Способ оценки биосовместимости имплантата с сетчатой структурой Российский патент 2023 года по МПК C12N5/02 A61F2/28 A61L27/56 G01N33/68 G01N33/15 

Изобретение относится к области медицины, а именно к клеточной биотехнологии, иммунологии, имплантологии и может применяться для определения биосовместимости материала.

Титановая сетка широко применяется в хирургии, в частности, при краниопластике, в челюстно-лицевой хирургии, при пластике брюшной стенки. Одной из ключевых проблем, связанных с имплантацией материала, является его приживаемость. Для повышения биосовместимости материала используют различные методы физической и химической модификации его поверхности. Биосовместимость материала может исследоваться как in vivo, путем имплантации лабораторным животным, так и in vitro. При исследовании имплантационного материала in vitro на биосовместимость, чаще всего, оцениваются ее два основных параметра: 1) способность имплантационного материала к интеграции в окружающие ткани (клеточная совместимость), в этом случае оценивается, в основном, адгезия и пролиферация клеток на его поверхности; 2) уровень и характер иммунологических реакций на имплантационный материал.

При оценке клеточной совместимости материала необходимо осуществить посев клеточной культуры на имплантат и оценить уровень их адгезии и пролиферации. Посев обычно осуществляется седиментационным методом: на поверхность имплантата наносится суспензия клеток, которые пассивно оседают на имплантат и адгезируются на его поверхности [Kawai, 2017; Groessner-Schreiber, 2003; Kopf, 2015], что дает возможность оценить долю адгезировавшихся клеток, степень их распластывания по поверхности, скорость пролиферации и ряд других показателей. При этом предполагается, что имплантат должен иметь плоскую поверхность.

Известен патент (RU, №2761266, МПК G01N 33/49, G01N 33/68, G01N 33/15, опубл. 06.12.2021 г.), описывающий метод оценки пригодности для использования в медицине синтетических полимеров путем инкубации имплантационного материала с мононуклеарными клетками периферической крови и последующей оценкой количества секретируемых мононуклеарными клетками противовоспалительных цитокинов.

Данный способ применим для материалов в виде сетки. В то же время, он оценивает лишь отдельные параметры иммунологической реакции на материал, но не дает никакой информации о способности материала к адгезии клеток, и, соответственно, к интеграции в окружающие имплантат ткани (клеточной совместимости).

Также известно устройство (SU, №1120221, МПК G01N 19/04, опубл. 23.10.1984 г.), оценивающее адгезионную способность клеток животных путем их отрыва с поверхности с помощью струи жидкости.

Данный способ использует принципиально другую методику и определяет устойчивость к отрыву связанных с поверхностью клеток, но не дает никакой информации о способности клеток к пролиферации на данной поверхности. Кроме того, способ не пригоден для сетчатых поверхностей.

Наиболее близким техническим решением является способ оценки биосовместимости костных имплантатов на основе костей аллогенного происхождения (Волов Л.Т., Трунин Д.А., Пономарева Ю.В., Попов Н.В. Исследование биосовместимости и цитотоксичности персонифицированных костных имплантатов с применением клеточных технологий, Вестник медицинского института «РЕАВИЗ», №5, 2017, с. 32-39).

1) Фрагменты имплантационного материала размером 3×3×5 мм, предварительно простерилизованный, помещается в чашки Петри. Имплантационный материал имеет монолитную не сетчатую структуру.

2) Готовят суспензию клеток. В данной работе была использована культура хондробластов. Клетки были ресуспендированы в ростовой среде.

3) Имплантационный материал помещают в емкость и наносят на нее суспензию клеток. Суспензия клеток наносится непосредственно на имплантат.

4) Емкости с имплантатами переносятся в СО₂-инкубатор. Происходит адгезия клеток и их дальнейшее деление прямо на поверхности имплантата.

5) Контроль роста клеток осуществлялся микроскопически, путем оценки формы клеток и приблизительной качественной оценки их количества.

Данный способ предполагает посев клеток на его поверхность методом седиментации и предполагает использование имплантата с плоской поверхностью, соответственно не пригоден для сетчатого имплантата.

