baxter), но также можно использовать 5% декстрозу в воде или лактат Рингера. Инфузионная среда может быть дополнена человеческим сывороточным альбумином.

[00208] В вариантах осуществления необходимые терапевтические количества клеток в композиции, как правило, составляют по меньшей мере 2 клетки (например, подгруппа из по меньшей мере 1 CD8+ центральной или стволовой Т-клетки памяти и по меньшей мере 1 CD4+ хелперной Т-клетки; или две или более CD8+ центральных или стволовых Т-клетки памяти; или подгруппа их двух или более CD4+ хелперных Т-клеток) или более часто составляют более чем 10² клеток и не более 10⁶ включительно, не более 10⁷, 10⁸ или 10⁹ клеток включительно и могут составлять более чем 10¹⁰ клеток. Количество клеток будет зависеть от необходимого пути применения, для которого предназначена композиция, и типа клеток, включенных в нее. Плотность необходимых клеток обычно превышает 10⁶ клеток/мл и, как правило, составляет более чем 10⁷ клеток/мл, как правило, 10⁸ клеток/мл или больше. Клинически значимое количество иммунных клеток может быть разделено на несколько инфузий, которые в совокупности равняются 10⁵, 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹, 10¹⁰, 10¹¹ или 10¹² клеткам или превышают это количество. В некоторых аспектах настоящего изобретения, в частности, поскольку все инфузированные клетки будут перенаправлены на конкретный целевой антиген, можно вводить меньшее количество клеток в диапазоне приблизительно 10⁵/килограмм или приблизительно 10⁶/килограмм (10⁶-10¹¹ на пациента). Средства лечения на основе CAR можно вводить несколько раз в дозах в этих диапазонах. Клетки могут быть аутологичными, аллогенными или гетерологичными по отношению к пациенту, проходящему терапию.

[00209] Популяции клеток, экспрессирующих CAR, по настоящему изобретению, можно вводить либо отдельно, либо в виде фармацевтической композиции в комбинации с разбавителями и/или с другими компонентами, такими как IL-2 или другие цитокины или популяции клеток. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут содержать популяцию клеток, экспрессирующих CAR или TCR, например Т-клетки, описанные в данном документе, в комбинации с одним или более фармацевтически или физиологически приемлемыми носителями, разбавителями или вспомогательными веществами. Такие композиции могут содержать буферы, такие как нейтральный забуференный солевой раствор, забуференный фосфатом солевой раствор и т.п.; углеводы, такие как глюкоза, манноза, сахароза или декстраны, маннит; белки; полипептиды или аминокислоты, такие как глицин; анти оксид анты; хелатирующие средства, такие как EDTA или глутатион; адъюванты (например, гидроксид алюминия) и консерванты. Композиции по настоящему изобретению предпочтительно составляют для внутривенного введения.

[00210] Фармацевтические композиции (растворы, суспензии и т.п.) могут включать одно или более из следующего: стерильные разбавители, такие как вода для инъекций, солевой раствор, предпочтительно физиологический раствор, раствор Рингера, изотонический хлорид натрия, нелетучие масла, такие как синтетические моно- или диглицериды, которые могут служить в качестве растворителя или суспендирующей среды, полиэтил енгликоли, глицерин, пропиленгликоль или другие растворители; антибактериальные средства, такие как бензиловый спирт или метилпарабен; антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота или бисульфит натрия; хелатирующие средства, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота; буферы, такие как ацетаты, цитраты или фосфаты, а также средства для регулирования тоничности, такие как хлорид натрия или декстроза. Препарат для парентерального введения может быть помещен в ампулы, одноразовые шприцы или флаконы для многократных доз, изготовленные из стекла или пластика. Фармацевтическая композиция для инъекций предпочтительно является стерильной.

6. Способы лечения

[00211] Настоящее изобретение предусматривает способы лечения или предупреждения заболевания (например, рака) у пациента, включающие введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества по меньшей мере одного CAR или иммунных клеток, содержащих CAR, раскрытые в данном документе.

[00212] Предусмотрены способы лечения заболеваний или нарушений, включающих рак. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к созданию опосредованного Т-клетками иммунного ответа у субъекта, предусматривающему введение субъекту эффективного количества сконструированных иммунных клеток по настоящей заявке. В некоторых вариантах осуществления опосредованный Т-клетками иммунный ответ направлен против целевой клетки или клеток. В некоторых вариантах осуществления сконструированная иммунная клетка содержит химерный антигенный рецептор (CAR). В некоторых вариантах осуществления целевая клетка представляет собой опухолевую клетку. В некоторых аспектах настоящее изобретение предусматривает способ лечения или предупреждения злокачественного новообразования, при этом указанный способ предусматривает введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества по меньшей мере одного выделенного антигенсвязывающего домена, описанного в данном документе. В некоторых аспектах настоящее изобретение предусматривает способ лечения или предупреждения злокачественного новообразования, при этом указанный способ предусматривает введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества по меньшей мере одной иммунной клетки, при этом иммунная клетка содержит по меньшей мере один химерный антигенный рецептор, Т-клеточный рецептор и/или выделенный антигенсвязывающий домен, описанный в данном документе. Содержащие CAR иммунные клетки по настоящему изобретению могут быть использованы для лечения злокачественных новообразований, связанных с аберрантной экспрессией биомаркеров. В некоторых вариантах осуществления содержащие CAR иммунные клетки по настоящему изобретению могут быть использованы для лечения мелкоклеточного рака легких, меланомы, глиом низкой степени злокачественности, глиобластомы, медуллярного рака щитовидной железы, карциноидных опухолей, диспергированных нейроэндокринных опухолей поджелудочной железы, мочевого пузыря и предстательной железы, рака яичек и аденокарциномы легких с нейроэндокринными особенностями. В иллюстративных вариантах осуществления содержащие CAR иммунные клетки, например, Т-клетки с CAR по настоящему изобретению, используют для лечения мелкоклеточного рака легких.

[00213] Также предусмотрены способы уменьшения размера опухоли у субъекта, включающие введение субъекту сконструированной клетки по настоящему изобретению субъекту, при этом клетка содержит химерный антигенный рецептор, содержащий антигенсвязывающий домен, и связывается с антигеном на опухоли.

[00214] В некоторых вариантах осуществления у субъекта имеется солидная опухоль или злокачественное новообразование крови, такое как лимфома или лейкоз. В некоторых вариантах осуществления сконструированную клетку доставляют в ложе опухоли. В некоторых вариантах осуществления рак присутствует в костном мозге субъекта. В некоторых вариантах осуществления сконструированные клетки представляют собой аутологичные иммунные клетки, например, аутологичные Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления сконструированные клетки представляют собой аллогенные иммунные клетки, например, аллогенные Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления сконструированные клетки представляют собой гетерологичные иммунные клетки, например, гетерологичные Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления сконструированные клетки по настоящей заявке трансфицируют или трансдуцируют in vivo. В других вариантах осуществления сконструированные клетки трансфицируют или трансдуцируют ex vivo. Используемый в данном документе термин «клетка in vitro» относится к любой клетке, которую культивируют ex vivo.

[00215] Термины «терапевтически эффективное количество», «эффективная доза», «эффективное количество» или «терапевтически эффективная дозировка» терапевтического средства, например, сконструированных Т-клеток с CAR, означают любое количество, которое при использовании отдельно или в комбинации с другим терапевтическим средством защищает субъекта от проявления заболевания или способствует регрессии заболевания, о чем свидетельствует уменьшение тяжести симптомов заболевания, увеличение частоты и продолжительности бессимптомных периодов заболевания, или предупреждает ухудшение или нетрудоспособность вследствие заболевания. Способность терапевтического средства обеспечивать регрессию заболевания может быть оценена с использованием различных способов, известных квалифицированному практикующему специалисту, например, на субъектах-людях во время клинических испытаний, на животных модельных системах, предсказывающих эффективность у людей, или путем анализа активности средства в анализах in vitro.

