БИС[1,2,4]ТРИАЗОЛО[4,3-b:3',4'-f][1,2,4,5]ТЕТРАЗИНЫ, ОБЛАДАЮЩИЕ АНТИГЛИКИРУЮЩЕЙ, АНТИГЛИКОКСИДАЦИОННОЙ И АНТИАГРЕГАНТНОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 2021 года по МПК A61K31/4196 C07D249/16 

Область техники к которой относится изобретение

Изобретение относится к фармацевтической химии и касается производных полиазотсодержащей гетероциклической системы бис[1,2,4]триазоло[4,3-b:3',4'-f][1,2,4,5]тетразина, содержащих в 1 и 8 положениях арильные фрагменты, которые могут быть использованы как агенты, сочетающие антигликирующую, антигликоксидационную и антиагрегантную активность при создании препаратов для лечения заболеваний, патогенез которых включает образование конечных продуктов гликирования (КПГ).

Уровень техники:

Конечные продукты гликирования (КПГ) при их избыточном образовании становятся патогенным фактором для организма. Образование КПГ потенцирует сшивание белковых макромолекул через поперечные сшивки. В то же время взаимодействие КПГ с изорецепторами к КПГ запускает сигнальные пути, влекущие активацию траскрипционного ядерного фактора - каппа В (NF-kB), фермента NADPH-оксидазы, митоген-активируемой киназы (МАРК), внеклеточной сигнал-регулируемой киназы, GTP-азы [Chawla D., Bansal S., Banerjeeetal B.D. // Microvascular Research. – 2014. –Vol. 95. –P. 1-6] и др., и приводит к повышению транскрипции таких белков, как молекулы межклеточной адгезии-1, Е-селектин, эндотелии-1, сосудистый эндотелиальный фактор роста, провоспалительные цитокины [Ott С., Jacobs K., Hauckeetal E. // Redox Biology. – 2014. – Vol. 2.– P. 411-429]. Участие КПГ в патогенезе заболевания установлено для таких состояний, как протеинопатические нейродегенерации, поздние осложнения сахарного диабета, атеросклероз, сердечная недостаточность, ревматоидный артрит, остеоартрит и др. [Brownlee M. // Diabetes. – 2005. – Vol. 54(6). – P. 1615-1625; Goh S.-Y., Cooper М.Е. // J. Clin. Endocrinol. Metab.. – 2008. – Vol. 93. – P. 1143-1155; Ramasamy R., Yan S.F., Schmidt A.M. // Ann. N. Y. Acad. Sci. – 2011. – Vol. 1243. – P. 88-102; Busch М., Franke S., , Wolf G. // Eur. J. Clin. Investig. – 2010. – Vol. 40. – P. 742-755; Syngle A., Vohhra K., Garg N., Kaur L. // Int. J. Rheum. Dis. – 2012. – Vol. 15, P. 45-55; Li J., Liu D., Sun L., Lu Y., Zhang Z. // J. Neurol. Sci. – 2012. – Vol. 317. – P. 1-5].

Образование КПГ является результатом реакции между свободными аминогруппами белков и карбонильными группами альдоз и прочих карбонильных соединений (реакции Майяра), которая может протекать многими путями, включая:

а) путь Ходжа, включающий образование оснований Шиффа (ранних продуктов гликирования), их перегруппировку в аминодезоксикетозы (продукты Амадори) и последующие реакции окисления, дегидратации и циклизации до КПГ [Ансари Н.А., Рашид З. // Биомедицинская химия. – 2010. – Т. 56. – С. 168-178; Singh V. P., Bali A., Singh N., etal. // Korean J. Physiol. Pharmacol. – 2014. – Vol. 18.– P. 1–14];

б) путь Намики, при котором ранние продукты гликирования (основания Шиффа) разрушаются с образованием более активых, чем моносахара, карбонильных соединений (глиоксаль, дезоксиглюкозон), образующих в реакциях со свободными аминогруппами КПГ [Ott C., Jacobs K., Haucke E.,et al. // RedoxBiol. – 2014. – 2. –P. 411-429];

