СПОСОБ ОЧИСТКИ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА Российский патент 2024 года по МПК C07K14/765 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0001] Настоящее изобретение относится к способу очистки рекомбинантного белка. В частности, настоящее изобретение относится к способу эффективного выделения рекомбинантного белка из образца, содержащего рекомбинантный белок, в частности, рекомбинантный человеческий альбумин.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0002] Человеческий альбумин представляет собой одноцепочечный негликозилированный белок, структура которого имеет сердцевидную форму, и который включает 585 аминокислот, 17 пар дисульфидных связей и одну свободную сульфгидрильную группу, и его молекулярная масса составляет 66438 Дальтон. Период полужизни человеческого альбумина в организме человека составляет 19-21 суток. Сердцевидная структура человеческого альбумина состоит из трех основных структурных доменов и шести субдоменов, “завернутых” в 17 дисульфидных связей, которые непрочно удерживаются вместе за счет ван-дер-ваальсовых сил. Как видно из кристаллической структуры человеческого альбумина, дисульфидные мостики придают спирально-сферической структуре жесткость, и в то же время достаточную гибкость, обеспечивая, таким образом, возможность конформационных изменений белка в ответ на изменения окружающей среды.

[0003] Человеческий альбумин традиционно получают выделением и очисткой из сыворотки крови человека, что отражено в его обобщенном названии - “человеческий сывороточный альбумин”. Количество человеческого альбумина, который может быть получен из крови человека, ограничено количеством источников плазмы крови; кроме того, существует риск вирусного заражения доноров плазмы крови, и у доноров также имеются индивидуальные различия в составе антител и белков, что делает рискованным клиническое использование такого альбумина. Поэтому во многих странах инструкции по применению альбумина, получаемого из человеческой крови, включают положение о вирусной безопасности, например: “Стандартные меры, принимаемые для предотвращения инфекций, обусловленных применением продуктов, получаемых из крови или плазмы человека, включают отбор донора крови, проверку единичной поставки крови или проверку пула плазмы на специфичные индикаторы инфекций, а также использование эффективных технологических процедур, обеспечивающих инактивацию/удаление вирусов. Даже в таких случаях, когда медицинский продукт, полученный из крови или плазмы крови, прошел отбор для последующего применения, возможность развития инфекции под действием инфицирующего агента не может быть исключена. Вышесказанное также относится к неизвестным или возникающим вирусам и другим патогенам”. Таким образом, наилучшим способом эффективного получения альбумина, не содержащего вирусного загрязнения, является способ генетической рекомбинации.

[0004] В настоящее время основным и наиболее часто применяемым способом экспрессии человеческого альбумина рекомбинантными микроорганизмами, способными производить альбумин в больших объемах, является применение дрожжевых экспрессирующих систем, среди которых наиболее разработанными экспрессирующими системами являются Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris. Однако, поскольку человеческий альбумин вводят в больших объемах, доза на одну инъекцию может достигать 5-30 граммов. Таким образом, необходимо, чтобы общий остаточный белок клеток хозяина и результаты испытания ELISA на загрязняющие вещества в результате такого получения не превышали 1 нг/мл (200 мг/мл rHA (сокр. от англ. “recombinant human albumin”, что означает “рекомбинантный человеческий альбумин ”)) в одной дозе, вводимой через инъекцию. Независимо от способа, применяемого для получения рекомбинантного человеческого альбумина, его иммуногенность также включает посттрансляционные модификации белков, такие как гликозилирование, окисление, мультимеризацию, агрегацию и подобные изменения. Таким образом, эффективная и специфичная очистка является ключевым этапом способа получения высокочистого рекомбинантного человеческого альбумина.

[0005] В способах очистки согласно предшествующему уровню техники используют существующие среды для очистки, которые сложны в применении и с помощью которых обычно невозможно получить рекомбинантный человеческий альбумин сверхвысокой чистоты. В заявке на патент Китая CN 1127299 рассмотрено совместное нагревание ферментативного бульона с бактериальными клетками для инактивации активной протеазы дрожжей, проведение нагревания для снижения массы и деполимеризации приблизительно 20-30% или более димера, образующегося в первом этапе обогащающей очистки с применением среды Sepharose-Streamline-SP (сефароза Streamline-SP), последующее удаление фрагмента альбумина с массой 45 кДа с помощью хроматографии гидрофобного взаимодействия и удаление пигмента хроматографией на материале Sepharose DEAE (диэтиламиноэтилсефарозе). Согласно этой заявке, для инактивации протеаз ферментативный бульон и бактериальные клетки нагревают до температуры выше 58-65°C, что приводит к сшиванию белков теплового шока с рекомбинантным человеческим альбумином и белками клеток-хозяев дрожжей, что затрудняет последующую хроматографическую очистку. При этом степень очистки разделением и коэффициент полезного действия при номинальном режиме при совместном элюировании бактериальных клеток и ферментативного бульона через хроматографическую среду Sepharose-Streamline-SP в псевдоожиженном слое очень низки.

