Средство, обладающее способностью увеличивать продолжительность жизни, улучшать когнитивные свойства, моторный контроль и координацию движений животных Российский патент 2023 года по МПК A61K35/64 A61P25/00 A61P39/06 

Изобретение относится к фармацевтической и кормовой промышленности, может быть использовано в кормовой биотехнологии для получения биологически активной добавки, способной увеличивать продолжительность жизни, улучшать когнитивные свойства, моторный контроль и координацию движений животных, и найти применение как продукт для здорового кормления.

Проблема активного долголетия привлекает внимание многих исследователей. Известна роль антиоксидантов для защиты головного мозга при дисбалансе прооксидантной и антиоксидантной систем, вызывающем оксидантный стресс, который по мнению ряда авторов является важным фактором старения. Kregel K., Zhang Н. An integrated view of oxidative stress in aging: basic mechanisms, unctional effects, and pathological considerations. Am. J. Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2007, v. 292(1), p. 18-36.

Известно применение химического соединения 2-этил-6-метил-3-оксипиридиния N-ацетил-L-глутамината (ЭМОП-АГ) в качестве нейротропного средства с антиоксидантной, противогипоксической, нейропротекторной, антиамнестической, противоукачивающей активностью и способностью улучшать когнитивные функции. ЭМОП-АГ при курсовом применении в дозах 10 и 20 мг/кг/сут (ежедневно в течение 5 сут) оказывает выраженное противогипоксическое действие при острой гипобарической гипоксии у крыс с геморрагическим инсультом (ГИ). При этом ЭМОП-АГ существенно увеличивает продолжительность жизни и выживаемость животных, предупреждает возникновение двигательных нарушений, возникающих при подъеме на «высоту», и улучшает общее состояние животных. У крыс с ГИ ЭМОП-АГ (по 20 мг/кг/сут в течение 14 сут) вызывает значительное уменьшение неврологического дефицита, улучшает координацию движений и в 2,3 раза уменьшает гибель животных. Курсовое введение средства восстанавливает нарушенные гемаррагическим инсультом когнитивные функции в тесте УРПИ через 7 и 14 сут после операции. По всем показателям оценки когнитивных функций ЭМОП-АГ проявляет высокую активность. RU 2394816 С1, опубл. 20.07.2010.

Как известно, антиоксиданты, благодаря их способности противодействовать свободным радикалам и нейтрализовать окислители, используются для лечения или облегчения симптомов заболеваний, связанных с активными формами кислорода, к которым относятся нейродегенеративные заболевания, такие, как болезнь Паркинсона, склероз. Miller Т.М., Pestronk A., David W. et al. An antisense oligonucleotide against SOD1 delivered intrathecally for patients with SOD1 familial amyotrophic lateral sclerosis: A phase 1, randomised, first-in-man study. Lancet Neurol., 2013, 12(5), p. 435-442.

В практике народной медицины Китая, Японии и стран Латинской Америки известен жук-чернотелка Ulomoides dermestoides (Coleoptera, Tenebrionidae), который используется против широкого спектра болезней. В научных исследованиях показан антидиабетический эффект. Jasso-Villagomez E.I., Garcia-Lorenzana М., Almanza-Perez J.C. et al. Beetle (Ulomoides dermestoides) fat improves diabetes: effect on liver and pancreatic architecture and on PPARg expression. Brazilian Journal of Medical and Biological Research, 2018, v. 51(6), e7238, http://dx.doi.org/10.1590/1414-431X20187238. Противовоспалительное действие водного экстракта жука - чернотелка Ulomoides dermestoides в лабораторных опытах на модели острого плеврита крыс. Santos R.C., Lunardelli A., Caberlon Е. et al. Antiinflammatory and immunomodulatory effects of Ulomoides dermestoides on induced pleurisy in rats and lymphoproliferation in vitro. Inflammation. 2010, 33, v. 3, p. 173-179.

Способность организма производить антиоксиданты уменьшается с возрастом, поэтому дополнительный прием антиоксидантов имеет важное значение. Насекомые рассматриваются как источник новых биологически активных веществ и являются перспективными объектами для получения новых субстанций для фармацевтического применения.

