Набор реагентов для определения рибонуклеиновых кислот при диагностике лимфопролиферативных заболеваний Российский патент 2023 года по МПК C12Q1/68 

Изобретение относится к области медицины, а именно к клинической лабораторной диагностике лимфоцитарной лимфомы/хронического лимфоцитарного лейкоза (ХЛЛ) с использованием молекулярно-генетических методов одновременного определения комбинаций отдельных рибонуклеиновых кислот: микроРНК и матричных РНК в мультиплексной полимеразной цепной реакции.

Известны характерные для ХЛЛ изменения концентрации молекул матричных РНК (мРНК) гена ROR1 [Aghebati-Maleki L, Shabani M, Baradaran B, Motallebnezhad M, Majidi J, Yousefi M. Receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 1 (ROR1): An emerging target for diagnosis and therapy of chronic lymphocytic leukemia. Biomedicine & pharmacotherapy. 2017; 88:814-822], а также микроРНК miR-155 [Due H., Svendsen P., Bødker J., Schmitz A., Bøgsted M., Johnsen H.E. et al. miR-155 as a Biomarker in B-Cell Malignancies. BioMed Research International. 2016;2016:1-14] и микроРНК miR-15а [Braga TV, Evangelista FCG, Gomes LC, Araújo SSDS, Carvalho MDG, Sabino AP. Evaluation of MiR-15a and MiR-16-1 as prognostic biomarkers in chronic lymphocytic leukemia. Biomed Pharmacother. 2017;92:864-869.; Balatti V, Croce CM. MicroRNA dysregulation and multi-targeted therapy for cancer treatment. Adv Biol Regul. 2020;75:100669] в лейкоцитарных клетках крови.

Технологии секвенирования нуклеиновых потенциально могут обнаружить несколько тысяч различных молекул РНК [Precazzini F, Detassis S, Imperatori AS, Denti MA, Campomenosi P. Measurements Methods for the Development of MicroRNA-Based Tests for Cancer Diagnosis. Int J Mol Sci. 2021;22(3):1176]. Использование технологии микрочипов также представляет собой высокопроизводительный метод, используемый для одновременного обнаружения широкого спектра РНК. Вместе с тем классическое секвенирование по Сэнгеру, пиросеквенирование и микрочипы не обладают достаточной чувствительностью для количественного определения РНК в тканях и жидкостях человека. Указанные методы анализа также недостаточно стандартизованы и пока не рекомендованы для использования в клинической лабораторной диагностике при диагностике лимфопролиферативных заболеваний.

Для количественного высокочувствительного определения мРНК и микроРНКРНК используются методы цифровой ПЦР, основанной на последовательном разведении образца во множестве отдельных капель, в которых проводятся реакции амплификации. Максимальное разведение образца, в котором еще детектируется результат реакции отражает количество исходных молекул нуклеиновых кислот.

К недостаткам всех указанных выше методов относятся дорогостоящие оборудование и реактивы, технологическая сложность, трудоемкость и длительность выполнения тестирования, высокие требования к квалификации персонала, что повышает стоимость тестирования и ограничивает широкое использование данных методов в реальной практике клинико-диагностических лабораторий. Кроме того, в доступной литературе не описано использование данных технологий для одновременного количественного определения мРНК ROR1 и микроРНК miR-155 и miR-15a для диагностики ХЛЛ.

Альтернативным и широкодоступным вариантом количественного определения уровня отдельных молекул нуклеиновых кислот является полимерная цепная реакция с детекций результатов в режиме «реального времени» (ПЦР-РВ). Преимуществом ПЦР-РВ наряду с высокой чувствительностью и специфичностью является возможность использования широко распространенного стандартного оборудования для выполнения анализа в клинико-диагностических лабораториях медицинских организаций, что позволяет обеспечить большую доступность диагностики для населения.

Из практики лабораторных исследований также известно, что проведение ПЦР в мультиплексном варианте определения разных маркеров в одной аналитической постановке имеет ряд преимуществ перед ПЦР в отдельных аналитических сериях для каждого отдельного маркера, а именно: снижение риска контаминации образцов, уменьшение расхода реактивов, сокращение времени проведения анализа и постановки диагноза. Кроме того, стандартизованное одновременное определение отдельных маркеров позволяет получать дополнительные диагностические критерии, основанные на соотношении их концентраций более точно, чем при использовании разных тест систем и технологий.