[0006] В заявках на патент Китая CN 101768206, CN 1854155 и CN 1496993 описано применение устойчивой к высокому содержанию солей катионной среды Sepharose HSL для обогащения и захвата рекомбинантного человеческого альбумина из ферментативного бульона, последующее применение среды Sepharose phenyl HIC (фенилсефароза для хроматографии гидрофобного взаимодействия, англ. hydrophobic interaction chromatography, сокр. “HIC”) для удаления фрагментов альбумина, и последующее применение хроматографической анионообменной среды Sepharose aminobutyl (аминобутилсефароза) для замены Sepharose DEAE с целью повышения выхода.

[0007] В заявках на патент Китая CN 1810834, CN 1550504 и CN 1880334 описано применение среды Sepharose SP FF для захвата и концентрирования рекомбинантного человеческого альбумина с последующим применением колоночной аффинной хроматографии с синим красителем Delta blue для поглощения альбумина и удаления фрагментов альбумина с массой 45 кДа и белков клеток-хозяев дрожжей; недостатками колонки с синим красителем являются отщепление лиганда и низкая безопасность синего красителя; кроме того, технологическая схема способа отделения рекомбинантного человеческого альбумина аффинной хроматографией приводит к пониженной эффективности очистки. Последующее применение молекулярного сита S-200HR дополнительно снижает эффективность очистки.

[0008] Способами, раскрытыми в описанных выше трех группах патентов, может быть эффективно получен рекомбинантный человеческий альбумин с более высокой чистотой; однако, в стадии предварительной очистки способа с улавливанием и обогащением образуется большое количество полимеров, которые необходимо подвергнуть повторной деполимеризации, и в процессе деполимеризации могут происходить нарушения комплементарности и образование других иммуногенных рекомбинантных человеческих альбуминов.

[0009] Таким образом, в данной области техники существует насущная необходимость разработки способов эффективной очистки рекомбинантного белка, в частности, рекомбинантного человеческого альбумина, отличающихся сниженным образованием полимеров и ингибированием взаимодействий белков, пигментов и углеводов клеток-хозяев с рекомбинантными белками.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0010] Один из вариантов реализации настоящего изобретения относится к способу очистки рекомбинантного белка, в частности, рекомбинантного человеческого альбумина, где способ включает:

(a) добавление аминогуанидина и среднецепочечной жирной кислоты к образцу, содержащему рекомбинантный белок; и

(b) хроматографирование полученного образца, где хроматографию необязательно выполняют с применением хроматографического буферного раствора, содержащего аминогуанидин.

[0011] В одном из вариантов реализации настоящего изобретения образец, содержащий рекомбинантный белок, представляет собой надосадочную жидкость, получаемую после ферментации. Предпочтительно, прозрачную надосадочную жидкость получают из ферментативного бульона традиционными способами, такими как центрифугирование, разделение твердая фаза-жидкость, инактивация нагреванием, ультрафильтрация через полое волокно и/или глубокое осветление фильтрацией и разделение.

[0012] В одном из вариантов реализации настоящего изобретения разделение твердая фаза-жидкость выполняют с помощью центрифуги, в которой может происходить быстрое разделение ферментированных бактериальных клеток и надосадочной жидкости, которые составляют консистенцию ферментативного бульона; после разделения ферментативного бульона на твердый осадок и жидкость, надосадочную жидкость после ферментации может быть нагрета до температуры 55-68°C в присутствии октаноата натрия и других термостабилизаторов для повторного проведения разделения твердая фаза-жидкость; затем выполняют осветление, применяя пакет мембран с номинальным отсечением по молекулярной массе 300-500 кДа или полое волокно, где размер пор мембраны составляет от 0,1 до 2 мкм. Осветление может быть выполнено однократно до и после инактивации нагреванием.

[0013] В другом варианте реализации настоящего изобретения концентрация аминогуанидина на стадии (a) составляет от 2 до 100 ммоль/г рекомбинантного белка, предпочтительно концентрация аминогуанидина составляет от 3 до 80 ммоль/г рекомбинантного белка.

[0014] В одном из вариантов реализации настоящего изобретения среднецепочечная жирная кислота выбрана из одной или более следующих кислот: октановой кислоты, каприновой кислоты, миристиновой кислоты (C14:0), пальмитиновой кислоты (C16:0), стеариновой кислоты (C18:0), олеиновой кислоты (C18:1), линолевой кислоты (C18:2), линоленовой кислоты (C18:3), арахидоновой кислоты (C20:4) и их солей. В одном из вариантов реализации концентрация среднецепочечной жирной кислоты составляет от 2 до 300 ммоль/г рекомбинантного белка. Предпочтительно концентрация среднецепочечной жирной кислоты составляет от 6 до 150 ммоль/г рекомбинантного белка.

[0015] В одном из вариантов реализации настоящего изобретения хроматография включает катионообменную хроматографию и гидрофобную хроматографию.

[0016] В других вариантах реализации рекомбинантный белок также может представлять собой G-CSF (англ. granulocyte colony-stimulating factor, русс. гранулоцитарный колониестимулирующий фактор), GLP-1 (англ. glucagon-like peptide-1, русс. глюкагоноподобный пептид-1), интерферон, гормон роста, интерлейкин и аналоги перечисленных белков, а также белки слияния вышеуказанных белков с альбумином.

