Способ очистки фолликулостимулирующего гормона Российский патент 2023 года по МПК C07K14/59 C07K1/18 C07K1/22 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Изобретение относится к способу очистки фолликулостимулирующего гормона (ФСГ), обеспечивающему высокий выход и высокую чистоту.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Различные белковые терапевтические средства, которые могут быть применены в качестве различных терапевтических агентов, используют не только для исследований, нацеленных на получение рекомбинантных белков, но и в клинической практике, и для коммерческой реализации.

Один из таких рекомбинантных белков (т.е. фолликулостимулирующий гормон (ФСГ)) представляет собой гормон, вырабатываемый гонадотропными клетками передней доли гипофиза; он высвобождается в кровяное русло и наряду с лютеинизирующим гормоном (ЛГ) участвует в регулировании созревания ооцитов в женском организме и в регулировании сперматогенеза в мужском организме. Человеческий ФСГ применяют для лечения женщин, в организме которых не происходит овуляции, для стимуляции множественной овуляции (суперовуляции) и для получения препаратов для искусственного оплодотворения (например, для экстракорпорального оплодотворения (ЭКО), для процедур интрацитоплазматической инъекции сперматозоида (ИКСИ), переноса гаметы в маточную трубу (ПГМТ) и переноса зиготы в маточную трубу (ПЗМТ). Кроме того, человеческий ФСГ применяют для стимуляции созревания фолликулов в организме женщин с низким уровнем выработки ФСГ или с его отсутствием и для стимуляции сперматогенеза у мужчин, страдающих олигоспермией.

Ввиду важности ФСГ для терапии репродуктивных нарушений, существует необходимость предоставления рекомбинантного ФСГ с высокой чистотой и высокоспецифичным действием.

Терапия ФСГ требует многократных инъекций, а препараты высокочистого ФСГ могут быть введены подкожно, что позволяет пациентам самим вводить себе препараты, что повышает удобство для пациента и приверженность к лечению.

В опубликованной международной заявке WO 2006/051070 А1 описан способ очистки ФСГ, который включает следующие стадии: 1) проведение аффинной хроматографии с красителем в качестве лиганда, 2) проведение хроматографии с гидрофобным взаимодействием и 3) проведение хроматографии с обращенной фазой; и способ очистки ФСГ, который включает следующие стадии: 1) проведение анионообменной хроматографии, 2) проведение аффинной хроматографии с красителем в качестве лиганда, 3) проведение хроматографии с гидрофобным взаимодействием, 4) проведение хроматографии с обращенной фазой и 5) проведение анионообменной хроматографии.

В опубликованной международной заявке WO 2005/063811 А1 описан способ для рекомбинантного ФСГ человека, где способ включает следующие стадии: 1) проведение ионообменной хроматографии; 2) проведение хроматографии с применением иммобилизованных ионов металлов; и 3) проведение хроматографии с гидрофобным взаимодействием (ХГВ).

В опубликованной международной заявке WO 2007/065918 А2 описан способ очистки ФСГ или мутированного ФСГ, который включает следующие стадии, которые могут быть выполнены в любом порядке: аффинная хроматография с красителем в качестве лиганда; анионообменная хроматография со слабым анионообменником; хроматография с гидрофобным взаимодействием; и анионообменная хроматография с сильным анионообменником.

Таким образом, все еще имеется необходимость создания нового способа очистки рекомбинантного ФСГ и вариантов ФСГ. В частности, аффинную хроматографию с красителем в качестве лиганда в основном применяют при очистке ФСГ на стадии улавливания. Несмотря на то, что преимуществом применения аффинной хроматографии с красителем в качестве лиганда является высокая степень извлечения целевого белка за счет удаления компонентов питательной среды из культуральной среды, недостаток этого способа состоит в пониженной способности к удалению загрязняющих веществ, получаемых из остатков клеток-хозяев. Такие загрязняющие вещества разнообразны и имеют весьма сложный состав и, следовательно, не могут быть идентифицированы как одно вещество. Таким образом, существует большой риск изменения качества целевого белка, и, кроме того, эти изменения сложно контролировать. Кроме того, для последующего удаления большого количества загрязняющих веществ, после проведения стадии улавливания требуется проведение сложного стадии очистки, что, таким образом, снижает выход.

Вследствие вышеуказанного, авторы изобретения предприняли попытку создать способ очистки с целью получения ФСГ с высокой чистотой и высоким выходом. В результате было обнаружено, что эффективное упорядочивание последовательности осуществления способа очистки наряду с установлением количества операций промывки и промывного растворителя на стадии промывки операции иммуноаффинной хроматографии (ИАХ) позволяет повысить эффективность способа при одновременном повышении выхода и достижении максимальной эффективности удаления загрязнений, что и составляет задачу изобретения.

ТЕХНИЧЕСКАЯ ЗАДАЧА

Задача изобретения состоит в предоставлении способа очистки фолликулостимулирующего гормона (ФСГ), где способ включает этап проведения иммуноаффинной хроматографии (ИАХ).

РЕШЕНИЕ ТЕХНИЧЕСКОЙ ЗАДАЧИ

Ниже изобретение раскрыто более подробно.

Следует понимать, что соответствующие описания и воплощения, раскрытые в этом документе, также могут относиться к другим описаниям и воплощениям. То есть все комбинации различных элементов, раскрытых в описании, включены в объем изобретения. Также следует понимать, что объем изобретения не ограничен конкретным описанием, приведенным ниже.

Кроме того, специалисты в данной области техники на основании лишь обычных экспериментов могут понять или создать множество воплощений, эквивалентных конкретным аспектам изобретения, описанным в этой заявке. При этом такие эквиваленты также включены в объем этой заявки.

Один из аспектов изобретения относится к способу очистки фолликулостимулирующего гормона (ФСГ), где способ включает стадию проведения иммуноаффинной хроматографии (ИАХ), и иммуноаффинная хроматография (ИАХ) включает этап промывки, где промывку осуществляют по меньшей мере 3 раза.

Способ очистки согласно изобретению представляет собой способ очистки фолликулостимулирующего гормона (ФСГ), обеспечивающий высокий выход и высокую чистоту.