Существующие способы оценки клеточной совместимости имплантатов не применимы для имплантатов с сетчатой структурой.

Задачей изобретения является усовершенствование методики оценки биосовместимости клеток и имплантатов с сетчатой поверхностью.

Технический результат заявляемого изобретения заключается в том, что оно позволяет оценивать клеточную совместимость имплантатов с сетчатой структурой, что позволяет определить способность такого имплантата к интеграции в окружающие ткани.

Технический результат достигается тем, способ оценки биосовместимости имплантата с сетчатой структурой включающий внесение стерильного имплантата в стерильную емкость, внесение клеточной суспензии, инкубацию в СО₂-инкубаторе и последующий контроль роста клеток на имплантате, согласно изобретению, имплантат имеет сетчатую структуру, его стерилизуют в автоклаве, заливают ростовой средой, состоящей мас.%:

среда Игла, в модификации Дульбекко (DMEM) 45% питательная смесь F-12 44,965% эмбриональная телячья сыворотка 10% L-глутамин 0,03% гентамицин 0,005%;

с последующей инкубацией в СО₂ инкубаторе в течение 16-24 часов, внесения в лунки планшетов клеточной суспензии с плотностью посева 3-7 тыс. клеток/см² площади лунок, при этом соотношение объема площади клеточной суспензии к ростовой среде 2:1, повторной инкубацией планшетов с сетками в СО₂ инкубаторе при T 37°С, СО₂-5% в течение 5-14 дней и дальнейшим снятием их с сеток раствором трипсина и подсчетом количества клеток.

Сетчатая структура имплантатов обеспечивает их меньшую массу, эластичность, а также возможность прорастания тканей в ячейки сетки.

Стерилизация имплантата в автоклаве обеспечивает стерильность изучаемого материала и предотвращает бактериальный/грибковый пророст во время исследования.

Предварительная заливка простерилизованного имплантата ростовой средой, состоящей масс. %: среды Игла, в модификации Дульбекко (DMEM) - 45%, питательной смеси F-12 - 44,965%, эмбриональной телячьей сыворотки - 10%, L-глутамина - 0,03% и гентамицина - 0,005%, с последующей инкубацией в СО₂-инкубаторе в течение 16-24 часов, позволяет удалить из сеток пузырьки воздуха, которые могут привести к их всплытию или неравномерному расположению на дне лунки.

Плотностью посева составляет 3-7 тыс. клеток/см² площади лунок, необходима, чтобы обеспечивать клеткам 3-4 цикла пролиферации до формирования конфлуэнтного монослоя и обеспечивает достаточно активную пролиферацию клеток, что дает им возможность мигрировать на петли сетчатого имплантата, соотношение объема площади клеточной суспензии к ростовой среде 2:1, позволяет распределению по поверхности уже имеющейся в лунке среды для обеспечения равномерности посева клеток.

Повторная инкубация планшетов с сетками в СО₂ инкубаторе при T 37°С, СО₂-5% в течение 5-14 дней до момента достижения конфлуэнтного монослоя на поверхности лунки обеспечивает достаточный уровень миграции клеток с пластика на сетчатый имплантат для оценки его клеточной совместимости.

Снятие клеток с сеток раствором трипсина и подсчет их количества позволяет количественно оценить клеточную совместимость имплантата.

Изобретение осуществляется следующим образом.

Берется сетчатый имплантат толщиной до 3 мм, размером 5-15 мм x 5-15 мм. Простерилизованный методом автоклавирования сетчатый имплантационный материал вносят в лунки культуральных планшетов и заливают ростовой средой, состоящей мас.%: среды Игла, в модификации Дульбекко (DMEM) - 45%, питательной смеси F-12 - 44,965%, эмбриональной телячьей сыворотки - 10%, L-глутамина - 0,03% и гентамицина - 0,005% выше уровня сеток. Петли сеток должны на всей площади соприкасаться с дном лунки. Планшеты с сетками инкубируют в СО₂-инкубаторе в течение 16-24 часов. В лунки с сетками вносится клеточная суспензия с плотностью посева 3-7 тыс. клеток/см² площади лунок, с соотношением объема площади клеточной суспензии к ростовой среде 2:1. Суспензия должна быть распределена по поверхности уже имеющейся в лунке среды для обеспечения равномерности посева клеток.

