Набор реагентов для определения малых рибонуклеиновых кислот (микроРНК) при диагностике множественной миеломы Российский патент 2025 года по МПК C12Q1/68 C12Q1/6876 

Изобретение относится к области медицины, в частности к клинической лабораторной диагностике, и предназначено для одновременного количественного определения микроРНК hsa-miR-16-5p и hsa-miR-21-5p в плазме венозной крови при диагностике множественной миеломы (ММ) с использованием молекулярно-генетических методов одновременного определения уровня экспрессии микроРНК в мультиплексной полимеразной цепной реакции в режиме «реального времени». Набор реагентов позволяет определить количество молекул микроРНК hsa-miR-16-5p и hsa-miR-21-5p в плазме крови. Соотношение их концентрации более 0,20 характерно для пациентов с множественной миеломой, в том числе с несекретирующим вариантом заболевания.

Согласно клиническим рекомендациям [Клинические рекомендации. Множественная миелома. Под ред. Поддубной И. В., Савченко В. Г., Каприна А. Д. – 2020.], основным лабораторным критерием множественной миеломы является обнаружение высокого уровня моноклонального иммуноглобулина, а также морфологическое и иммуногистохимическое исследование биоптата костного мозга и/или образцов вне костномозгового опухолевого субстрата. В случае отсутствия секреции опухолевыми клетками моноклональных иммуноглобулинов («несекретирующая» ММ), лабораторное подтверждение диагноза проводится путем исследования опухолевых клеток в биоптатах. Пациентам, с целью диагностики высокого риска тяжелого течения ММ, также рекомендуется проведение генетических тестов, таких как кариотипирование и флуоресцентная гибридизация in situ (FISH-метод), выявляющих нарушения количества и структуры хромосом, в том числе транслокации t(4;14), t(14;16), t(6;14), del17p13, t(11;14), del13. Однако, для выполнения данных анализов, необходимо получить достаточное количество опухолевых клеток с использованием инвазивных манипуляций и, кроме этого, результаты исследования не позволяют проводить количественную оценку.

Среди молекулярно-генетических маркеров, концентрация которых меняется в образцах костного мозга при ММ ранее описаны молекулы микроРНК hsa-miR-16-5p [Li F. et al. MicroRNA-15a/16-1 cluster located at chromosome 13q14 is down-regulated but displays different expression pattern and prognostic significance in multiple myeloma. Oncotarget. 2015. 6(35): 38270] и микроРНК hsa-miR-21-5p [Wang X. et al. Myeloma cell adhesion to bone marrow stromal cells confers drug resistance by microRNA-21 up-regulation. Leukemia & lymphoma. 2011. 52(10): 1991-1998].

Технологии секвенирования нуклеиновых кислот потенциально могут обнаружить несколько тысяч различных молекул РНК [Precazzini F, Detassis S, Imperatori AS, Denti MA, Campomenosi P. Measurements Methods for the Development of MicroRNA-Based Tests for Cancer Diagnosis. International Journal of Molecular Sciences. 2021. 22(3): 1176]. Альтернативная технология микрочипов также представляет собой высокопроизводительный метод, используемый для одновременного обнаружения широкого спектра РНК. Вместе с тем, классическое секвенирование по Сэнгеру, пиросеквенирование и микрочипы не обладают достаточной чувствительностью для количественного определения отдельных молекул РНК в тканях и биологических жидкостях человека. Для количественного высокочувствительного определения мРНК и микроРНК используются методы цифровой ПЦР, основанной на последовательном разведении образца во множестве отдельных капель, в которых проводятся реакции амплификации. Максимальное разведение образца, в котором еще детектируется, результат реакции отражает количество исходных молекул нуклеиновых кислот. Кроме того, для анализа РНК можно использовать высокочувствительное секвенирование «нового поколения» [Agnelli L. et al. Expanding the repertoire of miRNAs and miRNA-offset RNAs expressed in multiple myeloma by small RNA deep sequencing. Blood Cancer Journal. 2019. 9(3): 21].

К недостаткам всех вышеуказанных методов относятся отсутствие стандартизации, дорогостоящие оборудование и реактивы, технологическая сложность, трудоемкость и длительность выполнения тестирования, высокие требования к квалификации персонала, что повышает стоимость тестирования и ограничивает широкое использование данных методов в реальной практике клинико-диагностических лабораторий.

