НОВЫЙ АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫЙ АГЕНТ 3-(КАРБОКСИМЕТИЛ)-1-(ИМИДАЗО[1,2-b][1,2,4,5]ТЕТРАЗИН-3-ИЛ)-1Н-БЕНЗО[d]ИМИДАЗОЛ-3-ИУМ ХЛОРИД, ОБЛАДАЮЩИЙ АКТИВНОСТЬЮ ОТНОСИТЕЛЬНО NEISSERIA GONORRHOEAE И MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS Российский патент 2024 года по МПК C07D487/04 A61K31/4184 A61K31/4188 A61P31/04 A61P31/06 

Изобретение относится к фармацевтической химии и касается производных имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразина. Заявляемое вещество 3-карбоксиметил-1-(имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразин-3-ил)-1Н-бензо[d]имидазол-3-иум хлорид расширяет арсенал биологически активных соединений, обладающих антибактериальной активностью, и может быть использовано в качестве фармацевтической субстанции при создании лекарственных средств для лечения пациентов с заболеваниями, вызванными облигатными патогенами Neisseria gonorrhoeae и Mycobacterium tuberculosis.

Раскрываемое в настоящем изобретении соединение является новым, не описанным ранее производным имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразина, и представляют собой вещество формулы:

Аналогом заявляемого соединения по строению является 3-(бензимидазол-1-ил)имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразин (BIT) (в схеме синтеза: соединение 4), аналогами по действию цефтриаксон (СTХ) и изониазид (INH).

Новое соединение, раскрываемое в настоящем изобретении, отличается от известного и близкого по структуре соединения BIT тем, что в бензимидазолильном заместителе второй атом азота четвертичный, содержит карбоксиметил, а противо-ионом служит хлорид-анион. Синтез аналога по строению BIT описан в [Известия АН. Сер. химическая 2015, 9, с. 2100-2105]. Соединение BIT обладает фунгистатическим действием, умеренно ингибируя рост семи культур грибов родов Trichophyton, Epidermophyton, Microsporum с минимальной ингибирующей концентрацией (МИК) в диапазоне 3.12-25 мкг⋅мл^–1 [Известия АН. Сер. химическая 2015, 9, с. 2100-2105]. Антибактериальная активность для него неизвестна. Синтез заявляемого 3-карбоксиметил-1-(имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразин-3-ил)-1Н-бензо[d]имидазол-3-иум хлорида (см. схему) осуществляют из 3,6-ди-(3,5-диметилпиразол-1-ил)-1,2,4,5-тетразина (1), получение которого из многотоннажного сырья гидрохлорида гуанидина описано в публикации [M. D. Coburn, G. A. Buntain, B. W. Harris, M. A. Hiskey, K. Y. Lee, D. G. Ott, J. Heterocycl. Chem., 199I, 28, 2049 DOI: 10.1002/jhet.5570280844]. Используемые на разных стадиях другие реагенты также относятся к доступному сырью. Предшественники заявляемого соединения - 3,6-ди-(бензимидазол-1-ил)-1,2.4,5-тетразин (2); 3-(бензимидазол-1-ил)-6-(2,2-диметоксиэтиламино)-1,2,4,5-тетразин (3); а также 3-(бензимидазол-1-ил)имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразин (4, BIT) получены согласно методике, опубликованной в работе [Р. И. Ишметова, Н. К. Игнатенко, И. А. Белянинова, С. Г. Толщина, А. В. Коротина,, П. А Слепухин, Н. П. Евстигнеева, Н.В. Зильберберг, П. Г. Аминева, Н.В. Кунгуров, Г.Л. Русинов, О.Н. Чупахин, Изв. АН. Сер. химическая, 2015, 9, 2100, doi.org/10.1007/s11172-015-1124-y].

Структура нового заявляемого соединения, представленного в изобретении, подтверждена данными спектроскопии ЯМР ¹Н, ¹³С (спектрометр Avance DRX-400 (Bruker) с рабочей частотой 400 МГц) и элементного анализа (автоматический анализатор CHN РЕ 2400 сер. II (Perkin Elmer).