Планшеты с сетками переносятся и инкубируются в CO₂-инкубаторе (37°С, 5% - СО₂), в течение 5-14 дней. Во время инкубации должен проводиться ежедневный контроль формирования монослоя на дне лунок с помощью инвертированного микроскопа. Инкубация продолжается до формирования на поверхности пластика конфлуэнтного монослоя, когда клетки заполняют все пространство дна лунки и начинают «подпирать» друг друга. Адгезировавшиеся на пластике и пролиферирующие клетки при этом частично перемещаются на проволочную основу сетки при условии ее пригодности для адгезии клеток.

По завершении инкубации сетчатые имплантаты вынимаются из лунок и переносятся в лунки нового планшета. Осуществляется подсчет количества клеток, адгезированных на поверхности сетки. Для этого сетки отмываются от остатков среды и заливаются 0,25% раствором трипсина так, чтобы сетки были залиты целиком. Сетки с трипсином инкубируют при 37°С в течение 15 минут, после чего оставшиеся на сетках клетки снимаются осторожным пипетированием. Количество клеток в трипсине подсчитывается с помощью камеры Горяева или автоматического счетчика клеток.

Пример 1

1) Была произведена оценка уровня адгезии и пролиферации культуры дермальных фибробластов (получены от донора 1) на титановых сетках толщиной 1 мм из титана марки ВТ0-1.

2) Простерилизованные методом автоклавирования сетки размером 15x15 мм и толщиной 1 мм поместили в лунки 12-луночных культуральных планшетов и залили ростовой средой в объеме 1 мл выше уровня сеток.

3) Планшеты с сетками инкубировали в CO₂-инкубаторе в течение 16 часов.

4) По завершении инкубации в лунки с сетками внесли суспензию дермальных фибробластов (донор 1), соответственно, в объеме 2 мл и с плотностью 15000 клеток/мл (в пересчете на площадь поверхности лунки - 8000 клеток/см²). Общий объем среды в каждой лунке составил 3 мл.

5) Планшеты с сетками перенесли в СО₂-инкубатор (37°С, 5% СО₂) и инкубировали 7 дней до формирования на поверхности пластика конфлуэнтного клеточного монослоя.

6) По завершении инкубации планшеты были извлечены из СО₂-инкубатора, сетки с адгезировавшимися клетками были перенесены в пустые планшеты. Сетки были отмыты от остатков среды с помощью фосфатного буферного раствора.

7) Сетки в лунках были залиты 1 мл 0,25% раствора трипсина и проинкубированы в трипсине при 37°С в течение 15 мин. Клетки были окончательно сняты с сеток энергичным пипетированием.

8) Количество клеток в полученных клеточных суспензиях (и, соответственно, на поверхности сеток) определяли путем их подсчета в счетчике клеток МС-20 (Biorad). Концентрация клеток составила 52,5 тыс. клеток/мл.

Пример 2

1) Была произведена оценка уровня адгезии и пролиферации культуры дермальных фибробластов (получены от донора 2) на титановых сетках толщиной 1 мм из титана марки ВТ0-1.

2) Простерилизованные методом автоклавирования сетки размером 5x5 мм и толщиной 1 мм поместили в лунки 24-луночных культуральных планшетов и залили ростовой средой в объеме 0,5 мл выше уровня сеток.

3) Планшеты с сетками инкубировали в СО₂-инкубаторе в течение 16 часов.

4) По завершении инкубации в лунки с сетками внесли суспензию дермальных фибробластов (донор 2) в объеме 1 мл и с плотностью 5700 клеток/мл (в пересчете на площадь поверхности лунки - 3000 клеток/см²). Общий объем среды в каждой лунке составил 1,5 мл.

5) Планшеты с сетками перенесли в СО₂-инкубатор (37°С, 5% СО₂) и инкубировали 14 дней до формирования на поверхности пластика конфлуэнтного клеточного монослоя.