[00216] Термины «пациент» и «субъект» используются взаимозаменяемо и включают субъектов-людей и отличных от человека субъектов-животных, а также субъектов с официально диагностированными нарушениями, субъектов без официально признанных нарушений, субъектов, получающих медицинскую помощь, субъектов с риском развития нарушений и т.д.

[00217] Термины «лечить» и «лечение» включают виды терапевтического лечения, виды профилактического лечения и виды применения, в которых снижается риск того, что у субъекта разовьется нарушение или другой фактор риска. Лечение не требует полного излечения нарушения и охватывает варианты осуществления, в которых уменьшаются проявления симптомов или основные факторы риска. Термин «предупреждать» не требует 100% исключения вероятности события. Скорее, он означает, что вероятность возникновения события уменьшилась в присутствии соединения или вследствие применения способа.

[00218] Необходимые терапевтические количества клеток в композиции, как правило, составляют по меньшей мере 2 клетки (например, подгруппа из по меньшей мере 1 CD8+ центральной Т-клетки памяти и по меньшей мере 1 CD4+ хелперной Т-клетки), или более часто составляют более чем 10² клеток и не более 10⁶, не более 10⁸ или 10⁹ клеток включительно и могут составлять более чем 10¹⁰ клеток. Количество клеток будет зависеть от необходимого пути применения, для которого предназначена композиция, и типа клеток, включенных в нее. Плотность необходимых клеток обычно превышает 10⁶ клеток/мл и, как правило, составляет более чем 10⁷ клеток/мл, как правило, 10⁸ клеток/мл или больше. Клинически значимое количество иммунных клеток может быть разделено на несколько инфузий, которые в совокупности равняются 10⁵, 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹, 10¹⁰, 10¹¹ или 10¹² клеткам или превышают это количество. В некоторых аспектах настоящего изобретения, в частности, поскольку все инфузированные клетки будут перенаправлены на конкретный целевой антиген, можно вводить меньшее количество клеток в диапазоне 10⁶/килограмм (10⁶-10¹¹ на пациента). Средства лечения на основе CAR можно вводить несколько раз в дозах в этих диапазонах. Клетки могут быть аутологичными, аллогенными или гетерологичными по отношению к пациенту, проходящему терапию.

[00219] В некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективное количество Т-клеток с CAR составляет приблизительно 1×10⁵ клеток/кг, приблизительно 2×10⁵ клеток/кг, приблизительно 3×10⁵ клеток/кг, приблизительно 4×10⁵ клеток/кг, приблизительно 5×10⁵ клеток/кг, приблизительно 6×10⁵ клеток/кг, приблизительно 7×10⁵ клеток/кг, приблизительно 8×10⁵ клеток/кг, приблизительно 9×10⁵ клеток/кг, 2×10⁶ клеток/кг, приблизительно 3×10⁶ клеток/кг, приблизительно 4×10⁶ клеток/кг, приблизительно 5×10⁶ клеток/кг, приблизительно 6×10⁶ клеток/кг, приблизительно 7×10⁶ клеток/кг, приблизительно 8×10⁶ клеток/кг, приблизительно 9×10⁶ клеток/кг, приблизительно 1×10⁷ клеток/кг, приблизительно 2×10⁷ клеток/кг, приблизительно 3×10⁷ клеток/кг, приблизительно 4×10⁷ клеток/кг, приблизительно 5×10⁷ клеток/кг, приблизительно 6×10⁷ клеток/кг, приблизительно 7×10⁷ клеток/кг, приблизительно 8×10⁷ клеток/кг или приблизительно 9×10⁷ клеток/кг.

[00220] В некоторых вариантах осуществления целевые дозы для CAR+/CAR-T+/TCR+ клеток варьируют от 1×10⁶ до 2×10⁸ клеток/кг, например, составляют 2×10⁶ клеток/кг. Следует понимать, что дозы выше и ниже этого диапазона могут быть подходящими для определенных субъектов, и подходящие уровни доз могут быть определены поставщиком медицинских услуг при необходимости. Кроме того, согласно настоящему изобретению могут быть предусмотрены множественные дозы клеток.

[00221] В некоторых аспектах настоящее изобретение предусматривает фармацевтическую композицию, содержащую по меньшей мере один антигенсвязывающий домен, описанный в данном документе, и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция дополнительно содержит дополнительное активное средство.

[00222] Популяции клеток, экспрессирующих CAR, по настоящему изобретению, можно вводить либо отдельно, либо в виде фармацевтической композиции в комбинации с разбавителями и/или с другими компонентами, такими как IL-2 или другие цитокины или популяции клеток. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут содержать популяцию клеток, экспрессирующих CAR или TCR, например Т-клетки, описанные в данном документе, в комбинации с одним или более фармацевтически или физиологически приемлемыми носителями, разбавителями или вспомогательными веществами. Такие композиции могут содержать буферы, такие как нейтральный забуференный солевой раствор, забуференный фосфатом солевой раствор и т.п.; углеводы, такие как глюкоза, манноза, сахароза или декстраны, маннит; белки; полипептиды или аминокислоты, такие как глицин; анти оксид анты; хелатирующие средства, такие как EDTA или глутатион; адъюванты (например, гидроксид алюминия) и консерванты. Композиции по настоящему изобретению предпочтительно составляют для внутривенного введения.

[00223] Фармацевтические композиции (растворы, суспензии и т.п.) могут включать одно или более из следующего: стерильные разбавители, такие как вода для инъекций, солевой раствор, предпочтительно физиологический раствор, раствор Рингера, изотонический хлорид натрия, нелетучие масла, такие как синтетические моно- или диглицериды, которые могут служить в качестве растворителя или суспендирующей среды, полиэтил енгликоли, глицерин, пропиленгликоль или другие растворители; антибактериальные средства, такие как бензиловый спирт или метилпарабен; антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота или бисульфит натрия; хелатирующие средства, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота; буферы, такие как ацетаты, цитраты или фосфаты, а также средства для регулирования тоничности, такие как хлорид натрия или декстроза. Препарат для парентерального введения может быть помещен в ампулы, одноразовые шприцы или флаконы для многократных доз, изготовленные из стекла или пластика. Фармацевтическая композиция для инъекций предпочтительно является стерильной.

[00224] В некоторых вариантах осуществления при введении пациенту сконструированные иммунные клетки, экспрессирующие на своей клеточной поверхности любой из антигенспецифических CAR, описанных в данном документе, могут уменьшать, уничтожать или лизировать эндогенные экспрессирующие антиген клетки пациента. В одном варианте осуществления процент уменьшения или лизиса экспрессирующих антиген эндогенных клеток или клеток из клеточной линии, экспрессирующей антиген, сконструированными иммунными клетками, экспрессирующими любой из антигенспецифических CAR, описанных в данном документе, составляет по меньшей мере приблизительно 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% или больше. В одном варианте осуществления процент уменьшения или лизиса экспрессирующих антиген эндогенных клеток или клеток из клеточной линии, экспрессирующей антиген, сконструированными иммунными клетками, экспрессирующими антигенспецифические CAR, составляет от приблизительно 5% до приблизительно 95%, от приблизительно 10% до приблизительно 95%, от приблизительно 10% до приблизительно 90%, от приблизительно 10% до приблизительно 80%, от приблизительно 10% до приблизительно 70%, от приблизительно 10% до приблизительно 60%, от приблизительно 10% до приблизительно 50%, от приблизительно 10% до приблизительно 40%, от приблизительно 20% до приблизительно 90%, от приблизительно 20% до приблизительно 80%, от приблизительно 20% до приблизительно 70%, от приблизительно 20% до приблизительно 60%, от приблизительно 20% до приблизительно 50%, от приблизительно 25% до приблизительно 75% или от приблизительно 25% до приблизительно 60%. В одном варианте осуществления эндогенные экспрессирующие антиген клетки представляют собой эндогенные экспрессирующие антиген клетки костного мозга.