Схема - Синтез 3-карбоксиметил-1-(имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразин-3-ил)-1Н-бензо[d]имидазол-3-иум хлорида

Аналог по назначению - цефтриаксон (CTX) является антибактериальным препаратом широкого спектра действия и используется в медицинской практике для лечения многих заболеваний, в том числе вызванных грамотрицательными бактериями Neisseria gonorrhoeae. Синтез цефтриаксона, представляющий собой многостадийный процесс, описан в работе [R.S.Vardanyan, V.J. Hruby. Antibiotics: Synthesis of essential drugs, 2006, p. 456]. В отличие от способа получения заявляемого соединения он более энерготрудозатратен, требует специфических, дорогостоящих реагентов и катализаторов. Применение цефтриаксона может вызвать аллергические реакции, дисбактериоз, нарушения функции почек и печени, анемию, тромбоцитоз, лейкоцитоз и многие другие побочные эффекты со стороны различных систем организма [М.Д.Машковский. Лекарственные средства, 15-е изд., перераб., испр. и доп. -М.: РИА «Новая волна»: издатель Умеренков, 2007, с.788].

Второй аналог по действию изониазид (INH) является селективным противотуберкулезным препаратом, однако недостатками этого препарата являются его высокая токсичность, а также различные побочные эффекты при применении. Изониазид вызывает аллергию, негативно влияет на функцию желудочно-кишечного тракта, имеет побочное действие на нервную систему [М.Д. Машковский. Лекарственные средства, 15-е изд., перераб., испр. и доп. -М.: РИА «Новая волна»: издатель Умеренков, 2007, с.858 и Фармакология и токсикология, 1987, 50, (4), с.87]. Отмечено широкое распространение устойчивых к изониазиду клинических изолятов микобактерий [Антибиотики и химиотерапия, 2002, 47, № 6, с.28-30].

В настоящее время практическая медицина, как в России, так и в других странах, сталкивается с огромными сложностями в связи с появлением и развитием штаммов бактерий, обладающих резистентностью к применяемым антибиотикам. Так, некоторые штаммы микобактерий туберкулеза обладают множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) или широкой лекарственной устойчивостью (ШЛУ) [J. Antimicrob. Chtmother., 2007, 59, 1057-1067, doi:10.1093/jac/dkm086; J. Antimicrob. Chtmother., 2019, 74, 1477-1483, doi:10.1093/jac/dkz048]. Такая же тенденция наблюдается и для облигатного патогена Neisseria gonorrhoeae [Int. J. Mol. Sci. 2022, 23(18), 10499, doi.org/10.3390/ijms231810499; J. Antimicrob. Chemother., 2023, 78, 6, 1322-1336, doi.org/10.1093/jac/dkad071]. Например, в ряде стран, согласно отчету ВОЗ от 11.07.2023, отмечается крайне высокий уровень распространения устойчивости Neisseria gonorrhoeae к ципрофлоксацину, растет устойчивость к азитромицину и продолжают появляться случаи устойчивости (или сниженной чувствительности) к антибиотикам последнего поколения цефиксиму и цефтриаксону.

Несомненно, поиск веществ, активных относительно вышеназванных бактерий и их лекарственно устойчивых форм актуален и является одной из основных задач современной медицинской химии.

Примеры конкретного выполнения

Пример 1.

1,3-(карбоксиметил)-1-(имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразин-3-ил)-1Н-бензо[d]имидазол-3-иум хлорид

В круглодонную колбу с 7 мл этилхлорацетата вносят 237 мг (1 ммоль) 3-(бензимидазол-1-ил)имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразина и кипятят при интенсивном перемешивании в течение 3 часов. Реакционную массу охлаждают, образовавшийся осадок отфильтровывают. Промывают на фильтре сухим ацетонитрилом, сушат, перекристаллизовывают из ацетонитрила. Выход 231 мг (82 %). Кристаллическое вещество бежевого цвета, т. пл. 267-268°С (из ацетонитрила). Найдено (%): С, 47.26; Н, 2.95; N, 29.72. C₁₃H₁₀N₇ClO₂ Вычислено (%): C, 47.07; H, 3.04; N, 29.56. Спектр ЯМР¹Н (ДМСО-d6, δ, м.д., J/Гц): 13.16 (уш.с, 1H, -CH₂COOH); 9.33 (c, 1H, при C(2) бензимидазол-1-ила); 8.92, 8.69 (оба д, по 1Н, имидазотетразин, J = 0.7); 7.53 (тд, 1H, в бензимидазолиле, J₁=0.9, J₂=7.2, J₃= 8.1); 7.46 (тд, 1H, в бензимидазолиле, J₁=1.1, J₂=7.1, J₃= 8.2); 4.27 (с, 2Н, -CH₂COOH). Спектр ЯМР ¹³C (DMSO-d6, S, м.д., J/Гц): 41.5, 114.8, 118.4, 120.4, 124.3, 124.9, 130.8, 141.8, 144.1, 146.1, 150.4, 168.6.

