Композиция с использованием метаболитов Bacillus subtilis для лечения заболеваний мочевыводящих путей Российский патент 2025 года по МПК A61K35/742 A61K36/45 A61K31/7004 A61P13/00 C12R1/125 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0001] Настоящие изобретение относится к биотехнологии и медицине, а именно к композициям для лечения и профилактики заболеваний мочевыводящих путей с использованием метаболитов пробиотических микроорганизмов. Настоящее изобретение может быть использовано в пищевой промышленности, ветеринарии и медицине.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0002] Инфекция мочевыводящих путей (ИМП) является наиболее распространенной инфекцией, наблюдаемой у людей, ежегодно поражающей 150 миллионов человек во всем мире. В то время как ИМП может быть вызвана многочисленными видами бактерий, включая Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae), Proteus mirabilis (P. mirabilis) и Staphylococcus aureus (S. aureus), условно-патогенный микроорганизм Escherichia coli (E. coli) составляет большинство (>65%) зарегистрированных случаев (O'Connor et al., 2019). При этом E. coli является представителями микробиоты кишечника.

[0003] Микробиота кишечника, с одной стороны, обеспечивает колонизационную резистентность и участвует в формировании иммунного ответа. Отсутствие колонизационной резистентности приводит к значительному ослаблению противоинфекционной защиты организма, увеличению численности и спектра патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, а, следовательно, к повышению восприимчивости организма к возникновению инфекционных заболеваний бактериальной и вирусной природы (Бондаренко с соавт, 2003; Петровская, 1982; Бухарин, 1999), развитию эндогенных инфекций, суперинфекций различных локализаций (Ленцнер, 1987; Юшков, 2002; Минушкин с соавт., 1999). С другой стороны, многих представителей нормальной микробиоты кишечника можно отнести к условно-патогенным микроорганизмам. Попадая в несвойственные им органы или системы органов, эти микроорганизмы могут вызывать серьезные инфекционные заболевания. Например, при выведении с калом E.coli может колонизировать периуретральную область и попасть в мочевыводящие пути.

[0004] Отдельные эпизоды ИМП обычно хорошо переносятся пациентами, но рецидивирующие ИМП способны значительно ухудшить их качество жизни. Рецидивирующие инфекции встречаются у примерно 35-53% женщин после терапии в течение одного года (Domenici et al., 2016). Для лечения и профилактики рецидивов инфекционных заболеваний мочеполовой системы используют вещества, способствующие выведению из мочевыводящих путей патогенных микроорганизмов. Наиболее популярными в этом отношении являются клюква и D-манноза (например, US 9895341 B2, опубл. 20.02.2018, МПК: A61K 31/352, A61K 39/00, A61K 45/06, A61K 31/353, A61K 31/7048; US 8153166 B2, опубл.:10.04.2012, МПК: A01N 65/00; EP 3558459 A1, опубл. 30.10.2019, МПК: A61K 31/70, A61K 36/45, A61K 36/63, A61P 13/10, A61P 31/04). Однако использование клюквы и D-маннозы без дополнительных лекарственных веществ может быть недостаточно эффективным в отношении ярко выраженной инфекции мочевыводящих путей (Jepson et al., 2012; Barbosa-Cesnik et al., 2011).

[0005] Чаще всего для лечения развившейся инфекции мочевыводящих путей применяют антибиотики. Однако антибиотики, принимаемые перорально, могут вызывать дисбактериоз кишечника, связанный с нарушением качественного и количественного состава микрофлоры кишечника (Shah et al., 2021). Помимо проблем с пищеварением, дисбактериоз кишечника вызывает подавление общего иммунитета, что приводит к риску рецидива инфекционных заболеваний. В том числе, заболеваний мочевыводящих путей. Показано, что частота рецидивов ИМП возвращается к исходному уровню после прерывания антибиотикотерапии. Например, 60% женщин сталкиваются с рецидивом в течение ближайших 3 месяцев (Domenici et al., 2016).

[0006] Одним из способов разорвать этот замкнутый круг является применение пробиотических композиций, включающих живые пробиотические микроорганизмы. Известны композиции, направленные на лечение и профилактику заболеваний мочевыводящих путей, включающие пробиотические микроорганизмы (например, FR 2906109 B1, опубл. 22.09.2006, МПК: A23L 33/00, A61K 31/375, A61K 31/70, A61K 35/74, A61K 35/741, A61K 36/45, A61P 13/02, A61P 31/00; US 20090226548 A1, опубл. 10.09.2009; МПК: A61K 36/45, A61P 31/04). Однако такие композиции теряют эффективность при одновременном приеме с антибиотиками, т.к. содержащиеся в них живые пробиотические микроорганизмы под действием антибиотиков частично или полностью гибнут.