В частности, способ очистки может представлять собой способ очистки, осуществляемый в следующей последовательности, который включает; (а) проведение иммуноаффинной хроматографии (ИАХ); (b) проведение хроматографии с гидрофобным взаимодействием (ХГВ); и (с) проведение анионообменной хроматографии (АОХ).

Способ очистки согласно изобретению может представлять собой способ, в котором хроматографию на каждой из стадий (а)-(с) осуществляют только один раз, и не осуществляют дополнительную хроматографию.

Дополнительная хроматография может представлять собой один или более способов, выбранный из группы, состоящей из гель-фильтрационной хроматографии, аффинной хроматографии с красителем в качестве лиганда, хроматографии с обращенной фазой и катионообменной хроматографии, однако, выбор дополнительного способа хроматографии не ограничен перечисленными способами.

Способ очистки по изобретению отличается тем, что его осуществление позволяет удалять белки, получаемые из клетки-хозяина (т.е. загрязняющие вещества), а также повышать выход очистки, даже в тех случаях, когда хроматографию каждой из стадий (а)-(с) выполняют только один раз.

Используемый в документе термин «фолликулостимулирующий гормон (ФСГ)» относится к гормону, который вырабатывается гонадотропными клетками передней доли гипофиза и высвобождается в кровяное русло. Наряду с лютеинизирующим гормоном (ЛГ), ФСГ регулирует созревание ооцитов в женском организме и сперматогенез в мужском организме. ФСГ и ЛГ относятся к группе гетеродимерных гликопротеинов, которые состоят из двух нековалентно связанных α и β цепей, кодируемых индивидуальными генами. Цепи α и β гликозилированы. В то время как α-субъединица состоит из 92 аминокислотных остатков, β-субъединица состоит из 111 аминокислотных остатков, и каждая из субъединиц имеет два потенциальных участка гликозилирования, связанных с аспарагином.

Человеческий ФСГ применяют при лечении женщин, в организме которых не происходит овуляции, для стимуляции множественной овуляции (суперовуляции) и для получения препаратов для искусственного оплодотворения (например, для процедур ЭКО, ИКСИ, ПГМТ и ПЗМТ). Кроме того, человеческий ФСГ применяют для стимуляции созревания фолликулов в организме женщин с низким уровнем выработки ФСГ или с его отсутствием и для стимуляции сперматогенеза у мужчин, страдающих олигоспермией.

В соответствии с обычным режимом терапии для инициирования овуляции, пациентки ежесуточно получают ФСГ или его вариант посредством инъекции в количестве от приблизительно 75 ME (международных единиц) ФСГ/сутки до приблизительно 450 ME ФСГ/сутки, в течение периода от приблизительно 6 до приблизительно 12 суток. В соответствии с обычным режимом терапии для контролируемой гиперстимуляции яичников, пациентки ежесуточно получают ФСГ или его вариант посредством инъекции в количестве от приблизительно 150 ME ФСГ/сутки до приблизительно 600 ME ФСГ/сутки, в течение периода от приблизительно 6 до приблизительно 12 суток.

Таким образом, терапия ФСГ требует многократных инъекций, для которых необходимы высокочистые препараты ФСГ.

Для этой цели авторы изобретения попытались повысить выход, максимально улучшить способность удалять белки, получаемые из клетки-хозяина (т.е. загрязняющие вещества), и максимально улучшить удаление загрязняющих веществ посредством оптимизации технологических стадий элюирования колонки за счет эффективного упорядочивания последовательности проведения способа очистки, а также за счет установления количества операций промывки и промывного растворителя на стадии промывки при проведении способа очистки иммуноаффинной хроматографией (ИАХ), что позволяет снизить количество стадий очистки и повысить эффективность способа.

Каждая стадия способа очистки фолликулостимулирующего гормона более подробно описана ниже. Первая стадия (а) представляет собой стадию проведения иммуноаффинной хроматографии (ИАХ).

Используемый в документе термин «иммуноаффинная хроматография (ИАХ)» относится к способу, в котором: получают антитело к подлежащему очистке физиологически активному материалу, которое ковалентно связывают с твердым носителем; к комплексу антитело-носитель добавляют образец, содержащий подлежащий очистке физиологически активный материал, в результате чего физиологически активный материал адсорбируется на антителе; к системе подходящим образом добавляют элюент и путем элюирования получают целевой материал. Согласно изобретению, в иммуноаффинной хроматографии для очистки ФСГ применяют обменную смолу, которая задействует принцип селективного захвата исключительно ФСГ с использованием колонки и которая включает ФСГ-специфичный белок (т.е. белок, который связывается с альфа-субъединицей или бета-субъединицей ФСГ); такую смолу получают связыванием ФСГ-специфичного белка с подходящей матрицей с помощью определенного белка, имеющего схожие с ней структурные, физические и химические характеристики.

Иммуноаффинная хроматография для очистки ФСГ включает применение смолы CaptureSelect™ FHS (Thermo Fisher Scientific) и т.д., но не ограничена им и, в целом, может быть применена любая смола, которую применяют для иммуноаффинной хроматографии и которая специфично связывается с ФСГ.

Преимуществом этого способа является то, что он позволяет быстрее и в больших количествах извлекать физиологически активные материалы по сравнению с традиционными способами (т.е. такими способами, как гель-фильтрация, ионообменная хроматография и т.д.).

Для осуществления изобретения иммуноаффинная хроматография может включать выполнение одной или более стадий, выбранных из группы, состоящей из стадии уравновешивания, стадии ввода образца, стадии промывки, стадии элюирования и стадии очистки смолы.

Для реализации принципа иммуноаффинности может быть применен буферный раствор, рН которого составляет от 7 до 8; может быть применен раствор трис(гидроксиметил)аминометана (трис) с молярностью от 10 мМ до 50 мМ; в одном из воплощений может быть применен такой буферный раствор, как раствор трис, фосфатно-солевой буферный раствор (ФСБ), раствор 3-морфолинопропан-1-сульфоновой кислоты (MOPS), сульфоната, 2-[4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-ил]этансульфоновой кислоты (HEPES), 2-{[1,3-дигидрокси-2-(гидроксиметил)пропан-2-ил]амино}этан-1-сульфоновой кислоты (TES), фосфата и/или изопропанола и т.д., однако, выбор буферного раствора не ограничен перечисленными веществами.

