ПРОТИВОТУБЕРКУЛЕЗНЫЕ АГЕНТЫ, ПРЕДСТАВЛЯЮЩИЕ СОБОЙ 3,7-ДИЗАМЕЩЕННЫЕ [1,2,4]ТРИАЗОЛО[1,5-b][1,2,4,5]ТЕТРАЗИНЫ Российский патент 2023 года по МПК C07D487/04 A61K31/4196 A61P31/06 

Изобретение относится к фармацевтической химии и касается новых 3,7-дизамещенных производных [1,2,4]триазоло[1,5-b][1,2,4,5]тетразина, содержащих в 3 положении азолотетразиновой системы 3,5-(диметипиразол-1-ил)-, или метокси, или этокси, или изопропокси заместители, а также солевую форму гидроксигруппы (NaO-), а в положении 7 - метил, или пиразол-1-ил, или -пиридил, или [1,2,4]триазол-1-ил, или 3-нитрофенил. Заявляемые вещества расширяют арсенал биологически активных соединений, обладающих антибактериальной активностью, и могут быть использованы в качестве противотуберкулезных агентов для лечения больных туберкулезом. Раскрываемые в настоящем изобретении соединения представляют собой вещества общей формулы:

Соединения I-VI новые, антибактериальная активность для данных соединений в литературе не известна. Способ получения заявляемых соединений отличается от описанного в [Beilstein J. Org. Chem. 2022, 18, 243-250] метода тем, что окислительную циклизацию N-(6-(3,5-диметил-1H-пиразол-1-ил)-1,2,4,5-тетразин-3-ил)имидамидов ведут не при нагревании в труднодоступных и дорогостоящих трифторэтаноле или гексафторизопропаноле, а в широко используемом, многотоннажном хлористом метилене при комнатной температуре. При этом снижаются энергозатраты, увеличивается хемоселективность процесса, что сводит к минимуму побочные реакции и способствует увеличению выходов целевых веществ (см. Табл) и снижению их себестоимости.

Таблица
Условия получения 7-R-3-(3,5-диметил-1H-пиразол-1-ил)-[1,2,4]триазоло[1,5-b][1,2,4,5]тетразинов Соединение Заявляемые условия циклизации N-(6-(3,5-диметил-1H-пиразол-1-ил)-1,2,4,5-тетразин-3-ил)имидамидов Условия циклизации N-(6-(3,5-диметил-1H-пиразол-1-ил)-1,2,4,5-тетразин-3-ил)имидамидов, описанные в [Beilstein J. Org. Chem. 2022, 18, 243-250] Растворитель Время процесса, ч Температура процес-са Выход, % Растворитель Время процес са, ч Температура процесса Выход, % I CH₂Cl₂ 72 25 °C 84 (CF₃)₂CHOH 7 55 22 II CH₂Cl₂ 96 25 °C 75 CF₃CH₂OH 7 75 67 V CH₂Cl₂ -
(CF₃)₂CHOH (9:1) 24 25 °C 83 CF₃CH₂OH + ДМФА (1:1) 7 75 68

Аналогом вышеуказанных соединений по строению и действию является 6-(3,5-диметил-1H-пиразол-1-ил)-3-этилтио][1,2,4]триазоло[4,3-b][1,2,4,5]тетразин (А), препаратом сравнения по действию является изониазид (Б). Синтез вещества А описан [Журн. орган. химии, 1999, 35, 1379], данные по туберкулостатической активности соединения А приведены в публикации [Известия. АН, Сер. Химическая, 2021, N 6, 1093-1098], минимальная ингибирующая концентрация (МИК) для него равна 0.62 мкг/мл.

Раскрываемые в настоящем изобретении соединения I-VI отличаются от известного и близкого по структуре соединения А положениями атомов азота в азольной части гетероциклической системы и заместителями: вместо этилтио- реализуются метил-, или 2-пиридил, или пиразол-1-ил, или [1,2,4]триазол-1-ил, или 3-нитрофенил. Азиновый цикл содержит 3,5-диметилпиразол-1-ил, или метокси, или этокси, или изопропокси, или солевую форму гидроксигруппы (NaO).