[0007] Известна композиция, направленная на лечение и профилактику заболеваний мочевыводящих путей, включающая метаболиты Bacillus subtilis (B.subtilis) (US 6156355 A; опубл.: 05.12.2000; МПК: A23K 1/10, A23K 1/14, A23K 1/16, A23K 1/175, A23K 1/18, A23K 1/175). Однако в указанной композиции, предложенной для кормления животных используется экстракт культуральной жидкости (Bacillus subtilis Fermentation Extract), включающий лишь часть метаболитов B.subtilis. Выборочность метаболитов может снижать эффективность и спектр применения данной композиции.

[0008] Таким образом, существует необходимость разработки эффективных средств для лечения и/или профилактики инфекций мочевыводящих путей, не теряющих эффективность при одновременном приеме с антибиотиками и модулирующих микробиоту кишечника.

ТЕРМИНЫ И СОКРАЩЕНИЯ

[0009] Дисбактериоз - это качественное и/или количественное изменение бактериальной микрофлоры в организме, перемещение различных ее представителей в несвойственные им места обитания, сопровождающееся метаболическими и иммунными нарушениями. Причем указанные нарушения не исчезают после устранения неблагоприятного фактора, вызвавшего дисбактериоз. Чаще всего под дисбактериозом подразумевают нарушение микрофлоры кишечника (Хурса с соавт., 2017; Жучкова, 2015).

[0010] Изолятор патогенов - компонент, способствующий выведению патогенных и/или условно-патогенных микроорганизмов из мочевыводящих путей.

[0011] Культуральная жидкость - жидкая среда, получаемая при культивировании различных про- и эукариотических клеток in vitro и содержащая остаточные питательные вещества и продукты метаболизма этих клеток (Тарантула, 2005).

[0012] Культуральная суспензия - жидкая среда, получаемая при культивировании различных про- и эукариотических клеток in vitro и содержащая культивируемые клетки и/или споры.

[0013] Метабиотики - вещества, являющиеся структурными компонентами пробиотических микроорганизмов и/или их метаболитов, которые способны оптимизировать физиологические функции, метаболические, эпигенетические, информационные, регуляторные, транспортные, иммунные, нейрогормональные, и/или поведенческие реакции, связанные с деятельностью симбиотической (индигенной) микрофлоры организма-хозяина (Шендеров с соавт., 2018).

[0014] Микробиота (микрофлора) - совокупность различных видов микроорганизмов, населяющих определенную среду обитания. Постоянно живущие в симбиозе с хозяином микроорганизмы называются нормальной, или симбиотической, микрофлорой (Фирсов, 2006 г.).

[0015] Пробиотики - функциональный пищевой ингредиент в виде полезных для человека непатогенных и нетоксикогенных живых микроорганизмов, обеспечивающий при систематическом употреблении в пищу в виде препаратов или в составе пищевых продуктов благоприятное воздействие на организм человека в результате нормализации состава и/или повышения биологической активности нормальной микрофлоры кишечника (ГОСТ Р 52349-2005).

[0016] ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография.

[0017] ВЭЖХ-МС2 - высокоэффективная жидкостная хроматография с тандемным масс-селективным детектированием.

[0018] ВЭЖХ-МС2 ВР-ЭСИ - высокоэффективная жидкостная хроматография с тандемным масс-селективным детектированием высокого разрешения с ионизацией электроспреем.

[0019] ВЭЖХ-МС2ВР - высокоэффективная жидкостная хроматография высокого разрешения с тандемным масс-селективным детектированием высокого разрешения.

[0020] ЖК - жирные кислоты.

[0021] ЖКТ - желудочно-кишечный тракт.

[0022] кДа - килодальтон.

[0023] КОЕ - колониеобразующая единица.

[0024] B. subtilis - Bacillus subtilis.

[0025] E. сoli - Escherichia coli.

[0026] CD64 - мембранный белок Fc-гамма-рецептор 1, моноцитарный маркер, также провоспалительный маркер макрофагов.

[0027] IL1b - интерлейкин 1 бета, провоспалительный цитокин.

[0028] IL6 - интерлейкин 6, про- и противовоспалительный цитокин, фактор регенерации, фактор активации макрофагов, фактор стимуляции лимфоцитов.

[0029] IL10 - интерлейкин 10, противовоспалительный цитокин.

[0030] MRSA - метициллин-резистентные штаммы S. Aureus.

[0031] RI - индекс удерживания.

[0032] RT - время удерживания.

[0033] TNFa - фактор некроза опухолей альфа, фактор активации макрофагов.