Стадией уравновешивания называют стадию создания в колонке среды (например, с подходящим рН, концентрацией соли и т.д.), способствующей фиксации ФСГ, содержащегося в культуральной среде, на хроматографической колонке.

Для осуществления изобретения, в описанной выше стадии (а) загрязняющие вещества, включающие белки, получаемые из клеток-хозяев, за исключением ФСГ, который совместно с другими белками адсорбирован на колонке, могут быть удалены стадии путем проведения стадии промывки один или более раз, в частности, проведением стадии промывки три или более раза; однако, число стадий промывки не ограничено указанными значениями.

Стадией промывки называют стадию удаления других загрязняющих веществ, включающих белки, получаемые из клеток-хозяев, за исключением ФСГ, который совместно с другими белками адсорбирован на колонке. Могут быть удалены не только белки, получаемые из клеток-хозяев, но и компоненты культуральной среды. В это воплощение включен многостадийную стадию промывки. Более конкретно, может быть применен буферный раствор, рН которого составляет от 7 до 8; также, буферный раствор, имеющий означенный выше диапазон рН, может быть применен на всех стадиях: стадии уравновешивания, стадии промывки и стадии элюирования.

В одном из воплощений на первой стадии промывки могут быть удалены загрязняющие вещества, не обладающие специфичностью или имеющие слабо выраженную специфичность по отношению к смоле для иммуноаффинной хроматографии, или загрязняющие вещества с относительно низкой гидрофобностью. В частности, в среде, содержащей соли, соли могут находиться в виде ионов, и эти ионы могут окружать белки, в результате чего суммарный заряд может становиться близким к нулю, что соответствует гидрофобному состоянию. Не обладающие специфичностью загрязняющие вещества, связанные со смолой в таком состоянии, могут быть удалены на стадии промывки, поскольку в отсутствие солей или при очень низкой концентрации соли такие загрязняющие вещества десорбируются. На первой стадии промывки согласно изобретению может быть применен трис с молярностью от 2 мМ до 50 мМ, и, в частности, трис с молярностью от 2 мМ до 10 мМ, но выбор молярности трис не ограничен указанными величинами. Кроме того, промывной раствор первой стадии промывки может представлять собой любой один или более раствор, выбранный из группы, состоящей из раствора трис, ФСБ, 3-морфолинопропан-1-сульфоновой кислоты (MOPS), сульфоната, 2-[4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-ил]этансульфоновой кислоты (HEPES), TES, фосфата и/или изопропанола, но выбор промывного раствора не ограничен указанными веществами.

На второй стадии промывки могут быть удалены загрязняющие вещества с относительно слабым сродством к связыванию ионов со смолой для иммуноаффинной хроматографии. В частности, смола может обладать полярностью, и со смолой может связываться часть белка, имеющая противоположную ей полярность. В этом случае, когда Na⁺ и Cl^-, будучи сильнополярными ионами, проникают в присоединенные к смоле материалы, не обладающие специфичностью, может происходить обменное взаимодействие, в результате которого Na⁺ и Cl^- будут присоединяться к смоле, а не обладающие специфичностью загрязняющие вещества будут отщепляться от смолы. На второй стадии промывки согласно изобретению может быть применен трис с молярностью от 10 мМ до 50 мМ, и, в частности, трис с молярностью от 10 мМ до 30 мМ, хотя выбор молярности трис не ограничен указанными значениями. Кроме того, применяемая соль может быть от 0,5 М или более до 4,5 М или менее, от 0,5 М или более до 4,0 М или менее, от 0,5 М или более до 3,5 М или менее, от 0,5 М или более до 3,0 М или менее, от 0,5 М или более до 2,5 М или менее, от 0,5 М или более до 2,0 М или менее, от 0,5 М или более до 1,5 М или менее, от 1,0 М или более до 4,5 М или менее, от 1,0 М или более до 4,0 М или менее, от 1,0 М или более до 3,5 М или менее, от 1,0 М или более до 3,0 М или менее, и, в частности, от 0,5 М до 1,5 М. В одном из воплощений применяемая соль может включать сульфат натрия, хлорид натрия, сульфат аммония, хлорид аммония и/или хлорид магния и т.д.; в частности, соль может представлять собой хлорид натрия, но выбор применяемой соли не ограничен перечисленными веществами.

На третьей стадии промывки могут быть удалены загрязняющие вещества с относительно слабым, по сравнению с ФСГ, сродством к связыванию ионов со смолой для иммуноаффинной хроматографии, и может быть применен трис с молярностью от 10 мМ до 50 мМ, и, в частности, трис с молярностью от 10 мМ до 30 мМ, хотя выбор молярности трис не ограничен указанными значениями. Кроме того, применяемая концентрация соли может составлять от 0,001 М или более до 1,0 М или менее, от 0,001 М или более до 0,75 М или менее, от 0,001 М или более до 0,5 М или менее, от 0,005 М или более до 1,0 М или менее, от 0,005 М или более до 0,75 М или менее, от 0,005 М или более до 0,5 М или менее, от 0,01 М или более до 1,0 М или менее, от 0,01 М или более до 0,75 М или менее, от 0,01 М или более до 0,5 М или менее, от 0,1 М или более до 1,0 М или менее, от 0,1 М или более до 0,75 М или менее, от 0,1 М или более до 0,5 М или менее, и, в частности, от 0,1 М до 0,3 М; однако диапазон применяемой концентрации соли не ограничен указанными величинами. В одном из воплощений применяемая соль может включать сульфат натрия, хлорид натрия, сульфат аммония, хлорид аммония и/или хлорид магния и т.д.; в частности, соль может включать хлорид магния, но выбор применяемой соли не ограничен перечисленными веществами. В общем случае для элюирования белков из смолы в качестве соли применяют хлорид магния, который применяют в высокой концентрации, от 1,5 М до 2,5 М. Однако на третьей стадии согласно изобретению применяют низкую концентрацию соли, от 0,1 М до 0,5 М, поскольку на третьей стадии промывки могут быть удалены те белки, которые неспецифично связываются со смолой, но при этом должно сохраняться связывание между смолой и антителами к целевому белку, получаемому согласно изобретению.