Пример 2. Изучение антибактериальной активности in vitro заявляемого соединения

Изучение антибактериальной активности in vitro в отношении контрольного штамма Neisseria gonorrhoeae ATCC 49226/NCTC 12700

Антибактериальную активность химических соединений в отношении облигатного патогена Neisseria gonorrhoeae определяют методом двукратных серийных разведений в агаре (EUCAST). В качестве ростовой среды используют - гонококковый агар BD с ростовой добавкой. Разведения АБП в агаре проводят в 24 луночных планшетах, рабочий объем лунки 2 мл. Для каждого химического соединения готовят не менее 12 точек с разведениями: 250 мкг/мл - 0,12 мкг/мл. Растворитель - ДМСО, разбавители дистиллированная стерильная вода (для инъекций), ростовая среда на агаровой основе. Посевная доза (конечная концентрация) инокулюма из суточной культуры N. gonorrhoeae - 10⁵ КОЕ/мл. Инкубируют планшеты при условиях Т=37°С, [СО₂ = 5%]. Оценку результатов проводят через 18-24 часа. Критерии интерпретации результатов: новые химические соединения рассматриваются перспективными для дальнейшего изучения, если значения МИК in vitro для тест-штаммов не превышают 10-20 мкг/мл [Стандарт ГОСТ Р ИСО 20776-1-2010; Методические указания по изучению противомикробной активности фармакологических веществ. С.265].

Исследования проведены для эталонного штамм Neisseria gonorrhoeae NCTC 12700/ATCC 49226, чувствительного к цефтриаксону, и для штамма Neisseria gonorrhoeae, резистентного к данному аналогу.

2.2. Изучение антимикобактериальной активности

Изучение антимикобактериальной активности заявляемого соединения проводили на основе REMA метода [J.Palomino, A.Martin, M.Camacho, H.Guerra, J.Swings, F.Portaels // Antimicrob. Agents Chemother. 2002, 46 (8), 2720-2722. DOI: 10.1128/AAC.46.8.2720-2722.2002; N. Taneja, J. Tyagi // J. Antimicrob. Chemother. 2007, 60, 288-293. DOI:10.1093/jac/dkm207]. Суспензию МБТ с оптической плотностью 1.0 ед. по МакФарланду готовили с использованием физиологического раствора из культуры Mycobacterium tuberculosis, находящейся на питательной среде Левенштейна-Йенсена. 50 Мкл полученной суспензии переносили в пробирку с питательным бульоном Миддлбрука 7Н9 и ростовой добавкой OADC. Разведения исследуемого соединения проводили с использованием ДМСО, контрольный препарат изониазид использовали в виде водного раствора. Навеску исследуемого соединения массой 10 мг растворяли в 5 мл ДМСО, получая базовый раствор с концентрацией 2 000 мкг/мл, и осуществляли последовательные двукратные разведения. В лунки 96-луночного планшета вносили по 97 мкл питательной среды и по 3 мкл растворов соединения в концентрациях 2000, 1000, 500, 250, 125, 62.5, 31.25, 15.7 мкг/мл, приготовленных, как описано выше и добавляли по 100 мкл суспензии МБТ, получая в лунках планшета растворы исследуемого соединения в концентрациях 30, 15, 7.5, 3.75, 1.88, 0.94, 0.47, 0.23 мкг/мл. Концентрация ДМСО во всех лунках 1.5% (об.). В качестве положительного контроля использовали культуру МБТ без добавления соединений и с добавлением ДМСО (конечная концентрация 1.5%). В качестве препарата сравнения использовали изониазид (INH). Планшеты инкубировали при 37^° С в течение 7 суток. По истечении времени инкубации в лунки вносили по 30 мкл раствора резазурина (с добавлением Тween 80) и продолжали инкубацию при 37^°С. Результат учитывали через 24, 48 и 72 часа. За МИК принимали минимальную концентрацию исследуемого соединения, предотвращающую изменение окраски резазурина. Скрининг антимикотической активности проведен в отношении лекарственно-чувствительного музейного штамма Mycobacterium tuberculosis H₃₇R_V и в отношении лекарственно-устойчивого клинического изолята Mycobacterium tuberculosis МБТ-848 с ШЛУ.