[0034] TGFb - трансформирующий фактор роста бета, блокирует активацию макрофагов, подавляет воспалительный иммунный ответ.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0035] Задачей настоящего изобретения является создание композиции для лечения и профилактики заболеваний мочевыводящих путей, совместимых с приемом антибиотиков и препятствующих возникновению дисбактериоза кишечника.

[0036] Данная задача решается заявляемым изобретением за счет достижения такого технического результата как создание композиции, способствующей выведению патогенных микроорганизмов из мочевыводящих путей, обладающей широким антагонистическим действием в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, обладающей стимулирующим действием в отношении нормальной микробиоты кишечника, обладающей иммуномодулирующим потенциалом.

[0037] Заявленный технический результат достигается за счет того, что заявленная композиция включает биологически активные вещества, включающие комплекс метаболитов пробиотического штамма B. subtilis, в количестве 0,1-7% от массы всех биологически активных веществ. Кроме того, биологически активные вещества включают изолятор патогена, способствующий выведению патогенных и/или условно-патогенных микроорганизмов из мочевыводящих путей. При этом содержание изолятора патогенов может составлять 93,0-99,9 % от массы всех биологически активных веществ.

[0038] Метаболиты могут представлять собой вещества, содержащиеся в культуральной суспензии пробиотического штамма B. subtilis. В предпочтительном варианте реализации метаболиты представляют собой вещества, содержащиеся в смеси культуральной жидкости, вегетативных клеток и спор пробиотического штамма B. subtilis. Указанная смесь включает практически весь спектр метаболитов пробиотического штамма B. subtilis. При этом культуральная жидкость может быть высушенной до такого состояния, что влажность сухой культуральной жидкости составляет не более чем 6% мас. При этом вегетативные клетки и споры пробиотического штамма B. subtilis. могут быть инактивированными (неживыми). При этом вегетативные клетки и споры пробиотического штамма B. subtilis также могут быть высушенными так, что их влажность составлет не более 6% мас. В предпочтительном варианте реализации пробиотический штамм B. subtilis представляет собой B. subtilis ВКМ В-3536D. Метаболиты пробиотического штамма B. subtilis способны селективно подавлять рост широкого ряда патогенных и условно патогенных микроорганизмов. Благодаря отсутствию активных живых микроорганизмов, заявленная композиция не теряет эффективности при сочетанном приеме с антибиотиками, что позволяет использовать ее для лечения и профилактики заболеваний мочевыводящих путей у широкого круга пациентов. Использование высушенной культуральной жидкости, а также использование высушенных вегетативных клеток и спор пробиотического штамма B. subtilis позволяет создать сухую композицию, пригодную для длительного хранения и удобную для транспортировки.

[0039] Изолятор патогена может включать D-маннозу, клюкву или их смесь. При этом в смеси содержание D-маннозы может составлять 27,0-98,0% от массы биологически активных веществ, а содержание клюквы может составлять 1,9-66,0% от массы биологически активных веществ. В предпочтительном варианте реализации клюква включена в композицию в виде порошка, полученного из цельных ягод.

[0040] Заявленная композиция может дополнительно включать цинк. В предпочтительном варианте реализации цинк включен в композицию в виде органической соли. В еще более предпочтительном варианте реализации соль цинка представляет собой цитрат цинка.

[0041] Благодаря своему составу заявленная композиция нормализует количественный и качественный состав микрофлоры в кишечнике, селективно ингибируя рост патогенных и условно-патогенных микроорганизмов и создавая условия для роста симбиотической микрофлоры. Это обеспечивает иммуностимулирующее действие заявленной композиции на организм пациента. Кроме того, заявленная композиция способствует выведению патогенных и условно-патогенных микроорганизмов из мочевыводящих путей.

[0042] Технический результат также достигается за счет разработки доступного способа получения заявленной композиции. Способ включает следующие этапы:

а) выращивание пробиотического штамма B. subtilis в жидкой питательной среде, имеющей исходный рН 7,0±0,2. В предпочтительном варианте реализации проводят глубинное выращивание в ферментере с коэффициентом заполнения 60-70% при температуре 36-38°С при постоянном перемешивании и аэрации. При этом выращивание заканчивают, когда рН культуральной суспензии достигает 8,5-8,9 и/или до достижения созревания культуры не менее 90%. Этот этап выращивания соответствует максимальной концентрации метаболитов B. subtilis в культуральной суспензии. Указанный способ выращивания позволяет максимально эффективно использовать оборудование для получения метаболитов B. subtilis;

б) путем центрифугирования культуральной суспензии на проточной центрифуге отделяют вегетативные клетки и споры пробиотического штамма B. subtilis от культуральной жидкости;

в) высушивают культуральную жидкость. В предпочтительном варианте реализации культуральную жидкость высушивают методом лиофилизации;

г) инактивируют вегетативные клетки и споры;

д) смешивают лиофилизированную культуральную жидкость, инактивированные вегетативные клетки и споры в соотношении;

е) к полученному комплексу метаболитов добавляют изолятор патогенов.