Для целей изобретения содержание белков клеток-хозяев (БКХ) после проведения промывки три или более раз способом иммуноаффинной хроматографии может составлять от 0,01 млн доли до 350 млн долей, от 0,1 млн доли до 340 млн долей, от 1 млн доли до 330 млн долей, от 3 млн долей до 320 млн долей, от 5 млн долей до 300 млн долей и, в частности, 250 млн долей или менее, но не ограничено указанными значениями. Кроме того, выход очистки после проведения промывки три или более раз может составлять 60% или более, однако, выход очистки не ограничен указанной величиной.

В одном из воплощений изобретения было показано, что выход очистки от белков клетки-хозяина различается в зависимости от вида промывного растворителя и количества операций промывки, используемых на первой стадии очистки (ИАХ) (пример 2). В частности, было подтверждено, что содержание БКХ было самым низким при осуществлении промывки по меньшей мере три раза промывным растворителем определенного вида и определенной концентрации. В частности, было подтверждено, что после первой стадии промывки содержание БКХ снизилось до величины менее 4000 млн долей, после второй стадии промывки - до величины менее 50 млн долей, и после третьей стадии промывки - до величины менее 250 млн долей.

Стадией элюирования называют стадию извлечения ФСГ, связанного со смолой. Для преодоления иммунного сродства между ФСГ и смолой может быть применен хлорид магния (MgCl₂), и, в частности, элюирование может быть проведено при концентрации соли, составляющей от 1,5 М до 2,5 М, в буферном растворе с рН от 7 до 8. В одном из воплощений применяемая соль может включать сульфат натрия, хлорид натрия, сульфат аммония, хлорид аммония и/или хлорид магния и т.д., и, в частности, соль может включать хлорид магния; однако, выбор применяемой соли не ограничен указанными веществами.

Кроме того, может быть применен другой способ элюирования ФСГ, а именно, буферным раствором глицина с рН раствора от 2,5 до 3,5, однако, выбор буферного раствора не ограничен этим.

Стадия очистки смолы (безразборной очистки, CIP) представляет собой стадию полного удаления остаточного ФСГ, микроорганизмов и других загрязняющих веществ, остающихся в колонке, для предотвращения переноса остатков предыдущей пробы в последующие. Применяемый буфер элюирования может включать лимонную кислоту, уксусную кислоту, фосфорную кислоту, РАВ, мочевину, гидрохлорид гуанидина и/или изопропанол, NaOH и/или этанол и т.д.; в частности, можно использовать уксусную кислоту в концентрации от 0,1 М до 1 М, но выбор буфера элюирования не ограничен указанными веществами.

В способе очистки ФСГ указанная выше стадия (b) представляет собой стадию проведения хроматографии с гидрофобным взаимодействием (ХГВ).

Хроматография с гидрофобным взаимодействием относится к обменной смоле, использующей обратимое взаимодействие между белками и гидрофобной поверхностью среды. Белки связываются с колонкой при высокой ионной силе раствора (т.е. при высокой концентрации соли), и эти белки разделяются между собой по мере постепенного понижения ионной силы раствора.

В целях осуществления изобретения хроматография с гидрофобным взаимодействием может включать выполнение одной или более стадий, выбранных из группы, состоящей из стадии ввода образца, стадии уравновешивания, стадии промывки, стадии элюирования и стадии очистки смолы.

Используемый в документе термин «хроматография с гидрофобным взаимодействием (ХГВ)» относится к способу разделения, основанному на гидрофобном взаимодействии между матрицей, содержащей гидрофобные функциональные группы (например, фенил, октил, (изо)пропил, бутил, этил и т.д.), и определенными молекулами.

Более конкретно, такой тип хроматографии может быть проведен с использованием смолы для ХГВ, имеющей относительно слабогидрофобную поверхность (по сравнению с гораздо более гидрофобной поверхностью смолы для хроматографии с обращенной фазой). Обычно белки с гидрофобным характером поверхности присоединяются к смолам, которые содержат группу простого эфира, фенильную, бутильную или гексильную группу. Согласно изобретению, смола, применяемая в хроматографии с гидрофобным взаимодействием, может представлять собой смолу, в которой присутствует функциональная группа, выбранная из группы, состоящей из фенила, октила, (изо)пропила, бутила и этила; тем не менее, выбор смолы не ограничен этим, и может быть применена любая смола, обычно применяемая для хроматографии с гидрофобным взаимодействием.

Стадией уравновешивания при проведении хроматографии с гидрофобным взаимодействием называют стадию создания внутри колонки среды (например, с подходящим рН, концентрацией соли и т.д.), способствующей присоединению к колонке ФСГ, который содержится в элюате, получаемом на стадии иммуноаффинной хроматографии. В частности, применяемая концентрация соли может составлять от 1,5 М до 2,5 М, и в одном из воплощений может быть применен сульфат натрия, хлорид натрия, сульфат аммония и/или хлорид аммония и т.д. Дополнительно может быть применен буферный раствор, рН которого составляет от 7 до 8, а также может быть применен трис с молярностью от 10 мМ до 50 мМ. Приведенные выше условия могут быть применены ко всем стадиям: стадии уравновешивания, стадии промывки и стадии элюирования.

На стадии ввода образца может быть применен элюат, получаемый путем иммуноаффинной хроматографии.

Для осуществления изобретения на стадии промывки применяли уравновешивающий буферный раствор, который позволяет удалять загрязняющие вещества, неспецифично связывающиеся со смолой.

Стадия элюирования относится к стадии извлечения ФСГ, связанного со смолой. Для ингибирования гидрофобного взаимодействия между ФСГ и смолой может потребоваться среда, не содержащая соли или содержащая низкую концентрацию соли. Кроме того, может быть применен буферный раствор с рН от 7 до 8, и может быть применен трис с молярностью от 10 мМ до 50 мМ; однако выбор буферного раствора не ограничен указанными реагентами.

Стадия очистки смолы (CIP) представляет собой стадию полного удаления остаточного ФСГ, микроорганизмов и других загрязняющих веществ, остающихся в колонке, для предотвращения переноса остатков предыдущей пробы в последующие. Оставшийся ФСГ может быть извлечен с помощью очищенной воды и, дополнительно, могут быть применены гидроксид натрия (NaOH), фосфорная кислота и т.д., но осуществление изобретения не ограничено применением указанных реагентов.