в) путь Вольфа, при котором альдозы при участии окислительных процессов и катализаторов окисления (активные формы кислорода, переходные металлы и др.) превращаются в активные карбонильные соединения, образующие КПГ в реакциях со свободными аминогруппами [Wolff S.P., Dean R.T. // Biochem J. – 1987. – Vol. 245(1). – P. 243–250];

г) распад продуктов Амадори до реакционноспособных карбонильных соединений при участии окислительных или неокислительных условий среды [Cho S.J., Roman G., Yeboah F., Konishi Y. // Curr. Med. Chem. – 2007. – Vol. 14(15). – P. 1653-1671];

д) прочие пути, включая путь Бимеля, образование арабинозы и т.д. [Cho S.J., Roman G., Yeboah F., Konishi Y. // Curr Med Chem. – 2007. – Vol. 14(15). – P. 1653-1671].

Окислительный распад продуктов Амадори, аутоокисление глюкозы (путь Вольфа) и некоторые другие пути требуют оксидативных процессов и объединены в понятие гликоксидации. Источниками запуска окислительных реакций способны выступать металлы переходной валентности (Cu, Fe и др.). Поэтому хелатирующее действие препаратов способно замедлить формирование КПГ [Wolff S.P., Dean R.T. // Biochem J. – 1987. – Vol. 245(1). – P. 243–250; Кендлин Дж., Тейлор К., Томпсон Д. Реакции координационных соединений переходных металлов. Перевод с англ. Под ред. А.Н. Ермака. Изд-во Мир. 1970. 392 с.].

Поскольку гликирование и гликоксидация являются одними из ключевых патогенетических процессов, связанных с образованием КПГ, существует потребность разработки препаратов, способных ингибировать данные процессы.

Среди негативных последствий образования КПГ следует особо отметить их способность усиливать процессы агрегации тромбоцитов [Hangaishi M., Taguchi J., Miyata T. et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 1998. – Vol. 248(2). – P. 285-292], что приводит к повышению тромбообразования и к возникновению осложнений, например, в условиях сахарного диабета [Colwell J.A., Nair R.M., Halushka P.V. et al. Metabolism. Platelet adhesion and aggregation in diabetes mellitus. – 1979. – Vol. 28(4 Suppl 1).– P. 394-400], при болезни Альцгеймера [Gowert N.S., Donner L., Chatterjee M. et al.// PLoSOne. – 2014. – Vol. 9(2). – e90523] и других болезнях, включающих действие КПГ в свой патогенез. Эффективной мерой контроля избыточного тромбообразования является антиагрегантное действие. В связи с этим актуален поиск новых средств, способных контролировать различные этапы образования КПГ по оксидативным и неоксидативным механизмам, а также последствия этих процессов, в частности, повышенное тромбообразование.

Способность соединений блокировать различные пути образования КПГ или оказывать антиагрегантное действие in vitro отражает вероятный механизм их действия. Знание механизма анти-КПГ активности является основанием для дальнейшего исследования соединений на целых животных в качестве перспективной основы при создании препаратов для лечения болезней, сопровождающихся повышенным образованием КПГ.

На сегодняшний день в клинической практике нет препаратов, специфически угнетающих образование КПГ. Проводилось изучение активности в отношении образования КПГ в ряду сартанов (валсартан, лозартан и др.), являющихся блокаторами ангиотензиновых рецепторов и используемых как антигипертензивные препараты, а также липоевой кислоты, применяемой как метаболическое средство [Parengkuan L., Yagi M., Mohammad M. et al. // Glycative Stress Research. – 2014. – Vol. 1 (4). – P. 90-95; Ghelani H., Razmovski-Naumovski V., Pragada R.R., Nammi S. // BMC Complement Altern. Med. – 2018. – Vol. 18. – P. 13], однако эффект этих препаратов оказался слабым.

Наиболее изученным веществом, ингибирующим гликирование белков, является аминогуанидин (A) [Peyroux J., Sternberg M. // Pathologie Biologie. – 2006. – Vol. 54. – P. 405–419].