[00225] В одном варианте осуществления процент уменьшения или лизиса целевых клеток, например, клеточной линии, экспрессирующей антиген, сконструированными иммунными клетками, экспрессирующими на своей мембране клеточной поверхности антигенспецифический CAR по настоящему изобретению, может быть измерен с использованием анализа, раскрытого в данном документе.

[00226] Способы могут дополнительно включать введение одного или более химиотерапевтических средств. В некоторых определенных вариантах осуществления химиотерапевтическое средство представляет собой лимфодеплеционное (прекондиционирующее) химиотерапевтическое средство. Например, способы улучшения физического состояния пациента, нуждающегося в Т-клеточной терапии, включают введение пациенту конкретных эффективных доз циклофосфамида (от 200 мг/м²/сутки до 2000 мг/м²/сутки, от приблизительно 100 мг/м²/сутки до приблизительно 2000 мг/м²/сутки; например, приблизительно 100 мг/м²/сутки, приблизительно 200 мг/м²/сутки, приблизительно 300 мг/м²/сутки, приблизительно 400 мг/м²/сутки, приблизительно 500 мг/м²/сутки, приблизительно 600 мг/м²/сутки, приблизительно 700 мг/м²/сутки, приблизительно 800 мг/м²/сутки, приблизительно 900 мг/м²/сутки, приблизительно 1000 мг/м²/сутки, приблизительно 1500 мг/м²/сутки или приблизительно 2000 мг/м²/сутки) и определенных доз флударабина (от 20 мг/м²/сутки до 900 мг/м²/сутки, от приблизительно 10 мг/м²/сутки до приблизительно 900 мг/м²/сутки; например, приблизительно 10 мг/м²/сутки, приблизительно 20 мг/м²/сутки, приблизительно 30 мг/м²/сутки, приблизительно 40 мг/м²/сутки, приблизительно 40 мг/м²/сутки, приблизительно 50 мг/м²/сутки, приблизительно 60 мг/м²/сутки, приблизительно 70 мг/м²/сутки, приблизительно 80 мг/м²/сутки, приблизительно 90 мг/м²/сутки, приблизительно 100 мг/м²/сутки, приблизительно 500 мг/м²/сутки или приблизительно 900 мг/м²/сутки). Предпочтительный режим введения дозы включает лечение пациента, предусматривающее ежедневное введение пациенту приблизительно 300 мг/м²/сутки циклофосфамида и приблизительно 30 мг/м²/сутки флударабина в течение трех дней до введения терапевтически эффективного количества сконструированных Т-клеток пациенту.

[00227] В некоторых вариантах осуществления лимфодеплеция дополнительно предусматривает введение антитела к CD52. В некоторых вариантах осуществления антитело к CD52 вводят в дозеприблизительно 13 мг/сутки IV.

[00228] В других вариантах осуществления каждое из антигенсвязывающего домена, трансдуцированных (или иным образом сконструированных) клеток и химиотерапевтического средства вводят в количестве, эффективном для лечения заболевания или состояния у субъекта.

[00229] В некоторых определенных вариантах осуществления композиции, содержащие экспрессирующие CAR иммунные эффекторные клетки, раскрытые в данном документе, могут быть введены в сочетании с любым количеством химиотерапевтических средств, которые могут быть введены в любом порядке. Примеры химиотерапевтических средств включают алкилирующие средства, такие как тиотепа и циклофосфамид (CYTOXAN™); алкилсульфонаты, такие как бусульфан, импросульфан и пипосульфан; азиридины, такие как бензодопа, карбоквон, метуредопа и уредопа; этиленимины и метиламеламины, в том числе альтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметилоломеламиновую смолу; азотистые иприты, такие как хлорамбуцил, хлорнафазин, хлорфосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлорэтамин, мехлорэтаминоксид гидрохлорид, мелфалан, новэмбихин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урациловый иприт; нитрозомочевины, такие как кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин, ранимустин; антибиотики, такие как аклациномизины, актиномицин, антрамицин, азасерин, блеомицины, кактиномицин, калихемицин, карабицин, карминомицин, карцинофилин, хромомицины, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-Ь-норлейцин, доксорубицин, эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марцелломицин, митомицины, микофеноловая кислота, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, потфиромицин, пуромицин, квеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин; антиметаболиты, такие как метотрексат и 5-фторурацил (5-FU); аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; аналоги пурина, такие как флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин; аналоги пиримидина, такие как анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин, 5-FU; андрогены, такие как калустерон, дромостанолона пропионат, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон; средства, угнетающие функции коры надпочечников, такие как аминоглутетимид, митотан, трилостан; добавку для восполнения фолиевой кислоты, такую как фолиниевая кислота; ацеглатон; альдофосфамида гликозид; аминолевулиновую кислоту; амсакрин; бестрабуцил; бисантрен; эдатрексат; дефофамин; демеколцин; диазиквон; элформитин; эллиптиниума ацетат; этоглюцид; нитрат галлия; гидроксимочевину; лентинан; лонидамин; митогуазон; митоксантрон; мопидамол; нитракрин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; подофиллиновую кислоту; 2-этилгидразид; прокарбазин; PSK®; разоксан; сизофиран; спиро германий; тенуазоновую кислоту; триазиквон; 2,2',2''-трихлортриэтиламин; уретан; виндезин; дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман; гацитозин; арабинозид («Ara-С»); циклофосфамид; тиотепу; таксоиды, например, паклитаксел (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb) и доксетаксел (TAXOTERE®, Rhne-Poulenc Rorer); хлорамбуцил; гемцитабин; 6-тиогуанин; меркаптопурин; метотрексат; аналоги платины, такие как цисплатин и карбоплатин; винбластин; платину; этопозид (VP-16); ифосфамид; митомицин С; митоксантрон; винкристин; винорелбин; навельбин; новантрон; тенипозид; дауномицин; аминоптерин; кселоду; ибандронат; СРТ-11; ингибитор топоизомеразы RFS 2000; дифторметиломитин (DMFO); производные ретиноевой кислоты, такие как Targretin™ (бексаротен), Panretin™ (алитретиноин); ONTAK™ (денилейкин дифтитокс); эсперамицины; капецитабин; а также фармацевтически приемлемые соли, кислоты и производные любого из вышеуказанных. Также в это определение включены антигормональные средства, которые регулируют или подавляют действие гормонов на опухоли, такие как антиэстрогены, в том числе, например, тамоксифен, ралоксифен, 4(5)-имидазолы, подавляющие ароматазу, 4-гидрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, LY117018, онапристон и торемифен (фарестон); и антиандрогены, такие как флутамид, нилутамид, бикалутамид, лейпролид и гозерелин; а также фармацевтически приемлемые соли, кислоты и производные любого из вышеуказанных. Также при необходимости вводят комбинации химиотерапевтических средств, в том числе без ограничения CHOP, т.е. циклофосфамид (Cytoxan®), доксорубицин (гидроксидоксорубицин), винкристин (Oncovin®) и преднизон.

[00230] В некоторых вариантах осуществления химиотерапевтические средства вводят в одно и то же время или через одну неделю после введения сконструированной клетки, полипептида или нуклеиновой кислоты. В других вариантах осуществления химиотерапевтическое средство вводят через 1-4 недели или 1 неделю - 1 месяц, 1 неделю - 2 месяца, 1 неделю - 3 месяца, 1 неделю - 6 месяцев, 1 неделю - 9 месяцев или 1 неделю - 12 месяцев после введения сконструированной клетки, полипептида или нуклеиновой кислоты. В других вариантах осуществления химиотерапевтическое средство вводят по меньшей мере за 1 месяц до введения клетки, полипептида или нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления способы дополнительно включают введение двух или более химиотерапевтических средств.

