Способ получения жирорастворимого витамина D из объектов рыбной промышленности Российский патент 2023 года по МПК A61K35/60 A61K31/59 C11B7/00 

Изобретение относится к фармацевтической и рыбной промышленности и касается использования малоотходных технологий и получения субстанции, содержащей жирорастворимый витамин D.

Известны способы получения рыбного жира, витаминизированного концентрата этиловых эфиров полиненасыщенных высших жирных кислот из рыбного жира (патент РФ 2614587), получения кислот рыбного жира (заявка на изобретение 95106191), обогащенного рыбного жира (патент РФ 2039793), способ выделения и концентрирования жирорастворимых витаминов и провитаминов, касающийся в том числе и рыбьего жира и жира печени трески (заявка на изобретение 2004108053) и др.

Во всех упомянутых изобретениях делается акцент на получение жира, обогащенного полиненасыщенными жирными кислотами или суммы жирорастворимых витаминов, в том числе не только из продуктов и отходов рыбной промышленности.

Шнайдман Л.О. («Производство витаминов», 1973 г. с.308) описывает технологическую схему получения витамина D. Метод получения данного витамина основан на химическом синтезе. Принципиальная схема включает в себя следующие стадии синтеза: бензоата холестерина, 7-бромхолестеринбензоата, 7-дегидрохолестеринбензоата, холекальциферола. Данный метод включает промежуточную стадию омыления с последующим двухступенчатым процессом облучения УФ-светом.

Данный спсоб получения витамина осуществляется синтезом с применением сложных технологических и энергоемких процессов. В результате химических реакций возможно образование большого количества примесей и снижение биологической активности витамина D.

Известен способ «холодного омыления» («Хроматография в тонких слоях» под редакцией Э. Шталя, 1965.-с.147), для осуществления которого растворяют 1 весовую часть калия гидроксида в 1 весовой части воды дистиллированной, и после охлаждения разбавляют этот концентрированный раствор 3-4 частями метанола. Омыляемую пробу обрабатывают раствором калия гидроксида и оставляют на 12 часов при комнатной температуре. После окончания омыления большую часть метанола упаривают в вакууме. При температуре ниже 50°С и водный остаток разбавляют двойным объемом воды. Неомыляемые вещества экстрагируют диэтиловым эфиром порциями, равными половине объема раствора. Полнота экстракции контролируется методом ТСХ. Объединенные эфирные вытяжки промывают дистиллированной водой, прокипяченной в токе азота, и вновь охлажденной водой до нейтральной реакции. Эфир отгоняют в атмосфере азота.

Преимуществом данного способа является низкие энергозатраты и возможность рекомендовать данный метод для получения совместно с липидной фракцией, содержащей витамин D, производные сопряженно ненасыщенных жирных кислот.

Недостатком данного способа является невозможность применения отходов рыбной промышленности (используется печень рыб), большие временные и трудовые затраты. Также в данном методе применяются ядовитые компоненты (метанол, эфир), требующие особых условий труда, особой организации рабочего места с постоянным мониторингом факторов окружающей среды и пожарной безопасности, и приобретения специального дорогостоящего оборудования, позволяющего исключать выбросы метанола в окружающую среду.

Наиболее близким к заявляемому является способ получения жирорастворимого витамина в масле (Хайдарова З.Б., Поливанов М.А. «Современные методы получения рыбьего жира для пищевых и медицинских целей», III Национальная научно-техническая конференция: «Инновационное развитие рыбной отрасли в контексте обеспечения продовольственной безопасности Российской Федерации, сборник трудов конференции, 2020.-с.209-213). Этот способ включает добавление в гидролизатор воды в количестве 50-60% для жирной печени и 120% для тощей к массе печени. Массу подогревают 30-40 минут до температуры 55°С и добавляют 50% необходимого для гидролиза калия гидроксида с концентрацией до 30%. Далее в течение 30 минут поднимают температуру до 90-95°С. Температура поддерживается на уровне 90°С. Конец процесса определяют по полному растворению твердой белковой части печени. После этого нагревание и перемешивание прекращают и дают массе отстояться в течение 1-2 часов. Сливают нижний слой, а жировую массу отправляют на рафинирование 10% солевым раствором и горячей водой. После чего происходит отстаивание и центрифугирование - удаление влаги. Сушка жира обеспечивается вакуумом при температуре 135 - 140°С, фильтрацию жира после вакуумной сушки осуществляют через тканевый фильтр в вакууме.