[0017] В отличие от предшествующего уровня техники, авторами настоящего изобретения неожиданно было обнаружено, что добавление аминогуанидина и среднецепочечной жирной кислоты к образцу, содержащему рекомбинантный человеческий альбумин, и последующее проведение катионной хроматографии и гидрофобной хроматографии (необязательно с применением хроматографического буферного раствора, содержащего аминогуанидин) может приводить к некоторым неожиданным эффектам. Во-первых, аминогуанидин может устранять и снижать отмеченную ранее тенденцию катионообменной среды генерировать димеры, мультимеры и гетеромеры; среднецепочечная жирная действует как сильный активный лиганд, который ингибирует взаимодействие большинства белков, пигментов и углеводов организма-хозяина с альбумином. Таким образом, воплощение вариантов реализации настоящего изобретения значительно снижает концентрации полимеров, гетеромеров, пигментов и белков организма-хозяина, образующихся в большом количестве при катионообменной хроматографии. Во-вторых, присутствие аминогуанидина и среднецепочечной жирной кислоты замедляет полимеризацию общих дисульфидных связей, имеющихся между фрагментами рекомбинантного альбумина с молекулярной массой 45 кДа, и, таким образом, способствует раскрытию более гидрофобных участков нескладываемых фрагментов белка, позволяя более полно удалять мелкие фрагменты молекул рекомбинантного человеческого альбумина и разнообразные гидрофобные загрязняющие вещества способом гидрофобной хроматографии, а также дрожжевые пигменты со структурами, отличающимися сильными гидрофобными свойствами.

[0018] В одном из вариантов реализации настоящего изобретения концентрация аминогуанидина в хроматографическом уравновешивающем растворе, промывном растворе или буферном растворе для элюирования при катионообменной хроматографии составляет от 1 до 200 ммоль/л, и предпочтительно, концентрация аминогуанидина в хроматографическом уравновешивающем растворе, промывном растворе или буферном растворе для элюирования составляет от 1 до 150 ммоль/л.

[0019] В одном из вариантов реализации настоящего изобретения величина pH хроматографического уравновешивающего раствора и промывного раствора для катионообменной хроматографии составляет от 4,0 до 6,0, предпочтительно от 4,0 до 5,5; величина pH элюента составляет от 7,0 до 9,5, предпочтительно от 7,0 до 8,5.

[0020] В одном из вариантов реализации настоящего изобретения проводимость хроматографического уравновешивающего раствора и промывного раствора для катионообменной хроматографии не превышает 15 мС/см, предпочтительно не превышает 10 мС/см; проводимость элюента не превышает 30 мС/см, предпочтительно не превышает 25 мС/см.

[0021] В одном из вариантов реализации настоящего изобретения хроматографический уравновешивающий раствор и промывной раствор для катионообменной хроматографии представляют собой буферный раствор фосфорной кислоты или уксусной кислоты или буферный раствор Триса (трис(гидроксиметил)аминометана), предпочтительно буферный раствор фосфорной кислоты или уксусной кислоты.

[0022] В одном из вариантов реализации настоящего изобретения среда-сорбент для катионообменной хроматографии представляет собой сорбент на основе полиакрилата, сорбент на основе полистирола-дивинилбензола, сорбент на основе агарозы, сорбент на основе модифицированной целлюлозы.

[0023] В одном из вариантов реализации настоящего изобретения среду для катионообменной хроматографии комбинируют с гидрофобным катионным лигандом, и гидрофобный катионный лиганд включает устойчивую к высокому содержанию солей среду Sepharose Capto MMC.

[0024] В одном из вариантов реализации настоящего изобретения среда для катионообменной хроматографии выбрана из серии Uni-SP, серии UniGel-SP, серии NanoGel-SP, серии MonoMix-HC SP, серии MonoMix-MC SP, серии Sepharose или агарозы серии Bestarose.

[0025] В одном из вариантов реализации настоящего изобретения среда для гидрофобной хроматографии представляет собой гидрофильно модифицированную агарозу, полиакрилат, микросферы сорбента на основе полистирол-дивинилбензола, скомбинированного с гидрофобным лигандом серии Phenyl или Butyl; или среда для гидрофобной хроматографии представляет собой гидрофильную матрицу из полиметакрилата, скомбинированного с гидрофобным лигандом серии Phenyl или Butyl.

[0026] В одном из вариантов реализации настоящего изобретения среда для гидрофобной хроматографии выбрана из серии UniHR Phenyl, серии NanoHR Phenyl, серии UniHR Butyl, серии NanoHR Butyl, серии MonoMix-MC Butyl, серии MonoMix-MC Phenyl серии, Sepharose или агарозы серии Bestarose.

[0027] Для проведения катионообменной хроматографии и гидрофобной хроматографии предпочтительно применение среды для разделения, включающей катионный лиганд или гидрофобный лиганд, скомбинированный с имеющими модифицированную поверхность микросферами сорбента из гидрофильного полиакрилата или полистирол-дивинилбензола или полиметакрилата.