Альтернативным и широкодоступным вариантом количественного определения уровня отдельных молекул нуклеиновых кислот является полимеразная цепная реакция с детекцией результатов в режиме «реального времени» (ПЦР-РВ). Преимуществом ПЦР-РВ, наряду с высокой чувствительностью и специфичностью, является возможность использования широко распространенного стандартного оборудования для выполнения анализа в клинико-диагностических лабораториях медицинских организаций, что позволяет обеспечить большую доступность диагностики для населения.

Из практики лабораторных исследований также известно, что проведение ПЦР в мультиплексном варианте определения разных маркеров в одной аналитической постановке имеет ряд преимуществ перед ПЦР в отдельных аналитических сериях для каждого отдельного маркера, а именно: снижение риска контаминации образцов, уменьшение расхода реактивов, сокращение времени проведения анализа и постановки диагноза. Кроме того, стандартизованное одновременное определение отдельных маркеров позволяет оценивать дополнительные диагностические критерии, основанные на соотношении их концентраций более точно, чем при отдельном анализе маркеров в разных тест системах.

Учитывая способность клеток к высвобождению в плазму крови молекул микроРНК, а также их относительно высокую стабильность, описаны диагностические тесты, основанные на измерении уровня микроРНК в плазме венозной крови.

На сегодняшний день известны изобретения, основанные на анализе ряда микроРНК методом количественной ПЦР в реальном времени в плазме периферической крови человека, предназначенные для диагностики серозных пограничных цистаденом и цистаденокарценом яичника [Патент № 2688169 Российская федерация, МПК G 01 N 33/574, C 12Q 1/68. Количественная оценка hsa-miR-16-5p, hsa-miR-425-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-101-3p, hsa-miR-30d-5p и hsa-miR-93-5p в плазме периферической крови женщин как способ неинвазивной диагностики серозных пограничных цистаденом и цистаденокарценом яичника : № 2018129534 : заявл. 14.08.2018 : опубл. 08.07.2019 / Тимофеева А.В., Чаговец В.В., Асатурова А.В. и др. – 25 с.] и выявления ранних стадий колоректального рака [Патент № 2611189 Российская Федерация, МПК C 12 Q 1/68. Определение микроРНК в плазме для обнаружения ранних стадий колоректального рака: № 2014120427 : заявл. 20.10.2012 : опубл. 21.02.2017 / Хиронелья И Кос Меритксель, Лосано Сальвателья Хуан Хосе, Кастельс И Гарангоу Антони и др. – 49 с.], однако данные изобретения не направлены на диагностику онкогематологических заболеваний, а также не включают возможность проведения анализа в мультиплексном режиме. Также известно о изобретении, предназначенном для выбора терапии для субъекта, имеющего B-клеточную неоплазию, при этом способ включает выявление с помощью количественной ПЦР или микроматричного анализа микроРНК сниженной экспрессии miR-629 [Патент № 2016138431 Российская Федерация, МПК C 12 Q 1/68. Композиции и способы для идентификации B-клеточных неоплазий, реагирующих на терапию посредством истощения популяции B-клеток : № 2016138431 : заявл. 04.03.2015 : опубл. 05.04.2018 / Кудзиора Майкл, Яо Ихун, Ранад Коустубх, Брохаун Филип З., Стрейчер Кати – 3 с.], однако данный способ предусматривает анализ лишь одной микроРНК для конкретной цели отбора пациентов, подходящих для терапии препаратами антител к CD19.

До сих пор не известно об использовании мультиплексных технологий ПЦР-РВ для одновременного количественного определения микроРНК hsa-miR-16-5p и hsa-miR-21-5p в плазме венозной крови при диагностике ММ.

Наиболее близким к заявляемому изобретению по совокупности признаков является набор реагентов для определения рибонуклеиновых кислот при диагностике лимфопролиферативных заболеваний для одновременного определения экспрессии мРНК генов ABL1 и мРНК ROR1, а также микроРНК miR-39, miR-155 и miR-15а для диагностики хронического лимфоцитарного лейкоза (ХЛЛ) [Патент № 2802064 Российская Федерация, МПК C 12 Q 1/68. Набор реагентов для определения рибонуклеиновых кислот при диагностике лимфопролиферативных заболеваний : № 2023100712 : заявл. 16.01.2023 : опубл. 22.08.2023 / Ольховский И.А., Горбенко А.С., Столяр М.А., Бахтина В.И. – 15 с. (прототип)].