Как предполагается, основным механизмом торможения образования КПГ для аминогуанидина является способность связывать карбонильные соединения [Davies S.S., Zhang L.S. // Curr. Pharmacol. Rep. – 2017. – Vol. 3(2). – P. 51–67]. Аминогуанидин не применяется в клинической практике в связи с наличием многочисленных побочных эффектов (гастроинтестинальные симптомы, волчаночно-подобный, гриппоподобный синдромы, васкулит [Thornalley P.J. // Arch. Biochem. Biophys. – 2003. – Vol. 419 (1). – P. 31–40; Freedman B.I., Wuerth J.-P., Cartwright K., et al. // Control. Clin. Trials. – 1999. – Vol. 20 (5). – P. 493–510], анемия [Bolton W.K., Cattran D.C., Williams M.E., et al. // Am. J. Nephrol. – 2004. – Vol. 24. – P. 32–40]).

Описываемое изобретение относится к неизвестным ранее производным новой гетероциклической системы – бис[1,2,4]триазоло[4,3-b:3',4'-f][1,2,4,5]тетразинам общей формулы II, содержащим в триазольных фрагментах арильные заместители, а именно 3-метоксифенил, 2,3-диметоксифенил, 4-карбоксифенил.

Аналогами соединений II по строению, являются 3-арил[1,2,4]триазоло[4,3-b][1,2,4,5]тетразины B, обладающие противоопухолевой активностью [Xu F. Et al. // Bioorg.Med. Chem. Lett. – 2016. – Vol. 26.– P. 4580–4586], а также 3,6-диарилбис[1,2,4]триазоло[4,3-b:3',4'-f]пиридазины C, для которых изучалась противоопухолевая активность, однако не было выявлено каких-либо значимых результатов [Aggarwal R. et al. // J. Mol. Struct. – 2019. – Vol. 1185.– P. 379-391]. Антигликирующая, хелатирующая, антигликоксидационная и антиагрегантная активности соединений B и C не известны и не изучались.

Аналогами соединений II по антигликирующему действию являются гуанидиновые производные имидазо[1,2-b]- и [1,2,4]триазоло[4,3-b][1,2,4,5]тетразинов (D), обладающие антигликирующей активностью, сопоставимой с активностью аминогуанидина или превосходящей её [Пат. РФ 2668971, опубл. 05.10.2018, БИ № 28].

Также аналогами соединений II по действию и референтами при оценке анти-КПГ активности выступают аминогуанидин (A), ингибирующий гликирование белков, и лекарственные препараты, для которых известна слабая способность подавлять образование КПГ в том числе за счет хелатирующей/антиоксидантной активности –липоевая кислота (E), лозартан (F) и пиоглитазон (G) [Nagai R., Murray D.B., Metz T.O., Baynes J.W. // Diabetes. – 2012. – Vol. 61(3). – P. 549-559; Rahbar S., Figarola J.L. // Arch. Biochem. Biophys. – 2003. – Vol. 419. – P. 63–79; Younus H., Anwar S. // Int J Health Sci (Qassim). – 2016. – Vol. 10(2). – P. 261-277]. Аналогом соединений II по антиагрегантной активности и соответствующим препаратом сравнения является ацетилсалициловая кислота (H), которая обладает рядом нежелательных эффектов, таких как раздражение и изъязвление слизистой оболочки желудка, шум в ушах, головокружение, снижение слуха, тромбоцитопения, развитие синдрома Рейне (поражение головного мозга и печени) у детей.

Соединения II сравнительно легкодоступны, не требуют больших энергозатрат и получаются из товарного многотоннажного сырья с применением препаративно удобных реагентов. Они могут быть получены из синтетически легко доступного 3,6-дигидразино-1,2,4,5-тетразина [Chavez D.E., Hiskey M.A. // J. Heterocycl. Chem. – 1998. – Vol. 35. – P. 1329-1332] в результате его взаимодействия с ароматическими альдегидами с образованием с высоким выходом соответствующих дигидразонов I и последующего окисления дигидразонов I под действием диацетоксийодбензола.

Таким образом, представленные производные бис[1,2,4]триазоло[4,3-b:3',4'-f][1,2,4,5]тетразина IIa-c, обладающие способностью блокировать образование КПГ, сопоставимой с препаратами сравнения или превышающей её, при дальнейшем изучении являются перспективной основой для создания лекарственных средств, способных замедлять развитие заболеваний с КПГ-ассоциированным патогенезом.

