Средство для продуцирования органических соединений, обладающих антибактериальной и антиоксидантной активностью Российский патент 2023 года по МПК C12N1/20 C12P13/00 C12R1/15 

Изобретение относится к области биотехнологии, фармакологии и медицинской микробиологии и может быть использовано для получения лекарственных препаратов с использованием микроорганизмов-продуцентов.

Известно, что микроорганизмы являются важным источником биологически активных соединений, которые имеют большое значение для медицинского применения. Эти вещества обладают разнообразной биологической активностью, такой как антибактериальная, противогрибковая, противовирусная, антиоксидантная, противоопухолевая, цитотоксическая, иммуномодулирующая [Bérdy, J. Bioactive Microbial Metabolites. J Antibiot 58, 1–26 (2005). https://doi.org/10.1038/ja.2005.1].

Известно, что непатогенные коринебактерии, выделенные из различных биотопов тела человека способны продуцировать соединения, обладающие антибактериальной активностью по отношению к патогенным и условно-патогенным бактериям и грибам [P. Wysocki, A.K. Kwaszewska, E.M. Szewczyk. Influence of substances produced by lipophilic Corynebacterium CDC G1 ZMF 3P13 on the microorganisms inhabiting human skin. Med Dosw Mikrobiol. 201 1; 63(1):45-52, Gladysheva, I.V., Chertkov, K.L., Cherkasov, S.V. et al. Probiotic Potential, Safety Properties, and Antifungal Activities of Corynebacterium amycolatum ICIS 9 and Corynebacterium amycolatum ICIS 53 Strains. Probiotics & Antimicro. Prot. (2021). https://doi.org/10.1007/s12602-021-09876-3].

Ранее был описан новый штамм Corynebacterium amycolatum ICIS 53 ВКМ АС-2844D в качестве средства для продуцирования смеси азотсодержащих гетероциклических соединений групп 2,5-дикетопиперазина и 2-пирролидона, обладающей антибактериальной и антигрибковой активностью [Патент RU 2 774 192 C2]. Однако в литературе отсутствуют данные о способности микроорганизмов рода Corynebacterium spp. продуцировать соединения, обладающие антиоксидантной активностью.

Технический результат, на достижение которого направлено изобретение, заключается в получении средства для продуцирования органических соединений, обладающих антибактериальной и антиоксидантной активностью.

Указанный технический результат достигнут получением нового штамма бактерий Corynebacterium amycolatum ICIS 9, продуцирующего смесь азотсодержащих гетероциклических соединений групп 2,5-дикето-пиперазина, обладающую антибактериальной и антиоксидантной активностью.

Штамм Corynebacterium amycolatum ICIS 9 выделен в ноябре 2017 года из вагинального содержимого здоровой женщины в возрасте 27 лет г. Оренбурга, которая на момент обследования была клинически здорова, не имела в анамнезе инфекционных и соматических заболеваний репродуктивного тракта и других систем органов.

Изучение штамма проводили в лаборатории биомедицинских технологий Института клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Российской академии наук г. Оренбурга.

Штамм Corynebacterium amycolatum ICIS 9 депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН под регистрационным номером ВКМ Ас -2843D.

Штамм Corynebacterium amycolatum ICIS 9 характеризуется, следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками.

Культурально-морфологические признаки.

При световом микроскопическом исследовании клетки имеют вид прямых или слегка изогнутых грамположительных полиморфных палочек, располагаются чаще одиночно, реже парами или стопками из нескольких параллельно лежащих клеток («палисадом»). Окрашиваются неравномерно, часто имеют метахроматические гранулы. На Луриа-Бертани (LB) агаре формирует круглые, кремовые колонии (1-3 мм). Края колоний ровные, поверхность выпуклая, влажная. Рост обильный. Штамм безвреден, не токсичен, авирулентен.

Физиолого-биохимические признаки.

Грамположительные, неподвижные, неспорообразующие, некислотоустойчивые, каталазоположительные палочки. Облигатный аэроб.

Оптимальная температура роста 37ºС, рН = 7,2–7,4.

Ферментирует глюкозу, фруктозу, мальтозу, маннозу. Не восстанавливает нитраты, арабинозу, ксилозу, рамнозу, галактозу, лактозу, раффинозу, салицин не ферментирует. Не обладает гемолитическими свойствами, ДНКазной и лецитиназной активностью.

Условия и среды для культивирования.