Преимущество данного способа состоит в его возможности применения в промышленности.

Недостатком данного способа является невозможность применения отходов рыбной промышленности (используется только печень рыб), большие временные, трудовые и энергетические затраты. В технологии производства присутствуют дополнительные две стадии, которые отсутствуют в других известных технологических схемах.

Целью изобретения является получение субстанции из объектов рыбной промышленности, содержащей жирорастворимый витамин D, с применением малоотходных технологий.

Техническое решение поставленной задачи достигается тем, что в способе, включающем измельчение сырья, применяют деструкцию белковой части с применением непрерывного ступенчатого нагрева в установке с микроволновым излучением, (печь лабораторная микроволновая для пробоподготовки: технические данные: напряжение питающей сети - 220±10%, 50 Гц; мощность, потребляемая от сети - 1900 Вт; диапазон регулирования скорости набора давления 10-500 кПА/мин; максимальный уровень давления - 1 300 кПА/мин). Кроме этого, добавляют этиловый спирт 96%, антиоксидант - кислоту аскорбиновую, калия гидроксид, что ускоряется гидролиз белка, и жировая фаза отделяется от гидролизата, содержащего полипептиды, аминокислоты, минеральные вещества, эфиры жирных кислот (мыла).

Режимы щелочного гидролиза определяются следующими условиями:

- температурным режимом;

- количеством добавляемого спирта;

- количеством добавляемой воды;

- количеством добавляемой щелочи;

- воздействием на гидролизуемую массу микроволн;

- воздействием на гидролизуемую массу избыточного давления.

Количественный выход витамина D напрямую зависит от подготовки перерабатываемого сырья и соблюдения представленных показателей, характеризующих гидролиз. При избытке щелочи происходит адсорбция витамина D образовавшимся мылом и увеличиваются потери при рафинации жировой фракции гидролизата. Недостаток же щелочи не обеспечивает полного процесса гидролиза.

Способ осуществляется следующим образом.

Сырьем получения субстанции жирорастворимого витамина D является: культивируемые виды рыб (кета, горбуша, кижуч, форель, камбала, скумбрия), а также неперерабатываемые отходы рыбного производства. Данный метод рассчитан на полное истощение сырья и неперерабатываемых отходов. Расчет всех компонентов производится исходя из массы загруженного сырья в реактор.

Охлажденное сырье измельчают в среде инертного газа (азота или углекислого газа). Инертную среда обеспечивают в процессе измельчения непрерывной подачей в емкость азота или углекислого газа. Гомогенизацию осуществляют способом пакетирования в стерильные пакеты с продувкой в течение 20-30 сек. исследуемого материала газом и последующей герметизацией. Измельчение проводят с помощью высокопроизводительного диспергатора IKA с электронной регулировкой скорости и постоянным контролем температуры обрабатываемого объекта исследования. Частота вращения диспергирующего элемента поддерживается в интервале 8000 - 8200 об/мин в течение 10 мин. при температуре 20-24°С. Далее полученную массу помещают в лабораторный лопаточный гомогенизатор МикроБио БА-400 и подвергают процессу гомогенизации в течение 30 мин.