[00231] Ряд дополнительных терапевтических средств может быть использован в сочетании с композициями, описанными в данном документе. Например, потенциально применимые дополнительные терапевтические средства включают ингибиторы PD-1, такие как ниволумаб (Opdivo®), пембролизумаб (Keytruda®), пембролизумаб, пидилизумаб и атезолизумаб.

[00232] Дополнительные терапевтические средства, подходящие для применения в комбинации по настоящему изобретению, включают без ограничения ибрутиниб (Imbruvica®), офатумумаб (Arzerra®, ритуксимаб (Rituxan®), бевацизумаб (Avastin®), трастузумаб (Herceptin®), трастузумаб эмтанзин (KADCYLA®, иматиниб (Gleevec®), цетуксимаб (Erbitux®, панитумумаб) (Vectibix®), катумаксомаб, ибритумомаб, офатумумаб, тозитумомаб, брентуксимаб, алемтузумаб, гемтузумаб, эрлотиниб, гефитиниб, вандетаниб, афатиниб, лапатиниб, нератиниб, акситиниб, мазитиниб, пазопаниб, сунитиниб, сорафениб, тоцераниб, лестауртиниб, акситиниб, седираниб, ленватиниб, нинтеданиб, пазопаниб, регорафениб, семаксаниб, сорафениб, сунитиниб, тивозаниб, тоцераниб, вандетаниб, энтректиниб, сабозантиниб, иматиниб, дазатиниб, нилотиниб, понатиниб, радотиниб, босутиниб, лестауртиниб, руксолитиниб, пакритиниб, кобиметиниб, селуметиниб, траметиниб, биниметиниб, алектиниб, церитиниб, кризотиниб, афлиберцепт, адипотид, денилейкин дифтитокс, ингибиторы mTOR, такие как эверолимус и темсиролимус, ингибиторы hedgehog, такие как сонидегиб и висмодегиб, ингибиторы CDK, такие как ингибитор CDK (палбоциклиб).

[00233] В некоторых вариантах осуществления композиция, содержащая иммунные клетки, содержащие CAR, может быть введена при терапевтическом режиме для предупреждения синдрома высвобождения цитокина (CRS) или ней ротоксичн ости. Терапевтический режим для предупреждения синдрома высвобождения цитокина (CRS) или нейротоксичности может включать введение лензилумаба, тоцилизумаба, предсердного натрийуретического пептида (ANP), анакинры, ингибиторов iNOS (например, L-NIL или 1400W). В дополнительных вариантах осуществления композиция, содержащая иммунные клетки, содержащие CAR, может быть введена с противовоспалительным средством. Противовоспалительные средства или лекарственные средства включают без ограничения стероиды и глюкокортикоиды (в том числе бетаметазон, будесонид, дексаметазон, гидрокортизона ацетат, гидрокортизон, гидрокортизон, метилпреднизолон, преднизолон, преднизон, триамцинолон), нестероидные противовоспалительные лекарственные средства (NSAID), в том числе аспирин, ибупрофен, напроксен, метотрексат, сульфасалазин, лефлуномид, лекарственные препараты против TNF, циклофосфамид и микофенолат. Иллюстративные NSAID включают ибупрофен, напроксен, напроксен натрия, ингибиторы Сох-2 и сиалилаты. Иллюстративные анальгетики включают ацетаминофен, оксикодон, трамадол и пропоксифена гидрохлорид. Иллюстративные глюкокортикоиды включают кортизон, дексаметазон, гидрокортизон, метилпреднизолон, преднизолон или преднизон. Иллюстративные модификаторы биологических ответов включают молекулы, направленные против маркеров клеточной поверхности (например, CD4, CD5 и т.д.), ингибиторы цитокинов, такие как антагонисты TNF (например, этанерцепт (ENBREL®), адалимумаб (HUMIRA®) и инфликсимаб (REMICADE®), ингибиторы хемокина и ингибиторы адгезивных молекул. Модификаторы биологического ответа включают моноклональные антитела, а также рекомбинантные формы молекул. Иллюстративные DMARD включают азатиоприн, циклофосфамид, циклоспорин, метотрексат, пеницилламин, лефлуномид, сульфасалазин, гидроксихлорохин, Gold (пероральный (ауранофин) и внутримышечный) и миноциклин.

[00234] В некоторых определенных вариантах осуществления композиции, описанные в данном документе, вводят в сочетании с цитокином. Примерами цитокинов являются лимфокины, монокины и традиционные полипептидные гормоны. В число цитокинов входят гормоны роста, такие как гормон роста человека, N-метиониловый гормон роста человека и гормон роста крупного рогатого скота; паращитовидный гормон; тироксин; инсулин; проинсулин; релаксин; прорелаксин; гликопротеиновые гормоны, такие как фолликулостимулирующий гормон (FSH), тиреостимулирующий гормон (TSH) и лютеинизирующий гормон (LH); фактор роста печени (HGF); фактор роста фибробластов (FGF); пролактин; плацентарный лактоген; вещество, подавляющее муллериан; пептид, ассоциированный с гонадотропином мыши; ингибин; активин; эндотелиальные факторы роста сосудов; интегрин; тромбопоэтин (ТРО); факторы роста нервов (NGF), такие как NGF-бета; тромбоцитарный фактор роста; трансформирующие факторы роста (TGF), такие как TGF-альфа и TGF-бета; инсулиноподобный фактор роста I и II; эритропоэтин (ЕРО); остеоиндуктивные факторы; интерфероны, такие как интерферон-альфа, -бета и -гамма, колониестимулирующие факторы (CSF), такие как CSF макрофагов (M-CSF); CSF гранулоцитов и макрофагов (GM-CSF) и CSF гранулоцитов (G-CSF); интерлейкины (IL), такие как IL-1, IL-1-альфа, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-15, IL-21; фактор некроза опухолей, такой KaKTNF-альфа или TNF-бета; и другие полипептидные факторы, в том числе LIF и лиганд KIT (KL). Используемый в данном документе термин «цитокин» включает белки из природных источников или из культуры рекомбинантных клеток и биологически активные эквиваленты цитокинов с нативной последовательностью.

7. Способы сортировки и истощения

[00235] В некоторых вариантах осуществления предусмотрены способы сортировки популяции иммунных клеток in vitro, где подгруппа популяции иммунных клеток содержит сконструированные иммунные клетки, экспрессирующие антигенспецифические CAR, содержащие эпитопы, специфические в отношении моноклональных антител (например, иллюстративные последовательности мимотопа). Способ предусматривает введение в контакт популяции иммунных клеток с моноклональным антителом, специфическим в отношении эпитопов, и отбор иммунных клеток, которые связываются с моноклональным антителом, для получения популяции клеток, обогащенной сконструированными иммунными клетками, экспрессирующими антигенспецифический CAR.

[00236] В некоторых вариантах осуществления указанное моноклональное антитело, специфическое в отношении указанного эпитопа. необязательно конъюгировано с флуорофором. В этом варианте осуществления стадия отбора клеток, которые связываются с моноклональным антителом, может быть осуществлена посредством сортировки клеток с активированной флуоресценцией (FACS).

[00237] В некоторых вариантах осуществления указанное моноклональное антитело, специфическое в отношении указанного эпитопа. необязательно конъюгировано с магнитной частицей. В этом варианте осуществления стадия отбора клеток, которые связываются с моноклональным антителом, может быть осуществлена посредством активируемой магнитным полем сортировки клеток (MACS).

[00238] В некоторых вариантах осуществления mAb, используемое в способе сортировки иммунных клеток, экспрессирующих CAR, выбрано из алемтузумаба, ибритумомаба тиуксетана, муромонаб-CD3, тозитумомаба, абциксимаба, базиликсимаба, брентуксимаба ведотина, цетуксимаба, инфликсимаба, ритуксимаба, бевацизумаба, цертолизумаба пегола, даклизумаба, экулизумаба, эфализумаба, гемтузумаба, натализумаба, омализумаба, паливизумаба, ранибизумаба, тоцилизумаба, трастузумаба, ведолизумаба, адалимумаба, белимумаба, канакинумаба, деносумаба, голимумаба, ипилимумаба, офатумумаба, панитумумаба, QBEND-10 и/или устекинумаба. В некоторых вариантах осуществления указанное mAb представляет собой ритуксимаб. В другом варианте осуществления указанное mAb представляет собой QBEND-10. В другом варианте осуществления mAb связывается с TCRα или TCRβ.