Препарат сравнения по действию, изониазид формулы Б, является селективным противотуберкулезным препаратом, однако недостатками этого препарата являются его высокая токсичность и различные побочные эффекты при применении. Изониазид вызывает аллергию, негативно влияет на функцию желудочно-кишечного тракта, имеет побочное действие на нервную систему [М. Д. Машковский. Лекарственные средства, 16-е изд., перераб., испр. и доп. - М.: РИА «Новая волна»: издатель Умеренков, 2019, с.856 и Фармакология и токсикология, 1987, 50, (4), с.87]. Отмечено широкое распространение устойчивых к изониазиду клинических штаммов микобактерий [Антибиотики и химиотерапия, 2002, 47, №6, с.28-30].

Синтез заявляемых производных [1,2,4]триазоло[1,5-b][1,2,4,5]тетразина осуществляют по схеме:

Стартовый 3,6-ди-(3,5-диметилпиразол-1-ил)-1,2,4,5-тетразин получают по известной методике [Coburn, D. G.; Buntain, A.; Harris, B. W.; Hiskey, M. A.; Lee, K. Y.; Ott, D. G. J. Heterocycl. Chem. 1991, 28, 2049]. Структуры заявляемых соединений I-VI подтверждены данными спектроскопии ЯМР ¹Н (спектрометр Bruker Avance DRX-400 с рабочей частотой 400 МГц и Bruker Avance-500 с рабочей частотой 500 МГц) и элементного анализа (автоматический анализатор CHN РЕ 2400 сер. II (Perkin Elmer).

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1.

3-(3,5-Диметил-1H-пиразол-1-ил)-7-(2-пиридил)-[1,2,4]триазоло[1,5-b][1,2,4,5]тетразин (I).

а) N-(6-(3,5-диметил-1H-пиразол-1-ил)-1,2,4,5-тетразин-3-ил)-2-пиридин-1-карбоксиимид-амид получают перемешиванием при комнатной температуре в течение 3-х часов 810 мг (3 ммоль) 3,6-ди(3,5-диметилпиразол-1-ил)-1,2,4,5-тетразина и 473 мг (3 ммоль) -пиридиламидина гидрохлорида в 15 мл ДМФА в присутствии 303 мг (3 ммоль) триэтиламина. К реакционной массе добавляют 30 мл воды, образовавшийся красный осадок N-(6-(3,5-диметил-1H-пиразол-1-ил)-1,2,4,5-тетразин-3-ил)- -пиридин-1-карбокси-имидамида отфильтровывают, сушат в течение суток на воздухе. Выход 593 мг (67%), т. пл. 169-170 °C. Спектр ЯМР ¹Н (400 МГц, DMSO-d₆), δ, м. д. (J, Гц): 2.27, 2.55 (оба с, 6H, 2CH₃); 6.30 (с, 1H, CH в пиразолиле); 7.68-7.71, 8.08-8.12, 8.52-8.54, 8.75-8.77 (все м, 4Н, 4CH в пиридиле); 8.82, 9.03 (оба уш. с, 2H, 2NH). C₁₃H₁₃N₉. Вычислено, %: C, 52.87; H, 4.44; N, 42.69. Найдено, %: С, 52.90; Н, 4.31; N, 42.43.

б) К 295 мг (1.0 ммоль) N-(6-(3,5-диметил-1H-пиразол-1-ил)-1,2,4,5-тетразин-3-ил)-2-пиридин-1-карбоксиимидамида в 50 мл хлористого метилена добавляют 483 мг (1.5 ммоль) фенилйоддиацетата и выдерживают при перемешивании при комнатной температуре в течение 72 часов, растворитель отгоняют. Остаток перекристаллизовывают из ацетонитрила, получают 197 мг (67% от теор.) Из остатка, выделенного из фильтрата после перекристаллизации, при помощи колоночной хроматографии получают дополнительно еще 50 мг (17%) кристаллического вещества лимонно-желтого цвета с Rf = 0.64 (ацетонитрил-бензол 1:1). Суммарный выход 247 мг (84%), т. пл. 230 °C. Спектр ЯМР 1Н (500 МГц, DMSO-d₆), δ, м. д. (J, Гц): 2.31, 2.64 (оба с, 6H, 2CH₃); 6.39 (с, 1H, CH в пиразолиле); 7.69 (дд, J₁ = 7.1, J₂ = 4.5, 1H, CH в пиридиле) 8.12 (ддд, J₁ = 7.8, J₂ = 7.1, J₃ = 1.7, 1Н, CH в пиридиле); 8.45 (д, J₁ = 7.8, J₂ = 4.5, 1Н, CH в пиридиле). C₁₃H₁₁N₉. Вычислено, %: C, 53.24; H, 3.78.38; N, 42.98. Найдено, %: С, 53.16; Н, 3.67; N, 42.82.