Из гомогенизированного измельченного фарша рыбы отбирают навеску массой 10,0 г во фторопластовый стакан-лайнер микроволновой системы пробоподготовки классического камерного типа, снабженную датчиками для контроля давления и температуры. К навеске добавляют 3,4 мл раствора калия гидроксида 12,5%, 3,4 г кислоты аскорбиновой и 134 мл спирта этилового 96%. Деструкция белка проводится ступенчато непрерывно в течение 30 минут. Установленный режим проведения минерализации характеризует плавное повышение температуры и давления. Минерализацию начинают при малой мощности микроволнового излучения 400 Вт, постепенно увеличивая ее до максимального значения 1000 Вт, в три стадии. Диапазон температур составляет 20-90°С с шагом 30°С. Повышение температуры производят каждые 10 минут. Давление в системе составляет не менее 3 атмосфер постоянно с первой минуты нагрева. На протяжении всего цикла разложения белка кислород воздуха замещают инертным газом. Нагнетание инертного газа в стакан-лайнер осуществляется непрерывно через колонку распределитель.

После завершения нагрева, по истечении 30 минут, останавливают подачу микроволнового излучения и сбрасывают давление внутри стакана-лайнера. Охлаждают в закрытом состоянии, не вынимая из установки для минерализации, до комнатной температуры. Среднее время охлаждения пробы составляет 30-40 минут.

После охлаждения реакционные сосуды извлекают из удерживающего устройства и помещают на аппарат для встряхивания на 15 минут. Процесс перемешивания на орбитальном шейкере позволяет равномерно распределить в гидролизуемой массе объект и активные компоненты и более эффективно завершить стадию деструкции белка.

Гидролизированный раствор разбавляют 67 мл спирта этилового 96% и деионизированной водой в количестве 300 мл. Полученный раствор переносят в делительную воронку.

Жирорастворимые витамины экстрагируют петролейным эфиром или н-гексаном в течение 2 мин. После процедуры экстрагирования смесь в делительной воронке оставляют в покое на 30 мин до появления четкой границы фаз. Далее фазы разделяют в разные емкости, органическая фаза содержит конечный продукт - витамин D, а гидролизат подвергают повторному экстрагированию.

Экстракцию повторяют трижды порциями экстрагента по 100 мл. Объединенное извлечение отмывают от щелочи порциями ионизированной воды по 150 мл до полного исчезновения щелочной реакции промывных вод.

Для удаления остаточных количеств воды полученное извлечение в органическом растворителе фильтруют через фильтр с 5,0 г безводного натрия сульфата. Далее растворитель удаляют с помощью роторного испарителя при температуре не выше 50°С.

Полученный экстракт растворяют в изопропиловом спирте и переносят в сосуд-накопитель из темного стекла. Сосуд-накопитель продувают порцией инертного газа (азота или углекислого газа) и передают на хранение.

Полученный продукт - субстанцию жирорастворимого витамина D - подвергают контрольному анализу на содержание витамина D методом ВЭЖХ с применением спектрофотометрического детектора, при длине волны 265 нм.

При финальном эксперименте по определению витамина D были исследованы две опытные серии. Каждая серия испытаний включала в себя 10 исследуемых образцов. Аналитический контроль проводился методом параллельного анализа (всего 40 измерений) в соответствии с требованиями РМГ 61-2010 «Государственная система обеспечения единства измерений. Показатели точности, правильности, прецизионности методик количественного химического анализа. Методы оценки». Результаты представлены в таблице 1.

Использование в данном методе раствора калия гидроксида в концентрации 12,5% является оптимальным. Визуальное отсутствие стойкой омыленной фракции говорит об оптимальном соотношении количества калия гидроксида и исходного сырья. Невозможность технологически разделить омыленную фракцию от жировой позволило предположить об отсутствии ее влияния на технологический процесс. Выход получаемого продукта в совокупности с количеством применяемых компонентов и проведением гидролиза под воздействием микроволн максимальный.