Однако известные методы диагностики, основанные на количественной ПЦР-РВ, позволяют выполнять исследования в аналитических постановках только отдельно для мРНК и для микроРНК с помощью разных наборов реактивов и технологических режимов проведения реакции. Наборы для использования в клинической лабораторной диагностике для совместного одновременного определения мРНК и микроРНК не известны.

Описано использование мультиплексной реакции ПЦР-РВ для определения мРНК ряда онкогенов при острых лейкозах [Ольховский И.А., Горбенко А.С., Столяр М.А., Бахтина В.И., Михалёв М.А., Ольховик. Т.И., Судариков А.Б., Сидорова Ю.С., Поспелова Т.И., Колесникова М.А., Капорская Т.С., Лыскова В.А. Исследование мРНК генов WT1, BAALC, EVI1, PRAME и HMGA2 в образцах цельной крови. Клиническая лабораторная диагностика. 2022; 67(10): 613-620]. Однако перечень использованных в данной методике ограничен только мРНК характерных для бластных клеток при острых вариантах лейкоза не предполагает возможности определения молекул микроРНК.

Наиболее близким к заявляемому изобретению по совокупности признаков являются реактивы применяемые в диагностике хронического миелоидного лейкоза методом мультиплексной реакции ПЦР для одновременного выявления трех основных вариантов мРНК транскриптов BCR/ABL - р210, р190, р230 [Горбенко А.С., Столяр М.А., Васильев Е.В., Михалёв М.А., Бахтина В.И., Ольховик Т.И., Мочалова Е.Е., Орлова К.Э., Ольховский И.А. Использование набора «BCR/ABL - мультитест» в алгоритме лабораторной диагностики онкогематологических заболеваний: экономические аспекты. Клиническая лабораторная диагностика. 2021; 66(9): 571-576 (прототип)]. Описанный вариант набора предусматривает использование одной реакционной смеси, содержащих специфичные праймеры и флуоресцентно-меченые ДНК-зонды, имеющих следующий нуклеотидный состав (5'-3'-):

ENR561: CACTCAGACCCTGAGGCTCAA

ENF402: CTGGCCCAACGATGGCGA

E19: TGGAGGAGGTGGGCATCTAC

ENP541: FAM-CCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGABHQ1,

в качестве источника флуоресценции в TaqMan зонде на 5' конце применяют краситель флуоресцеин (FAM), а для тушения флуоресценции используют Black Hole Quencher-1 (BHQ1) на 3' конце. Данное техническое решение позволяет проводить одновременное выявление трех вариантов мРНК в одной аналитической постановке, что приводит к экономии реактивов и времени получения результатов анализа.

Недостаток этого набора заключается в том, что он предусматривает возможность выявления только трех вариантов мРНК гена BCR-ABL, имеющих диагностическое значение при хроническом миелоидном лейкозе. Набор не обеспечивает возможности выделения и определения уровня экспрессии микроРНК, а также его использования при диагностике ХЛЛ.

Кроме того, состав используемых реагентов не включает реагенты для выделения РНК, что при использовании разных методик выделения РНК приводит к необходимости дополнительного определения концентрации выделенных нуклеиновых кислот для оценки оптимальности их значений для внесения в реакционные смеси амплификации. Среди используемых реактивов также нет реагентов для выполнения специфической обратной транскрипции, что исключает возможность детекции микроРНК.

Предметом настоящего изобретения является набор реактивов для мультиплексной ПЦР-РВ с целью одновременного обнаружения мРНК генов ABL и ROR1, а также микроРНК miR-155, miR-15a и miR-39 в образцах биологических проб, что ранее не применялось в практике клинической лабораторной диагностике ХЛЛ.

Техническим результатом данного изобретения является состав оптимально подобранных реактивов для стандартизованного выделения РНК, проведения обратной транскрипции и мультиплексной полимеразной цепной реакции, что позволяет осуществлять все этапы выполнения анализа в одной аналитической серии в течение одного рабочего дня.