Результаты скрининга антибактериальной активности заявляемого соединения представлены в таблице.

Таблица

Результаты исследований антибактериальной активности 3-(карбоксиметил)-1-(имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразин-3-ил)-1Н-бензо[d]имидазол-3-иум хлорида

Структура Результаты исследования антибактериальной активности Минимальная ингибирующая активность, мкг мл Контрольный штамм
N. gonorrhoeae
NCTC 12700 Ceftriaxone sensitive CTХ-S Контрольный штамм
N. gonorrhoeae
Ceftriaxone
resistant CTX-R Mycobacterium tuberculosis
H37RV Mycobacterium tuberculosis
(МБТ-848 ШЛУ)* 0.488 1.9 0.78 0.78 CTX 0.015 н/а Нет данных Нет данных Нет данных Нет данных 0.03 н/а

* ШЛУ - широкая лекарственная устойчивость; клинический изолят M.tuberculosis МБТ-848, резистентный к препаратам Изониазид, Рифампицин, Левофлоксацин, Моксифлоксацин, Бедаквилин, Этамбутол

Помимо антибактериального действия у заявляемого соединения была выявлена заметная антифунгальная активность в отношении контрольных штаммов грибов дерматофитов T. rubrum (МИК 3,12 мкг/мл), E. floccosum (МИК 6,25 мкг/мл), M. canis (МИК 3,12 мкг/мл), и умеренная для дрожжеподобных грибов Candida parapsilosis (МИК 25 мкг/мл). Данный факт немаловажен, поскольку у ослабленных больных с гонококковой инфекцией и туберкулезом, как правило, присутствуют микотические поражения кожи и слизистых.

Таким образом, заявляемое соединение, а именно 3-(карбоксиметил)-1-(имидазо[1,2b][1,2,4,5]тетразин-3-ил)-1Н-бензо[d]имидазол-3-иум хлорид, обладает выраженной антибактериальной активностью в отношении грамотрицательных бактерий Neisseria gonorrhoeae и в отношении микобактерий туберкулеза человека, в том числе их лекарственно-устойчивых вариантов. Кроме того, данное соединение обладает антимикотической активностью в отношении дерматофитов и дрожжеподобных грибов рода Candida. Вещество может быть использовано в качестве фармакологической субстанции при создании новых лекарственных препаратов для лечения гонореи и туберкулеза.

Изобретение относится к фармацевтической химии и касается производных имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразина. Заявляемое вещество 3-карбоксиметил-1-(имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразин-3-ил)-1Н-бензо[d]имидазол-3-иум хлорид расширяет арсенал биологически активных соединений, обладающих антибактериальной активностью, и может быть использовано в качестве фармацевтической субстанции при создании лекарственных средств для лечения пациентов с заболеваниями, вызванными облигатными патогенами Neisseria gonorrhoeae и Mycobacterium tuberculosis.

Раскрываемое в настоящем изобретении соединение является новым, не описанным ранее производным имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразина, и представляют собой вещество формулы:

Аналогом заявляемого соединения по строению является 3-(бензимидазол-1-ил)имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразин (BIT) (в схеме синтеза: соединение 4), аналогами по действию цефтриаксон (СTХ) и изониазид (INH).

Изобретение относится к фармацевтической химии и производным имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразина, а именно к 3-карбоксиметил-1-(имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразин-3-ил)-1Н-бензо[d]имидазол-3-иум хлориду, активному в отношении лекарственно-чувствительных и лекарственно-устойчивых Neisseria gonorrhoеae и Mycobacterium tuberculosis. Технический результат – получение 3-карбоксиметил-1-(имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразин-3-ил)-1Н-бензо[d]имидазол-3-иум хлорида, активного в отношении лекарственно-чувствительных и лекарственно-устойчивых Neisseria gonorrhoеae и Mycobacterium tuberculosis. 2 пр., 1 табл.

Новый антибактериальный агент, представляющий собой 3-(карбоксиметил)-1-(имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразин-3-ил)-1Н-бензо[d]имидазол-3-иум хлорид формулы

активный в отношении лекарственно-чувствительных и лекарственно-устойчивых Neisseria gonorrhoeae и Mycobacterium tuberculosis.