Заявленный штамм микроорганизма культивируется 24 ч при 37°С в шейкер-инкубаторе Триптон-соевый бульоне (г/л): гидролизат казеина 17,00, папаиновый перевар соевой муки 3,00, натрия хлорид 5,00, калия гидрофосфат 2,50, глюкоза 2,50, рН -7.0-7.2; бульоне LB (Леннокс) с добавлением глюкозы (г/л): хлорид натрия 5,0, триптон 10,0, дрожжевой экстракт 5,0, глюкоза 0,5, конечная величина pH 7,0±0,2 при 25°C.

Антибиотикорезистентность штамма.

Штамм Corynebacterium amycolatum ICIS 9 чувствителен к: цефепиму, цефтриаксону, доксициклину и имипенему. Устойчив к амикацину, амоксициллину, кларитромицину, хлорамфениколу, ципрофлоксацину и гентамицину.

Генетическая характеристика предлагаемого штамма.

Проведено полногеномное секвенирование ДНК штамма Corynebacterium amycolatum ICIS 9 на секвенаторе MiSeq (Illumina) с использованием наборов реагентов MiSeq Reagent Kit v2 и Nextera XT (Illumina, США). Сборку и анализ геномов проводили с помощью SPAdes genome assembler (St. Petersburg genome assembler, version 3.9.0) и the National Center for Biotechnology Information (NCBI) Prokaryotic Genome Annotation Pipeline (PGAP) [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/annotation_prok]. Поиск генов, кодирующих факторы вирулентности (на основе нуклеотидной последовательности) проведен с использованием базы данных факторов вирулентности патогенных бактерий человека [Bo Liu et al., VFDB 2019: a comparative pathogenomic platform with an interactive web interface, Nucleic Acids Research, Volume 47, Issue D1, 08 January 2019, Pages D687–D692, https://doi.org/10.1093/nar/gky1080]. Поиск генов устойчивости к антибиотикам выполнен с использованием инструмента RGI (Resistance Gene Identifier) [B. Jia et al., CARD 2017: expansion and model-centric curation of the comprehensive antibiotic resistance database, Nucleic Acids Res. 45 (D1) (2016) D566–D573.31].

Результаты проведенного биоинформатического анализа показали:

Размер генома – 2,587,830 bp;

G+C состав – 58.67 %;

Количество генов – 2,330;

Количество rRNA оперонов – 1, 1, 1 (5S, 16S, 23S);

Количество tRNAs – 53;

Последовательность генома Corynebacterium amycolatum ICIS 9 не содержала факторов вирулентности, подтверждая его безопасность.

Полногеномная последовательность размещена в открытых базах данных DDBJ/ENA/GenBank под номером MTPT00000000.

BioProject ID: PRJNA339674

BioSample: SAMN06233788

Sample name: Corynebacterium amycolatum ICIS 9

На основе проведенного полногеномного секвенирования и культурально-морфологических признаков Штамм Corynebacterium amycolatum ICIS 9 идентифицирован как штамм вида Corynebacterium amycolatum.

Штамм является непатогенным и нетоксичным микроорганизмом.

Условия хранения штамма: штамм бактерий Corynebacterium amycolatum ICIS 9 хранят в пробирках на скошенном питательном агаре (LB агар) при температуре 4±2⁰С в защищенном от прямых солнечных лучей месте при относительной влажности воздуха не более 60%. Периодические пересевы, до 2 недель. В криогенном состоянии в 20% глицерине при –80⁰С с периодичностью обновления 1 раз в год.

Авторами экспериментально установлено, что выделенный ими новый штамм Corynebacterium amycolatum ICIS 9 продуцирует смесь азотсодержа-щих гетероциклических соединений группы 2,5-дикетопиперазина, которая обладает антибактериальной и антиоксидантной активностью.

Примеры осуществления изобретения.

Пример 1. Культивирование штамма Corynebacterium amycolatum ICIS 9 (ВКМ Ас -2843D)

Культивирование продуцента проводят в жидкой питательной среде следующего состава (г/л): триптон - 10,0; дрожжевой экстракт - 5,0; мясной экстракт – 5,0; натрий хлорид - 5,0; глюкоза – 5,0, рН=7,0±0,2. Ферментацию осуществляют в колбах Эрленмейера емкостью 750 мл на качалке со скоростью вращения 220 об/мин и при температуре +37 ºC. Объем питательной среды в колбе 100 мл. Продолжительность ферментации 72 часа. Объем посевного материала 10%. Состав среды для получения и выращивания посевного материала (г/л): триптон - 10,0; дрожжевой экстракт - 5,0; натрий хлорид - 5,0; глюкоза – 3,6, рН=7,0±0,2. Продолжительность выращивания посевного материала 48 часов на качалке со скоростью вращения 220 об/мин и при температуре + 37 ^oC. Микроморфология штамма ВКМ Ас-2843D Corynebacterium amycolatum ICIS 9 приведена на фигуре 1.