При осуществлении изобретения задачей описанной выше стадии (b) является дополнительное повышение чистоты ФСГ за счет дополнительного удаления загрязняющих веществ (например, белков, получаемых из клеток-хозяев и т.д.), которые не могут быть удалены на стадии (а). При выполнении этой стадии белки, получаемые из клеток-хозяев, могут быть более эффективно удалены с помощью устройства для фильтрования, способного удалять получаемые из клетки-хозяина белки посредством гидрофобной реакции и пр., то есть с помощью способа, отличающегося от способа иммуноаффинного хроматографического разделения, осуществляемого на стадии (а), механизмом разделения.

Используемый в документе термин «белок клетки-хозяина» (БКХ), который представляет собой белок, отличный от ФСГ, обычно относится к белку, получаемому из клетки-хозяина. Для антител или белков, которые могут быть применены в качестве фармацевтических лекарственных средств, предпочтительно, чтобы БКХ были исключены из индивидуального антитела или белка. Удаление белков клеток-хозяев это концепция, которая включает удаление всех веществ, кроме подлежащего очистке ФСГ, и они могут включать не только сами белки клеток-хозяев, но также и ДНК, факторы роста клеток и т.д., получаемые из клетки-хозяина. Таким образом, при удалении белков клеток-хозяев, может быть выделен только подлежащий очистке целевой белок с высокой степенью чистоты.

В описанном выше способе очистки ФСГ стадия (с) представляет собой стадию проведения анионообменной хроматографии (АОХ).

Ионообменная хроматография относится к обменной смоле, принцип действия которой основан на обратимом взаимодействии между средой и поверхностью белка за счет суммарных зарядов (т.е. на разности величин ионной силы).

Репрезентативные примеры сильных ионообменных групп включают Q и SP, и репрезентативные примеры слабых ионообменных групп включают DEAE, ANX, СМ и т.д. Поскольку каждая из них имеет определенный диапазон рН, в котором она имеет значительный заряд, возможен выбор селективности. Ионообменные смолы делятся на анионообменные смолы и катионообменные смолы, и в частности, для осуществления изобретения применяли анионообменные смолы.

Используемый в документе термин «анионообменная хроматография (АОХ)» относится к хроматографии, в которой применяют колонку, заполненную анионообменной смолой, и на описанной выше стадии при проведении анионообменной хроматографии могут быть дополнительно удалены загрязняющие вещества, в частности, белки клеток-хозяев, и могут быть селективно выделены изоформы, имеющие требуемую изоэлектрическую точку.

Анионообменной смолой называют синтетическую смолу, которую помещают в различные водные растворы для обмена ее анионов на определенные анионы, находящиеся в водном растворе, и на анионообменной колонке могут адсорбироваться белки, содержащие анионы, выше изоэлектрической точки этих белков. В случае ФСГ, согласно изобретению, третью стадию очистки осуществляют таким образом, что когда используют буфер с нейтральным рН, белок (ФСГ) связывается с анионообменной смолой, поскольку его изоэлектрическая точка находится низкая, а при пропускании элюата после промывки целевой белок (т.е. ФСГ) отделяется.

В качестве анионообменных смол могут быть применены смолы, обычно применяемые в данной области техники, но выбор анионообменных смол не ограничен ими. В частности, могут быть применены: Q Sepharose, смолы с четвертичными аминоэтильными группами, с четвертичными аминогруппами (Q) и т.д., и, более конкретно, может быть применена смола Q Fast Flow™.

Для осуществления изобретения анионообменная хроматография может включать выполнение одной или более стадий, выбранных из группы, состоящей из стадии ввода образца, стадии уравновешивания, стадии промывки, стадии элюирования и стадии очистки смолы.

Стадией уравновешивания называют стадию создания в колонке среды (например, с подходящим рН, концентрацией соли и т.д.), способствующей связыванию ФСГ, полученного хроматографией с гидрофобным взаимодействием, с материалом хроматографической колонки. Может быть применен буферный раствор, рН которого составляет от 7 до 8, и может быть применен трис с молярностью от 10 мМ до 50 мМ; однако выбор буферного раствора не ограничен этим. Такой буферный раствор может быть применен как на стадии уравновешивания, так и на стадии элюирования, но не на стадии промывки.

Стадией промывки называют стадию удаления загрязняющих веществ, адсорбированных на колонке. Кроме того, могут быть селективно удалены изоформы, отличающиеся от изоформ, имеющих требуемую изоэлектрическую точку. Может быть применен буферный раствор, рН которого составляет от 5 до 6, и может быть применен ацетат с молярностью от 1 мМ до 100 мМ, и, в частности, ацетат с молярностью от 10 мМ до 50 мМ, однако, выбор буферного раствора не ограничен ими. Кроме того, в одном из воплощений может быть применен ацетат, цитрат и т.д., однако, выбор буферного раствора не ограничен ими.

Стадией элюирования называют стадию извлечения ФСГ, связанного со смолой. Условия элюирования могут включать концентрацию соли от 0,05 М до 0,2 М, в буферном растворе с рН от 7 до 8. В одном из воплощений может быть применен сульфат натрия, хлорид натрия, сульфат аммония и/или хлорид аммония и т.д., однако, выбор применяемой соли не ограничен указанными веществами.

Стадия очистки смолы (CIP) представляет собой стадию полного удаления остаточного ФСГ, микроорганизмов и других загрязняющих веществ, остающихся на колонке, для предотвращения переноса остатков предыдущей пробы в последующие. В одном из воплощений может быть применен гидроксид натрия (NaOH), фосфорная кислота и т.д., но способ не ограничен этими реактивами.

Удаление белков клеток-хозяев - это концепция, которая включает удаление всех веществ, кроме подлежащего очистке ФСГ, как указано выше, и удаляемые вещества могут включать не только сами белки клеток-хозяев, но также и ДНК, факторы роста клеток и т.д., полученные из клетки-хозяина. Таким образом, при удалении белков клеток-хозяев, может быть выделен только подлежащий очистке целевой белок с высокой степенью чистоты.