Структуры представленных в изобретении новых соединений доказаны данными спектроскопии ЯМР ¹H и ¹³С (спектрометр Avance DRX-400 (Bruker) c рабочей частотой 400 МГц), масс-спектрометрии высокого разрешения (масс-спектрометр maXis impact HD (Bruker)), а также элементного анализа (автоматический анализатор CHN РЕ 2400 сер. II (PerkinElmer)).

Примеры конкретного выполнения

Пример 1

1,8-Бис(3-метоксифенил)бис[1,2,4]триазоло[4,3-b:3',4'-f][1,2,4,5]тетразин (IIa)

К суспензии 1 ммоль (142мг) 3,6-дигидразино-1,2,4,5-тетразина в 5 мл уксусной кислоты добавили раствор 2,1 ммоль (286 мг) 3-метоксибензальдегида в 3 мл уксусной кислоты, перемешивали 1 сутки при комнатной температуре, отфильтровали осадок и промыли этанолом на фильтре. 3,6-Ди(3-метоксибензилиденгидразино)-1,2,4,5-тетразин (Ia). Выход 65%. T. пл.> 214 °C (с разложением). Найдено (%): С, 56.84; Н, 4.77; N, 29.95. С₁₈Н₁₈N₈O₂. Вычислено (%): С, 57.14; Н, 4.79; N, 29.61. Спектр ЯМР ¹H(ДМСО-d₆, д, м.д.): 3.81 (с, 6 Н, 2 МеO); 6.95-6.99 (м, 2H, Ar); 7.25-7.29 (м, 4H, Ar) 7.36 (дд, J₁ = J₂ = 8.1 Гц, 2H, Ar); 8.20 (с, 2 H, 2 N=СН), 11.90 (c, 2H, 2 NH).

К раствору 1 ммоль (378 мг) гидразона Iа в 6 мл смеси ацетонитрил-ДМФА (1:1) при температуре 80 °С порциями по 161 мг с интервалом 15 мин добавили 4,5 ммоль (1,449 г) диацетоксийодбензола. Реакционную массу выдержали при нагревании 30 минут до полного исчезновения исходного гидразона, охладили до комнатной температуры, растворитель упарили, остаток промыли CHCl₃, отфильтровали осадок. 1,8-Бис(3-метоксифенил)бис[1,2,4]триазоло[4,3-b:3',4'-f][1,2,4,5]тетразин (IIa). Выход 65%. Т. пл. > 250 °C (с разложением). Найдено (%): С, 57.56; Н, 3.76; N, 29.87. С₁₈Н₁₄N₈O₂. Вычислено (%): С, 57.75; Н, 3.77; N, 29.93. Спектр ЯМР ¹H(ДМСО-d₆, д, м.д.): 3.66 (с, 6 Н, 2МеO); 6.75-6.81 (м, 2H, Ar); 6.94 (c, 2 H, Ar) 7.09-7.18 (м, 4H, Ar). Спектр ЯМР ¹³C (ДМСО-d₆, д, м.д.): 55.0; 113.9; 117.1; 121.1; 126.4; 129.9; 145.5; 151.1; 158.4. Найдено: m/z 375.1315 [M+H]⁺. C₁₈H₁₄N₈O₂. Вычислено: [M+H]⁺ 375.1312.

Пример 2

1,8-Бис(2,3-диметоксифенил)бис[1,2,4]триазоло[4,3-b:3',4'-f][1,2,4,5]тетразин (IIb)

Получают аналогично примеру 1. 3,6-Ди(2,3-диметоксибензилиденгидразино)-1,2,4,5-тетразин (Ib) синтезируют из 1ммоль (142 мг) 3,6-дигидразино-1,2,4,5-тетразина и 2,1 ммоль (345 мг) 2,3-диметоксибензальдегида. Выход 79%. Т. пл. 225-226 °C. Найдено (%): С, 54.71; Н, 5.07; N, 25.69. С₂₀Н₂₂N₈O₄. Вычислено (%): С, 54.79; Н, 5.06; N, 25.56. Спектр ЯМР ¹H(ДМСО-d₆, д, м.д.): 3.80, 3.84 (оба с, по 6 Н, 4МеO); 7.07 (дд, J₁= 1.2 Гц, J₂ = 8.1 Гц 2H, Ar); 7.13 (дд, J₁= 7.8 Гц, J₂ = 8.1 Гц, 2H, Ar); 7.48 (дд, J₁= 1.2 Гц, J₂ = 7.8 Гц, 2H, Ar); 8.51 (с, 2H, 2N=СН); 11,87 (с, 2H, 2NH).