Пример 2. Выделение экзаметаболитов штамма Corynebacterium amycolatum ICIS 9 (ВКМ Ас -2843D)

По окончании срока ферментации культуральную жидкость сливают из колб в пробирки и центрифугируют при 9000 об/мин при t +4 ^oC, затем фильтруют сначала через стерильные мембранные фильтры Millipore (Merk) с диаметром пор 0,22 мкм, закисляют 2 N HCl до рН 2,0 и оставляют на ночь при +4 °С. Фильтрат культуральной жидкости экстрагируют смесью органических растворителей (хлороформа, бутилацетата, метанола и диэтилового эфира в соотношении 2:2:1:1) при соотношении экстрагента к культуральной жидкости 1:1 в течение 6 часов при температуре 25 ºС и постоянном перемешивании со скоростью 220 об/мин. Полученные экстракты упаривают досуха под вакуумом при температуре не выше 40 °С. После фильтрования и упаривания под вакуумом получают конечный продукт – сухой сырец.

Пример 3. Определение антибактериальной активности смеси экзаметаболитов штамма Corynebacterium amycolatum ICIS 9 (ВКМ Ас -2843D) в отношении штаммов условно-патогенных и патогенных бактерий

Для определения антибиотической активности используют метод дисков [Егоров, 2004]. Диски пропитывают препаратом, растворенном в 60% водном растворе диметилсульфоксида (ДМСО) и сушат их на воздухе в стерильных условиях.

Тест-объектами берут коллекционные штаммы условно-патогенных и патогенных грамположительных и грамотрицательных бактерий – Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecium, Pseudomonas aeruginosa АТСС 27853, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae. Контролем служат стандартные диски с амоксициллином («НИИ Пастера», 20 мкг/мл). Величину диаметра зоны подавления роста тест-культур оценивают через 24 часа. Чашки Петри с патогенными и условно-патогенными бактериями и инкубируют при 37°С на среде LB.

Экстракты культуральной жидкости штамма Corynebacterium amycolatum ICIS 9 обладают широким спектром антибактериальной активности в отношении патогенных и условно-патогенных видов бактерий. Величины зоны подавления роста тест-культур Staphylococcus aureus, Enterococcus faecium – 8 мм и 10 мм, соответственно и грамотрицательных бактерий Pseudomonas aeruginosa АТСС 27853, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae – 9 мм, 9 мм и 10 мм соответственно. Штамм ингибирует рост всех условно-патогенных и патогенных тест-культур (Таблица 1).

Таблица 1

Антибактериальная активность (в мм зоны подавления тест-организмов) органических экстрактов культуральной жидкости штамма Corynebacterium amycolatum ICIS 9 (ВКМ Ас -2843D)

Тест-культуры Диаметр зоны подавления, мм C. amycolatum ICIS 9 Амоксициллин S. aureus 8 22 E. faecium 10 13 P. aeruginosa АТСС 27853 9 8 E. coli 9 15 Kl. pneumoniae 10 11

Продуктивность биомассы по сырцу комплекса составила 104,075 мг на грамм абсолютной сухой биомассы.

Пример 3. Определение антиоксидантной активности органических экстрактов культуральной жидкости штамма Corynebacterium amycolatum ICIS 9 (ВКМ Ас -2843D)

Антиоксидантную активность определяли по методу Ling с соавторами [Ling et al., 2014]. Метод основан на способности антиоксидантов исходного сырья связывать стабильный хромогенрадикал 2,2-дифенил-1-пикрилгидразил (DPPH). К 1 мл неочищенного экстракта в различных концентрациях добавляли 3 мл метанола и 1 мл метанольного раствора 0,12 мг/мл DPPH. Смеси встряхивали и выдерживали в темноте в течение 20 мин. Затем измеряли оптическую плотность при 517 нм на спектрофотометре UV-2501 PC (Shimadzu, США) с приставкой диффузного отражения ISR-240A (Shimadzu, США). В качестве положительного контроля использовали аскорбиновую кислоту. Способность смеси метаболитов сырых экстрактов поглощать радикалы DPPH рассчитывали по следующей формуле:

Активность по удалению DPPH (%) = (поглощение контроля - поглощение образца) / (поглощение контроля) × 100%

Таблица 2

Антиоксидантная активность неочищенного экстракта Corynebacterium amycolatum ICIS 9 (ВКМ Ас -2843D) при различной концентрации.