[0043] Заявленный способ обеспечивает получение композиции, включающей практически весь спектр метаболитов пробиотического штамма B. subtilis. Благодаря этому заявленная композиция усиливает иммунитет и позволяет избежать или снизить эффект дисбактериоза, который может быть вызван антибиотиками, используемыми при лечении заболеваний мочевыводящих путей.

[0044] Способ может дополнительно включать высушивание инактивированных вегетативных клеток и спор. В предпочтительном варианте реализации инактивированные клетки и споры высушивают методом лиофилизации.

[0045] Способ может дополнительно включать добавление соли цинка к композиции, включающей комплекс метабиотиков пробиотического штамма B. subtilis и изолятор патогенов. Это позволяет создать композицию с усиленным иммуностимулирующим эффектом.

[0046] В предпочтительном варианте реализации для получения композиции все компоненты используют в сухом виде. Это увеличивает срок хранения композиции без потери ее эффективности. Это связано с сохранением активности метаболитов и с минимизацией риска загрязнения композиции какими-либо активными микроорганизмами.

ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0047] На Фиг. 1 представлены результаты исследования иммуномодулирующих свойств комплекса метаболитов B. subtilis.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0048] В приведенном ниже подробном описании реализации изобретения приведены многочисленные детали реализации, призванные обеспечить отчетливое понимание настоящего изобретения. Однако, квалифицированному в предметной области специалисту, очевидно, каким образом можно использовать настоящее изобретение, как с данными деталями реализации, так и без них. В других случаях хорошо известные методы, процедуры и компоненты не описаны подробно, чтобы не затруднять излишне понимание особенностей настоящего изобретения.

[0049] Кроме того, из приведенного изложения ясно, что изобретение не ограничивается приведенной реализацией. Многочисленные возможные модификации, изменения, вариации и замены, сохраняющие суть и форму настоящего изобретения, очевидны для квалифицированных в предметной области специалистов.

[0050] Заявленная композиция способствует лечению и профилактике заболеваний мочевыводящих путей. Заявленная композиция включает биологически активные вещества, включающие комплекс метаболитов B. subtilis и изолятор патогенов. При этом соотношение биологически активных веществ, мас. %:

комплекс метаболитов Bacillus subtilis 0,1-7,0 изолятор патогенов 93,0-99,9

[0051] Комплекс метаболитов представляет собой вещества, содержащиеся в культуральной суспензии пробиотического штамма B. subtilis. В предпочтительном варианте реализации комплекс метаболитов представляет собой вещества, содержащиеся в смеси культуральной жидкости, вегетативных клеток и спор пробиотического штамма B. subtilis. Указанная смесь включает практически весь спектр метаболитов пробиотического штамма B. subtilis. Экспериментальные данные показывают, что метаболиты B. subtilis способны селективно подавлять рост широкого ряда патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, например: Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus agalactiae, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Streptococcuss salivarius, Streptococcus mitis, Escherichia coli (Примеры 2 и 4).

[0052] Метаболиты B. subtilis включают разнообразные биологически активные вещества, которые обладают противомикробным, пробиотическим, иммунномодулирующим действием. Например, экспериментальные данные (Пример 3) показывают, что метаболиты B. subtilis включают амикумацины А и В, которые относятся к классу продуктов дигидроизокумарина природного происхождения и проявляют антибактериальную, противогрибковую, противоопухолевую и противовоспалительную активность. Механизм их действия заключается в том, чтобы остановить транслокацию рибосом, тем самым блокируя синтез белка в клетках. Амикумацины активны в отношении устойчивых к антибиотикам штаммов возбудителя S. aureus (MRSA - метициллин-резистентные штаммы S. aureus), поэтому представляет особый интерес для борьбы с растущей устойчивостью штаммов возбудителя к антибиотикам. Амикумацин A активен против грамположительных бактерий Salmonella sp. и Shigella sp. (Maksimova et al., 2021; Kaspar et al., 2019; Park et al., 2016; Prokhorova et al., 2016; Tosco et al., 2015; Hamdache et al., 2011).