1,8-Бис(2,3-диметоксифенил)бис[1,2,4]триазоло[4,3-b:3',4'-f][1,2,4,5]тетразин (IIb) получают из 1 ммоль (438 мг) гидразона Ib и 3 ммоль (966 мг) диацетоксийодбензола. Выход 50%. Т. пл. 310-312 °С (с разложнием). Найдено (%): С, 55.09; Н, 4.11; N, 25.65. С₂₀Н₁₈N₈O₄. Вычислено (%): С, 55.30; Н, 4.18; N, 25.79. Спектр ЯМР ¹H(ДМСО-d₆, д, м.д.): 3.37, 3.69 (оба с, по 6 Н, 2 МеO); 6.88 (дд, J₁ = 7.5 Гц, J₂ = 1.9 Гц, 2H, Ar); 6.95-7.02 (м, 4 H, Ar). Спектр ЯМР ¹³C (ДМСО-d₆, д, м.д.): 55.5; 60.9; 116.0; 120.0; 121.9; 123.8; 143.2; 146.5; 150.5; 150.9. Найдено: m/z 435.1519 [M+H]⁺. C₂₀H₁₈N₈O₄. Вычислено: [M+H]⁺ 435.1524.

Пример 3

4,4'-(Бис[1,2,4]триазоло[4,3-b:3',4'-f][1,2,4,5]тетразин-1,8-диил)дибензойная кислота (IIc)

Получают аналогично примеру 1. 4,4'-(2,2'-(1,2,4,5-Тетразин-3,6-диил)бис(гидразин-2-ил-1-илиден))бис(метан-1-ил-1-илиден)дибензойную кислоту (Iс) синтезируют из 1ммоль (142 мг) 3,6-дигидразино-1,2,4,5-тетразина и 2,1 ммоль (315 мг) 4-формилбензойной кислоты. Выход 91%. Т. пл. > 300 °C. Найдено (%): С, 53.05; Н, 3.35; N, 27.69. С₁₈Н₁₄N₈O₄. Вычислено (%): С, 53.20; Н, 3.47; N, 27.58. Спектр ЯМР ¹H(ДМСО-d₆, д, м.д.): 7.82, 8.00 (оба д, J = 8.4 Гц, по 4H, Ar); 8.29 (с, 2 H, 2 N=СН); 12,14 (с, 2 H, 2 NH); 12.59 (уш. с, 2 H, 2 COOH).

4,4'-(Бис[1,2,4]триазоло[4,3-b:3',4'-f][1,2,4,5]тетразин-1,8-диил)дибензойую кислоту (IIc) получают из 1 ммоль (406 мг) гидразона Iс и 6 ммоль (1,932 г) диацетата фенилйодония. Реакционную массу охладили до комнатной температуры, добавили 10 мл воды и отфильтровали выпавший осадок. Осадок кипятили в 20 мл CH₃COOH в течение 30 минут, отфильтровали не охлаждая, высушили, затем перекристаллизовали из смеси CH₃CN-ДМФА 2:1. Выход 40 мг (10%). Т.пл. > 300°С. Найдено (%): С, 53.80; Н, 2.60; N, 27.70. С₁₈Н₁₀N₈O₄. Вычислено (%): С, 53.74; Н, 2.51; N, 27.85 Спектр ЯМР ¹H (ДМСО-d₆, д, м.д.): 7.58-7.66 (м, 8 Н, Ar); 13.09 (с, 2 H, 2 СOOН). Спектр ЯМР ¹³C (ДМСО-d₆, д, м.д.): 128.7; 129.3; 129.5; 132.9; 144.9; 151.2; 165.9. Найдено: m/z 403.0895 [M+H]⁺. C₁₈H₁₀N₈O₄. Вычислено: [M+H]⁺ 403.0898.