Описанный вариант набора предусматривает выполнение полимеразной цепной реакции в реальном времени с использованием специфических праймеров для определения miR-15a и miR-155, при этом miR-155 детектируется одновременно с miR-39 в мультиплексной режиме посредством использования одной реакционной смеси. В качестве источника флуоресценции при регистрации уровня miR-155 и miR-39 используется TaqMan зонды на 5' конце применяют краситель флуоресцеин (FAM) и гексахлорфлуоресцеин (HEX), а для тушения флуоресценции используют Black Hole Quencher-1 (BHQ1) на 3' конце. Для регистрации уровня miR-15a используется оценка флуоресценции интеркалирующий красителя Eva Green.

Предметом настоящего изобретения является набор реактивов для мультиплексной ПЦР-РВ с целью одновременного обнаружения микроРНК hsa-miR-16-5p, hsa-miR-21-5p и cel-miR-39-3p в образцах плазмы венозной крови, что ранее не применялось в практике клинической лабораторной диагностики ММ.

Отличие заявляемого изобретения от прототипа заключается в том, что прототип не направлен на диагностику ММ, он не предусматривает возможность выявления микроРНК miR-16 и miR-21, а также в том, что в заявляемом изобретении в качестве флуорофоров для всех измеряемых микроРНК используются исключительно TaqMan зонды, имеющие большую специфичность за счет связывания с целевой последовательностью нуклеиновых кислот, чем описанные в прототипе интеркалирующие красители, которые связываются с любой двухцепочечной ДНК в ходе реакции ПЦР. Среди используемых реактивов в наборе прототипа нет стандартных образцов микроРНК с известным количественным уровнем (копий в мл), что исключает возможность построения калибровочных графиков для выполнения дальнейших количественных расчетов.

Технический результат заключается в возможности осуществлять все этапы выполнения анализа в одной аналитической серии.

Технический результат достигается тем, что в набор для диагностики множественной миеломы, включены все необходимые реактивы для выделения микроРНК, выполнения обратной транскрипции и мультиплексной амплификации. При этом для проведения реакции обратной транскрипции микроРНК (5'-3'-): используются следующие петлевые праймеры:

miR39-SL: GAAAGAAGGCGAGGAGCAGATCGAGGAAGAAGACGGAAGAATGTGCGTCTCGCCTTCTTTCCAAGCTGA (SEQ ID №10);

miR16-SL:

GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGCCAA (SEQ ID №11);

miR21-SL: CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTCAACAT (SEQ ID №12).

а для амплификации используются оригинальные комбинации специфических праймеров и зондов:

miR39-P: HEX-CGTCTCGCCTTCTTTCCA-BHQ1 (SEQ ID №1);

miR39-R: CGAGGAAGAAGACGGAAGAAT (SEQ ID №2);

miR39-F: GGTCACCGGGTGTAAATC (SEQ ID №3);

miR16-P: FAM-ACTGGATACGACCGCCAATA-BHQ1 (SEQ ID №4);

miR16-R: GTCGTATCCAGTGCAGGGT (SEQ ID №5);

miR16-F: AACAGTGTAGCAGCACGTAAA (SEQ ID №6);

miR21-P: FAM-GGCAATTCAGTTGAGTCAACA-BHQ1 (SEQ ID №7);

miR21-R: CTCAACTGGTGTCGTGGAGTC (SEQ ID №8);

miR21-F: TGTCCGCCTAGCTTATCAGAC (SEQ ID №9).