[0053] Также метаболиты B. subtilis включают циклические дипептиды (2,5-дикетопиперазины) проявляют противоопухолевую, и нейропротекторную и антигипергликемическую активность. Кроме того, циклические дипептиды проявляют противирусную, противогрибковую и антибактериальную активность. В частности, цикло(лейцилпролил) (L-Phe-D-Pro лактам) и цикло(D-фенилаланин-L-пролил) показывают антагонистическую активность в отношении S. аureus, E. coli, P. aeruginosa и C. аlbicans. При этом P. аeruginosa - один из самых распространенных возбудителей внутрибольничных инфекций, приобретающий устойчивость к обычно используемым антибиотикам., а C. аlbicans - частая причина возникновения грибковых инфекций (Zhao et al., 2020).

[0054] Молочная кислота также относится к метаболитам B. subtilis и обладает противовоспалительным эффектом за счет стимуляции противовоспалительного цитокина IL-10 и подавления активности провоспалительного цитокина IL-12. Также молочная кислота и ее производные (например, 3-фенилмолочная кислота, 4-гидроксифенилмолочная кислота) обладают антибактериальным и противогрибковым эффектом. Например, 3-фенилмолочная кислота (самостоятельно или в сочетании с молочной кислотой) проявляет подавляет рост таких патогенов, как L. monocyotgenes, E. coli, S. typhimurium, B. cereus, E. faecalis (Ning et al., 2021; Liu et al., 2020; Zheng et al., 2019; Wang et al., 2018; Ning et al., 2017; Sun et al., 2017; Narayana et al., 2007).

[0055] а-Гидроксиизокапроновая кислота обладает широким антибактериальным действием, включая такие бактерии, как MRSA (метициллин-резистентные штаммы S. aureus), устойчивые к множеству системно применяемых противомикробных препаратов (Sakko et al., 2012).

[0056] Индол представляет собой гетероциклическое конденсированное ароматическое соединение, образующееся в результате разложения аминокислоты триптофана. Индол обладает пробиотическими свойствами и поддерживает нормальный количественный и качественный состав микробиоты кишечника. Также индол поддерживает функцию эпителиального барьера и способствует иммунной толерантности для поддержания микробного комменсализма при защите от патогенных инфекций. Кроме того, индол обладает антикарциногенным, антиоксидантным и противовоспалительным действием. Последнее, вероятно, за счет стимуляции выработки цитокина IL-22 иммунными клетками кишечника (Guimarães et al., 2018; Zhang and Davies, 2016).

[0057] Длинноцепочечные мононенасыщенные жирные кислоты (т.н. Омега-9 жирные кислоты), например, миристолеиновая (C14:1), пальмитолеиновая (C16:1), олеиновая (C18:1) и элаидиновая (C18:1) кислоты увеличивают разнообразие кишечной микробиоты (Machate et al., 2020).

[0058] Некоторые насыщенные жирные кислоты с длинной цепью (ДЦЖК, LCFAs) обладают противомикробным и противовоспалительным действием. Например, пальмитиновая кислота обладает антогонистической активностью в отношении S.mutans, S.gordonii, S.sanquis, P.ginbivalis, F.nucleatum. Пентадекановая и маргариновая кислоты оказывают противовоспалительное действие (Venn-Watson et al., 2020; Huang et al., 2011).

[0059] Насыщенные жирные кислоты со средней длиной цепи, например, каприловая (C8), каприновая (C10), ундециловая (C11) и лауриновая (C12) кислоты, улучшают функцию кишечного эпителия, повышение активности ферментов микроворсинок слизистой оболочки в тонкой кишке. Указанные кислоты обладают антибактериальным, противогрибковым, противовоспалительным действием. Например, лауриновая кислота является наиболее эффективной в отношении Campylobacter jejuni, каприновая и лауриновая кислоты обладают антибактериальным действием в отношении Helicobacter pylori (Machate et al., 2020; Bae and Rhee 2019; Jung et al., 2016; Omura et al., 2011).

[0060] Витамин B5 (пантотеновая кислота) замедляет рост бактерий посредством регуляции врожденного иммунитета и адаптивного иммунитета у мышей, инфицированных Mycobacterium tuberculosis (He et al., 2018).

[0061] Аминокислоты поддерживают функцию кишечного барьера и эндокринную функцию кишечника. Аминокислоты, попадающие в кишечник извне метаболизируются кишечной микробиотой, которая использует их для синтеза собственных белков и катаболических путей. Показано, что пищевые аминокислоты могут регулировать состав микробиоты. Например, лизин поддерживает комменсальную (пробиотическую) микробиоту в кишечнике. Кроме того, лизин способствует поддержанию иммунной системы (Levine and Lohinai, 2021; Lin et al., 2017).

[0062] Культуральная жидкость пробиотического штамма B. subtilis в составе заявленной композиции может быть высушенной до такого состояния, что влажность сухой культуральной жидкости составляет не более чем 6% мас. При этом вегетативные клетки и споры пробиотического штамма B. subtilis могут быть инактивированными, то есть неспособными к размножению, предпочтительно неживыми. В предпочтительном варианте реализации пробиотический штамм B. subtilis представляет собой B. subtilis ВКМ В-3536D.