Пример 1

Охлажденное сырье измельчают в среде инертного газа. Инертную среду обеспечивают в процессе диспергирования непрерывной подачей в реакционную емкость азота или углекислого газа. Гомогенизацию осуществляют способом пакетирования в стерильные пакеты с продувкой в течение 20-30 сек. исследуемого материала газом и последующей герметизацией. Измельчение проводят с помощью высокопроизводительного диспергатора IKA с электронной регулировкой скорости и постоянным контролем температуры обрабатываемого объекта исследования. Частоту вращения диспергирующего элемента поддерживают в интервале 8000 - 8200 об/мин в течение 10 мин. при температуре 20-24°С. Далее полученную массу помещают в лабораторный лопаточный гомогенизатор МикроБио БА-400 и подвергают процессу гомогенизации в течение 30 мин.

Из гомогенизированного измельченного фарша рыбы отбирают навеску массой 3,0 г во фторопластовый стакан-лайнер микроволновой системы. К навеске добавляют 1 мл раствора КОН в концентрации 60,0%, 1,0 г кислоты аскорбиновой и 40 мл спирта этилового 96%. Деструкцию белка проводят ступенчато и непрерывно в течение 30 минут. Установленный режим проведения минерализации характеризуется плавным повышением температуры и давления. Минерализацию начинают при малой мощности микроволнового излучения, постепенно увеличивая ее до максимального значения в три стадии. Диапазон температур составляет 20-90°С с шагом 30°С. Повышение температуры производят каждые 10 минут. Давление в системе составляет не менее 3 атмосфер постоянно с первой минуты нагрева. На протяжении всего цикла разложения белка кислород воздуха замещают инертным газом. Нагнетание инертного газа в стакан-лайнер осуществляют непрерывно через колонку распределитель.

После завершения нагрева, по истечении 30 минут, сбрасывают давление внутри стакана-лайнера. Охлаждают в закрытом состоянии, не вынимая из установки для минерализации, до температуры близкой к комнатной. Среднее время охлаждения пробы составляет 30-40 минут.

После охлаждения реакционные сосуды извлекают из удерживающего устройства и помещают на аппарат для встряхивания на 15 минут. Процесс перемешивания на орбитальном шейкере позволяет равномерно распределить в гидролизуемой массе объект и активные компоненты и более эффективно завершить стадию деструкции белка.

Гидролизированный раствор разбавляют деионизированной водой в количестве 80 мл и переносят в делительную воронку.

Жирорастворимые витамины экстрагируют петролейным эфиром или н-гексаном в течение 2 мин. После процедуры экстрагирования смесь в делительной воронке оставляют в покое на 30 мин. до появления четкой границы фаз. Далее фазы разделяют в разные емкости, органическая фаза содержит конечный продукт - витамин D, а гидролизат идет на повторное экстрагирование.

Экстракцию повторяют три раза порциями экстрагента по 100 мл. Объединенное извлечение отмывают от щелочи три-четыре раза порциями ионизированной воды по 150 мл до полного исчезновения щелочной реакции промывных вод.

Для удаления остаточных количеств воды полученное извлечение в органическом растворителе фильтруют через фильтр с 5,0 г безводного натрия сульфата. Далее растворитель удаляют с помощью роторного испарителя при температуре не выше 50°С.

Полученный экстракт растворяют в изопропиловом спирте и переносят в сосуд-накопитель из темного стекла. Сосуд-накопитель продувают порцией инертного газа (азот) и передают на хранение.

Таким образом, выход витамина D при использовании в данном способе раствора калия гидроксида в концентрации 60,0% является допустимым. Однако наличие омыленной фракции говорит о присутствии избыточного количества калия гидроксида. Большое количество омыленной фракции приводит к сорбции витамина и повышает его потери, что несомненно является технологическим недостатком данного способа.

При финальном эксперименте по определению витамина D были исследованы две опытные серии. Каждая серия испытаний включала в себя 10 исследуемых образцов. Аналитический контроль проводился методом параллельного анализа (всего 80 измерений с учетом анализа омыленной фракции) в соответствии с требованиями РМГ 61-2010 «Государственная система обеспечения единства измерений. Показатели точности, правильности, прецизионности методик количественного химического анализа. Методы оценки.». Результаты представлены в таблице 2.