Концентрация неочищенного экстракта ICIS 9 (мг/мл) 6,5 13 26,02 52,04 104,08 DPPH radical scavenging
activity (%) 3,1 ±0,031 11,48±0,11 28,46±0,57 47,17±0,47 64,78±1,94

* В таблице представлены среднее значение ± стандартное отклонение (n = 3).

Пример 4. Выделение и идентификация органических соединений в смеси экстракта культуральной жидкости штамма Corynebacterium amycolatum ICIS 9

Для определения химического состава сухого сырца, выделенного из культуральной жидкости штамма Corynebacterium amycolatum ICIS 9 применяют методы масс-спектрометрии и инфракрасной спектроскопии.

Для анализа пробы используют хроматомасс-спектрометр с диапазоном массовых чисел от 1,5 до 1090 а.е.м., разрешающей способностью не более 2 а.е.м., автоматической настройкой детектора с использованием калибровочного стандарта перфтортрибутиламина, хроматографической капиллярной колонкой длинной 30 м, диаметром 0,25 мм и толщиной пленки неподвижной фазы 0,25 мкм.

Запись спектра ведут в режиме электронной ионизации. Энергия ионизирующих электронов 70 эВ, газ носитель – гелий, скорость газа-носителя 1,5 мл/мин. Температура ионного источника 200 ºС, температура испарителя хроматографа 250 ºС, температура интерфейса детектора 250 ºС. Температура термостата колонки: выдерживание при 40° С в течение 4 мин, повышение температуры со скоростью 25 °С/мин до 250° С, выдержка при конечной температуре в течение 35 минут. Деление потока 1:20. Образцы растворяют в метаноле.

Идентификацию пиков, соответствующих веществам, проводят с использованием библиотеки масс-спектров NIST (The NIST Mass Spectral Search Program for the NIST/EPA/NIH Mass Spectral Library Version 2.0 g build May 19 2011).

Инфракрасную спектроскопию осуществляют на инфракрасном спектрометре с приставкой нарушенного полного внутреннего отражения в диапазоне обратных чисел от 400 до 4000 см^-1. Образец помещают на кристалл и записывают спектр (без предварительной пробоподготовки, напрямую). Расшифровку записанного спектра осуществляют согласно литературным данным [Infrared and Raman Characteristic Group Frequencies / George Socrates. – England, 2004. – 347 p]

Результаты расшифровки масс- и инфракрасного спектров с указанием соотношения компонентов в пересчете на сухую массу экстракта приведены в таблице 3.

Таблица 3

Химический состав смеси экзаметаболитов, выделенных из культуральной жидкости штамма Corynebacterium amycolatum ICIS 9 (ВКМ Ас -2843D)