[00239] В некоторых вариантах осуществления популяция экспрессирующих CAR иммунных клеток, полученных при использовании способа in vitro сортировки экспрессирующих CAR иммунных клеток, описанных выше, содержит по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% экспрессирующих CAR иммунных клеток. В некоторых вариантах осуществления популяция экспрессирующих CAR иммунных клеток, полученных при использовании способа in vitro сортировки экспрессирующих CAR иммунных клеток, содержит по меньшей мере 85% экспрессирующих CAR иммунных клеток.

[00240] В некоторых вариантах осуществления популяция экспрессирующих CAR иммунных клеток, полученных при использовании способа in vitro сортировки экспрессирующих CAR иммунных клеток, описанных выше, демонстрирует повышенную цитотоксическую активность in vitro по сравнению с изначальной (несортированной) клеточной популяцией. В некоторых вариантах осуществления указанная цитотоксическая активность in vitro повышается на 10%, 20%, 30% или 50%. В некоторых вариантах осуществления иммунные клетки представляют собой Т-клетки.

[00241] В некоторых вариантах осуществления mAb предварительно связывают с подложкой или поверхностью. Неограничивающие примеры твердой подложки могут включать гранулу, гранулу агарозы, магнитную гранулу, пластиковый планшет с лунками, стеклянный планшет с лунками, керамический планшет с лунками, колонку или пакет для культивирования клеток.

[00242] Экспрессирующие CAR иммунные клетки, подлежащие введению реципиенту, могут быть обогащены in vitro из исходной популяции. Способы размножения исходных популяций могут включать отбор клеток, которые экспрессируют антиген, такой как антиген CD34, с использованием комбинаций центрифугирования в градиенте плотности, очистки иммуномагнитными гранулами, аффинной хроматографии и сортировки клеток с активированной флуоресценцией.

[00243] Проточная цитометрия может быть использована для количественного определения конкретных типов клеток в популяции клеток. В целом, проточная цитометрия представляет собой способ количественного определения компонентов или структурных признаков клеток, главным образом с помощью оптических средств. Поскольку различные типы клеток можно различить путем количественного определения структурных признаков, проточная цитометрия и сортировка клеток могут использоваться для подсчета и сортировки клеток разных фенотипов в смеси.

[00244] Анализ проточной цитометрии включает две основных стадии: 1) мечение выбранных типов клеток одним или более мечеными маркерами и 2) определение количества меченых клеток по отношению к общему количеству клеток в популяции. В некоторых вариантах осуществления способ мечения типов клеток предусматривает связывание меченых антител с маркерами, экспрессируемыми конкретным типом клеток. Антитела могут быть либо непосредственно мечены флуоресцентным соединением, либо опосредованно мечены с использованием, например, второго антитела с флуоресцентной меткой, которое распознает первое антитело.

[00245] В некоторых вариантах осуществления способ, используемый для сортировки Т-клеток, экспрессирующих CAR, представляет собой сортировку клеток с магнитной активацией (MACS). Сортировка клеток с магнитной активацией (MACS) представляет собой способ разделения различных популяций клеток в зависимости от их поверхностных антигенов (молекул CD) с использованием суперпарамагнитных наночастиц и колонок. MACS может быть использована для получения чистой популяции клеток. Клетки в одноклеточной суспензии можно подвергнуть магнитному мечению с помощью микрогранул. Образец наносят на колонку, состоящую из ферромагнитных сфер, покрытых безвредным для клеток покрытием, обеспечивающим быстрое и осторожное разделение клеток. Немеченые клетки проходят, а клетки с магнитной меткой остаются внутри колонки. Проходящий поток можно собрать как фракцию немеченных клеток. После стадии промывки колонку удаляют из сепаратора и клетки с магнитной меткой элюируют из колонки.

[00246] Подробный протокол очистки конкретной популяции клеток, например Т-клеток, можно найти у Basu S et al. (2010). (Basu S, Campbell HM, Dittel BN, Ray A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J Vis Exp. (41): 1546).

[00247] В некоторых аспектах настоящее изобретение предусматривает способ истощения антигенспецифических экспрессирующих CAR иммунных клеток путем in vivo истощения. In vivo истощение может предусматривать введение средства лечения (например, молекулы, которая связывает эпитоп на CAR) в организм млекопитающего с целью прекращения пролиферации экспрессирующих CAR иммунных клеток путем подавления или элиминации.

[00248] В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает способ in vivo истощения сконструированной иммунной клетки, экспрессирующей CAR, содержащий специфический в отношении mAb эпитоп, включающий приведение в контакт указанной сконструированной иммунной клетки или указанной экспрессирующей CAR иммунной клетки с по меньшей мере одним специфическим в отношении эпитопа mAb. В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает способ in vivo истощения экспрессирующей CAR иммунной клетки, которая содержит химерный scFv (например, образованный путем вставки специфического в отношении mAb эпитопа), путем приведения в контакт указанной сконструированной иммунной клетки со специфическими в отношении эпитопа антителами. В некоторых вариантах осуществления иммунные клетки представляют собой Т-клетки, и/или антитела являются моноклональными.

[00249] Согласно одному варианту осуществления in vivo истощение иммунных сконструированных клеток выполняют на сконструированных иммунных клетках, которые предварительно были отсортированы с использованием способа in vitro по настоящему изобретению. В этом случае можно использовать то же инфузированное mAb В некоторых вариантах осуществления специфический в отношении mAb антиген представляет собой антиген CD20, а специфическое в отношении эпитопа mAb представляет собой ритуксимаб. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает способ in vivo истощения сконструированной иммунной клетки, экспрессирующей CAR, содержащий специфический в отношении mAb эпитоп (экспрессирующей CAR иммунной клетки), у пациента, включающий приведение в контакт указанной экспрессирующей CAR иммунной клетки с по меньшей мере одним специфическим в отношении эпитопа mAb

[00250] В некоторых вариантах осуществления стадия приведения в контакт указанной сконструированной иммунной клетки или указанной экспрессирующей CAR иммунной клетки с по меньшей мере одним специфическим в отношении эпитопа mAb, предусматривает инфузию пациенту специфического в отношении эпитопа mAb (например, ритуксимаба). В некоторых вариантах осуществления количество специфического в отношении эпитопа mAb, вводимое пациенту, является достаточным для уничтожения по меньшей мере 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% экспрессирующих CAR иммунных клеток у пациента.

[00251] В некоторых вариантах осуществления стадия приведения в контакт указанной сконструированной иммунной клетки или указанной экспрессирующей CAR иммунной клетки с по меньшей мере одним специфическим в отношении эпитопа mAb, предусматривает инфузию пациенту 375 мг/м² ритуксимаба один или более раз. В некоторых вариантах осуществления mAb (например, ритуксимаб) вводят один раз в неделю.

[00252] В некоторых вариантах осуществления при истощении иммунных клеток, экспрессирующих CAR, содержащий специфический в отношении mAb эпитоп (экспрессирующих CAR иммунных клеток), в анализе комплементзависимой цитотоксичности (CDC) с использованием специфического в отношении эпитопа mAb количество жизнеспособных экспрессирующих CAR иммунных клеток снижается. В некоторых вариантах осуществления количество жизнеспособных экспрессирующих CAR иммунных клеток снижается на по меньшей мере 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90%. В некоторых вариантах осуществления указанный специфический в отношении mAb эпитоп представляет собой эпитоп CD20 или мимотоп, и/или специфическое в отношении эпитопа mAb представляет собой ритуксимаб.