Согласно изобретению, проведение стадий (а)-(с) способа очистки ФСГ (т.е. трехстадийного колоночного способа) позволяет в конечном итоге выделить ФСГ с высокой чистотой и высоким выходом, из которого эффективно удалены загрязняющие вещества, в частности, белки клеток-хозяев.

Согласно изобретению, после проведения стадий (а)-(с) может быть дополнительно осуществлен любой из способов, выбранный, без ограничений, из концентрирования и диализа или фильтрования. Кроме того, может быть включен способ фильтрации вирусов и способ замены буфера с маточным буферным раствором (ультрафильтрации/диафильтрации), однако, изобретение не ограничено выбором лишь указанных способов.

По завершении окончательной очистки содержание белков клеток-хозяев (БКХ), может составлять от 0,001 млн доли до 50 млн долей, в частности, от 0,01 млн доли до 40 млн долей, от 0,1 млн доли до 30 млн долей, от 1 млн доли до 30 млн долей, от 3 млн долей до 25 млн долей и, в частности, от 5 млн долей до 20 млн долей, и, более конкретно, от 0,01 млн доли до 12 млн долей; однако, содержание белков клеток-хозяев не ограничено указанными значениями. В одном из воплощений изобретения было подтверждено, что содержание белков клеток-хозяев после первой очистки было снижено до уровня менее, чем 200 млн долей, после второй очистки - до менее, чем 50 млн долей, и после третьей очистки - до менее, чем 15 млн долей (пример 3-2). В частности, было показано, что содержание белков клеток-хозяев менее 12 млн долей, может быть достигнуто только после проведения трех стадий, т.е. стадий иммуноаффинной хроматографии, хроматографии с гидрофобным взаимодействием и анионообменной хроматографии в указанном порядке, что подтверждает полезный эффект изобретения (пример 3-2).

Описанный выше способ может быть применен для уравновешивания колонки буферным раствором, имеющим рН 7 или более и 8 или менее, перед вводом образца на описанных выше стадиях (а)-(с). Буферный раствор может представлять собой любой один или более растворов, выбранных из группы, состоящей из трис, ФСБ, 3-морфолинопропан-1-сульфоновой кислоты (MOPS), сульфоната, 2-[4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-ил]этансульфоновой кислоты (HEPES), TES и фосфата, в частности, трис, однако, выбор буферного раствора не ограничен ими.

Дополнительно, на стадиях (а)-(с) описанного выше способа может быть выполнена стадия промывки, включающая одну или более промывок промывным раствором, имеющим рН 4 или более и 8 или менее. Его осуществляют для удаления первичных загрязняющих веществ, поступающих с культуральной жидкостью, и для повышения чистоты образца. Промывной раствор может представлять собой раствор, который включает одну или более солей, выбранных из группы, состоящей из фосфата натрия, хлорида калия, хлорида магния, фосфата калия, хлорида натрия, трис, 3-морфолинопропан-1-сульфоновой кислоты (MOPS), PIPES, 2-[4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-ил]этансульфоновой кислоты (HEPES), цитрата, ацетата, сукцината, цитрата натрия, ацетата натрия, сукцината натрия, сульфата натрия, сульфата аммония, хлорида аммония и/или хлорида магния, однако, выбор промывного раствора не ограничен ими.

ФСГ, выделенный способом очистки согласно изобретению, может представлять собой ФСГ, чистота которого составляет, но не ограничена, 90% или более, в частности, 90% или более, 91% или более, 92% или более, 93% или более, 94% или более, 95% или более, 96% или более, 97% или более, 98% или более, или 99% или более и, более конкретно, 99% или более. Используемый в документе термин "чистота" относится к чистому ФСГ, из которого удалены загрязняющие вещества. Например, если чистота составляет 92%, то оставшиеся 8% составляют загрязняющие вещества. Кроме того, чистота может просто представлять собой чистоту материала, отделенного от элюата, но выраженная в процентах конечная чистота может быть различной в зависимости от чистоты загружаемого образца.

Дополнительно, после очистки ФСГ от элюата чистота ФСГ может быть определена способом ВЭЖХ, анализом на основе электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel Electrophoresis, SDS-PAGE) и т.д., однако, выбор способа анализа не ограничен указанными способами.

В этом воплощении было подтверждено, что конечный выход был наиболее высоким и содержание белков клеток-хозяев (БКХ), было наиболее низким, если последовательность выполнения способа была следующей: ИАХ → ХГВ → АОХ, то есть согласно способу очистки в соответствии с изобретением. Эти результаты не только подтверждают то, что эффективность очистки повышается при увеличении количества проведенных хроматографий, но и указывают на то, что эффективность очистки оказывается различной в разных способах в зависимости от организации самого способа, несмотря на то, что в каждом из способов выполняли одни и те же три вида хроматографии (т.е. иммуноаффинную хроматографию, хроматографию с гидрофобным взаимодействием и анионообменную хроматографию).

Дополнительно, ФСГ, очищенный способом очистки согласно изобретению, может быть применен в качестве белкового терапевтического средства. Используемый в документе термин "белковое терапевтическое средство" является общим названием белков, обычно применяемых в биомедицине, и относится к белкам, имеющим разнообразную физиологическую активность. К физиологической активности относится действие, регулирующее экспрессию генов и физиологические функции таким образом, чтобы скорректировать аномалии, вызываемые дефицитом или избыточной секрецией веществ, участвующих в функциональном регулировании in vivo, и такое действие может включать введение обычных белковых терапевтических средств.

ПОЛЕЗНЫЕ ЭФФЕКТЫ

Как показано в способе очистки согласно изобретению, эффективная организация последовательности выполнения способа очистки позволят повышать эффективность способа, а также одновременно повышать выход ФСГ и максимально усиливать способность удалять загрязняющие вещества.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг. 1 представлены результаты определения чистоты способом гель-фильтрационной ВЭЖХ (SE-HPLC).

На фиг. 2 представлены результаты определения содержания оксида способом ВЭЖХ с обращенной фазой (RP-HPLC).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Далее изобретение раскрыто более подробно с помощью нижеследующих примеров. Однако эти примеры приведены для иллюстрации изобретения и не ограничивают его объем.