Заявленный вариант комплектации набора реагентов, рассчитанный на 50 реакций, включает флаконы и пробирки, содержание:

1. Реагенты для выделения РНК фенол-хлороформным методом (таблица 1):

а. Раствор 1 – 20 мл;

б. Раствор 2 – 40 мл;

в. Раствор 3 – 14 мл;

г. Раствор 4 – 45 мл;

д. Раствор 5 – 20 мл

е. раствор 6 – 1 мл;

ж. Раствор 7 – 50 мл;

з. Раствор 8 – 40 мл;

и. Раствор 9 – 8 мл;

2. две реакционные смеси для выполнения специфической обратной транскрипции микроРНК – «МикроРНК-39-21-ОТ» и «МикроРНК-16-ОТ» (таблица 2);

3. Ревертазу для проведения обратной транскрипции (5 ед/мкл) – 50 мкл;

4. реакционную смесь для определения экспрессии микроРНК cel-miR-39-3p и hsa-miR-21-5p (39-21-РВ) методом ПЦР-РВ - 1200 мкл (таблица 3);

5. реакционную смесь для определения экспрессии микроРНК hsa-miR-16-5p (16-РВ) методом ПЦР-РВ - 1200 мкл, (таблица 3);

6. ДНК-полимеразу Thermus aquaticus 5 ед/мкл (Taq-полимераза) - 100 мкл;

7. положительные контрольные образцы (ПКО) (стандартная кДНК hsa-miR-16-5p (4,8*10⁸ копий/мкл), hsa-miR-21-5p и cel-miR-39-3p (4,8*10⁹ копий/мкл)). Объем каждого ПКО – 500 мкл;

8. калибраторы (5 шт на каждую микроРНК: стандартные растворы кДНК hsa-miR-16-5p (4,8*10⁹ копий/мкл, 4,8*10⁸ копий/мкл, 4,8*10⁷ копий/мкл, 4,8*10⁶ копий/мкл, 4,8*10⁵ копий/мкл), hsa-miR-21-5p и cel-miR-39-3p (1,75*10⁹ копий/мкл, 1,75*10⁸ копий/мкл, 1,75*10⁷ копий/мкл, 1,75*10⁶ копий/мкл, 1,75*10⁵ копий/мкл)) для построения калибровочных графиков. Объем каждого калибратора – 25 мкл;

9. стандартный раствор микроРНК cel-miR-39-3p с концентрацией 10⁹ копий/мкл;

10. отрицательный контрольный образец (ОКО, не содержит нуклеиновых кислот) – 500 мкл;

11. Колонки и собирательные пробирки для выделения РНК – 50 шт.

Положительные контрольные образцы (ПКО) представляют из себя кДНК микроРНК hsa-miR-16-5p и hsa-miR-21-5p. Отрицательный контрольный образец (ОКО) представляет собой деионизированную воду.

Таблица 1. Состав реактивов для выделения микроРНК и мРНК из образца крови

Наименование Состав Раствор 1 5М гуанидин тиоционат, 10 мМ Трис-HCl, pH 7,6, 10 мМ ЭДТА, 0,5% лаурилсаркозинат натрия Раствор 2 Фенол, рН 4,5 Раствор 3 Хлороформ Раствор 4 Этиловый спирт, 96% Раствор 5 Изопропиловый спирт, 100% Раствор 6 Гликоген, 1% Раствор 7 Этиловый спирт, 80%, 10 мМ Трис-HCl, pH 7,6 Раствор 8 0,2 мМ ЭДТА, 5 мМ Трис-HCl, 0,02% Твин-20

Таблица 2. Состав реакционных смесей на выполнение одной реакции обратной транскрипции микроРНК cel-miR-39, hsa-miR-16 и hsa-miR-21

Выявляемые РНК cel-miR-39 miR-21 miR-16 Название реакционной смеси МикроРНК-39-21-ОТ МикроРНК-16-ОТ Вода 5 мкл 6,5 мкл Буфер для обратной транскрипции (5Х) 5 мкл 5 мкл дНТФ (25 мМ) 1 мкл 1 мкл Праймер miR39-SL (1,25 мкМ) 1,5 мкл - - Праймер miR21-SL (1,25 мкМ) - 1,5 мкл - Праймер miR16-SL (1,25 мкМ) - - 1,5 мкл

Таблица 3. Состав реакционных смесей на выполнение одной реакции амплификации и детекции cel-miR-39, miR-21 и miR-16 в ПЦР-РВ

