Штамм Amycolatopsis umgeniensis - продуцент антибиотика эремомицина Российский патент 2019 года по МПК C12N1/20 C12P1/06 

Штамм Amycolatopsis umgeniensis - продуцент антибиотика эремомицина

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к медицине и биотехнологической промышленности и касается нового штамма актиномицета, образующего противобактериальный антибиотик эремомицин.

Антибиотик эремомицин по химическому строению относится к полициклическим антибиотикам группы ванкомицина-ристомицина (далбагептидам), являющимся жизнеспасающими средствами при лечении особо тяжелых инфекций.

Структура антибиотика эремомицина сульфат

Эремомицин эффективен при лечении заболеваний, вызываемых грамположительными бактериями, включая метициллинрезистентные штаммы золотистого стафилококка (MRSA) и анаэробного возбудителя псевдомембранного колита Clostridium difficile. Эремомицин служит также исходной субстанцией в получени полусинтетических производных природной структуры для улучшения химиотерапевтических показателей (1), в том числе ослабления аллергизирующего действия, характерного для гликопептидных антибиотиков.

Предшествующий уровень техники

Известен штамм Amycolatopsis orientalis subsp. eremomycini ВКПМ Ac 807 - продуцент антибиотика эремомицина [2], принятый в качестве прототипа. Недостатком данного штамма является невысокая антибиотическая активность - 2300 мкг в 1 мл ферментационной жидкости.

Раскрытие изобретения

Сущность изобретения состоит в том, что получен новый штамм-продуцент эремомицина путем селекционного преобразования свойств почвенной культуры Amycolatopsis umgeniensis в результате последовательного многоступенчатого воздействия N-метилнитрозомочевины и гамма-лучей ⁶⁰Со на споры исходной культуры и отбора оригинального мутантного штамма №1472 с повышенной антибиотической активностью среди мутагенизированной популяции колоний актиномицета, выросших на селективном фоне устойчивости к гликопептидным антибиотикам ванкомицину и блеомицину.

Полученный новый штамм Amycolatopsis umgeniensis №1472 депонирован в коллекции культур ГосНИИ «Генетика» под номером штамм ВКПМ Ас-1978.

Штамм Amycolatopsis umgeniensis ВКПМ Ас-1978 обладает повышенной антибиотической активностью образования эремомицина (3300 мкг в 1 мл ферментационной жидкости) и характеризуется следующими таксономическими, культурально-морфологическими и физиолого-химическими признаками.

Таксономические, культурально-морфологические и физиологические признаки штамма Amycolatopsis umgeniensis ВКПМ Ас-1978

Таксономические признаки. Длительность выращивания для изучения таксономических признаков (7-21) суток при температуре 28°С. Для засева диагностических сред используется споровый посевной материал десятидневной культуры штамма, выращенной на глюкозо-аспарагиновом агаре или на среде Линденбайна. Цвет определен по таблице Бондарцева и Праузера. Данные приведены в таблице №1.

Морфологические признаки. Гифы воздушного мицелия слегка извилистые, распадающиеся на фрагменты различной длины; поверхность спор гладкая.

Физиолого-биохимические свойства. Аэроб. Растет при (24-37)°С, оптимум роста 28°С и в диапазоне значений рН (5,0-10,0) с оптимумом роста при рН 7,0; желатину разжижает, молоко пептонизирует. Сахарозу инвертирует. Крахмал гидролизует. На клетчатке не растет. Восстанавливает нитраты до нитритов. Меланоидные пигменты не образует при росте на провокационной среде Треснера с лимонно-кислым железом.

Использование источников углерода. Хорошо утилизирует глюкозу, фруктозу, лактозу, рамнозу, ксилозу, рибозу, арабинозу, маннит, мальтозу; не утилизирует сахарозу, рафинозу, сорбит, маннозу, целлюлозу.

Антагонистические свойства. Штамм Amycolatopsis umgeniensis ВКПМ Ас-1978 при росте на агаровых средах умеренно угнетает рост грамположительных бактерий Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Bacillus mycoides, Micrococcus luteus и не действует на грамотрицательные бактерии Escherichia coli, Comamonas terrigena, Providencia stuartii.

Хранение штамма Amycolatopsis umgeniensis ВКПМ Ас-1978. Штамм хранится в виде спор на стерильной почве с кварцевым песком или на зернах пшена, а также в виде зрелой культуры на агаровых средах под вазелиновым маслом. Антибиотическая активность штамма Amycolatopsis umgeniensis ВКПМ Ас-1978 при глубинном культивировании определяется луночным методом диффузии в агар (среда №2 Гаузе) с использованием в качестве тест-микроорганизма Bacillus subtilis АТСС 6633 и сравнением зон подавления роста образцами ферментационной жидкости с калибровочной кривой стандарта эремомицина сульфата (100 мкг, 50 мкг, 25 мкг, 12,5 мкг). Биологическая активность получаемой биосинтезом и химически очищенной субстанции антибиотика определяется трехдозным вариантом метода (ГФХ, стр. 949).