Перспективно изыскание у насекомых веществ, имеющих широкий спектр фармакологического действия, которое может оцениваться, например, по способности эффективно действовать в модельных системах по продлению жизни нематоды в условиях оксидативного стресса, в тестах на улучшение пространственного ориентирования, моторного контроля, когнитивных способностей по распознаванию предметов стареющими мышами, хомяками.

Технической задачей является выявление способности увеличивать продолжительность жизни, улучшать когнитивные свойства, моторный контроль и координацию движений животных новым средством - водным экстрактом личинок жука-чернотелки Ulomoides dermestoides, содержащим комплекс антиоксидантных ферментов, белки теплового шока 70 kDa и 60 kDa.

Технический результат, достигаемый от реализации изобретения, заключается в расширении арсенала средств, обладающих способностью увеличивать продолжительность жизни, улучшать когнитивные свойства, моторный контроль и координацию движений животных.

Технический результат достигается средством, обладающим способностью увеличивать продолжительность жизни, улучшать когнитивные свойства, моторный контроль и координацию движений животных, согласно изобретению, представляющим собой антибактериально обработанный водный экстракт личинок жука-чернотелки Ulimoides dermestoides, содержащий комплекс антиоксидантных ферментов, белки теплового шока 70 kDa и 60 kDa, полученный тонким диспергированием биомассы личинок в воде кавитационным методом в соотношении 1:4 до момента повышения температуры до 25-45°С, последующей экстракцией в течение суток при медленном перемешивании, фильтрацией экстракта и обработкой мембранной фильтрацией.

Техническая сущность заявленного изобретения заключается в следующем.

Заявленное средство, представляющее собой водный экстракт из личинок жука-чернотелки Ulomoides dermestoides, получают следующим образом. Личинки отделяют просеиванием через сито с диаметром ячейки 1,5 мм и промывают водой. После чего помещают в кавитационный дисиергатор, в котором смесь личинок и воды в соотношении 1:4 подвергают измельчению и гомогенизации до момента повышения температуры до 25-45°С (но не выше 45°С). Далее проводят экстракцию в течение суток при медленном перемешивании. Экстракт фильтруют сначала через капроновую марлю для грубой очистки от твердых частиц, а затем через мембранный фильтр Миллипор (Merck, Германия) с диаметром пор 0,1 мкм для антибактериальной обработки.

Проведенный анализ позволил выделить в полученном экстракте наиболее показательные белки, которые могут объяснять биологическую активность заявляемого средства: комплекс антиоксидантных ферментов (супероксидредуктаза, каталаза, глутатион S-трансфераза, пероксиредоксин, тиоредоксин), белки теплового шока 70 kDa и 60 kDa.

Основное внимание было уделено оценке активности антиоксидантных ферментов в экстракте. Определяли показатели каталазной и антиоксидантной активности (АОА).

Каталазную активность измеряли по содержанию пероксида водорода с помощью молибдата аммония. АОА оценивали по тушению хемилюминесценции люминола. Полученные результаты сравнивали с действием тролокса (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid) - водорастворимого аналога витамина Е (природного антиоксиданта).

Результаты измерения АОА экстрактов по Тролоксу: 1 мг/мл белка экстракта личинок эквивалентен по антиоксидантной активности 1,36 мМ Тролокса.

Результаты измерения каталазной активности экстракта личинок -6,3±1,1 мкмоль H₂O₂/мин/мг белка.

Тестирование биологической эффективности заявленного средства (далее экстракта) проводили в модельных опытах на нематоде в условиях оксидантного стресса, стареющих мышах, стареющих хомяках.

Тестировали влияние экстракта на продолжительность жизни свободноживущей почвенной нематоды Caenorhabditis elegans в условиях индуцированного оксидативного стресса. Индуктор оксидативного стресса - паракват (Paraquat-dichlorid, Methyl viologen dichloride hydrate), SIGMA. Экстракт личинок, содержащий 1,2 мг белка/мл, тестировали на взрослых особях нематоды, выращенных стандартным образом до стадии Adl, и отмытых от бактерий. При оксидативном стрессе (ОС) в 160 мкл S-среды и 20 мкл экстракта вводили оксидантное средство - 20 мкл 0,5 М раствора параквата PQ (концентрация в лунке 40 мкМоль). Определяли МПЖ - медианная продолжительность жизни.