Выявляемые РНК cel-miR-39,
miR-21 miR-16 Название реакционной смеси 39-21-РВ 16-РВ Вода 17,2 мкл 17,8 мкл MgCl₂ (2,5 мМ) 2,0 мкл 2,0 мкл Буфер для ПЦР (10Х) 2,5 мкл 2,5 мкл дНТФ (2,5 мМ) 0,5 мкл 0,5 мкл Праймер miR21-R (0,1 мМ) 0,2 мкл - Праймер miR21-F (0,1 мМ) 0,2 мкл - TaqMan зонд miR21-P (0,1 мМ) 0,16 мкл - Праймер miR39-R (0,1 мМ) 0,2 мкл - Праймер miR39-F (0,1 мМ) 0,2 мкл - TaqMan зонд miR39-P (0,1 мМ) 0,16 мкл - Праймер miR16-R (0,1 мМ) - 0,2 мкл Праймер miR16-F (0,1 мМ) - 0,2 мкл TaqMan зонд miR16-P (0,1 мМ) - 0,16 мкл

Таблица 4. Нуклеотидные последовательности стандартных микроРНК

miRBase ID Нуклеотидная последовательность cel-miR-39-3p 5'- UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG -3' hsa-miR-16-5p 5`- UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG -3` hsa-miR-21-5p 5`- UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA -3`

Набор позволяет определять микроРНК из одного образца крови объемом от 1,2 мл. При этом используются широко распространенные в клинико-диагностических лабораториях приборы и оборудование для ПЦР, что обеспечивает доступность тестирования для населения. Использование данного набора приводит к сокращению рабочего времени на выполнение лабораторных тестов и экономии расходных материалов в сравнении с раздельным использованием диагностических наборов для выявления отдельных молекул РНК.

Новым является то, что в набор для определения микроРНК дополнительно включены оригинальные реагенты для выделения микроРНК и реагенты для обратной транскрипции со специфическими петлевыми праймерами, а мультиплексную ПЦР-РВ проводят одновременно для двух маркеров, используя во всех реакционных смесях в качестве флуорофора TaqMan зонды.

Пример использования набора для выполнения анализа и оценки диагностического значения микроРНК miR-16 и miR-21 при множественной миеломе.

Образцы крови получали из локтевой вены и стабилизируют раствором ЭДТА К2 в объемном отношении 9:1. В процессе исследования кровь сохраняли в закрытых пластиковых пробирках при комнатной температуре не более 3 часов, с соблюдением общепринятых мер предосторожности при работе с венозной кровью и её компонентами. Для получения плазмы пробирку с венозной кровью центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 минут. Из надосадочной жидкости, которая представляет собой плазму крови, отбирали 200 мкл в чистую пробирку. Дальнейший анализ выполняли с полученной плазмой с использованием заявляемого набора реактивов в соответствии с технологическими этапами выполнения анализа, подробно представленных в таблице 5. В процессе выделения производится добавление внутреннего контроля (микроРНК cel-miR-39-3p) в исследуемую пробу для дополнительного контроля эффективности всех этапов анализа.

Таблица 5. Описание этапов определения уровня микроРНК с помощью заявляемого набора реагентов

Первый этап: Выделение микроРНК Добавление Раствора №1 500 мкл Добавление Раствора №2 400 мкл Добавление cel-miR-39-3p 10 мкл Добавление раствора №3 130 мкл Инкубация 10 минут при +4°С , затем центрифугирование 10 минут при 12000g Перенос водной фазы 1/5 объема Добавление раствора №6 3 мкл Добавление раствора №4 900 мкл Перенос на колонку 750 мкл
Удаление фильтрата Центрифугирование 6000g в течение 30 сек Добавление раствора №7 500 мкл Центрифугирование 6000g в течение 30 сек
Удаление фильтрата Добавление раствора №7 500 мкл Центрифугирование 6000g в течение 30 сек
Удаление фильтрата Высушивание колонки путём центрифугирования 12000g в течение 1 мин
Перенос колонки на пробирку Добавление раствора №8 Нагрев раствора в термостате до 65°С
150 мкл Центрифугирование 6000g в течение 30 сек, затем при 12000g в течение 1 минуты Перенос жидкости в пробирки для обратной транскрипции Третий этап: Выполнение реакции обратной транскрипции Добавление реакционной смеси 14 мкл Добавление ревертазы 1 мкл Добавление РНК 10 мкл Проведение реакции обратной транскрипции 30 минут при 16°С, затем при 42°С в течение 30 минут, 92°С в течение 5 минут. Четвертый этап: Проведение амплификации в режиме «реального времени» Добавление реакционной смеси 23,3 мкл Добавление полимеразы 0,2 мкл Добавление кДНК 1,5 мкл Режим амплификации:
95°С - 5 минут; 95°С - 15 секунд, 58°С - 60 секунд (цикл повторить 50 раз).