Пример 2.

Способ аналогичен примеру 1, за исключением того, что на этапе гидролиза используется раствор калия гидроксида с концентрацией 50,0%.

Выход витамина D при снижении концентрации раствора калия гидроксида до 50,0% остается на том же уровне. Однако у метода имеются недостатки в виде использования высокой концентрации щелочного раствора, что приводит к повышенному омылению жировой фракции и к сорбции витамина, повышаются его потери.

Аналогично примеру 1 выход витамина D при использовании в данном способе раствора калия гидроксида в концентрации 50,0% является допустимым. Однако снижение концентрации щелочи на 10% не привело к значительному снижению омыленной фракции, что позволило также говорить о присутствии избыточного количества гидроксида калия. Образовавшееся количество омыленной фракции при использовании 50% раствора калия гидроксида не поменяло количественное содержание витамина D в жировой фракции. Это позволило предположить, что содержание основного реактива находится за пределами его необходимого технологического количества.

Результаты эксперимента представлены в таблице 3.

Пример 3

Способ аналогичен примеру 1, за исключением того, что на этапе гидролиза используется раствор калия гидроксида в концентрации 25,0%.

Аналогично примерам 1 и 2 выход витамина D является допустимым. Существенное снижение концентрации щелочи привело к незначительному снижению омыленной фракции. Образовавшееся количество омыленной фракции при использовании 25% раствора калия гидроксида не привело к устранению эффекта сорбции витамина D.

Результаты эксперимента представлены в таблице 4.

Таким образом, предлагается способ получения жирорастворимого витамина D из объектов рыбной промышленности, который может стать основой малоотходной и экономически выгодной технологии.

Таблица 1 - Результаты измерений содержания витамина D при гидролизе 12,5% раствором гидроксида калия № серии Концентрация КОН, % Наличие витамина D в жировой фракции* Наличие витамина D в омыленной фракции* Количество витамина D в жировой фракции, мг%** 1 12,5 + - 0,4965±0,0206 2 12,5 + - 0,4912±0,0203

* «+» - наличие, «-» - отсутствие;

** Средний результат одной серии, состоящий из 10 образцов.

Таблица 2. Результаты измерений содержания витамина D при гидролизе 60,0% раствором гидроксида калия № серии испытания Концентрация КОН, % Наличие витамина D в жировой фракции* Наличие витамина D в омыленной фракции* Количество витамина D в жировой фракции, мг%** 1 60,0 + + 0,4965±0,0205 2 60,0 + + 0,5019±0,0208

* «+» - наличие, «-» - отсутствие;

** Средний результат одной серии, состоящий из 10 образцов.

Таблица 3 - Результаты измерений содержания витамина D при гидролизе 50,0% раствором гидроксида калия № серии Концентрация КОН, % Наличие витамина D в жировой фракции* Наличие витамина D в омыленной фракции* Количество витамина D в жировой фракции, мг%** 1 50,0 + + 0,4953±0,0203 2 50,0 + + 0,5037±0,0206

* «+» - наличие, «-» - отсутствие;

** Средний результат одной серии состоящий из 10 образцов.

Таблица 4 - Результаты измерений содержания витамина D при гидролизе 25,0% раствором гидроксида калия № серии Концентрация КОН, % Наличие витамина D в жировой фракции* Наличие витамина D в омыленной фракции* Количество витамина D в жировой фракции, мг%** 1 25,0 + + 0,4955±0,0207 2 25,0 + + 0,5016±0,0209

* «+» - наличие, «-» - отсутствие;