Технический результат достигается тем, что в набор для диагностики ХЛЛ, включены все необходимые реактивы для выделения РНК, выполнения обратной транскрипции и мультиплексной амплификации. При этом для проведения реакции обратной транскрипции микроРНК (5'-3'-): используются следующие петлевые праймеры

miR155-L: GAAAGAAGGCGAGGAGCAGATCGAGGAAGAAGACGGAAGAATGTGCGTCTCGCCTTCTTTCACCCCTAT (SEQ ID №15);

miR39-L: GAAAGAAGGCGAGGAGCAGATCGAGGAAGAAGACGGAAGAATGTGCGTCTCGCCTTCTTTCCAAGCTGA (SEQ ID №16);

miR15a-L: GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCACAAAC (SEQ ID №17);

а для амплификации используются оригинальные комбинации специфических праймеров и зондов:

miR39-P: HEX-CGTCTCGCCTTCTTTCCA-BHQ1 (SEQ ID №1);

miR39-R: CGAGGAAGAAGACGGAAGAAT (SEQ ID №2);

miR39-F: GGTCACCGGGTGTAAATC (SEQ ID №3);

miR155-P: FAM-GTCTCGCCTTCTTTTCACCC-BHQ1 (SEQ ID №4);

miR155-R: CGAGGAAGAAGACGGAAGAAT (SEQ ID №5);

miR155-F: GCGGTTAATGCTAATCGTGATA (SEQ ID №6);

miR15a-R: GTCGTATCCAGTGCAGGGTCC (SEQ ID №7);

miR15a-F: TGTCCGCCTAGCAGCACATAA (SEQ ID №8);

ABL-R: GATGTAGTTGCTTGGGACCCA (SEQ ID №9);

ABL-F: GGCCAGTGGAGATAACACTC (SEQ ID №10);

ROR-F: AGTCTTGTTTGTCAAGTTTGGCC (SEQ ID №11);

ROR-R: CATGCAATCCCTCTGTATGGC (SEQ ID №12);

ABL-P: HEX-CCATTTTTGGTTTGGGCTTCACACCATT-BHQ1 (SEQ ID №13);

ROR-P: FAM-CCTCCCACTGCAAGTCCAGGATACTCAGA-BHQ1 (SEQ ID №14).

Заявленный вариант комплектации набора реагентов, рассчитанный на 50 реакций, включает флаконы и пробирки, содержание:

1. Реагенты для выделения РНК фенол-хлороформным методом (таблица 1):

а. Раствор 1 - 20 мл;

б. Раствор 2 - 40 мл;

в. Раствор 3 - 14 мл;

г. Раствор 4 - 45 мл;

д. Раствор 5 - 20 мл

е. Раствор 6 - 1 мл;

ж. Раствор 7 - 50 мл;

з. Раствор 8 - 40 мл;

и. Раствор 9 - 8 мл.

2. Две реакционные смеси для выполнения специфической обратной транскрипции мРНК и микроРНК - по «МикроРНК-ОТ» и «мРНК-ОТ» (таблица 2).

3. Ревертазу для проведения обратной транскрипции (5 ед/мкл) - 50 мкл.

4. Реакционную смесь для определения экспрессии мРНК ABL1 и мРНК ROR1 (мРНК-РВ) методом ПЦР-РВ - 900 мкл (таблица 3).

5. Реакционную смесь для определения экспрессии микроРНК miR-39 и микроРНК miR-155 (155-39-РВ) методом ПЦР-РВ - 1200 мкл (таблица 3).

6. Реакционную смесь для определения экспрессии микроРНК miR-15а (15а-РВ) методом ПЦР-РВ - 1200 мкл, (таблица 3).

7. ДНК-полимеразу Thermus aquaticus 5 ед/мкл (Taq-полимераза) - 100 мкл.

8. Положительный контрольный образец (ПКО) (стандартная кДНК с концентрацией 2 нг/мкл) - 500 мкл.

9. Стандартный раствор микроРНК miR-39 с концентрацией 10⁹ копий/мкл.

10. Отрицательный контрольный образец (ОКО, не содержит нуклеиновых кислот) - 500 мкл.

11. Колонки и собирательные пробирки для выделения РНК - 50 шт.

Положительные контрольные образцы (ПКО) представляют из себя человеческую геномную ДНК с наличием кДНК ROR1, а также кДНК микроРНК miR-155 и miR-15a. Отрицательный контрольный образец (ОКО) представляет собой деионизированную воду.