Полученные данные – кривые накопления флуоресцентного сигнала и определение пороговых циклов (Ct) рассчитывают с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР в режиме «реального времени» в соответствии с инструкцией к прибору.

Уровень экспрессии рибонуклеиновых кислот определяют в соответствии с калибровочными графиками для hsa-miR-16-5p, hsa-miR-21-5p и cel-miR-39-3p.

Коэффициент miR-21/miR-16 вычисляют по формуле:

Интерпретация результатов возможна при выполнении следующих условий:

1) Ct микроРНК miR-39 для образца кДНК находится в диапазоне от 17 до 23 циклов.

2) Ct микроРНК miR-16 для образца ПКО находится в диапазоне от 16 до 19 циклов.

3) Ct микроРНК miR-21 для образца ПКО находится в диапазоне от 19 до 22 циклов.

4) Ct для всех микроРНК для ОКО не должен определяться.

Результаты тестирования клинических образцов крови представлены в таблице 6.

Таблица 6. Пример полученных результатов с использованием заявляемого набора реагентов при обследовании пациентов с ММ и группы контроля

№ микроРНК в плазме крови, количество копий в пробе miR-16 miR-21 Коэффициент
miR-21/miR-16 Пациенты с подтвержденным диагнозом ММ 1 450 788 297 032 0,66 2 647 487 201 865 0,31 3 642 906 137 971 0,21 4 399 534 305 589 0,76 5 102 945 115 040 1,12 6 463 154 1 070 757 2,31 7 1 677 453 6 299 232 3,76 8 1 729 781 7 087 733 4,10 9 700 800 1 015 439 1,45 10 1 649 319 4 141 618 2,51 11 714 120 2 042 317 2,86 12 1 390 885 4 347 654 3,13 13 1 951 286 13 262 131 6,80 Медиана 700 800 1 070 757 2,31 Первый квартиль (Q25) 463 154 297 032 0,76 Третий квартиль (Q75) 1 649 319 4 347 654 3,13 № микроРНК в плазме крови, количество копий в пробе miR-16 miR-21 Коэффициент
miR-21/miR-16 Доноры крови 1 1 403 884 280 631 0,20 2 1 664 697 193 997 0,12 3 1 988 027 211 250 0,11 4 2 640 961 68 607 0,03 5 1 354 921 41 149 0,03 6 2 104 216 72 617 0,03 7 1 712 652 71 390 0,04 8 3 087 442 217 335 0,07 9 2 736 399 5 832 0,002 10 1 988 027 72 617 0,04 11 1 664 697 68 607 0,03 12 2 640 961 211 250 0,11 13 1 403 884 280 631 0,20 Медиана 1 664 697 193 997 0,12 Первый квартиль (Q25) 1 988 027 211 250 0,11 Третий квартиль (Q75) 2 640 961 68 607 0,03 P-value 0,0019 0,00077 0,000004

Использование заявляемого набора позволило обнаружить увеличение уровня микроРНК miR-16 и снижение уровня микроРНК miR-21 в плазме образцов венозной крови пациентов с ММ. Коэффициент «К» отношения уровня экспрессии микроРНК miR-21 и микроРНК miR-16 у всех пациентов с диагнозом ММ значительно выше максимальной величины у доноров (0,20). Широкий диапазон вариации выявляемых РНК маркеров у пациентов с ММ не только позволяет выявить заболевание, но также представляет возможность оценить индивидуальные эпигенетические особенности опухолевых клеток и прогноз эффективности разных схем лечения.

Интерпретация результатов: при значениях коэффициента miR-21/miR-16 больше 0,20 с достоверностью 95% пациент относится к группе пациентов с ММ.