Штамм Amycolatopsis umgeniensis ВКПМ Ас-1978 поясняется следующим примером.

Пример 1. Споровым материалом с мицелием культуры Amycolatopsis umgeniensis ВКПМ-Ас-1978, выращенной в течение (10-14) суток при 28°С на среде Линденбайна, засевают питательную среду (150 мл в колбах Эрленмейера объемом 0,75 л), и выращивают при 28°С в течение (24-36) часов на круговой качалке при скорости вращения 220-240 об/мин.

Состав посевной среды, %:

Среда стерилизуется в течение 30 мин. при давлении 0,6 атм. при 120°С.

Выросшим мицелием в количестве (5-10) % засевают питательную среду (100 мл в колбах Эрленмейера объемом 0,75 л) следующего состава, %:

Стерилизация среды в течение 30 мин. при давлении 0,6 атм. при 120°С.

Ферментационное культивирование проводят при 28°С в течение 120 часов на качалке при скорости вращения 220-240 об/мин. Эремомицин накапливается в культуральной жидкости продуцента. Антибиотическую активность определяют методом диффузии в агар с использованием тест-культуры Bacillus subtilis АТСС 6633. Содержание эремомицина в культуральной жидкости штамма Amycolatopsis umgeniensis ВКПМ Ас-1978 к окончанию ферментации составляет 3300 мкг/мл.

Для выделения эремомицина (3) проводят его сорбцию из нативного раствора (отфильтрованной от мицелия культуральной жидкости) на карбоксильном катионите КБ-2 в солевой форме, элюируют раствором аммиака, элюат нейтрализуют, обеззоливают, пропускают через сорбент Амберлит XAD-2, колонку промывают водой, антибиотик элюируют 4%-ным раствором изопропилового спирта в 0,2 М уксусной кислоте, элюат концентрируют в вакууме до содержания эремомицина (120-140) мг/мл и кристаллизуют в форме сульфата.

Эремомицина сульфат, полученный путем биосинтеза новым штаммом-продуцентом Amycolatopsis umgeniensis ВКПМ Ас-1978, представляет собой белый кристаллический порошок, легко растворимый в воде и нерастворимый в органических растворителях. Показатели, характеризующие эремомицина сульфат (физико-химические свойства, антибактериальная активность и токсичность) полностью соответствует показателям, которые определены для эремомицина сульфата, защищенного патентом РФ №2110578 (брутто-формула: C₇₃H₈₉N₁₀ClO₂₆XH₂SO₄. Мол. масса 1656 а.е.м.

УФ-спектр: λ_max (0,01 н. HCl) нм (E^1% _{1 см}): 280 (42); λ_max (0,01 н. NaOH) нм (E^1% _{1 см}): 300 (60);

ИК-спектр (KBr), ν_max, см^-1: 3350, 1650, 1500, 1200-1000; [α]²⁰_D = -100° (с 1,0, H₂O).

Выход целевого продукта - очищенного (97% чистоты) кристаллического препарата эремомицина сульфата от содержания в нативном растворе составляет 65,0%, т.е. 2,1 г с 1 л нативного раствора (отфильтрованной ферментационной жидкости).

Таким образом, получен новый мутантный штамм Amycolatopsis umgeniensis ВКПМ Ас-1978, отличающийся от известного продуцента по способности антибиотикообразования, которая более чем на 40% превосходит активность продуцента-прототипа Amycolatopsis orientalis subsp. eremomycini ВКПМ-807 (Таблица 2). Использование нового штамма Amycolatopsis umgeniensis ВКПМ Ас-1978 позволяет увеличить выход целевого продукта. Выход эремомицина составляет 2,1 г с 1 литра нативного раствора.

Источники информации.

1. M.N. Preobrazhenskaya, E.N. Olsufyeva, O.V. Miroshnikova et al., G. Antib. 60 (4): 235-244, 2007

2. Патент RU 2352631 от 10.2008 г.

3. Патент RU 2110578 от 10.1998 г.

*/ +++ - хороший; ++ - умеренный; + - слабый.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при производстве ценного антибиотика эремомицина сульфата. Штамм Amycolatopsis umgeniensis, обладающий способностью продуцировать эремомицин, депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ Ас-1978. Штамм позволяет получать эремомицин с высоким выходом. 2 табл., 1 пр.

Штамм Amycolatopsis umgeniensis ВКПМ Ас-1978 - продуцент антибиотика эремомицина.