[00253] В некоторых определенных вариантах осуществления in vivo истощение CAR-сконструированных иммунных клеток осуществляют путем инфузии биспецифических антител. По определению биспецифическое моноклональное антитело (BsAb) представляет собой искусственный белок, который состоит из фрагментов двух разных моноклональных антител и, следовательно, связывается с антигенами двух разных типов. Эти BsAb и их применение в иммунотерапии были рассмотрены в Muller D and Kontermann R.E. (2010) Bispecific Antibodies for Cancer Immunotherapy, BioDrugs 24 (2): 89-98.

[00254] Согласно другому конкретному варианту осуществления инфузированное биспецифическое mAb способно связывать как специфический в отношении mAb эпитоп, переносимый на сконструированных иммунных клетках, экспрессирующих химерный scFv, так и поверхностный антиген на эффекторной и цитотоксической клетке (например, на иммунных клетках, таких как лимфоциты, макрофаги, дендритные клетки, натуральные киллерные клетки (NK-клетки), цитотоксические Т-лимфоциты (CTL)). Таким образом, истощение сконструированных иммунных клеток, вызванное BsAb, может происходить из-за антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC). (Deo Y М, Sundarapandiyan К, Keler Т, Wallace PK, and Graziano RF, (2000), Journal of Immunology, 165 (10):5954-5961]).

[00255] В некоторых вариантах осуществления цитотоксическое лекарственное средство связывается со специфическими в отношении эпитопа mAb, которые могут быть использованы для истощения экспрессирующих CAR иммунных клеток. При объединении нацеливающих способностей моноклональных антител со способностью цитотоксических лекарственных средств уничтожать раковые клетки конъюгат антитело-лекарственное средство (ADC) позволяет четко различать здоровую и больную ткань по сравнению с применением лекарственного средства отдельно. Одобрения к продаже были получены для нескольких ADC; технология их получения, особенно на линкерах, описана в ((Payne, G. (2003) Cancer Cell 3:207-212; Trail et al (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337; Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drug Del. Rev. 26:151-172; патент США №4975278).

[00256] В некоторых вариантах осуществления специфическое в отношении эпитопа mAb, подлежащее инфузии, предварительно конъюгируют с молекулой, способной стимулировать комплементзависимую цитотоксичность (CDC). Следовательно, система комплемента усиливает или дополняет способность антител выводить патогены из организма. При стимуляции запускается каскад активации как массивное усиление ответа и активация мембраноатакующего комплекса, уничтожающего клетки. Могут быть использованы различные молекулы для конъюгации с mAb, такие как гликаны (Courtois, A, Gac-Breton, S., Berthou, С, Guezennec, J., Bordron, A. and Boisset, C. (2012), Complement dependent cytotoxicity activity of therapeutic antibody fragments can be acquired by immunogenic glycan coupling, Electronic Journal of Biotechnology ISSN: 0717-3458; http://www.ejbiotechnology.info DOI: 10.2225/voll5-issue5).

8. Наборы и изделия

[00257] Настоящее изобретение предусматривает наборы, содержащие любые из культивируемых иммунных клеток или сконструированных иммунных клеток, описанных в данном документе, и их фармацевтические композиции. В некоторых иллюстративных вариантах осуществления набор по настоящему изобретению содержит аллогенные содержащие CAR Т-клетки для введения субъекту.

[00258] Настоящая заявка также предусматривает издели, содержащие любые из терапевтических композиций или наборов, описанных в данном документе. Примеры изделия включают флаконы (например, закупоренные флаконы).

[00259] Кроме того, настоящее изобретение предусматривает наборы, содержащие один или более контейнеров, содержащих раствор калия в необходимой концентрации, и необязательно один или более контейнеров, содержащих раствор, содержащий один или более цитокинов, таких как IL-7 или IL-15.

ПРИМЕРЫ

[00260] Как показано в следующих примерах, комбинации цитокина и метаболических модуляторов, условий и концентраций сред для размножения Т-клеток могут приводить к повышению эффективности препаратов клеточной терапии на основе аллогенных клеток. Например, необходимые фенотипы аллогенных Т-клеток с CAR можно получить с помощью применения стимуляторов клеточной пролиферации, например, IL-7, IL-15 и повышенного количества внеклеточного калия.

1. Иллюстративный протокол для получения Т-клеток с CAR

[00261] Как описано в данном документе, Т-клетки с CAR могут быть получены различными способами, известными из уровня техники. В данном документе описан иллюстративный стандартный способ.

[00262] Для создания Т-клеток с CAR РВМС можно очистить из образцов светлого слоя кровяного сгустка здоровых добровольцев с использованием среды с градиентом плотности Ficoll (Ficoll Paque PLUS/GE Healthcare Life Sciences). Т-клетки можно очистить от РВМС с использованием коммерчески доступного набора для выделения Т-клеток (Miltenyi Biotec, № по каталогу 130-096-535). Альтернативно первичные Т-клетки человека можно непосредственно очистить из Leuko Paks (StemCell Technologies).

[00263] Чтобы получить лентивирус, кодирующий CAR, клетки НЕК-293Т можно высеять из расчета 0,4 миллиона клеток на мл в 2 мл DMEM (Gibco), дополненной 10% FBS (Hyclone или JR Scientific), на лунку 6-луночного планшета в день 0. В день 1 лентивирус может быть получен путем смешивания вместе лентивирусных упаковывающих векторов 1,5 мкг psPAX2, 0,5 мкг pMD2G и 0,5 мкг соответствующего вектора для переноса CAR в 250 мкл Opti-MEM (Gibco) на лунку 6-луночного планшета («смесь ДНК»). 10 мкл Lipofectamine 2000 (Invitrogen) в 250 мкл Opti-MEM можно инкубировать при комнатной температуре в течение 5 минут, а затем добавить к смеси ДНК. Смесь можно инкубировать при комнатной температуре в течение 20 минут и медленно добавлять общий объем 500 мкл по бокам лунок, содержащих НЕК-293Т.

[00264] Очищенные Т-клетки можно активировать в подходящей среде. В день 2 среду из каждой лунки 6-луночного планшета можно заменить 2 мл на лунку среды для трансдукции Т-клеток, т.е. X-Vivo-15, дополненной 10% FBS. В день 3 Т-клетки могут быть повторно суспендированы из расчета 0,5 миллиона клеток на мл в 1 мл среды для трансдукции Т-клеток на лунку планшета Grex-24 (Wilson Wolf, № по каталогу 80192М). Содержащие лентивирус надосадочные жидкости из клеток HEK293T можно собирать и пропускать через 0,45-микронный фильтр (EMD Millipore) для удаления клеточного дебриса, а затем добавлять к Т-клеткам вместе со 100 МЕ/мл IL-2 человека.

[00265] В день 5 можно добавлять 4,5 мл среды для размножения Т-клеток (например, содержащей IL-7 + IL-15 и с дополнительным внеклеточным калием или без него) в каждую лунку планшета Grex-24. В день 9 и день 13 эффективность трансдукции может быть определена путем определения процента Т-клеток, которые распознают необходимый антиген (например, рекомбинантный антиген), посредством проточной цитометрии. Клетки размножали в более крупных колбах или сосудах G-Rex (Wilson Wolf) при необходимости с использованием сред для размножения Т-клеток, описанных в данном документе.

[00266] В день 14 антигенспецифические Т-клетки с CAR могут быть криоконсервированы, например, путем замораживания клеток в такой среде, как CryoStor® CS5, CryoStor® CS10 или CryoStor® CS2 (BioLife Solutions). Процент клеток, окрашенных рекомбинантным антигеном, можно нормализовать по клонам непосредственно перед криоконсервацией.

2. Дополнение IL-7+15

[00267] Данные в следующих примерах демонстрируют, что, например, применение первого стимулятора и второго стимулятора, например, IL-7 (5000 МЕ/мл) и IL-15 (50 МЕ/мл), необязательно с повышенным количеством внеклеточного калия (25 мМ), может обеспечить необходимый фенотип аллогенных Т-клеток с CAR по сравнению с классическими процессами на основе IL-2.