№ Метаболит Содержание, % Полоса в ИК спектра, , см^-1 Масса молекулярного иона [M+H]⁺, Da (относительная интенсивность, %) Масса фрагментарных ионов (Da) с указанием относительной интенсивности сигнала (%) 1. 2,3-Dithiabutane 5,57 640 (С-S), 2916 (С-H) 78,95 (100) 94 (66), 45 (31), 47 (6,34), 28 (35) 2. Undecane 2,30 2916 (С-H)_asym , 2852 (С-H)_sym, 1380 δ(C-H)_CH3sym, 1406 δ(C-H) _CH3asym 57(100) 43 (96,82), 71 (46,77), 41 (42,45), 51 (4,32), 85 (37,95), 28 (34,47), 32 (21,80) 3. 4H-Pyran-4-one, 2,3-dihydro-3,5-dihydroxy-6-methyl- 6,94 1716 (С=O), 1541, 1530, 1435, 1406 – combination of C=O and C=C str, vib 144 (41,63) 28 (100), 43(57,20), 55 (12,19), 73(13,42), 101 (20,89) 4. 5-Hydroxymethylfurfural 5,08 3130 (С-H)_{furan cycle}, 2846 (С-H)_assoc.COH, 1668 (С=O) _COH, 1568, 1473, 1463, 1382 - δ(С-H)_{furan cycle} 126 (60,51) 41 (100), 97 (89,68), 39 (40,03), 29 (16,36), 38 (14,20), 51 (13,54), 69 (26,51) 5. Butyl 2-acetoxyacetate 5,17 1716 (С=O), 1228 (С-O-C)asym, 1145 (С-O-C)sym - 43 (100), 28 (54,65), 32 (25,8), 41 (12,15), 45 (23,11), 55 (13,81), 61 (21,59), 3 (20,39) 6. 1,6-Anhydro-D- β glucofuranose 20,79 1228 (С-O-C), 1145 (С-O-C), 3230 (OH) - 60 (100), 57 (49,00), 29 (29,26), 31 (19,78), 43 (20,55), 44 (9,32), 73 (32,73), 70 (15,54), 98 (8,59) 7. β-D-Glucopyranose, 1,6-anhydro- 24,67 - 73 (100), 29 (40), 31 (26,22), 43 (34,76), 69 (28,96), 61 (25,04), 85 (13,68), 8. Glycyl-L-proline 4,14 1716 (С=O), 1653 (С=O)_Polypeptides Mainly C=O str but coupled with C=N also (due to group -CO-NH-), 2916 (С-H)_asym , 2852 (С-H)_sym, 1380 δ(C-H)_CH3sym, 1406 δ(C-H) _CH3asym 172 (0,94) 28 (100), 33 (22,71), 41 (17,65), 55 (13,72), 68 (6,92), 70 (18,42), 83 (23,96), 111 (19,09), 154 (12) 9. Pyrrolo[1,2-a]pyrazine-1,4-dione, hexahydro-3-isopropyl- 5,13 196 (1,58) 154 (100), 70 (99,72), 28 (19,60), 41 (31,00), 55 (13,20), 125 (28,41) 10. Pyrrolo[1,2-a]pyrazine-1,4-dione, hexahydro-3-alkyl(C9H19) 4,38 281 (1,09) 154 (100), 70 (76,47), 27 (18,83), 32 (26,99), 86 (28,09), 41 (26,59), 55 (7,55), 96 (5,90), 125 (12,14), 277 (3,5) 11. Pyrrolo[1,2-a]pyrazine-1,4-dione, hexahydro-3-cycloalkyl(C10H19) 10,97 292 (1,42) 154 (100), 70 (82,58), 86 (27,67), 41 (26,58), 55 (9,82), 96 (5,90), 125 (28,41), 277 (3,5) 12. Pyrrolo[1,2-a]pyrazine-1,4-dione, hexahydro-3-alkyl(C11H23) 1,82 309 (0,86) 70 (100), 154 (91,02), 28 (4,04), 38 (10,21),41 (19,24), 43 (20,33), 54 (6,66), 86 (10,71), 125 (15,04), 281(2,48) 13. 1,2-Benzenedicarboxylic acid, dibutyl ester 3,06 1731 (С=O), 1467 Ring str., 1435 Ring str.; 1287, 1145 Aromatic =C-H in-plane deformation vibrations - 149 (100), 41 (11,50), 29 (8,81)

Таким образом, основными веществами в смеси органических соединений сухого сырца экзаметаболитов, обладающими выраженными антибактериальными и антиоксидантными свойствами, являются азотсодержащие гетероциклические вещества 3-изопропилгексагидропирроло[1,2-α]пиразин-1,4-дион, 3-октилгексагидропирроло[1,2-α]пиразин-1,4-дион, 3-циклодецил гексагидропирроло[1,2-α]пиразин-1,4-дион и 3-ундецилгексагидропирроло [1,2-α]пиразин-1,4-дион, относящиеся к гомологам группаы 2,5-дикетопиперазина, структуры которых представлены на фигуре 2. Содержание гетероциклических соединений в сырце не менее 20 %.

Изобретение относится к биотехнологии. Применение штамма Corynebacterium amycolatum ICIS 9, в качестве средства для продуцирования смеси азотсодержащих гетероциклических соединений группы 2,5-дикетопиперазина, обладающей антибактериальной и антиоксидантной активностью. Изобретение обеспечивает расширение арсенала средств для получения лекарственных препаратов с использованием микроорганизмов-продуцентов. 2 ил., 3 табл., 5 пр.

Применение штамма Corynebacterium amycolatum ICIS 9 ВКМ Ас-2843D в качестве средства для продуцирования смеси азотсодержащих гетероциклических соединений группы 2,5-дикетопиперазина, обладающей антибактериальной и антиоксидантной активностью.