Пример 4

Определение антигликирующей активности

Исследование антигликирующей активности проведено по описанной методике [Savateev K.V., Fedotov V.V., Butorin I., etal. // Eur. J. Med. Chem. – 2020. – Vol. 185. – Art. No. 111808]. В качестве субстрата и индуктора реакции гликирования выступают бычий сывороточный альбумин, фракция 5 (БСА, Sigma Aldrich) (концентрация 1 г/л) и глюкоза (Sigma Aldrich) (концентрация 0,5 М) в фосфатном буферном растворе (рН 7,4). Вещество сравнения – аминогуанидин (A). Соединения испытаны в концентрациях 1*10^-2 – 1*10^-5 М, с расчетом IC₅₀ (концентрации полумаксимального ингибирования) на линейном участке зависимости. Соединения вносили в реакционную среду в виде растворов в ДМСО и инкубировали 24 часа при 60°С. Протекание реакции образования КПГ фиксировали по нарастанию флуоресценции (спектрофлуориметр Infinite M200 PRO, Tecan, λ_exitation 370 nm, λ_emission 440 nm). Антигликирующую активность рассчитывали по отношению к интенсивности флуоресценции контрольных образцов по формуле:

100 – A_test*100 / A_control,

где A_test и A_control – значения интенсивности флуоресценции, полученные в экспериментах с исследуемым и контрольным образцом соответственно.

Статистическая обработка проведена в программе GraphPad Prism 7.0, с применением статистического критерия попарного сравнения групп несвязанных данных – критерия Манна-Уитни, при р<0,05, а также методами линейной и нелинейной регрессии.

Лидером по антигликирующей активности, как установлено в эксперименте, является соединение IIc (таблица 1). Данное соединение значительно превосходит соединение сравнения аминогуанидин (A) по показателю IC₅₀. Активность соединений IIa,b является умеренной, соответствующей аминогуанидину, однако значительно превосходящей по показателю IC₅₀ активности всех препаратов сравнения, применяемых в клинической практике.

Пример 5

Определение хелатирующих свойств (антигликоксидационной активности) по методике подавления аутоокисления аскорбиновой кислоты

Исследование провели по методике металл-зависимого аутоокисления аскорбиновой кислоты [Шамшина Д.Д., Литвинов Р.А. // Вестник Волгоградского государственного медицинского университета. – 2018. – № 1 (65). – С. 115-117]. В качестве веществ сравнения применяли липоевую кислоту (E), лозартан (F) и пиоглитазон (G). Для оценки хелатирующих свойств использовали 100 мкМ раствор аскорбиновой кислоты. В качестве катализатора аутооксиления применяли раствор сульфата меди (II) (конечная концентрация 120 мкМ). Комплексообразование проводили предварительным смешением раствора сульфата меди (II) и раствора тестируемого вещества (конечная концентрация 10-200 мкМ) или растворителя (ДМСО 99%) и инкубированием в течении 5 минут при 37°C на водной бане. Запускание реакции аутоокисления осуществляли добавлением проинкубированной смеси к раствору аскорбиновой кислоты. Окисление аскорбиновой кислоты регистрировали спектрофотометрически, по показателю оптической плотности (спектрофотометр APEL PD 303 UV, длина волны 265 нм). IC₅₀ тестируемых веществ определяли методом линейной регрессии.

Статистическая обработка проведена в программе GraphPad Prism 7.0, с применением статистического критерия попарного сравнения групп несвязанных данных – критерия Манна-Уитни, при р<0,05, а также методами линейной и нелинейной регрессии.

Лидером по уровню активности является соединение IIc. Соединения IIa,b оказались очень низкоактивными, а исследование IIb в концентрациях, превышающих указанные для него в таблице, было невозможно ввиду собственного светопоглощения вещества. Препараты сравнения липоевая кислота и лозартан были менее активны, чем соединение IIc, а пиоглитазон соответствовал ему по активности. С целью подтверждения представлений о том, что действие основного референта по механизму антигликирующей активности – аминогуанидина, вероятно, не связано с хелатированием, аминогуанидин также был проанализирован и не показал наличия активности.

Пример 6

Определение антигликоксидационной активности по методике гликирования бычьего сывороточного альбумина в присутствии катионов Cu²⁺.

Анализу в данном тесте были подвергнуты только те соединения, которые показали значимую хелатирующую активность в тесте подавления медь-индуцированного аутоокисления аскорбиновой кислоты.