Таблица 1 - Состав реактивов для выделения микроРНК и мРНК из образца крови Наименование Состав Раствор 1 5М гуанидин тиоционат, 10 мМ Трис-HCl, pH 7,6, 10 мМ ЭДТА, 0,5% лаурилсаркозинат натрия Раствор 2 Фенол, рН 4,5 Раствор 3 Хлороформ Раствор 4 Этиловый спирт, 96% Раствор 5 Изопропиловый спирт, 100% Раствор 6 Гликоген, 1% Раствор 7 Этиловый спирт, 80%, 10 мМ Трис-HCl, pH 7,6 Раствор 8 0,2 мМ ЭДТА, 5 мМ Трис-HCl, 0,02% Твин-20

Таблица 2 - Состав реакционных смесей на выполнение одной реакции обратной транскрипции микроРНК cel-miR-39, 3 - miR-155, miR15a и мРНК ABL1, ROR1 Выявляемые РНК miR-155 miR-15a cel-miR-39 ROR1 ABL1 Название реакционной смеси МикроРНК-ОТ мРНК-ОТ Вода 4,5 мкл 7 мкл Буфер для обратной транскрипции (5Х) 5 мкл 5 мкл дНТФ (25 мМ) 1 мкл 1 мкл Праймер miR155-SL (1,25 мкМ) 1,5 мкл - - - Праймер miR39-SL (1,25 мкМ) - - 1,5 мкл - Праймер miR15a-SL (1,25 мкМ) - 1,5 мкл - - Праймер Random - - - 1 мкл

Таблица 3 - Состав реакционных смесей на выполнение одной реакции амплификации и детекции cel-miR-39, miR-155, miR-15a и ABL1, ROR1 в ПЦР-РВ Выявляемые РНК ABL,
ROR1 miR-155,
cel-miR-39 miR-15а Название реакционной смеси мРНК-РВ 155-39-РВ 15а-РВ Вода 9,7 мкл 9,7 мкл 9,7 мкл MgCl₂ (2,5 мМ) 2,0 мкл 2,0 мкл 2,0 мкл Буфер для ПЦР (10Х) 2,5 мкл 2,5 мкл 2,5 мкл дНТФ (2,5 мМ) 0,38 мкл 0,38 мкл 0,38 мкл Праймер ABL-R (0,1 мМ) 0,075 мкл - - Праймер ABL-F (0,1 мМ) 0,075 мкл - - TaqMan зонд ABL-P (0,1 мМ) 0,075 мкл - - Праймер miR155-R (0,1 мМ) - 0,075 мкл - Праймер miR155-F (0,1 мМ) - 0,075 мкл - TaqMan зонд miR155-P (0,1 мМ) - 0,075 мкл - Праймер ROR-R (0,1 мМ) 0,075 мкл - - Праймер ROR-F (0,1 мМ) 0,075 мкл - - TaqMan зонд ROR-P (0,1 мМ) 0,075 мкл - - Праймер miR39-R (0,1 мМ) - 0,075 мкл - Праймер miR39-F (0,1 мМ) - 0,075 мкл - TaqMan зонд miR39-P (0,1 мМ) - 0,075 мкл - Праймер miR15а-R (0,1 мМ) - - 0,075 мкл Праймер miR15а-F (0,1 мМ) - - 0,075 мкл Eva-Green, 50X - - 0,3 мкл

Набор позволяет определять матричные РНК и микроРНК в клетках крови из одного образца крови объемом до 1,2 мл. При этом используются широко распространенные в клинико-диагностических лабораториях приборы и оборудование для ПЦР, что обеспечивает доступность тестирования для населения. Использование данного набора приводит к сокращению рабочего времени на выполнение лабораторных тестов и экономии расходных материалов в сравнении с раздельным использованием диагностических наборов для выявления отдельных молекул РНК.

Новым является то, что в набор для определения мРНК и микроРНК дополнительно включены реагенты для выделения РНК и реагенты для обратной транскрипции в том числе со специфическими петлевыми праймерами, а мультиплексную ПЦР-РВ проводят одновременно для всех маркеров использую единый режим амплификации.

Пример использования набора при диагностике ХЛЛ.

Образцы крови получали из локтевой вены и стабилизируют раствором ЭДТА К2 в объемном отношении 9:1. В процессе исследования кровь сохраняли в закрытых пластиковых пробирках при комнатной температуре не более 3 часов, с соблюдением общепринятых мер предосторожности при работе с клетками крови. Для выделения лейкоцитов к 1 мл крови добавляли 3,5 мл гемолитика, инкубировали при комнатной температуре в течение 10 минут, затем центрифугировали при 1900g в течение 5 минут. Надосадочную жидкость удаляли и к осадку добавляли 400 мкл лизирующего раствора и тщательно перемешивали. Дальнейший анализ выполняли с клеточным осадком с использованием заявляемого набора реактивов в соответствии с технологическими этапами выполнения анализа подробно представлены в таблице 4.