[0063] Использование комплекса метаболитов B. subtilis в концентрации менее 0,1% мас. приводит к существенному снижению эффективности композиции. Увеличение содержания метаболитов более 7% мас. нерационально, так как увеличивает стоимость производства и при этом не оказывает значительного влияния на эффективность композиции.

[0064] В качестве пробиотического штамма B. subtilis могут быть использованы штаммы B. subtilis ВКПМ №В-2335 (3), B. subtilis 534, B. subtilis ТПИ 13 - 07.06.21 - ДЕП/ВГНКИ, B. subtilis ВКПМ №В4759 (3), B. subtilis р ВМВ105, B. subtilis ТПИ 9; B. subtilis рВМВ 105. В предпочтительном варианте реализации пробиотический штамм B. subtilis представляет собой B. subtilis ВКМ В-3536D.

[0065] Благодаря отсутствию живых микроорганизмов, заявленная композиция не теряет эффективности при сочетанном приеме с антибиотиками, что позволяет использовать ее для лечения и профилактики заболеваний мочевыводящих путей у широкого круга пациентов. Кроме того, неживые вегетативные клетки и споры B. subtilis не создают конкуренции микрофлоре кишечника, которая является уникальной для каждого пациента, и соответственно, не нарушают ее баланс.

[0066] Использование высушенной культуральной жидкости, а также использование высушенных вегетативных клеток и спор пробиотического штамма B. subtilis позволяет создать сухую композицию, пригодную для длительного хранения и удобную для транспортировки.

[0067] Изолятор патогенов предназначен для связывания с фимбриями или другими адгезивными структурами патогеных микроорганизмов, и соответственно, подавления адгезивной активности бактерий в мочевыводящих путях. В качестве изолятора патогенов могут быть использованы D-манноза, клюква (Vaccinium macrocarpon) или их смесь. При этом содержание D-маннозы в смеси может составлять 27,0-98,0% от массы биологически активных веществ. Содержание клюквы в смеси может составлять 1,9-66,0% от массы биологически активных веществ. Указанное содержание D-маннозы и клюквы наиболее эффективно для выведения патогенных и условно-патогенных микроорганизмов из мочевыводящих путей.

[0068] D-манноза - простой сахар, моносахарид, структурно связанный с глюкозой. D-манноза быстро всасывается и через 30 минут достигает периферических органов, затем выводится из мочевого тракта. Она не может быть превращена в гликоген и не накапливается в организме человека. В мочевыводящих путях патогенные и условно-патогенные микроорганизмы, например, E. coli, Salmonella spp., Proteus mirabilis, могут связываться с маннозой в составе белка уромодулина на поверхности клеток, выстилающих уротелий. Связывание микроорганизмов с уротелием способствует развитию инфекционных заболеваний мочевыводящих путей. Связываясь со свободной экзогенной D-маннозой в моче, а не с белками на поверхности клеток, микроорганизмы устраняются с током мочи (Domenici et al., 2016).

[0069] Вещества, содержащиеся в клюкве (Vaccinium macrocarpon), могут снизить частоту бактериурии. В частности, было показано, что проантоцианидины ингибируют прилипание уропатогенных P-фимбрий E. coli. Сложные фенольные полимеры, такие как эллагитаннины, также были идентифицированы как сильные антибактериальные агенты (Puupponen-Pimia et al., 2005). Кроме того, проантоцианидины проявляют противовоспалительные и иммунорегуляторные функции, гипогликемические и гиполипидемические эффекты, регуляцию метаболизма, репарацию ДНК и противораковые эффекты (Qi et al., 2022). Антоцианы, содержащиеся в клюкве, обладают выраженной антиоксидантной активностью как в условиях in vitro, так и in vivo. Для антоцианов характерна высокая биодоступность при пероральном применении, что обусловливает их высокий терапевтический и профилактический эффект (Алексеенко и Азарова, 2018). В предпочтительном варианте изолятор патогена включает эллагитаннины, проантоцианидины и/или полифенолы. Указанные вещества могут связываться с фимбриями микроорганизмов, устойчивыми к маннозе, что обусловливает эффективность в отношении патогенов, которые не поддаются действию только D-маннозы.

[0070] Помимо удаления патогенных микроорганизмов из мочевыводящих путей клюква обладает пребиотическими свойствами. Было показано, что салицилат, полученный из клюквы, может модулировать состав кишечной микробиоты за счет уменьшения численности Enterobacteriaceae и увеличения численности Bacteroidaceae. Снижение численности потенциально патогенных микроорганизмов, относящихся к семейству Enterobacteriaceae (Shigella/Escherichia) благотворно влияет на функционирование кишечника и снижает риск диареи.