** Средний результат одной серии состоящий из 10 образцов.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к способу получения субстанции жирорастворимого витамина D. Заявленный способ заключается в гидролизе сырья в присутствии калия гидроксида и спирта этилового при нагревании, где сырьем служат культивируемые виды рыб: кета, горбуша, кижуч, форель, камбала, скумбрия, а также неперерабатываемые отходы рыбного производства, которое измельчают диспергирующим элементом с частотой вращения в интервале 8000-8200 об/мин в течение 10 мин при температуре 20-24°С с подачей инертного газа азота или углекислого газа, гомогенизируют измельченное сырье в течение 30 мин проводимой в герметичных пакетах с продувкой их в течение 20-30 сек азотом или углекислым газом в гомогенизаторе лопаточного типа, а также в проведении деструкции белковой части сырья в среде инертного газа и непрерывного ступенчатого нагрева в установке с микроволновым излучением, которое начинают подавать с 400 Вт, постепенно увеличивая до 1000 Вт; добавлением на 10 г сырья раствора калия гидроксида 12,5% в количестве 3,4 мл, кислоты аскорбиновой – 3,4 г и спирта этилового 96% - 134 мл, которую проводят в течение 30 мин с постоянным давлением в системе не менее 3 атм, а повышение температуры производят каждые 10 мин с шагом в 30°С при диапазоне температур от 20 до 90°С; через 30 мин давление сбрасывают путем охлаждения в закрытом состоянии до комнатной температуры, после чего реакционные сосуды помещают на аппарат для встряхивания на 15 мин и после этого гидролизованную смесь разбавляют деионизированной водой в количестве 300 мл и спиртом этиловым в количестве 67 мл, и экстрагируют жирорастворимые витамины петролейным эфиром или н-гексаном в течение 2 мин, после разделения смеси органическая фаза содержит конечный продукт, экстракцию повторяют три раза порциями экстрагента по 100 мл, извлечения объединяют, отмывают от щелочи, а для удаления воды полученное извлечение фильтруют через безводный натрия сульфат; растворитель удаляют в роторном испарителе при температуре не выше 50°С. Вышеописанный способ обеспечивает получение субстанции из объектов рыбной промышленности, содержащей жирорастворимый витамин D, с применением малоотходных технологий. 4 табл., 3 пр.

Способ получения субстанции жирорастворимого витамина D, заключающийся в гидролизе сырья в присутствии калия гидроксида и спирта этилового при нагревании, отличающийся тем, что сырьем служат культивируемые виды рыб: кета, горбуша, кижуч, форель, камбала, скумбрия, а также неперерабатываемые отходы рыбного производства, которые измельчают диспергирующим элементом с частотой вращения в интервале 8000-8200 об/мин в течение 10 мин при температуре 20-24°С с подачей инертного газа азота или углекислого газа, гомогенизируют измельченное сырье в течение 30 мин проводимой в герметичных пакетах с продувкой их в течение 20-30 сек азотом или углекислым газом в гомогенизаторе лопаточного типа, а также в проведении деструкции белковой части сырья в среде инертного газа и непрерывного ступенчатого нагрева в установке с микроволновым излучением, которое начинают подавать с 400 Вт, постепенно увеличивая до 1000 Вт; добавлением на 10 г сырья раствора калия гидроксида 12,5% в количестве 3,4 мл, кислоты аскорбиновой – 3,4 г и спирта этилового 96% - 134 мл, которую проводят в течение 30 мин с постоянным давлением в системе не менее 3 атм, а повышение температуры производят каждые 10 мин с шагом в 30°С при диапазоне температур от 20 до 90°С; через 30 мин давление сбрасывают путем охлаждения в закрытом состоянии до комнатной температуры, после чего реакционные сосуды помещают на аппарат для встряхивания на 15 мин и после этого гидролизованную смесь разбавляют деионизированной водой в количестве 300 мл и спиртом этиловым в количестве 67 мл, и экстрагируют жирорастворимые витамины петролейным эфиром или н-гексаном в течение 2 мин, после разделения смеси органическая фаза содержит конечный продукт, экстракцию повторяют три раза порциями экстрагента по 100 мл, извлечения объединяют, отмывают от щелочи, а для удаления воды полученное извлечение фильтруют через безводный натрия сульфат; растворитель удаляют в роторном испарителе при температуре не выше 50°С.