Исследование проведено по описанной методике [Литвинов Р.А., Косолапов В.А., Муравьева Е.А., Скачко И.В., Шамшина Д.Д. // Вестник Волгоградского государственного медицинского университета. – 2020. – № 2 (74). – С. 61-66]. В качестве субстрата и индуктора реакции гликирования использованы бычий сывороточный альбумин, фракция 5 (БСА, Sigma Aldrich) (1 г/л) и глюкоза (Sigma Aldrich) (0,5 М). Среда содержала HEPES-буфер c ионами меди (ii) (CuSO₄*5H₂O 10мг/л, рН 5,8). В качестве референтов выбраны лозартан (F), пиоглитазон (G) и липоевая кислота (E), обладающие способностью к хелатированию катионов переходных элементов. При этом в качестве основного препарата сравнения рассматривался лозартан, поскольку анти-КПГ действие сартанов основано, как предполагается, на хелатирующем/антиоксидантном действии [Price D.L., Rhett P.M., Thorpe S.R., Baynes J.W. // J Biol Chem. – 2001. – 276(52). – P. 48967-48972]. Аминогуанидин (A) не рассматривался в качестве референта при изучении антигликоксидационных свойств соединений в связи со сведениями о его неоднозначной активности в описанной методике [Литвинов Р.А., Усмиянова Л.Э., Клименко Д.Р., Гонтарева А.В. // Вестник Волгоградского государственного медицинского университета. – 2020. – № 3 (75). – С. 159-165]. Исследуемые и референтные соединения испытаны в концентрациях 1*10^-2 – 1*10^-5 М с расчетом IC₅₀ на линейном участке зависимости. Соединения вносили в реакционную среду в виде растворов в деионизированной воде и инкубировали 24 часа при 60°С. Определение активности и статистическую обработку результатов проводили аналогично примеру 4.

Установлено, что соединение IIc, для которого была показана хелатирующая активность, оказалось высокоактивным антигликоксидативным соединением. Релевантный референт лозартан имел значительно меньшую активность. Прочие референты (липоевая кислота, пиоглитазон) также проявили более низкую активность, чем соединение IIc.

Пример 7

Определение антиагрегантной активности

Антиагрегантную активность исследовали в концентрации 100 мкМ (если не указана иная) на модели АДФ-индуцированной (Sigma, США) агрегации тромбоцитов кролика, по изменению степени светопропускания плазмы, богатой тромбоцитами. Основная методика представлена в [Spasov A.A., Brel A.K., Litvinov R.A., etal. //Russian Journal of Bioorganic Chemistry.– 2018. – Т. 44.– № 6. –С. 769-777]. Эксперименты провели на двухканальном лазерном анализаторе агрегации тромбоцитов 230 LA (НПФ «Биола», Россия). Об активности веществ судили по снижению амплитуды агрегации тромбоцитов по отношению к контролю. В качестве препарата сравнения использовали ацетилсалициловую кислоту (H) (Shandong Xinhua Pharmaceutical Co., Ltd., Китай).

Статистическая обработка проведена в программе GraphPad Prism 7.0, с применением статистического критерия попарного сравнения групп несвязанных данных – критерия Манна-Уитни, при р<0,05, а также методами линейной и нелинейной регрессии.

Наибольшая активность установлена для соединения IIc, которое значительно превосходило препарат сравнения ацетилсалициловую кислоту.

Изобретение относится к производным новой гетероциклической системы – 1,8-диарилбис[1,2,4]триазоло[4,3-b:3',4'-f][1,2,4,5]тетразинам общей формулы IIа-с, которые обладают антигликирующей, антигликоксидационной и антиагрегантной активностями и, как следствие, способностью блокировать образование конечных продуктов гликирования и патологические следствия этого процесса. 7 пр., 4 табл.

1,8-Диарилбис[1,2,4]триазоло[4,3-b:3',4'-f][1,2,4,5]тетразины формулы IIa-c

где R = 3-метоксифенил (IIa), 2,3-диметоксифенил (IIb), 4-карбоксифенил (IIc), обладающие антигликирующей (IIa-с), антигликоксидационной (IIc) и антиагрегантной (IIc) активностями и, как следствие, способностью блокировать образование конечных продуктов гликирования и патологические следствия этого процесса.