[0071] В одном варианте реализации клюква включена в композицию в виде экстракта. Например, в виде экстракта, обогащенного проантоцианидинами. В предпочтительно варианте реализации клюква включена в композицию в виде порошка, полученного из цельных ягод. Это обусловлено тем, что использование цельных ягод позволяет использовать весь спектр и объем биологически активных веществ, содержащихся в клюкве. Например, исследования локализации антоцианов в клюкве показали, что в кожице их в 5,8-10,8 раз больше, чем в мякоти (Алексеенко и Азарова, 2018). Кроме того, использование порошка из цельных ягод обеспечивает оптимальное соотношений стоимости и эффективности заявленной композиции, что делает ее более доступной для широкого круга потребителей.

[0072] Биологически активные вещества могут включать цинк. Цинк играет важную роль в развитии и поддержании иммунной системы. Применение цинка подавляет рост патогенных микроорганизмов, например, Mycobacterium, а также препятствует развитию вирусной инфекции (Read et al., 2019). Заявленная композиция может включать цинк в виде соединения с другими химическими элементами. При этом содержание цинка в композиции может составлять 0,2-3% от массы всех биологически активных веществ. В предпочтительном варианте реализации цинк может быть включен в композицию в виде органической соли цинка. Это обусловлено тем, что органические соли обладают большей биодоступностью, чем неорганические соли цинка. В одном варианте реализации цинк может быть включен в композицию в хелатной форме, например, в виде соединения с аминокислотой. Однако такие соединения на рынке сравнительно дороги, что значительно увеличивает себестоимость композиции. В предпочтительном варианте реализации цинк может быть включен в композицию в виде цитрата цинка. Цитрат цинка широко доступен на рынке и обеспечивает оптимальную стоимость производства композиции без потери ее эффективности. При этом содержание остальных компонентов в заявленной композиции суммарно уменьшается на то количество мас. %, которое соответствует содержанию соли цинка. При этом содержание каждого компонента, кроме соли цинка, уменьшается пропорционально исходному содержанию каждого компонента в композиции.

[0073] Заявленная композиция может включать наполнитель, представляющий собой одно или несколько веществ, которые могут способствовать сохранению целостности композиции, сохранению биологической активности указанных метаболитов и/или могут оказывать полезный физиологический эффект, усиливая полезное действие композиции. В качестве наполнителя могут быть использованы, например, но не ограничиваясь этим: мальтодекстрин, пищевые волокна, производные крахмала, пектины, целлюлоза, микрокристаллическая целлюлоза и другие производные целлюлозы, а также другие технологически приемлемые наполнители (например, выбранные из списка, представленного на сайте https://lexparency.org/eu/32008R1333/ANX_III/). Кроме того, в качестве наполнителя может использоваться один или несколько пребиотиков, которые могут представлять собой ди-, олиго- и полисахариды, устойчивые к гидролизу пищеварительными ферментами человека и не абсорбирующиеся в верхних отделах пищеварительного тракта. Например, это могут быть пищевые волокна злаковых, овощей, фруктов, трав, например, инулин и/или олигофруктоза, или синтетические полисахариды, такие как лактулоза, или их сочетания. В еще более предпочтительном варианте реализации один или несколько пребиотиков могут иметь растительное происхождение.

[0074] Благодаря своему составу заявленная композиция усиливает ось: ЖКТ - мочевыводящие пути. Благодаря действию описанного комплекса метаболитов пробиотического штамма B. subtilis нормализуется количественный и качественный состав индивидуальной микробиоты кишечника пациента, усиливается иммунитет, увеличивается эффективность выведения патогенов из мочевыводящих путей. При этом даже при приеме антибиотиков не развивается дисбактериоз кишечника, который мог бы снижать общий иммунитет пациента и приводить к рецидивам инфекционного заболевания мочевыводящих путей. Таким образом, заявленная композиция способствует не только лечению, но и профилактике инфекционных заболеваний мочевыводящих путей.

[0075] Заявленная композиция может быть использована для изготовления пищевой добавки или фармацевтического препарата в виде порошка, таблетки или капсулы.