ПРИМЕР 1: способ очистки

ПРИМЕР 1-1: последовательность выполнения способа очистки

Как было описано выше, для оптимизации стадий очистки и порядка проведения способа очистки ФСГ, белок ФСГ очищали пятнадцатью различными способами очистки. В зависимости от испытания, очистку осуществляли вплоть до стадии 1, стадии 2 или стадии 3, и в каждом стадии собирали очищенную жидкость.

Поскольку в каждой последующей стадии в качестве загружаемого образца применяли жидкость, очищенную на предыдущем стадии, при необходимости может быть выполнена предварительная обработка (например, разбавление или замена буфера в способе АОХ и добавление соли в способе ХГВ и т.д.). Все основные условия проведения очистки способами ИАХ, ХГВ и АОХ были одинаковы. ПРИМЕР 1-2: условия очистки на каждой стадии

Ниже в таблицах 2-4 приведены буферные растворы, применяемые в каждом из способов очистки, и конкретные условия проведения.

ПРИМЕР 2: Сравнение содержания БКХ в соответствии со стадией промывки способа очистки ИАХ

ПРИМЕР 2-1

Стадия промывки ИАХ

Полагая, что конечная эффективность очистки повысится, если увеличить количество операций промывки при удалении БКХ способом ИАХ, авторы изобретения попытались создать оптимальные условия очистки способом ИАХ, включающие оптимальное количество операций промывки, вид промывного раствора и т.д. Так, промывные растворители для очистки способом ИАХ представлены ниже в таблице 5, а стадии промывки представлены ниже в таблице 6.

ПРИМЕР 2-2: Сравнение содержания БКХ в соответствии со способом промывки при очистке способом ИАХ

В результате проведения очистки способом ИАХ в условиях примера 2-1 было подтверждено, что, в зависимости от вида промывного растворителя и количества операций промывки, выходы очистки различались, как указано ниже.

В частности, как показано в таблице 7, было подтверждено, что содержание БКХ было самым низким, если в очистке способом ИАХ количество операций промывки составляло три или более; кроме того, несмотря на одинаковое количество операций промывки, при использовании различных промывных растворов содержание БКХ было разным. Кроме того, как показано в таблицах 8 и 9, было подтверждено, что содержание БКХ было наиболее низким при определенных концентрациях второго и/или третьего промывочного раствора при использовании различных концентраций второго и/или третьего промывного раствора. В частности, было подтверждено, что, если промывным раствором второй стадии промывки был раствор хлорида натрия с концентрацией соли 1 М или более и 4 М или менее, то выход очистки составлял 60% или более, и содержание БКХ составляло 250 млн долей или менее; и, кроме того, если промывным раствором третьей стадии промывки был раствор хлорида магния с концентрацией соли 0,01 М или более и 0,5 М или менее, то выход очистки составлял 60% или более, и содержание БКХ составляло 250 млн долей или менее.

Полученные результаты показывают, что количество операций промывки, а также вид и концентрация промывного растворителя являются наиболее важными факторами при очистке способом ИАХ в способе очистки согласно изобретению.

ПРИМЕР 3: подтверждение результатов очистки в зависимости от последовательности способа очистки

Авторы изобретения получили дополнительные результаты очистки в зависимости от последовательности способа очистки, в котором применяли ИАХ, ХГВ и АОХ.

ПРИМЕР 3-1: полученные выходы

Количественные анализы на белки в культуральных жидкостях и в очищенных жидкостях осуществляли с помощью аналитического устройства Octet Qk. С помощью устройства Octet Qk производят количественный анализ с помощью реакции антиген/антитело, в результате которой может быть количественно определен только целевой белок. Анализ проводили следующим образом:

Стабилизировали биодатчик, используя буфер Kinetics (Pall-ForteBio).

При помощи буфера Kinetics и биотинилированного анти-ФСГ антитела выполняли иммобилизацию.

Количественно оценивали состав каждого из образцов, которые подходящим образом разбавляли буфером Kinetics. Выполняли регенерацию с использованием буфера (20 мМ трис-HCl (рН 7,6) и 1,7 М MgCl₂).

Используя буфер Kinetics, выполняли нейтрализацию.

Затем количественно оценивали состав очищенной жидкости, получаемой на каждомйиз стадий, и определяли выход.

Конечные выходы в соответствии с порядком проведения способа очистки представлены в таблице 10.

В результате было подтверждено, что конечный выход был наибольшим в случае выполнения способа в последовательности ИАХ → ХГВ → АОХ (опыт 1), которая представляет собой последовательность способа очистки согласно изобретению. Этот результат подтверждает, что эффективность очистки различна в разных способах и зависит от порядка выполнения операций способа, несмотря на то, что в каждом из способов выполняют одни и те же виды хроматографии (т.е. иммуноаффинную хроматографию, хроматографию с гидрофобным взаимодействием и анионообменную хроматографию); таким образом, наиболее важным фактором является выполнение способа в последовательности ИАХ → ХГВ → АОХ.

ПРИМЕР 3-2: условия проведения и результаты анализа БКХ

В качестве стадии предварительной обработки перед проведением определения содержания БКХ, очищенную жидкость концентрировали с очищенной водой и заменяли буфер с помощью центрифугирования на центрифужном фильтре Amicon. Количественный анализ белков в образцах с замененным буфером выполняли с помощью аналитического устройства Octet Qk, применяемого в примере 3-1. Количественное содержание БКХ определяли в очищенной жидкости после ее концентрации и замены буфера. Анализ БКХ выполняли, используя набор "СНО Host Cell Protein 3rd Generation" (Cygnus). Анализ проводили следующим образом:

Каждый образец подходящим образом разбавляли буфером разбавления таким образом, чтобы содержание БКХ в образце находилось в стандартном диапазоне.

В лунки планшета помещали анти-СНО:HRP (пероксидазу хрена) в количестве, составляющем 100 мкл на лунку.

В каждую лунку помещали стандарт и соответствующий образец в количестве, составляющем 50 мкл на лунку, и проводили реакцию при 24±4°С и скорости от 400 об./мин. до 600 об./мин. в течение двух часов.