[0028] Также, среда-сорбент для разделения согласно настоящему изобретению, гидрофильно модифицированная микросферами из полиакрилатного полимера, представляет собой, например, гидрофильно модифицированную полиметакрилатную ионообменную смолу Fractogel® и гидрофобные сорбенты на основе наполнителей для аффинной хроматографии, производимые Merck Millipore, примеры которых включают, без ограничений, следующие серии: катионообменную смолу Fractogel® EMD SO₃^- (S) или Fractogel® SO₃^- (сильная катионообменная смола) или Fractogel® SE Hicap (сильная катионообменная смола) или Eshmuno® S (сильная катионообменная смола) и подобные среды.

[0029] Настоящее изобретение включает, без ограничений, катионные и гидрофобные среды для разделения, гидрофильно модифицированные по завершении синтеза соответствующей среды-сорбента.

[0030] Предпочтительно, для осуществления настоящего изобретения применяют указанный выше полиметакрилатный гидрофильно модифицированный сорбент для разделения Fractogel®, производимый Merck Millipore, и указанную выше гидрофильно модифицированную комбинированную среду для разделения из полиакрилатных микросфер или микросфер на основе полистирол-дивинилбензола, производимую Suzhou NanoMicro Technology Co. Ltd. или Sepax Technologies, Inc.; наиболее предпочтительно, применяют указанную выше гидрофильно модифицированную комбинированную среду для разделения из полиакрилатных микросфер или микросфер на основе полистирол-дивинилбензола, производимую Suzhou NanoMicro Technology Co. Ltd. и Sepax Technologies, Inc.

[0031] При выполнении различных хроматографических стадий согласно настоящему изобретению, замена буферных растворов и концентрирование могут быть выполнены с применением таких устройств и оборудования, как половолоконные мембраны и пакеты плоских мембран с размером разделительных пор, пропускающих молекулы с молекулярной массой от 1 кДа до 30 кДа, и режим работы устройств и оборудования включает, без ограничений, их последовательное или попеременное функционирование.

[0032] При выполнении хроматографических стадий согласно настоящему изобретению, замена буферных растворов также может быть выполнена с помощью устройств Sephadex G25 или Superdex G75.

[0033] Кроме того, авторами настоящего изобретения также неожиданно было обнаружено, что в описанной выше хроматографии предпочтительно применение микросфер из полиакрилата или полиметакрилата или полистирол-дивинилбензола, имеющих диаметр от 10 до 150 мкм; после модификации посредством нанесения гидрофильного покрытия производят прививку катионных и гидрофобных лигандов, например, серии Uni-SP, серии UniGel-SP или NanoGel-SP, серии MonoMix-HC SP или MonoMix-MC SP для катионообменной среды, и серии UniHR Phenyl, серии NanoHR Phenyl, серии UniHR Butyl и серии NanoHR Butyl, серии MonoMix-MC Butyl или серии MonoMix-MC Phenyl для гидрофобной хроматографии. Этот тип сред для очистки разделением сохраняет определенную степень гидрофобности самого полиакрилата или полиметакрилата или полистирол-дивинилбензола или нанесенного на него покрытия, что облегчает удаление пигментов и белков организма-хозяина хроматографическим способом в комбинации с рекомбинантным человеческим альбумином, содержащим аминогуанидин и жирную среднецепочечную кислоту.

[0034] В одном из вариантов реализации настоящего изобретения при проведении гидрофобной хроматографии величина pH составляет от 6,0 до 8,5, предпочтительно от 6,5 до 8,0.

[0035] В одном из вариантов реализации настоящего изобретения при проведении гидрофобной хроматографии величина проводимости не превышает 30 мС/см, предпочтительно не превышает 25 мС/см.

[0036] В одном из вариантов реализации настоящего изобретения концентрация аминогуанидина в растворе для загрузки для гидрофобной хроматографии составляет от 1 до 100 ммоль/г рекомбинантного белка.

[0037] В одном из вариантов реализации настоящего изобретения аминогуанидин находится в виде своей соли, предпочтительно гидрохлорида.

[0038] Способ согласно настоящему изобретению в основном применяют для предварительной очистки надосадочной жидкости после ферментации дрожжей, экспрессирующих белок,, позволяя тем самым упростить процесс обогащения ферментативного бульона и повышать степень очистки, что приводит к повышению эффективности, увеличению выхода и снижению затрат на последующее рафинирование и очистку.

[0039] Способ согласно настоящему изобретению также можно применять в других способах, связанных с получением рекомбинантного человеческого альбумина, примеры которых включают, без ограничений, способ рафинирования и способ промежуточной очистки.

[0040] В некоторых конкретных вариантах реализации настоящего изобретения диаметр пор гидрофильно модифицированных полимерных микросфер из полиакрилата или полиметакрилата или полистирол-дивинилбензола составляет от 300 до 3000 Å, и диаметр микросфер составляет от 10 до 150 мкм.