Таблица 4 - Описание этапов определения уровня мРНК и микроРНК с помощью заявляемого набора реагентов Первый этап: Выделение РНК Добавление Раствора №1 1 мл Добавление Раствора №2 1 мл Добавление cel-miR-39 20 мкл Добавление раствора №3 260 мкл Инкубация 10 минут при +4°С , затем центрифугирование 10 минут при 12000g Перенос водной фазы 4/5 объема 1/5 объема Выделение мРНК из клеток Выделение микроРНК из клеток Добавление раствора №6 10 мкл 3 мкл Добавление раствора №5 400 мкл 0 Инкубация 20 минут при -20°С отсутствует Добавление раствора №4 0 900 мкл Перенос на колонку - 750 мкл Центрифугирование 12000g в течение 10 мин, надосадочную жидкость переносят в чистые пробирки 6000g в течение 30 сек Добавление раствора №7 800 мкл 500 мкл Центрифугирование 12000g в течение 10мин,
удаление надосадочной жидкости 6000g в течение 30 сек
Перенос колонки в пробирку Высушивание осадка 7 минут при 55°С отсутствует Добавление раствора №8 10 мкл 150 мкл Инкубация Все пробирки 3 мин при 55°С Центрифугирование отсутствует 6000g в течение 30 сек, затем при 12000g в течение 1 минуты Перенос надосадочной жидкости в пробирки для обратной транскрипции Третий этап: Выполнение реакции обратной транскрипции Добавление реакционной смеси 15 мкл 15 мкл Добавление ревертазы 1 мкл Добавление РНК 10 мкл Проведение реакции обратной транскрипции 37°С в течение 30 минут, 92°С в течение 5 минут. 30 минут при 16°С, затем при 42°С в течение 30 минут, 92°С в течение 5 минут. Четвертый этап: Проведение амплификации в режиме «реального времени» Добавление реакционной смеси 15 мкл 23,5 мкл Добавление полимеразы 0,5 мкл 0,5 мкл Добавление кДНК 10 мкл 1,5 мкл Режим амплификации:
95°С - 5 минут; 95°С - 15 секунд, 58°С - 60 секунд (цикл повторить 50 раз).

Полученные данные - кривые накопления флуоресцентного сигнала и определение пороговых циклов (Ct) рассчитывают с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР в режиме «реального времени» в соответствии с инструкцией к прибору.

Уровень экспрессии рибонуклеиновых кислот определяют по формуле:

где E - эффективность реакции ПЦР, CtN - значение порогового цикла гена «домашнего хозяйства», CtM - значение порогового цикла miR-155 или ROR1.

Коэффициент К вычисляют по формуле:

Уровень экспрессии miR-155 / Уровень экспрессии miR-15a (2).

Интерпретация результатов возможна при выполнении следующих условий:

1) Ct гена ABL для образца кДНК и образца ПКО находится в диапазоне от 17 до 28.

2) Ct гена ROR1 для образца ПКО находится в диапазоне от 17 до 31 цикла.

3) Ct микроРНК miR-39 для образца кДНК и образца ПКО находится в диапазоне от 17 до 29.

4) Ct микроРНК miR-155 для образца ПКО находится в диапазоне от 17 до 28 циклов.

5) Ct для всех мРНК и микроРНК для ОКО не должен определяться.

6) Выявление экспрессии мРНК гена ROR1 более 0,1 и/или увеличение коэффициента отношения К (miR-155/miR-15а) выше 0,05 свидетельствует о наличии у пациента хронического лимфопролиферативного заболевания

Результаты тестирования клинических образцов крови представлены в таблице 5.