б*) При проведении циклизации в гексафторизопропаноле в условиях, описанных в [Beilstein J. Org. Chem. 2022, 18, 243-250], из 295 мг (1.0 ммоль) N-(6-(3,5-диметил-1H-пиразол-1-ил)-1,2,4,5-тетразин-3-ил)-2-пиридин-1-карбоксиимидамида выделяют при помощи колоночной хроматографии с использованием элюента ацетонитрил-бензол (1:1) 65 мг (22%) 3-(3,5-диметил-1H-пиразол-1-ил)-7-(2-пиридил)-[1,2,4]триазоло[1,5-b][1,2,4,5]тетразина (I).

Пример 2.

3-Метокси-7-(пиразол-1-ил)-[1,2,4]триазоло[1,5-b][1,2,4,5]тетразин (II).

Получают из 282 мг (1 ммоль) 3-(3,5-диметил-1H-пиразол-1-ил)-7-(1H-пиразол-1-ил)-[1,2,4]триазоло[1,5-b][1,2,4,5]тетразина, синтезированного аналогично примеру 1 (б) (время реакции 4 суток, выход 75%), в 5 мл метанола в присутствии 0.1 ммоль (14 мг) карбоната калия при перемешивании на магнитной мешалке при комнатной температуре в течение 4 часов. Осадок отфильтровывают, промывают метанолом. Выход 90 мг (41%), т. пл. 165-167°С. Спектр ЯМР ¹Н (500 МГц, DMSO-d₆), δ, м. д. (J, Гц): 4.22 (с, 3Н, ОСН₃); 6.77 (дд, J₁ = 2.5 Гц, J₂ = 1.5 Гц, 1Н, С(4)Н в пиразолиле); 8.04 (д, J = 1.5 Гц, 1Н, CH в пиразолиле); 8.73 (д, J = 2.5 Гц, 1Н, CH в пиразолиле). C₇H₆N₈O. Найдено, %: C, 38.52; H, 2.65; N, 51.54. Вычислено, %: C, 38.54; H, 2.77; N, 51.36.

Пример 3.

3-Метокси-7-(1,2,4-триазол-1-ил)-[1,2,4]триазоло[1,5-b][1,2,4,5]тетразин (III).

Получают аналогично соединению II (пример 2) из 283 мг (1 ммоль) 3-(3,5-диметил-1H-пиразол-1-ил)-7-(1H-1,2,4-триазол-1-ил)-[1,2,4]триазоло[1,5-b][1,2,4,5]тетразина, синтезированного по известной методике [Beilstein J. Org. Chem. 2022, 18, 243-250]. Выход 66 мг (30%), т.пл. >200°С (разл.). Спектр ЯМР ¹Н (500 МГц, DMSO-d₆), δ, м. д. (J, Гц): 4.24 (с, 3Н, ОСН₃); 8.52, 9.68 (оба с, 2H, 2CH в триазолиле). C₆H₅N₉O. Найдено: C, 32,87; H, 2,19; N, 57,61. Вычислено: C, 32,88; H, 2,30; N, 57,52.

Пример 4.

3-Этокси-7-(1,2,4-триазол-1-ил)-[1,2,4]триазоло[1,5-b][1,2,4,5]тетразин (IV).