Изменение относительного количества нематод в присутствии 40 мкМоль параквата (условия массированного оксидативного стресса): экстракт продлил МПЖ нематоды с 27 ч до 39 ч, что составляет более 20%.

Полученный экстракт личинок тестировали на биологическую активность в поведенческих тестах на мышах и хомяках. Исследование когнитивных способностей и двигательных навыков проводили на стареющих мышах линии C57BL/6 (возраст при тестировании 19 месяцев из 24-х возможных, т.е. 80% от средней продолжительности жизни) по 8 особей в опытной и контрольной группах и обыкновенном хомяке Cricetus cricetus (группы по 9 особей).

Экстракт - иммобилизованный на пищевом носителе (облепиховый шрот) в виде опытного БАД вводили в корм лабораторным животным (мыши линии С57 В1/6 и обыкновенный хомяк Cricetus cricetus) в течение 3х месяцев в дозе 400 мкг экстракта/кг массы тела два раза в неделю. Затем проводили тестирование.

Тесты:

Физическая выносливость, пространственное ориентирование, когнитивные способности - тесты на ротароде, вертикальном шесте и распознавание предметов у мышей (когнитивные способности).

Общие показатели: продолжительность жизни, масса тела, общий анализ и биохимия крови, когнитивные способности по распознаванию предметов у хомяков.

Сравнение максимального времени (из трех попыток), проведенного мышами на шесте с использованием критерия Кракскела-Уолиса, показало наличие достоверных различий между группами. Результаты приведены в таблице 1.

Время нахождения мышей на барабане ротарода и количество оборотов в минуту, которые выдерживали мыши контрольной и экспериментальной групп, приведено в таблице 2.

Результаты двух первых экспериментов показали, что мыши из экспериментальной группы способны дольше удерживаться на верху вертикального шеста и дольше удерживаться на вращающемся барабане с постоянно увеличивающейся скоростью вращения. Это предполагает, что у мышей из этой группы сильнее мышечный тонус и более эффективная координация движений, поскольку шест «неудобен» для того, чтобы удерживаться на нем длительное время. Действительно, в течение всего времени теста мышь постоянно меняет положение тела на шесте - площадь опоры на верхнем конце шеста невелика (высота шеста 50 см, его диаметр 1 см) и мышь, вероятно, прилагает много усилий, чтобы удержаться и сохранить равновесие, при этом не перенапрягая мышцы лап и тела. Можно предполагать, лучший моторный контроль и координация движений позволяет мышам из экспериментальной группы дольше удерживаться на шесте, чем мышам из контрольной. Более высокий мышечный тонус также позволяет мышам из экспериментальной группы дольше удерживаться на барабане ротарода и выдерживать более высокие скорости его вращения.

Тест на когнитивные способности мышей по распознаванию предметов.

Длительность обследования нового предмета мышами в группе экспериментальная достоверно превышала таковую в группе контрольная. Сравнение общей длительности обследования референтного (старого) и нового предмета за 5 мин тестирования показало, что мыши из экспериментальной группы дольше обследуют новый предмет в тестовых предъявлениях, и у них сильнее различия в длительности обследования нового и старого предметов. Таким образом в экспериментальной группе сильнее выражена реакция на новизну, и у мышей из этой группы более выражены механизмы распознавания новых предметов, результаты приведены в таблице 3.

Тесты на хомяках. Результаты приведены в таблице 4.

Наблюдения выявили, что изменение массы тела в обеих группах хомяков (контрольной и опытной) имело сезонный характер: масса тела возрастала в осенне-зимний период и снижалась к весне, при этом потери массы тела перезимовавших животных (в марте) в опытной группе, принимавшей препарат на основе заявленного экстракта, были значительно меньше, чем в контрольной. В обеих группах в марте отмечено повышение среднего уровня гемоглобина, причем последнего в опытной группе - достоверное (здесь и далее t-критерий Стьюдента, р≤0.05), в зимний период напротив, отмечалось достоверное снижение этих показателей в обеих группах. Таким образом, перечисленные изменения могут иметь адаптивное значение. В опытной группе содержание лейкоцитов в начале наблюдений было более высоким по сравнению с контролем (выборка была случайной), а за время эксперимента этот показатель заметно снизился. Несмотря на то, что все колебания происходили в пределах референтных значений, снижение уровня лимфоцитов опытных животных носило достоверный характер, что связано со снижением зараженности гельминтами.