Таблица 5 - Пример полученных результатов с использованием заявляемого набора реагентов при обследовании пациентов с ХЛЛ и группы контроля № мРНК в клетках крови, относительные единицы экспрессии микроРНК в клетках крови, относительные единицы экспрессии ROR1 miR-155 miR-15a К Контрольная группа пациентов, не имеющих онкогематологического заболевания 1 0,00 592,3 95750 0,006 2 0,00 1195,1 78186 0,003 3 0,00 1291,1 109389 0,004 4 0,00 1203,6 108757 0,004 5 0,00 789,8 144435 0,004 6 0,00 96,8 72517 0,002 7 0,00 731,2 96865 0,002 8 0,00 109,9 140314 0,004 9 0,00 514,7 89323 0,013 10 0,00 135,6 159375 0,008 11 0,00 54,4 168875 0,007 12 0,00 237,8 84298 0,009 13 0,00 128,2 112602 0,001 Пациенты с подтвержденным диагнозом ХЛЛ № мРНК в клетках крови, относительные единицы экспрессии микроРНК в клетках крови, относительные единицы экспрессии ROR1 miR-155 miR-15a К 1 0,00 1568 9641 0,163 2 0,10 9792 30522 0,321 3 1,12 1685 31042 0,054 4 0,22 18551 45477 0,408 5 0,00 9302 19759 0,471 6 622,29 4192 37381 0,112 7 2494,78 16095 33293 0,483 8 31,00 4105 45934 0,089 9 0,54 317 6561 0,048 10 63,78 328352 581469 0,565 11 20,87 6323 11889 0,532 12 338,34 6440 29103 0,221 13 4,7 1315 33496 0,039

Использование заявляемого набора позволило обнаружить характерный для ХЛЛ маркер мРНК гена ROR1, а также увеличение уровня микроРНК miR-155 и снижение уровня микроРНК miR-15а. Коэффициент «К» отношения уровня экспрессии микроРНК miR-155 и микроРНК miR-15а всех пациентов соответствует диагнозу ХЛЛ. Широкий диапазон вариации выявляемых РНК маркеров у пациентов с ХЛЛ не только позволяет выявить заболевание, но также представляет возможность оценить индивидуальные эпигенетические особенности опухолевых клеток и прогноз эффективности разных схем лечения.

Сопоставительный анализ заявляемого набора реактивов с прототипом позволил выявить совокупность существенных по отношению к техническому результату отличительных признаков, изложенных в формуле. Следовательно, изобретение соответствует критерию «новизна».

Из литературы и практики молекулярно-генетических исследований в клинической лабораторной диагностике неизвестно о способе ПЦР-анализа для одновременного выявления экспрессии мРНК и микроРНК, в том числе для выявления мРНК ROR1 и микроРНК miR-155 и miR-15a в клетках и плазме из одного образца крови при диагностике ХЛЛ, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого решения критерию «изобретательский уровень».

Сущность изобретения поясняется с помощью графических материалов:

На фиг. 1 представлена схема основных этапов проведения аналитической процедуры.

На фиг. 2 представлены кривые накопления флуоресцентного сигнала после проведения ПЦР-РВ для пробы здорового донора: 1 - ABL1, 2 - cel-miR-39, 3 - miR-155, 4 - ROR1, 5 - miR-15a.

На фиг. 3 представлены кривые накопления флуоресцентного сигнала после проведения ПЦР-РВ для пробы пациента с ХЛЛ: 1 - ABL1, 2 - cel-miR-39, 3 - miR-155, miR-15a, 4 - ROR1.

Отличие заявляемого набора реактивов от прототипа заключается в том, что

1. Набор предусматривает возможность количественного определения уровня экспрессии РНК за счет включения в состав набора реактивов для выделения РНК и реактивов для реакции обратной транскрипции мРНК и микроРНК.

2. Набор предусматривает одновременное проведение единого режима амплификации и детекции нескольких молекул мРНК и микроРНК.

3. Набор позволяет выполнять молекулярно-генетические исследования для диагностики ХЛЛ.

При проведении тестирвоания использовалось стандарное оборудование клинико-диагностических лабораторий для ПЦР анализа, время проведения анализа составило 3 часа 40 мин для определения всех изучаемых молекулРНК.