Пример использования набора при несекретирующей ММ

Пациентка ЛНА, 1952 г рождения. Клиническая манифестация заболевания с января 2023 г. - после осевой нагрузки на позвоночнике появились боли постоянные боли в спине. Лечилась самостоятельно без эффекта. Двигательная активность прогрессивно ухудшалось, вплоть до невозможности самостоятельно встать с кровати к июлю 2023 г. С 22.06 по 29.06.23 г. находилась на лечении в КМКБ №7 по поводу дорсопатии. 17.07.23 г обратилась в поликлинику по м/ж: лабораторно отрицательная динамика в виде нарастания уровня креатинина с 369 до 639, мочевины с 15.9 до 25.9 ммоль/л. Выписано направление на госпитализацию в нефрологическое отделение БСМП. С 20.07 по 03.08.23 г. пациентка находилась на госпитализации в отделении нефрологии КГБУЗ БСМП, где возникло подозрение на гематологическое заболевание. При поступлении в гематологическое отделение Красноярской краевой больницу клинический анализ крови - лейкоциты 23.8 тыс (с/я 6.2, лимфоциты 14.3, моноциты 1.7 тыс), эритроциты 2.72 млн, гемоглобин 89 г/л, тромбоциты 151 тыс. СОЭ 54 мм/час; - биохимический анализ крови - общий белок 61.6 г/л, мочевая к-та 630 мкмоль/л; - суточная потеря белка 0.56 г/сут. При электрофорезе патологические градиенты иммуноглобулинов сыворотки крови не обнаружены. 03.08.23 г. был выполнен анализ крови на определение микроРНК miR-16 и микроРНК miR-21 с использованием заявляемого набора реагентов. В результате получено значение коэффициента miR-21/miR-16 более 0,20, что соответствует уровню, характерному для множественной миеломы. Была выполнена стернальная пункция, где обнаружено 33% плазматических клеток. На основании этого результата был верифицирован диагноз симптоматической ММ. Инициирован 1 курс VCD. Проведена повторная стернальная пункция 14.09.2023, в результате молекулярно-цитологического исследования: в 5-7% клеток выявлена транслокация t(11;14) (q13 q23) с делецией 11q13 обнаружены делеция 13q14-q34, 16q23 (MAF), трипликации 1q21, делеция гена T353 и MYC.

Окончательный диагноз: Симптоматическая множественная миелома, не секретирующая моноклональный парапротеин, с распространенным остеодеструктивным процессом, IIIB стадия по Durie, S.Salmon) III ст. по ISS, III ст. по R-ISS, с транслокацией t(11;14) (q13 q23) с делецией 11q13 обнаружены делеция 13q14-q34, 16q23 (MAF), трипликации 1q21, делеция гена TP53 и MYC, впервые выявленная от 03.08.2023 г.

Таким образом, использование заявляемого набора реактивов способствовало своевременной постановке диагноза несекретирующая множественная миелома.

Сопоставительный анализ заявляемого набора реактивов с прототипом позволил выявить совокупность существенных по отношению к техническому результату отличительных признаков, изложенных в формуле. Следовательно, изобретение соответствует критерию «новизна».

Из литературы и практики молекулярно-генетических исследований в клинической лабораторной диагностике неизвестно о способе ПЦР-анализа для одновременного выявления экспрессии микроРНК hsa-miR-16-5p и hsa-miR-21-5p в плазме из одного образца крови при диагностике ММ, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого решения критерию «изобретательский уровень». Преимуществом использования набора также является возможность выявления не секретирующих вариантов ММ, когда в периферической крови не удается выявить характерные моноклональные иммуноглобулины.

Отличие заявляемого набора реактивов от прототипа заключается в том, что:

1. Набор предусматривает возможность одновременной детекции микроРНК miR-39, miR-16 и miR-21 методом ПЦР в реальном времени.

2. Набор содержит во всех реакционных смесях в качестве флуорофора TaqMan зонды.

3. Набор содержит стандартные микроРНК в нескольких разведениях, предназначенные для построения калибровочных графиков для выполнения дальнейших расчетов.

4. Набор позволяет выполнять молекулярно-генетические исследования для диагностики ММ, в том числе и не секретирующем варианте заболевания.

При проведении тестирования использовалось стандарное оборудование клинико-диагностических лабораторий для ПЦР анализа, время проведения анализа составило 3 часа 40 мин для определения всех изучаемых молекул микроРНК.

Таким образом, в приведенном примере подтвержден заявленный технический результат, что свидетельствует о диагностических возможностях заявленного набора реактивов для диагностики множественной миеломы.