[00268] Сначала авторы настоящего изобретения тестировали добавление IL-7 и IL-15 в среду для культивирования, в которой количество калия сохранялось на исходном уровне 4 мМ. Как показано на фиг. 1А, при сравнении с процессом получения на основе IL-2 («IL-2 IL-2» → 100 МЕ/мл IL-2 везде, свежий IL-2 добавляли в день 5) процесс на основе IL-7 + IL-15 (либо «IL-2 IL-7+15» → 100 МЕ/мл IL-2 до дня 2, в день 5 добавляли 5000 МЕ/мл IL-7 и 50 МЕ/мл IL-15, либо «IL-7+15 IL-7+15» → 5000 МЕ/мл IL-7 и 50 МЕ/мл IL-15 везде с добавлением свежих IL-7 и IL-15 в день 5) обеспечивал увеличение количества TSCM (CD62L+CD45RO") среди специфических в отношении CD19 Т-клеток с CAR в конечном продукте. Как показано на фиг. 1В, условия культивирования IL-7+15 также повышают способность специфических в отношении CD19 Т-клеток с CAR высвобождать цитокины при воздействии на целевые клетки.

3. Исследования при добавлении калия и титровании

[00269] Чтобы еще больше повысить эффективность аллогенных Т-клеток с CAR по настоящему изобретению, авторы настоящего изобретения исследовали сочетание преимуществ добавления IL-7+15 при тех же концентрациях, что и в предыдущих экспериментах, с внеклеточными питательными веществами, которые, как известно, модулируют метаболизм Т-клеток. Было показано, что внеклеточный калий обеспечивает механизм подавления, с помощью которого микроокружение опухоли (ТМЕ) подавляет эффекторные Т-клетки in vivo. С другой стороны, повышенное содержание внеклеточного калия во время in vitro увеличения количества адоптивных клеточных терапевтических средств (ACT) приводит к сохранению Т-клеток с более молодым, менее дифференцированным фенотипом.

[00270] Как показано на фиг. 2А, условия повышенного уровня внеклеточного калия (40 мМ, незакрашенные столбцы) обеспечивают увеличение количества TSCM-клеток аллогенных Т-клеток с CAR для CD19 в способах как с IL-2-, так и с IL-7+15 по сравнению с нормальными (4 мМ) концентрациями калия (закрашенные столбцы). На фиг. 2В, однако, показано, что, как неожиданно было обнаружено, условия повышенного уровня внеклеточного калия (40 мМ, незакрашенные столбцы) отрицательно влияют на способность размножения аллогенных Т-клеток с CAR в способах с применением IL-2- и IL-7+15 по сравнению с нормальными (4 мМ) концентрациями калия (4 мМ, закрашенные столбцы).

[00271] Чтобы еще больше усилить преимущества высокого уровня внеклеточного калия во время получения аллогенных Т-клеток с CAR авторы настоящего изобретения корректировали количество внеклеточного калия, которое особенно эффективно для процесса получения аллогенных Т-клеток с CAR с применением IL-7+15. Концентрации внеклеточного калия 25 мМ и 10 мМ не оказывали отрицательного воздействия на рост Т-клеток человека во время получения аллогенных Т-клеток с CAR (фиг. 3). Кроме того, максимального уровня сохранения TSCM-клеток достигали при 25 мМ внеклеточного калия (фиг. 4).

4. Исследования эффективности с использованием комбинированного дополнения IL-7+15 и калием

[00272] Анализ серийного уничтожения предусматривает повторное воздействие на Т-клетки с CAR их мишени, в результате чего Т-клетки с CAR подвергаются пролиферации и, в некоторых случаях, дифференцировке и истощению. Этот анализ использовали для исследования активности аллогенных Т-клеток с CAR, размножающихся в различных условиях.

[00273] Выявив эффективные концентрации внеклеточного калия для получения аллогенных Т-клеток с CAR авторы настоящего изобретения приступили к оцениванию того, улучшает ли комбинация IL-7+15 при концентрации 25 мМ калия эффективность аллогенных Т-клеток с CAR по настоящему изобретению. Комбинация способа с применением IL-7+15 с дополнением 25 мМ внеклеточного калия приводит к максимальной эффективности Т-клеток с CAR по сравнению с изготовлением аналогичных продуктов в IL-2 с нормальными (4 мМ) концентрациями калия (фиг. 5). Кроме того, комбинация способа с применением IL-7+15 с 25 мМ внеклеточного калия значительно улучшала эффективность по сравнению со способом с применением IL-2 с 25 мМ калия и даже с дополнительно улучшенным способом с применением IL-7+15 с исходным уровнем калия 4 мМ.

[00274] В заключение авторы настоящего изобретения идентифицировали высокоэффективную комбинацию цитокинов (IL-7 + IL-15) и модуляторов метаболизма (внеклеточного калия), которые могут максимизировать эффективность аллогенных Т-клеток с CAR.

[00275] Хотя раскрытые идеи были описаны со ссылкой на различные варианты применения, способы, наборы и композиции, следует понимать, что различные изменения и модификации могут быть сделаны без отклонения от идей данного документа и формулы изобретения, представленной ниже. Вышеприведенные примеры предусмотрены для лучшего иллюстрирования раскрытых идей и не предназначены для ограничения объема идей, представленных в данном документе. Хотя настоящие идеи были описаны в определениях этих иллюстративных вариантов осуществления, специалист в данной области техники легко поймет, что многочисленные вариации и модификации этих иллюстративных вариантов осуществления возможны без чрезмерных экспериментов. Все такие вариации и модификации находятся в рамках действующих идей.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Представлены: среда для выращивания клеток для размножения Т-клеток, содержащая: первый стимулятор и второй стимулятор клеточной пролиферации, каждый из которых независимо выбран из группы, состоящей из IL-7 и IL-15, и внеклеточный модулятор клеточного метаболизма, который представляет собой внеклеточный калий, в концентрации, составляющей не менее чем приблизительно 10 мМ, где первый стимулятор и второй стимулятор присутствуют при отношении концентраций от приблизительно 250:1 до приблизительно 10:1 МЕ/мл, и способы получения популяции Т-клеток in vitro. Также раскрыта среда для выращивания клеток для размножения Т-клеток, содержащая: первый стимулятор и второй стимулятор клеточной пролиферации, каждый из которых независимо выбран из группы, состоящей из IL-7 и IL-15; и необязательно внеклеточный модулятор клеточного метаболизма, который представляет собой внеклеточный калий, в концентрации, составляющей не менее чем приблизительно 10 мМ, где первый стимулятор и второй стимулятор присутствуют при отношении концентраций от приблизительно 250:1 до приблизительно 10:1, и причем концентрация в МЕ/мл. Изобретение может быть использовано для получения популяции Т-клеток. 4 н. и 27 з.п. ф-лы, 5 ил., 2 табл., 4 пр.

1. Среда для выращивания клеток для размножения Т-клеток, содержащая: первый стимулятор и второй стимулятор клеточной пролиферации, каждый из которых независимо выбран из группы, состоящей из IL-7 и IL-15, и внеклеточный модулятор клеточного метаболизма, который представляет собой внеклеточный калий, в концентрации, составляющей не менее чем приблизительно 10 мМ, где первый стимулятор и второй стимулятор присутствуют при отношении концентраций от приблизительно 250:1 до приблизительно 10:1 МЕ/мл.

2. Среда для выращивания клеток по п. 1, где первый стимулятор клеточной пролиферации представляет собой IL-7.

3. Среда для выращивания клеток по п. 1 или 2, где второй стимулятор клеточной пролиферации представляет собой IL-15.