[0041] В некоторых конкретных вариантах реализации настоящего изобретения из микросфер диаметром от 10 до 150 мкм, состоящих из полиакрилата или полистирол-дивинилбензольного полимера, формируют слои в колонках из высокопрочных полимерных материалов, имеющие высоту от 100 до 800 мм, предпочтительно от 250 до 600 мм.

[0042] В некоторых конкретных вариантах реализации настоящего изобретения микросферы из полиакрилата или полистирол-дивинилбензольного полимера имеют однородное распределение диаметра и создают относительно низкое противодавление, и их применяют для разделения и очистки способом непрерывной проточной хроматографии.

[0043] Условия проведения хроматографии, описанные в настоящем изобретении, могут быть до некоторой степени отрегулированы и уточнены в соответствии с общим руководством.

[0044] В хроматографическом способе, описанном в настоящем изобретении, для проведения стадий диализа, ультрафильтрации и пастеризации могут быть применены некоторые другие традиционные способы, которые не влияют на эффективность осуществления настоящего изобретения.

[0045] Для последующей очистки рекомбинантного человеческого альбумина после завершения описанной выше хроматографии для извлечения макромолекулярных агрегатов и удаления небольших молекул необязательно может быть применен пакет мембран с номинальным отсечением по молекулярной массе 100 кДа и/или 30 кДа и/или 10 кДа, после чего производят замену буферного раствора и выполняют концентрирование для получения базового раствора рекомбинантного человеческого альбумина с концентрацией, превышающей 20%. В альтернативном варианте клетки-хозяева, экспрессирующие рекомбинантный человеческий белок включают, без ограничений, дрожжи, Saccharomyces cerevisiae, содержащие сахариды, клеточную линию рода Saccharomyces, клеточную линию рода Kluyveromyces, клеточную линию рода Hansenula и клеточную линию рода Bichia.

[0046] Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют значения, общепринятые среди специалистов в данной области техники. В случае конфликта приоритет имеет значение, упоминаемое в настоящем описании. Предпочтительные способы и материалы описаны ниже; для воплощения или анализа настоящего изобретения могут быть применены способы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным в настоящей работе. Материалы, способы и примеры, описанные в настоящей работе, приведены лишь для иллюстрации изобретения и не ограничивают его объем.

[0047] В настоящем описании термин “рекомбинантный человеческий альбумин” также может быть заменен на “рекомбинантный человеческий сывороточный альбумин” и/или “рекомбинантный альбумин крови человека” и/или “rHA” и/или “rHSA”. Термином “человеческий сывороточный альбумин” обозначают человеческий альбумин, извлеченный из сыворотки крови человека, и он также может быть назван “альбумин крови человека” и/или “HSA” и/или “HA” и/или “pdHSA”.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[0048] На Фиг. 1 представлено образование полимеров при проведении первой стадии обогатительной очистки способом очистки в отсутствие аминогуанидина;

[0049] На Фиг. 2 представлен эффект добавления аминогуанидина для предотвращения и снижения образования димеров, полимеров и гетеромеров в соответствии со способом согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения;

[0050] На Фиг. 3 представлена полученная способом ВЭЖХ-C4 хроматограмма раствора, собранного в результате проведения гидрофобной хроматографии без добавления среднецепочечной жирной кислоты;

[0051] На Фиг. 4 представлена полученная способом ВЭЖХ-C4 хроматограмма раствора, собранного в результате проведения гидрофобной хроматографии в присутствии среднецепочечной жирной кислоты, которая показывает, что среднецепочечная жирная кислота действует как сильный активный лиганд, ингибируя взаимодействия большинства белков, пигментов и углеводов организма-хозяина с альбумином;

[0052] На Фиг. 5 и 6 представлены, соответственно, вестерн-блоттинг хроматограммы в восстанавливающих условиях и в невосстанавливающих условиях антител белков клетки-хозяина (анти-БКХ), очищенных двумя способами очистки в отсутствие и в присутствии аминогуанидина и среднецепочечной жирной кислоты, согласно способу Примера 4; дорожки 1-6 соответствуют раствору -1, собранному после хроматографии на катионообменной среде; раствору -3, собранному после хроматографии на катионообменной среде; раствору -4, собранному после хроматографии на катионообменной среде; раствору -5, собранному после хроматографии на катионообменной среде; раствору -6, собранному после хроматографии на катионообменной среде; и раствору -7, собранному после хроматографии на катионообменной среде, соответственно (все загружаемые объемы составляли 0,14 мкл), где числовые обозначения представляют собой номера подпартий в способе очистки, -2 обозначает запасные образцы, предназначенные для других экспериментов в ходе экспериментальных процедур; -1/-3/-4 обозначают образцы, полученные способом получения в отсутствие аминогуанидина, -4/-5/-6 обозначают образцы, полученные способом получения с добавлением аминогуанидина и среднецепочечной жирной кислоты согласно настоящему изобретению;