--->

<?xml version="1.0" encoding="ISO-8859-1"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing SYSTEM "ST26SequenceListing_V1_3.dtd" PUBLIC

"-//WIPO//DTD Sequence Listing 1.3//EN">

<ST26SequenceListing productionDate="2024-05-10" softwareVersion="2.3.0"

softwareName="WIPO Sequence" fileName="sequence.xml" dtdVersion="V1_3"

nonEnglishFreeTextLanguageCode="ru" originalFreeTextLanguageCode="ru">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode/>

<ApplicationNumberText/>

<FilingDate>2024-05-10</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>sequence</ApplicantFileReference>

<ApplicantName languageCode="ru">Тимерман Анна Дмитриевна</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Timerman Anna Dmitrievna</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Набор реагентов для определения

малых рибонуклеиновых кислот (микроРНК) при диагностике

множественной миеломы</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>12</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>18</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q23">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>modified_base</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mod_base</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>OTHER</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q30">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>hex</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>hex</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>modified_base</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>18</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mod_base</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>OTHER</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q31">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>bhq1</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>bhq1</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cgtctcgccttctttcca</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q32">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cgaggaagaagacggaagaat</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>18</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q33">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ggtcaccgggtgtaaatc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q34">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>modified_base</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mod_base</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>OTHER</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q35">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>fam</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>fam</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>modified_base</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mod_base</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>OTHER</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q36">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>bhq1</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>bhq1</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>actggatacgaccgccaata</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="5">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q37">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gtcgtatccagtgcagggt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="6">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q38">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>aacagtgtagcagcacgtaaa</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="7">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q39">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>modified_base</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mod_base</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>OTHER</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q40">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>fam</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>fam</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>modified_base</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>21</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mod_base</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>OTHER</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q41">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>bhq1</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>bhq1</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ggcaattcagttgagtcaaca</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="8">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q42">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ctcaactggtgtcgtggagtc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="9">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q43">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tgtccgcctagcttatcagac</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="10">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>69</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..69</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q49">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>stem_loop</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..61</INSDFeature_location>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gaaagaaggcgaggagcagatcgaggaagaagacggaagaatgtgcgtctcgccttctttccaagctga</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="11">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>50</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..50</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q50">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>stem_loop</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..44</INSDFeature_location>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgaccgccaa</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="12">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>43</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..43</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q51">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>stem_loop</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..36</INSDFeature_location>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ctcaactggtgtcgtggagtcggcaattcagttgagtcaacat</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области молекулярной биологии. Описан способ для одновременного количественного определения не менее двух микроРНК в плазме венозной крови. Способ включает выделение РНК, проведение обратной транскрипции с праймерами и последующим проведением полимеразной цепной реакции в режиме «реального времени» с использованием подобранных праймеров и флуоресцентно-меченых TaqMan зондов, а также мультиплексного режима детекции одной из микроРНК вместе с miR-39, взятой в качестве маркера эффективности выделения РНК. Технический результат заключается в возможности осуществлять все этапы выполнения анализа в одной аналитической серии. 6 табл., 2 пр.

Способ для одновременного количественного определения не менее двух микроРНК в плазме венозной крови, включающий выделение РНК, проведение обратной транскрипции с праймерами SEQ ID NO: 10-12 и последующим проведением полимеразной цепной реакции в режиме «реального времени» с использованием праймеров и флуоресцентно- меченых TaqMan зондов SEQ ID NO: 1-9, а также мультиплексного режима детекции одной из микроРНК вместе с miR-39, взятой в качестве маркера эффективности выделения РНК, отличающийся тем, что в качестве диагностически значимых молекул в плазме венозной крови определяется концентрация микроРНК hsa-miR-16-5p и hsa-miR-21-5p, для выполнения обратной транскрипции используют петлевые праймеры SEQ ID NO: 10-12, при проведении полимеразной цепной реакции во всех реакционных смесях в качестве флуоресцентно-меченых зондов используют TaqMan зонды SEQ ID NO: 1,4,7, мультиплексный режим применяют для детекции микроРНК hsa-miR-21-5p и cel-miR-39-3p, используемой в качестве контроля процедуры выделения РНК, количество копий микроРНК, присутствующих в образцах плазмы венозной крови рассчитывают по калибровочным графикам, далее рассчитывают коэффициент соотношения уровня hsa-miR-21-5p к уровню hsa-miR-16-5p и при его значении более 0,20 приходят к заключению о лабораторном подтверждении диагноза множественной миеломы, в том числе с несекретирующим вариантом.