4. Среда для выращивания клеток по любому из пп. 1-3, где первый стимулятор и второй стимулятор присутствуют при отношении концентраций от приблизительно 250:1 до приблизительно 10:1, от приблизительно 200:1 до приблизительно 10:1, от приблизительно 150:1 до приблизительно 10:1, от приблизительно 100:1 до приблизительно 10:1, от приблизительно 500:1 до приблизительно 50:1, от приблизительно 250:1 до приблизительно 50:1, от приблизительно 200:1 до приблизительно 50:1, от приблизительно 150:1 до приблизительно 50:1, от приблизительно 100:1 до приблизительно 50:1, от приблизительно 500:1 до приблизительно 75:1, от приблизительно 250:1 до приблизительно 75:1, от приблизительно 200:1 до приблизительно 75:1, от приблизительно 150:1 до приблизительно 75:1, от приблизительно 100:1 до приблизительно 75:1, от приблизительно 10:1 до приблизительно 4:1, от приблизительно 8:1 до приблизительно 4:1 или от приблизительно 7:1 до приблизительно 6:1, и причем концентрация в МЕ/мл.

5. Среда для выращивания клеток по любому из пп. 1-3, где первый стимулятор и второй стимулятор присутствуют при отношении концентраций приблизительно 150:1, приблизительно 140:1, приблизительно 130:1, приблизительно 120:1, приблизительно 110:1, приблизительно 100:1, приблизительно 90:1, приблизительно 80:1 или приблизительно 70:1, и причем концентрация в МЕ/мл.

6. Среда для выращивания клеток по любому из пп. 1-5, где первый стимулятор представляет собой IL-7, присутствующий в концентрации от приблизительно 100 МЕ/мл до приблизительно 5000 МЕ/мл; и второй стимулятор представляет собой IL-15, присутствующий в концентрации от приблизительно 1 МЕ/мл до приблизительно 100 МЕ/мл.

7. Среда для выращивания клеток по п. 6, где IL-7 присутствует в концентрации от приблизительно 300 МЕ/мл до приблизительно 5000 МЕ/мл, и IL-15 присутствует в концентрации, которая составляет от приблизительно 25 МЕ/мл до приблизительно 50 МЕ/мл.

8. Среда для выращивания клеток по п. 7, где IL-7 присутствует в концентрации приблизительно 5000 МЕ/мл, и IL-15 присутствует в концентрации, которая составляет приблизительно 50 МЕ/мл.

9. Среда для выращивания клеток по любому из пп. 1-8, где внеклеточный калий присутствует в концентрации от приблизительно 10 мМ до приблизительно 25 мМ, от приблизительно 20 мМ до приблизительно 35 мМ или от приблизительно 20 мМ до приблизительно 30 мМ.

10. Среда для выращивания клеток по п. 9, где внеклеточный калий присутствует в концентрации приблизительно 20 мМ или приблизительно 25 мМ.

11. Среда для выращивания клеток по любому из пп. 1-10, где внеклеточный калий присутствует в виде KCl.

12. Способ получения популяции Т-клеток in vitro, включающий культивирование исходной популяции Т-клеток со средой для выращивания клеток, содержащей первый стимулятор и второй стимулятор клеточной пролиферации, каждый из которых независимо выбран из группы, состоящей из IL-7 и IL-15, и внеклеточный модулятор клеточного метаболизма, который представляет собой внеклеточный калий, в концентрации, составляющей не менее чем 10 мМ, где первый стимулятор и второй стимулятор присутствуют при отношении концентраций от приблизительно 250:1 до приблизительно 10:1, и причем концентрация в МЕ/мл.

13. Способ по п. 12, где среда для выращивания клеток представляет собой среду для выращивания клеток по любому из пп. 1-11.

14. Способ по п. 12 или 13, где полученную популяцию Т-клеток обогащают T_CM- и/или T_SCM-клетками.

15. Способ по любому из пп. 12-14, где полученная популяция Т-клеток содержит по меньшей мере приблизительно 30%, 35%, 40% или 45% T_SCM-клеток.

16. Способ по п. 15, где полученная популяция Т-клеток содержит по меньшей мере приблизительно 40% T_SCM-клеток.

17. Способ по любому из пп. 12-16, где полученная популяция Т-клеток обогащена в от приблизительно 100 раз до приблизительно 1000 раз большим количеством T_CM- и/или T_SCM-клеток, чем количество T_CM- и/или T_SCM-клеток в исходной популяции Т-клеток, как измерено за период приблизительно 7-16 дней.

18. Способ по п. 17, где полученная популяция Т-клеток обогащена в от приблизительно 100 раз до приблизительно 1000 раз большим количеством T_CM- и/или T_SCM-клеток, чем количество T_CM- и/или T_SCM-клеток в исходной популяции Т-клеток, как измерено за период приблизительно 10-14 дней.

19. Способ по п. 18, где полученная популяция Т-клеток обогащена в по меньшей мере приблизительно 100 раз или приблизительно 200 раз большим количеством T_CM- и/или T_SCM-клеток, чем количество T_CM- и/или T_SCM-клеток в исходной популяции Т-клеток.

20. Способ по любому из пп. 12-19, где исходная популяция Т-клеток представляет собой популяцию сконструированных Т-клеток.

21. Способ по п. 20, где исходная популяция Т-клеток представляет собой популяцию T-клеток, экспрессирующих один или более химерных антигенных рецепторов (T-клетки с CAR).

22. Способ по любому из пп. 12-21, где Т-клетки являются аллогенными Т-клетками.

23. Способ по любому из пп. 12-21, где Т-клетки являются аутологичными Т-клетками.

24. Способ по п. 21, где Т-клетки с CAR содержат по меньшей мере приблизительно 30%, 35%, 40% или 45% T_SCM-клеток.

25. Способ по п. 24, где Т-клетки с CAR содержат по меньшей мере приблизительно 40% T_SCM-клеток.

26. Среда для выращивания клеток для размножения Т-клеток, содержащая: первый стимулятор и второй стимулятор клеточной пролиферации, каждый из которых независимо выбран из группы, состоящей из IL-7 и IL-15; и необязательно внеклеточный модулятор клеточного метаболизма, который представляет собой внеклеточный калий, в концентрации, составляющей не менее чем приблизительно 10 мМ, где первый стимулятор и второй стимулятор присутствуют при отношении концентраций от приблизительно 250:1 до приблизительно 10:1, и причем концентрация в МЕ/мл.

27. Среда для выращивания клеток по п. 26, в которой первый стимулятор представляет собой IL-7, присутствующий в концентрации от приблизительно 100 МЕ/мл до приблизительно 5000 МЕ/мл; и второй стимулятор представляет собой IL-15, присутствующий в концентрации от приблизительно 1 МЕ/мл до приблизительно 100 МЕ/мл.

28. Среда для выращивания клеток по любому из пп. 1-11 или 26, 27, причем Т-клетка представляет собой CD4+ или CD8+ T-клетку.

29. Способ получения популяции Т клеток in vitro, включающий культивирование исходной популяции Т клеток со средой для выращивания клеток, содержащей: первый стимулятор и второй стимулятор клеточной пролиферации, каждый из которых независимо выбран из группы, состоящей из IL-7 и IL-15; и необязательно внеклеточный модулятор клеточного метаболизма, который представляет собой внеклеточный калий, в концентрации, составляющей не менее чем 10 мМ, где первый стимулятор и второй стимулятор присутствуют при отношении концентраций от приблизительно 250:1 до 10:1, и причем концентрация в МЕ/мл.

30. Способ по п. 28, в котором первый стимулятор представляет собой IL-7, присутствующий в концентрации от приблизительно 100 МЕ/мл до приблизительно 5000 МЕ/мл; и второй стимулятор представляет собой IL-15, присутствующий в концентрации от приблизительно 1 МЕ/мл до приблизительно 100 МЕ/мл.

31. Способ по любому из пп. 12-25 или 29-30, причем популяция Т-клеток представляет собой CD4+ или CD8+ T-клетки.