[0053] На Фиг. 7 представлена полученная электрофорезом SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия) в невосстанавливающих условиях хроматограмма сравнительного анализа результатов двух способов очистки одного и того же раствора, собранного в результате катионообменной хроматографии согласно способу Примера 4; в этом эксперименте собирали одну партию раствора после катионообменной хроматографии, и белок очищали двумя способами очистки, то есть в присутствии аминогуанидина и среднецепочечной жирной кислоты и в отсутствие аминогуанидина и среднецепочечной жирной кислоты, и сравнивали результаты образования полимеров; числом -1 обозначен образец, очищенный способом получения в отсутствие аминогуанидина и среднецепочечной жирной кислоты; числом 2 обозначен образец, очищенный способом получения с добавлением аминогуанидина и среднецепочечной жирной кислоты согласно настоящему изобретению; условия загрузки образца на дорожки 1-10 были следующими:

1 Раствор, собранный в результате катионообменной хроматографии 0,2 мкл 2 Проточная фракция -1 гидрофобной хроматографии 5 мкл 3 Целевой собранный раствор, полученный в результате гидрофобной хроматографии -1 0,2 мкл 4 Промывной раствор -1 из гидрофобной хроматографии 1 мкл 5 Очищающий раствор -1 из гидрофобной хроматографии 5 мкл 6 Образец #1-2, прошедший проточную гидрофобную хроматографию 5 мкл 7 Образец #2-2, прошедший проточную гидрофобную хроматографию 0,5 мкл 8 Целевой собранный раствор -2, полученный в результате гидрофобной хроматографии 0,2 мкл 9 Промывной раствор -2 из гидрофобной хроматографии 2 мкл 10 Очищающий раствор -2 из гидрофобной хроматографии 2 мкл

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ РЕАЛИЗАЦИИ

[0054] Ферментацию для осуществления настоящего изобретения проводили на оборудовании масштаба 10 л, 20 л, 3000 л и 100000 л с хорошим линейным масштабированием со степенью очистки, определяемой диаметром колонок 10 см, 45 см и 120 см, соответственно. Варианты реализации настоящего изобретения включают, но не ограничиваются, вышеуказанными масштабами. Описанные ниже варианты реализации в сочетании с графическими материалами позволяют лучше понять признаки и преимущества настоящего изобретения, но никоим образом не ограничивают объем настоящего изобретения.

[0055] Пример 1 Ферментация и разделение твердая фаза-жидкость

[0056] Ферментацию выполняли согласно способу, описанному в патенте CN 102190722, конструируя штамм Pichia pastoris и оптимизируя среду и параметры культуры; после ферментации в течение 300 часов был получен ферментативный бульон, содержащий 12 г/л рекомбинантного человеческого альбумина. Ферментативный бульон центрифугировали для отделения бактериальных клеток, собирали надосадочную жидкость над осадком, добавляли стабилизаторы (октаноат натрия до конечной концентрации 20 мМ, аминогуанидин до конечной концентрации 30 мМ, цистеин до конечной концентрации 10 мМ и N-ацетилтриптофан до конечной концентрации 5 мМ) и нагревали при 64°C в течение 60 минут для инактивации протеазы. После фильтрования и осветления с помощью мембраны из полых волокон с отверстиями 0,22 мкм и промывки водой для инъекций, pH раствора доводили до величины 4,0-4,5 добавлением уксусной кислоты.

[0057] Сорбент UniGel SP загружали в колонку слоем высотой 400 мм, хроматографическую колонку уравновешивали уравновешивающим раствором, содержащим 50 мМ HAc + 50 мМ NaCl + 10 мМ аминогуанидина (pH=4,1), и загружали осветленный и отделенный ферментативный бульон (содержащий 30 ммоль альбумина/г октаноата натрия; хроматографическую колонку промывали уравновешивающим раствором; затем целевой белок элюировали раствором для элюирования, содержащим 50 мМ фосфатного буфера + 170 мМ NaCl + 10 мМ аминогуанидина (pH=8,3); после завершения элюирования среду тщательно очищали и регенерировали раствором, содержащим 1 M NaCl + 0,5 M NaOH, и водой.

[0058] Пример 2 Гидрофобная хроматография

[0059] Элюент, собранный в Примере 1, непосредственно загружали в гидрофобную хроматографическую колонку (UniHR Phenyl-80L, высота слоя в колонке: 400 мм), уравновешенную уравновешивающим раствором, содержащим 50 мМ фосфатного буфера + 160 мМ NaCl (pH 7,8) + 10 мМ аминогуанидина; хроматографическую колонку промывали уравновешивающим раствором, собирали образец, содержащий рекомбинантный человеческий альбумин, и среду тщательно очищали и регенерировали 0,01 M NaOH и водой.

[0060] Пример 3 Удаление аминогуанидина ультрафильтрацией

[0061] Раствор белка, собранный в Примере 2, обрабатывали с использованием пакета мембран с номинальным отсечением по молекулярной массе 30 кДа и/или 10 кДа, удаляя, таким образом, аминогуанидин и другие стабилизаторы, и продолжали очистку; раствор перемещали и концентрировали, получая базовый раствор рекомбинантного человеческого альбумина с концентрацией более 20%.