Гельминтоовоскопия. Результаты обследования представлены в таблице 5.

При первоначальном обследовании весной 2021 г. была показана зараженность гельминтами животных обеих групп.Обнаружено 2 вида нематод: Aspiculuris tetraptera (Oxyurata: Heteroxynematidae) и Capillaria spp.(Trichocehyalata Capillariidae).

При повторном исследовании образцов кала в октябре обнаружены только нематоды-капиллярииды: Capillaria spp.(Trichocehyalata Capillariidae) и Trichocehalus muris. Нематода Aspiculuris tetraptera, (Oxiurata), выявленная в прошлом исследовании (весна) - отсутствует. Очередное исследование, проведенное после перезимовки (в марте) при применении в рационе опытных животных на основе заявленного средства, показало общее снижение экстенсивности инвазии у контрольных животных до 33%, однако у опытных животных гельминты не обнаружены, и общая экстенсивность инвазии (ИЭ) составила 0%. Смертность в контрольной группе была выше, чем в опытной, также более высокий уровень смертности отмечался среди самцов. Из 9 животных пало 5 особей (4 самца и 1 самка), что составило 55,6%. В то время, как в опытной группе пала только одна самка, что составило 16,7%.

Тест на когнитивные способности хомяков Cricetus cricetus.

При сравнении усредненной общей длительности обследования как референтного и нового предмета, и частоты обследования референтного (старого) и нового предмета показало, что хомяки как контрольной, так и экспериментальной группы дольше обследуют новый предмет. При этом наблюдается выраженная тенденция к повышенному вниманию (суммарной продолжительности обнюхивания) опытных хомяков по отношению к новому предмету по сравнению с контрольными, что указывает на лучшее запоминание старых предметов и распознавание новых у опытных животных. Результаты приведены в таблице 6.

На основании проведенных экспериментальных исследований можно сделать вывод, что использование антибактериально обработанного водного экстракта личинок жука-чернотелки Ulimoides dermestoides, содержащего комплекс антиоксидантных ферментов, белки теплового шока 70 kDa и 60 kDa в качестве средства, обладающего способностью увеличивать продолжительность жизни, улучшать когнитивные свойства, моторный контроль и координацию движений животных, позволило расширить арсенал средств с заявленным специфическим действием.

Изобретение относится к области фармацевтики, а именно к средству, обладающему способностью увеличивать продолжительность жизни, улучшать когнитивные свойства, моторный контроль и координацию движений животных. Средство, обладающее способностью увеличивать продолжительность жизни, улучшать когнитивные свойства, моторный контроль и координацию движений животных, характеризующееся тем, что оно представляет собой антибактериально обработанный методом фильтрации водный экстракт личинок жука-чернотелки Ulomoides dermestoides, содержащий комплекс антиоксидантных ферментов, белки теплового шока 70 кДа и 60 кДа. Получают средство тонким диспергированием биомассы личинок в воде кавитационным методом в кавитационном диспергаторе в соотношении 1:4 до момента повышения температуры до 25-45°С, последующей экстракцией в течение суток при медленном перемешивании, фильтрацией экстракта и обработкой мембранной фильтрацией. Вышеуказанное изобретение позволяет расширить арсенал средств, обладающих способностью увеличивать продолжительность жизни, улучшать когнитивные свойства, моторный контроль и координацию движений животных. 6 табл.

Средство, обладающее способностью увеличивать продолжительность жизни, улучшать когнитивные свойства, моторный контроль и координацию движений животных, характеризующееся тем, что оно представляет собой антибактериально обработанный методом фильтрации водный экстракт личинок жука-чернотелки Ulomoides dermestoides, содержащий комплекс антиоксидантных ферментов, белки теплового шока 70 кДа и 60 кДа, полученный тонким диспергированием биомассы личинок в воде кавитационным методом в кавитационном диспергаторе в соотношении 1:4 до момента повышения температуры до 25-45°С, последующей экстракцией в течение суток при медленном перемешивании, фильтрацией экстракта и обработкой мембранной фильтрацией.