Получают аналогично соединению II (пример 2) из 283 мг (1 ммоль) 3-(3,5-диметил-1H-пиразол-1-ил)-7-(1H-1,2,4-триазол-1-ил)-[1,2,4]триазоло[1,5-b][1,2,4,5]тетразина, синтезированного по известной методике [Beilstein J. Org. Chem. 2022, 18, 243-250], в 5 мл этанола. Осадок отфильтровывают и промывают этанолом. Выход 124 мг (53%), т.пл. 175-177°С. Спектр ЯМР ¹Н (500 МГц, DMSO-d₆), δ, м. д. (J, Гц): 1.65 (т, J = 7.1, 3Н, СН₃); 4.72 (к, J = 7.1, 2Н, СН₂); 8.28, 9.18 (оба с, 2H, 2CH в триазолиле). Найдено, %: C 36.10; H, 3.04; N, 54.35. C₇H₇N₉O. Вычислено, %: C, 36.05; H, 3.03; N, 54.06.

Пример 5.

3-Изопропокси-7-(3-нитрофенил)-[1,2,4]триазоло[1,5-b][1,2,4,5]тетразин (V).

Получают аналогично соединению II (пример 2) из 337 мг (1 ммоль) 3-(3,5-диметил-1H-пиразол-1-ил)-7-(3-нитрофенил)-[1,2,4]триазоло[1,5-b][1,2,4,5]тетразина, синтезированного аналогично примеру 1 (б) с использованием в качестве растворителя смеси CH₂Cl₂-(CF₃)₂CHOH 9:1 (время реакции 24 часа, выход 83%), в 5 мл изопропанола при кипячении в течение 4 часов. Осадок отфильтровывают и промывают изопропанолом. Выход 120 мг (40%), т.пл. 153-155°С. Спектр ЯМР ¹Н (400 МГц, CDCl₃), δ, м. д. (J, Гц): 1.61 (д, J = 6.2, 6Н, 2СН₃); 5.46 (сп, J = 6.2, 1Н, СН, OPrⁱ); 7.75-7.79, 8.41-8.44, 8.72-8.74, 9.25-9.26 (все м, 4H, 4CH, Ar). Найдено, %: C 47.88; H, 3.82; N, 32.28. C₁₂H₁₁N₇O₃. Вычислено, %: C, 47.84; H, 3.86; N, 32.55.

Пример 6.

Натриевая соль 3-гидрокси-7-метил-[1,2,4]триазоло[1,5-b][1,2,4,5]тетразина (VI).

3-(3,5-Диметилпиразол-1-ил)-7-метил-[1,2,4]триазоло[1,5-b][1,2,4,5]тетразин, синтезированный по известной методике [Beilstein J. Org. Chem. 2022, 18, 243-250], в количестве 230 мг (1 ммоль) суспендируют в 4 мл ацетонитрила, прибавляют 1 мл 1н водного раствора NaOH и выдерживают при 60°С в течение 5 часов. Растворитель удаляют при пониженном давлении и 90°С. Остаток промывают этиловым спиртом, отфильтровывают, сушат в течение 3 ч при 90°С. Выход 105 мг (60%), т.пл. >335°С (разл.). Спектр ЯМР ¹Н (500 МГц, DMSO-d₆), δ, м. д. (J, Гц): 2.37 (с, 3Н, СН₃). C₄H₃N₆NaO×H₂O. Вычислено, %: C, 25.01; H, 2.62; N, 43.75. Найдено, %: C, 25.04; H, 2.59; N, 44.15.

Изучение антимикобактериальной активности соединений проводили на основе REMA метода [Palomino, J. Resazurin Microtiter Assay Plate: Simple and Inexpensive Method for Detection of Drug Resistance in Mycobacterium tuberculosis / J.Palomino, A.Martin, M.Camacho, H.Guerra, J.Swings, F.Portaels // Antimicrob. Agents Chemother. - 2002. - Vol. 46. - N 8. - P. 2720-2722 DOI: 10.1128/AAC.46.8.2720-2722.2002; Taneja, N. Resazurin reduction assays for screening of anti-tubercular compounds against dormant and actively growing Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis BCG and Mycobacterium smegmatis / N.Taneja, J.Tyagi // J. Antimicrob. Chemother. - 2007. - Vol. 60. - P. 288-293 DOI:10.1093/jac/dkm207].