[0062] Пример 4 Сравнение способа очистки согласно настоящему изобретению и способа очистки в отсутствие аминогуанидина и среднецепочечной жирной кислоты

[0063] Ферментативный бульон, полученный одним и тем же способом ферментации, очищали без добавления аминогуанидина и среднецепочечной жирной кислоты, и очистку также выполняли с добавлением аминогуанидина и олеата натрия способами Примера 1 и Примера 2 согласно настоящему изобретению. Очевидные различия наблюдали как при сравнении эффективности очистки, так и в сравнительном анализе методом жидкостной хроматографии (Фиг. 1, Фиг. 2, Фиг. 3 и Фиг. 4), в сравнительном анализе электрофоретического обнаружения (Фиг. 5, Фиг. 6 и Фиг. 7) и при сравнении результатов обнаружения сахаров (Таблица 1).

[0064]

Таблица 1 Проточный способ обнаружения в отсутствие аминогуанидина и среднецепочечной жирной кислоты (гликопротеин мкг/мг белка) Проточный способ обнаружения согласно настоящему изобретению
(гликопротеин мкг/мг белка) Загрузка базового раствора Общее количество раствора, собранного катионообменной хроматографией Общее количество раствора, собранного гидрофобной хроматографией Загрузка базового раствора Общее количество раствора, собранного катионообменной хроматографией Общее количество раствора, собранного гидрофобной хроматографией 341,09 5 1,04 358,96 0,4 0,17 224,02 5,19 1,06 Не обнаружено 0,29 0,21 343,11 5,37 1,11 317,24 0,42 Не обнаружено

[0065] Пример 5 Способ определения параметров при контроле качества очистки белка

[0066] Способ ВЭЖХ: основным способом определения результатов хроматографии 1 был способ ВЭЖХ-ГФХ (высокоэффективной жидкостной хроматографии - гель-фильтрационной хроматографии)/ВЭЖХ-C4.

[0067] Способ обнаружения: соответствующий способ обнаружения был разработан на основании документа “3121 A Method for Determining Human Blood Albumin Polymers, General Rules, Volume III of the Pharmacopoeia of People’s Republic of China, 2015 edition (Способ определения полимеров альбумина человеческой крови, Общие правила, том III Фармакопеи Китайской Народной Республики, издание 2015 года)” для определения полимеров (включая полимеры и димеры) в растворе рекомбинантного человеческого альбумина.

[0068] Способ обнаружения: соответствующий способ обнаружения был разработан на основании документа “0512 High Performance Liquid Chromatography, General Rules, Volume III of the Pharmacopoeia of People’s Republic of China, 2015 edition (0512 Высокоэффективная жидкостная хроматография, Общие правила, том III Фармакопеи Китайской Народной Республики, издание 2015 года)” для определения белков, связывающих пигменты, и белков, частично связывающих сахара, в растворе рекомбинантного человеческого альбумина.

[0069] 2. Электрофоретический способ: основным способом определения результатов гидрофобной хроматографии был электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия:

[0070] Способ обнаружения: анализ образца выполняли в соответствии с документом “0541 Method Five SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis, Общие правила, Volume IV of the Pharmacopoeia of People’s Republic of China, 2015 edition (0541 Способ номер пять электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия, Общие правила), Том IV Фармакопеи Китайской Народной Республики, издание 2015 года”;

[0071] Анализ референтного образца выполняли в соответствии с документом “3401 Western Blotting, General Rule, Volume IV of the Pharmacopoeia of People’s Republic of China, 2015 edition (3401 Вестерн-блоттинг, Общие правила, Том IV Фармакопеи Китайской Народной Республики, издание 2015 года)”.

[0072] 3. Определение содержания сахара по PAS-реакции (реакции с йодной кислотой и реактивом Шиффа)

[0073] Испытуемый раствор отбирали и добавляли в раствор соляной кислоты, получая раствор с кислотным pH; туда добавляли перйодат натрия и тщательно перемешивали, что приводило к окислению цис-этиленгликолевой группы полисахарида, содержащегося в испытуемом образце, до альдегида при комнатной температуре; затем протекание реакции останавливали, помещая смесь на ледяную баню, и для осаждения белка при охлаждении льдом добавляли сульфат цинка и гидроксид натрия; после центрифугирования при 8000 об./мин. в течение 15 минут, надосадочную жидкость переносили на 96-луночный планшет, после чего к ней добавляли свежеприготовленную смесь ацетилацетона-ацетата аммония, и 96-луночный планшет инкубировали при 37°C в течение 1 часа. Содержание сахара вычисляли из результатов колориметрического анализа, производимого при длине волны 405 нм с помощью полностью автоматического считывателя микропланшетов.

[0074] Несмотря на то, что в настоящем документе были разъяснены и описаны некоторые признаки настоящего изобретения, специалисту в данной области техники должно быть понятно, что существует множество модификаций, замен, изменений и эквивалентов описанных вариантов реализации. Соответственно, следует понимать, что прилагаемые пункты формулы изобретения охватывают все такие модификации и изменения, не выходящие за пределы объема настоящего изобретения.