Реагенты удаляли, и планшет четыре раза промывали промывочным буфером.

В лунки планшета помещали тетраметилбензидиновый субстрат (ТМВ) в количестве, составляющем 100 мкл на лунку, и проводили реакцию при 24±4°С в течение 30 минут.

Реакцию прекращали посредством добавления останавливающего раствора в лунки планшета в количестве, составляющем 100 мкл на лунку.

Вычисляли выражаемое в частях на миллион содержание БКХ для каждого из способов очистки, исходя из количества целевого белка и измеренного содержания БКХ.

В результате было подтверждено, что содержание БКХ было наиболее низким, если последовательность выполнения способа была следующей: ИАХ → ХГВ → АОХ (№испытания 3), то есть в виде способа очистки согласно изобретению. Кроме того, было подтверждено, что содержание БКХ было меньше, если применяли несколько видов хроматографии, чем в случае применения одной хроматографической очистки. Эти результаты подтверждают, что эффективность очистки не только повышается при увеличении количества стадий хроматографии, но еще и отличается в разных способах, в зависимости от порядка выполнения соответствующих операций, несмотря на то, что в каждом способе применяют одни и те же три вида хроматографии (т.е. иммуноаффинную хроматографию, хроматографию с гидрофобным взаимодействием и анионообменную хроматографию).

В частности, можно отметить, что содержание БКХ в способе, в котором очистку выполняли в последовательности ХГВ → АОХ → ИАХ (№испытания 8), и в способе, в котором очистку выполняли в последовательности ИАХ → ХГВ → АОХ, т.е. в способе очистки согласно изобретению, может различаться в 3000 раз или более, несмотря на то, что в обоих способах применяли одни и те же три вида хроматографии (т.е. иммуноаффинную хроматографию, хроматографию с гидрофобным взаимодействием и анионообменную хроматографию). Эти результаты показывают, что порядок выполнения стадий способа является наиболее важным фактором в способе очистки согласно изобретению.

ПРИМЕР 3-3: результаты анализа чистоты способом гель-фильтрационной ВЭЖХ

Был проведен анализ чистоты ФСГ способом гель-фильтрационной ВЭЖХ. Для получения подвижной фазы с рН 7 к раствору фосфата натрия добавляли ацетонитрил. Затем колонку уравновешивали и в колонку помещали образец. Чистоту определяли по пикам, которые регистрировали при достаточном пропускании подвижной фазы. Чистота, полученная для каждой стадии очистки, представлена на фиг. 1.

Как показано на фиг. 1, по мере выполнения способа чистота, определяемая по главному пику (т.е. пику димера), повышается.

ПРИМЕР 3-4: результат анализа содержания оксида способом ВЭЖХ с обращенной фазой

Содержание оксида ФСГ определяли способом ВЭЖХ с обращенной фазой. Подвижную фазу (В) с рН 2,5 получали добавлением ацетонитрила в подвижную фазу (А) на основе фосфата калия и в фосфат калия. Затем колонку уравновешивали и в колонку помещали образец. Содержание оксида определяли по пикам, регистрируемым при пропускании указанных двух подвижных фаз в условиях градиента концентрации. Содержание оксида, полученного для каждой стадии очистки, представлено на фиг. 2.

Как показано на фиг. 2, подтверждено, что по мере выполнения способа очистки чистота повышается, а пик, соответствующий оксиду, уменьшается.

После ознакомления с вышеизложенным, специалист в области техники, к которой относится изобретение, должен понять, что изобретение может иметь и другие конкретные формы воплощения, не нарушающие техническую концепцию или существенные характеристики изобретения. Таким образом, приведенные в описании примеры воплощения, изложены лишь для иллюстрации и не должны рассматриваться как ограничивающие объем изобретения. Напротив, изобретение включает не только приведенные примеры воплощения, но также различные альтернативные варианты, модификации, эквиваленты и другие воплощения, которые могут быть включены в объем изобретения, определяемый прилагаемыми пунктами формулы изобретения.

Изобретение относится к биохимии. Описан способ очистки фолликулостимулирующего гормона (ФСГ). Способ включает стадию проведения иммуноаффинной хроматографии (ИАХ), причем иммуноаффинная хроматография (ИАХ) включает стадию промывки, на которой промывку осуществляют по меньшей мере 3 раза, при этом промывной раствор на второй стадии промывки представляет собой раствор хлорида натрия с концентрацией соли от 1 M или более до 3 M или менее, и при этом промывной раствор на третьей стадии промывки представляет собой раствор хлорида магния с концентрацией соли от 0,01 M или более до 0,3 M или менее. Изобретение позволяет очищать ФСГ с высоким выходом и высокой чистотой. 4 з.п. ф-лы, 2 ил., 11 табл., 3 пр.

1. Способ очистки фолликулостимулирующего гормона (ФСГ), где способ включает стадию проведения иммуноаффинной хроматографии (ИАХ), причем иммуноаффинная хроматография (ИАХ) включает стадию промывки, на которой промывку осуществляют по меньшей мере 3 раза,

при этом промывной раствор на второй стадии промывки представляет собой раствор хлорида натрия с концентрацией соли от 1 M или более до 3 M или менее, и

при этом промывной раствор на третьей стадии промывки представляет собой раствор хлорида магния с концентрацией соли от 0,01 M или более до 0,3 M или менее.

2. Способ по п. 1, в котором стадию промывки осуществляют с применением промывного раствора, pH которого составляет от 7 или более до 8 или менее.

3. Способ по п. 2, в котором промывной раствор содержит одну или более солей, выбранных из группы, состоящей из сульфата натрия, хлорида натрия, сульфата аммония, хлорида аммония и хлорида магния.

4. Способ по п. 1, в котором фолликулостимулирующий гормон (ФСГ), очищенный на третьей стадии промывки, имеет чистоту, при которой содержание белков клеток-хозяев (БКХ) составляет 250 млн долей или менее.

5. Способ по п. 1, в котором способ очистки фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) осуществляют в следующей последовательности и способ включает:

(a) проведение иммуноаффинной хроматографии (ИАХ);

(b) проведение хроматографии с гидрофобным взаимодействием (ХГВ) и

(c) проведение анионообменной хроматографии (АОХ).