6) По завершении инкубации планшеты были извлечены из СО₂-инкубатора, сетки с адгезировавшимися клетками были перенесены в пустые планшеты. Сетки были отмыты от остатков среды с помощью фосфатного буферного раствора.

7) Сетки в лунках были залиты 0,3 мл 0,25% раствора трипсина и проинкубированы в трипсине при 37°С в течение 15 мин. Клетки были окончательно сняты с сеток энергичным пипетированием.

8) Количество клеток в полученных клеточных суспензиях (и, соответственно, на поверхности сеток) определяли путем их подсчета в счетчике клеток МС-20 (Biorad). Концентрация клеток составила 83,4 тыс. клеток/мл.

Пример 3

1) Была произведена оценка уровня адгезии и пролиферации перевиваемой культуры клеток остеосаркомы человека SaOS-2 на титановых сетках толщиной 3 мм из титана марки ВТ0-1.

2) Простерилизованные методом автоклавирования сетки размером 9x9 мм и толщиной 3 мм поместили в лунки 24-луночных культуральных планшетов и залили ростовой средой в объеме 0,75 мл выше уровня сеток.

3) Планшеты с сетками инкубировали в CO₂-инкубаторе в течение 24 часов.

4) По завершении инкубации в лунки с сетками внесли суспензию остеобластов SaOS-2, соответственно, в объеме 1,5 мл и с плотностью 6300 клеток/мл (в пересчете на площадь поверхности лунки - 5000 клеток см²). Общий объем среды в каждой лунке составил 2,25 мл.

5) Планшеты с сетками перенесли в СО₂-инкубатор (37°С, 5% СО₂) и инкубировали 5 дней до формирования на поверхности пластика конфлуэнтного монослоя.

6) По завершении инкубации планшеты были извлечены из СО₂-инкубаторы, сетки с адгезировавшимися клетками были перенесены в пустые планшеты. Сетки были отмыты от остатков среды с помощью фосфатного буферного раствора.

7) Сетки в лунках были залиты 0,75 мл 0,25% раствора трипсина и проинкубированы в трипсине при 37°С в течение 15 мин. Клетки были окончательно сняты с сеток энергичным пипетированием.

8) Количество клеток в полученных клеточных суспензиях (и, соответственно, на поверхности сеток) определяли путем их подсчета в счетчике клеток МС-20 (Biorad). Концентрация клеток составила 22 тыс. клеток/мл.

Использование предлагаемой методики позволяет оценивать клеточную совместимость имплантатов с сетчатой структурой путем подсчета количества клеток, перемещающихся на петли сетки.

Изобретение относится к области биотехнологии, а в частности к имплантологии, и может применяться для определения биосовместимости материала. Предложен способ оценки биосовместимости имплантата с сетчатой структурой включающий внесение стерильного имплантата в стерильную емкость, внесение клеточной суспензии, инкубацию в CO₂-инкубаторе и последующий контроль роста клеток на имплантате, где имплантат имеет сетчатую структуру. Использование предлагаемой методики позволяет оценивать клеточную совместимость имплантатов с сетчатой структурой путем подсчета количества клеток, перемещающихся на петли сетки. 3 пр.

Способ оценки биосовместимости имплантата с сетчатой структурой, включающий внесение стерильного имплантата в стерильную емкость, внесение клеточной суспензии, инкубацию в CO₂-инкубаторе и последующий контроль роста клеток на имплантате, отличающийся тем, что имплантат имеет сетчатую структуру, стерилизацией его в автоклаве, заливкой ростовой средой, состоящей мас.%:

среда Игла, в модификации Дульбекко (DMEM) 45% питательная смесь F-12 44,965% эмбриональная телячья сыворотка 10% L-глутамин 0,03% гентамицин 0,005%,

с последующей инкубацией в CO₂ инкубаторе в течение 16-24 часов, внесения в лунки планшетов клеточной суспензии с плотностью посева 3-7 тыс. клеток/см² площади лунок, при этом соотношение объема площади клеточной суспензии к ростовой среде 2:1, повторной инкубацией планшетов с сетками в CO₂ инкубаторе при T 37°С, CO₂-5% в течение 5-14 дней и дальнейшим снятием их с сеток раствором трипсина и подсчетом количества клеток.