Таким образом, в приведенном примере подтвержден заявленный технический результат, что свидетельствует о диагностических возможностях заявленного набора реактивов для диагностики ХЛЛ.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Общество с ограниченной ответственностью «БиоМатрикс» (ООО

«БиоМатрикс»)

<120> Набор реагентов для определения рибонуклеиновых кислот

<160> 14

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

cgtctcgccttctttcca

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

cgaggaagaa gacggaagaat

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 3

ggtcaccggg tgtaaatc

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 4

gtctcgcctt cttttcaccc

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 5

cgaggaagaa gacggaagaat

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 6

gcggttaatg ctaatcgtgata

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 7

gtcgtatcca gtgcagggtcc

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 8

tgtccgccta gcagcacataa

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 9

gatgtagttg cttgggaccca

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 10

ABL-F: ggccagtgga gataacactc

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 11

ROR-F: agtcttgttt gtcaagtttggcc

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 12

ROR-R: catgcaatcc ctctgtatggc

<210> 13

<211> 28

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 13

ABL-P: ccatttttgg tttgggcttcacaccatt

<210> 14

<211> 29

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 14

ROR-P: cctcccactg caagtccagg atactcaga

<---

Изобретение относится к области медицины, а именно к клинической лабораторной диагностике лимфоцитарной лимфомы/хронического лимфоцитарного лейкоза (ХЛЛ) с использованием молекулярно-генетических методов одновременного определения уровня экспрессии рибонуклеиновых кислот разного класса: микроРНК и матричных РНК в мультиплексной полимеразной цепной реакции в режиме «реального времени». Изобретение представляет собой набор, содержащий реагенты для выделения РНК, реагенты для проведения обратной транскрипции, включающий специфические петлевые праймеры к микроРНК, реагенты для проведения ПЦР, включающие оптимально подобранные реакционные смеси для определения экспрессии мРНК генов ABL1 и мРНК ROR1, а также микроРНК miR-39, miR-155 и miR-15а, ДНК-полимеразу Thermus aquaticus, положительный контрольный образец, отрицательный контрольный образец, а также контрольный маркер оценки эффективности выделения микроРНК. Отличительной особенностью набора является использование оригинальных комбинаций специфичных праймеров и флуоресцентно-меченые ДНК-зондов в трех реакционных смесях, а также возможность одновременного определения мРНК и микроРНК. Первая смесь включает праймеры: ABL-F, ABL-R, ROR-F, ROR-R и TaqMan зонды: ABL-P, ROR-P с красителями. Вторая смесь содержит праймеры: miR155-F, miR155-R, miR39-R, miR39-F и TaqMan зонды: miR155-P, miR39-P с красителями. Третья смесь содержит праймеры: miR15а-F, miR15а-R. Изобретение позволяет проводить одновременное определение уровня мРНК и микроРНК в одной аналитической серии используя три пробирки с реакционными смесями. Техническим результатом, достигаемым заявляемым изобретением, является набор реактивов для мультиплексной полимеразной цепной реакции, который позволяет выполнять молекулярно-генетическую диагностику ХЛЛ с использованием стандартного оборудования клинико-диагностических лабораторий. Использование возможностей мультиплексного режима реакции приводит к экономии используемого объема биологического образца, расходных материалов и сокращает время выполнения анализа. 3 ил., 5 табл.

Набор реагентов для определения уровня экспрессии РНК в клетках крови, включающий: реагенты для проведения обратной транскрипции, реагенты для проведения ПЦР в режиме «реального времени», специфичные праймеры и флуоресцентно-меченые ДНК-зонды, красители, используемые в качестве источника флуоресценции в TaqMan зондах на 5’ конце: флуоресцеин (FAM) и хлорированный флуоресцеин (HEX), и Black Hole Quencher-1 (BHQ1) на 3’ конце для тушения флуоресценции, отличающийся тем, что включает:

1) реагенты для фенол-хлороформного выделения мРНК и микроРНК;

2) реагенты для проведения обратной транскрипции, в качестве которых используют специфические петлевые праймеры микроРНК: miR155-L с нуклеотидной последовательностью SEQ ID 15, miR39-L с нуклеотидной последовательностью SEQ ID 16, miR15a-L с нуклеотидной последовательностью SEQ ID 17;

3) три оптимизированные по составу реакционные смеси для проведения мультиплексной ПЦР в режиме «реального времени», при этом:

- первая смесь включает праймеры: SEQ ID 9 - SEQ ID 12 и TaqMan зонды: SEQ ID 13 - SEQ ID 14;

- вторая смесь содержит праймеры: SEQ ID 2 - SEQ ID 3, SEQ ID 5 - SEQ ID 6 и TaqMan зонды: SEQ ID 1, SEQ ID 4;

- третья смесь содержит праймеры: miR15a-F с нуклеотидной последовательностью SEQ ID 8, miR15a-R с нуклеотидной последовательностью SEQ ID 7.