[0075]

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии. Описан способ очистки рекомбинантного белка, в частности рекомбинантного человеческого альбумина. Способ включает осуществление следующих стадий: (a) добавление аминогуанидина и среднецепочечной жирной кислоты к образцу, содержащему рекомбинантный белок; (b) хроматографирование полученного образца, где хроматографию выполняют с применением буферного раствора, содержащего аминогуанидин; (c) удаление аминогуанидина из прошедшего хроматографирование образца посредством ультрафильтрации и (d) получение очищенного препарата рекомбинантного белка. Способ согласно настоящему изобретению в сравнении с известными из уровня техники аналогами обеспечивает эффективную очистку рекомбинантного белка, в частности рекомбинантного человеческого альбумина, и отличается сниженным образованием полимеров и/или ингибированием взаимодействий белков, пигментов и углеводов клеток-хозяев с продуцируемыми рекомбинантными белками. 19 з.п. ф-лы, 7 ил., 1 табл., 5 пр.

1. Способ очистки рекомбинантного белка, включающий:

(a) добавление аминогуанидина и среднецепочечной жирной кислоты к образцу, содержащему рекомбинантный белок;

(b) хроматографирование полученного образца, где хроматографию выполняют с применением хроматографического буферного раствора, содержащего аминогуанидин;

(c) удаление аминогуанидина из прошедшего хроматографирование образца, содержащего рекомбинантный белок, посредством ультрафильтрации; и

(d) получение очищенного рекомбинантного белка.

2. Способ по п. 1, в котором на стадии (а) конечная концентрация аминогуанидина в образце, содержащем рекомбинантный белок, составляет 30 мМ.

3. Способ по п. 1, в котором среднецепочечная жирная кислота выбрана из одной из следующих кислот: октановой кислоты, олеиновой кислоты и их солей.

4. Способ по п. 3, в котором конечная концентрация среднецепочечной жирной кислоты составляет 20 мМ.

5. Способ по п. 1, в котором хроматография включает катионообменную хроматографию и гидрофобную хроматографию.

6. Способ по п. 5, в котором концентрация аминогуанидина в хроматографическом уравновешивающем растворе, промывном растворе или буферном растворе для элюирования для катионообменной хроматографии составляет 10 мМ.

7. Способ по п. 6, в котором величина pH хроматографического уравновешивающего раствора и промывного раствора для катионообменной хроматографии составляет от 4,0 до 6,0 и величина pH элюента составляет от 7,0 до 9,5.

8. Способ по п. 6, в котором проводимость хроматографического уравновешивающего раствора и промывного раствора для катионообменной хроматографии не превышает 15 мС/см; проводимость элюента не превышает 30 мС/см.

9. Способ по п. 6, в котором хроматографический уравновешивающий раствор и промывной раствор для катионообменной хроматографии представляют собой буферный раствор фосфорной кислоты или уксусной кислоты или буферный раствор трис(гидроксиметил)аминометана.

10. Способ по п. 5, в котором среда-сорбент для катионообменной хроматографии выбрана из сорбента на основе полиакрилата, сорбента на основе полистирол-дивинилбензола, сорбента на основе агарозы или сорбента на основе модифицированной целлюлозы.

11. Способ по п. 5, в котором среду для катионообменной хроматографии комбинируют с гидрофобным катионным лигандом и гидрофобный катионный лиганд включает устойчивый к высокому содержанию солей Sepharose Capto MMC.

12. Способ по п. 5, в котором среда для катионообменной хроматографии выбрана из серии Uni-SP, серии UniGel-SP, серии NanoGel-SP, серии MonoMix-HC SP, серии MonoMix-MC SP, серии Sepharose или агарозы серии Bestarose.

13. Способ по п. 5, в котором среда для гидрофобной хроматографии представляет собой гидрофильно модифицированную агарозу, полиакрилат, микросферы сорбента на основе полистирол-дивинилбензола, скомбинированного с гидрофобным лигандом серии Phenyl или Butyl; или среда для гидрофобной хроматографии представляет собой гидрофильную матрицу из полиметакрилата, скомбинированного с гидрофобным лигандом серии Phenyl или Butyl.

14. Способ по п. 5, в котором среда для гидрофобной хроматографии выбрана из серии UniHR Phenyl, серии NanoHR Phenyl, серии UniHR Butyl, серии NanoHR Butyl, серии MonoMix-MC Butyl, серии MonoMix-MC Phenyl, серии Sepharose или агарозы серии Bestarose.

15. Способ по п. 5, в котором величина pH при проведении гидрофобной хроматографии составляет от 6,0 до 8,5.

16. Способ по п. 5, в котором величина проводимости при проведении гидрофобной хроматографии не превышает 30 мС/см.

17. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором аминогуанидин находится в виде своей соли.

18. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором рекомбинантный белок представляет собой рекомбинантный человеческий альбумин.

19. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором рекомбинантный белок представляет собой G-CSF, GLP-1, интерферон, гормон роста, интерлейкин и их аналоги, а также белки слияния вышеуказанных белков с альбумином.

20. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором образец, содержащий рекомбинантный белок, представляет собой надосадочную жидкость, получаемую после ферментации.