Приготовление суспензии МБТ. Суспензию МБТ с оптической плотностью 1.0 ед. по МакФарланду готовили (с использованием физиологического раствора) из культуры Mycobacterium tuberculosis H37Rv, находящейся в логарифмической фазе роста на питательной среде Левенштейна-Йенсена. 50 мкл полученной суспензии переносили в пробирку с питательным бульоном 7Н9 и ростовой добавкой OADC. В лунки планшетов вносили по 100 мкл полученной суспензии.

Приготовление разведений исследуемых соединений. Разведения исследуемых соединений готовили с использованием ДМСО. Изониазид растворяли только в воде.

Навеску 10 мг исследуемого соединения растворяли в 5 мл ДМСО, получая базовый раствор с концентрацией исследуемого соединения 2000 мкг/мл. Далее выполняли последовательные двукратные разведения с использованием в качестве разбавителя чистого ДМСО.

Процедура исследования:

В лунки 96-луночного планшета вносили по 97 мкл питательной среды и по 3 мкл растворов исследуемых соединений, приготовленных, как описано выше. Далее в лунки планшетов вносили по 100 мкл суспензии МБТ. Таким образом, в лунках планшета получены растворы исследуемых соединений в следующих концентрациях: 30, 15, 7.5, 3.75, 1.88, 0.94, 0.47, 0.23 мкг/мл. Концентрация ДМСО во всех лунках 1.5% (об.).

В качестве положительного контроля использовали культуру МБТ без добавления соединений и с добавлением ДМСО (конечная концентрация 1.5%). В качестве препарата сравнения использовали изониазид.

Планшеты инкубировали при 37 °С в течение 7 суток. По истечении времени инкубации в лунки вносили по 30 мкл раствора резазурина (с добавлением Tween 80) и продолжали инкубацию при 37 °С. Результат учитывали 72 часа. За МИК принимали минимальную концентрацию исследуемого соединения, предотвращающую изменение окраски резазурина.

Приведённые значения МИК получены в результате двух независимых экспериментов.

Туберкулостатическая активность некоторых триазоло[1,5-b][1,2,4,5]тетразинов Шифр Соединение МИК, мкг/мл Шифр Соединение МИК, мкг/мл I 0.94 IV <31.25 II 1.88 V 0.94 III 3.75 VI 3.10 Изониазид 0.03

Результаты получены в рамках реализации проекта Минобрнауки «Медицинская химия в создании лекарств нового поколения для лечения социально-значимых болезней» (грант № 075-15-2020-777).

Группа изобретений относится к фармацевтической химии и включает 3,7-дизамещенные [1,2,4]триазоло[1,5-b][1,2,4,5]тетразины формулы I-VI и способ их получения. Где R = 2-пиридил, R¹ = 3,5-диметилпиразол-1-ил (I); R = пиразол, R¹ = метокси (II); R = 1,2,4-триазол-1-ил, R¹ = метокси (III); R = 1,2,4-триазол-1-ил, R¹ = этокси (IV); R = 3-нитрофенил, R¹ = изопропокси (V); R = метил, R¹ = ONa (VI). Технический результат - 3,7-дизамещенные [1,2,4]триазоло[1,5-b][1,2,4,5]тетразины формулы I-VI, обладающие антибактериальной активностью. 2 н.п. ф-лы, 1 табл., 6 пр.

1. 3,7-дизамещенные [1,2,4]триазоло[1,5-b][1,2,4,5]тетразины формулы I-VI

где:

R = 2-пиридил, R¹ = 3,5-диметилпиразол-1-ил (I);

R = пиразол, R¹ = метокси (II);

R = 1,2,4-триазол-1-ил, R¹ = метокси (III);

R = 1,2,4-триазол-1-ил, R¹ = этокси (IV);

R = 3-нитрофенил, R¹ = изопропокси (V);

R = метил, R¹ = ONa (VI),

обладающие антибактериальной активностью.

2. Способ получения соединений по п.1, заключающийся в осуществлении синтеза по схеме:

и отличающийся тем, что стадию окислительной циклизации N-(6-(3,5-диметил-1H-пиразол-1-ил)-1,2,4,5-тетразин-3-ил)имидамида проводят в хлористом метилене при комнатной температуре.