[0076] Способ получения заявленной композиции включает следующие этапы. На этапе а) проводят глубинное выращивание пробиотического штамма B. subtilis в жидкой питательной среде, имеющей исходный рН 7,0±0,2. В предпочтительном варианте реализации глубинное выращивание проводят в ферментере. При этом коэффициент заполнения ферментера может составлять от приблизительно 60% до приблизительно 70%. Указанный коэффициент заполнения, с одной стороны, позволяет избежать нежелательного пенообразования, и с другой стороны, позволяет максимально эффективно использовать оборудование для получения культуральной суспензии, насыщенной метаболитами пробиотического штамма B. subtilis. Глубинное выращивание проводят при температуре 36-38°С при постоянном перемешивании и аэрации до тех пор, когда рН культуральной суспензии достигнет 8,5-8,9 и/или до достижения созревания культуры не менее 90%. На данном этапе выращивания происходит переход культуры в стационарную фазу, когда клетки перестают делиться, те количество клеточной массы не увеличивается. Этот этап выращивания соответствует максимальной концентрации метаболитов B. subtilis в культуральной жидкости.

[0077] На этапе б) проводят отделение культуральной жидкости от клеток и спор пробиотического штамма B. subtilis. В одном варианте реализации культуральную жидкость отделяют от вегетативных клеток и спор путем фильтрации. В предпочтительном варианте реализации культуральную жидкость отделяют от вегетативных клеток и спор путем центрифугирования культуральной суспензии на проточной центрифуге до получения прозрачного супернатанта, представляющего собой культуральную жидкость. При этом осадок в основном содержит вегетативные клетки и споры пробиотического штамма B. subtilis.

[0078] На этапе в) высушивают культуральную жидкость, полученную на этапе б). Культуральная жидкость может быть высушена любым подходящим способом, известным из уровня техники. В предпочтительном варианте реализации культуральную жидкость высушивают методом лиофилизации. При этом культуральную жидкость высушивают до такого состояния, что влажность сухой культуральной жидкости составляет не более чем 6% мас.

[0079] На этапе г) инактивируют вегетативные клетки и споры пробиотического штамма B. subtilis путем нагревания осадка, полученного на этапе б), до температуры 60-140°С. Осадок инкубируют при указанной температуре 5-120 минут. Инактивация путем нагревания обусловливает необходимость отделения вегетативных клеток и спор от культуральной жидкости. Дело в том, что указанная температура инактивации может критически снизить биологическую активность, по меньшей мере, части метаболитов B. subtilis, содержащихся в культуральной жидкости.

[0080] д) смешивают культуральную жидкость с инактивированными вегетативными клетками и спорами.

[0081] е) к полученному комплексу метаболитов добавляют изолятор патогенов. В предпочтительном варианте реализации в качестве изолятора патогенов используют D-маннозу и/или клюкву. В случае использования обоих указанных изоляторов патогенов, они могут быть добавлены в композицию по-отдельности или в виде смеси.

[0082] Заявленный способ обеспечивает получение композиции, включающей весь спектр метаболитов пробиотического штамма B. subtilis. Благодаря этому заявленная композиция усиливает иммунитет и позволяет избежать или снизить эффект дисбактериоза, который может быть вызван антибиотиками, используемыми при лечении заболеваний мочевыводящей системы.

[0083] В одном из вариантов реализации способ дополнительно включает высушивание инактивированных вегетативных клеток и спор пробиотического штамма B. subtilis. При этом инактивированные вегетативные клетки и споры могут быть высушены любым подходящим способом, известным из уровня техники. В предпочтительном варианте реализации инактивированные вегетативные клетки и споры высушивают путем лиофилизации. В одном варианте реализации инактивированные вегетативные клетки и споры сначала смешивают с культуральной жидкостью, а затем полученную смесь высушивают, например, лиофилизируют с использованием подходящего носителя, например, мальтодекстрина. В предпочтительном варианте реализации инактивированные вегетативные клетки и споры высушивают отдельно от культуральной жидкости. В любом случае инактивированные клетки споры высушивают до такого состояния, что влажность высушенных вегетативных клеток и спор составляет не более чем 6% мас. Использование высушенных вегетативных клеток и спор позволяет получать композицию в сухом виде.

[0084] В предпочтительном варианте реализации способ дополнительно включает добавление соли цинка к композиции, включающей метабиотики пробиотического штамма B. subtilis, а также клюкву и/или D-маннозу. Это позволяет создать композицию с усиленным иммуностимулирующим эффектом.

[0085] В предпочтительном варианте реализации получают композицию в сухом виде, например, в виде порошка. Во-первых, это связано с низкой растворимостью биологически активных веществ, содержащихся в клюкве. Во-вторых, в сухом виде увеличивается срок хранения композиции без потери ее эффективности. Это связано и с сохранением активности метаболитов, и с минимизацией риска загрязнения композиции какими-либо активными микроорганизмами.

ОПИСАНИЕ РЕАЛИЗАЦИИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Пример 1. Получение комплекса метаболитов B. subtilis

[0086] В данном примере получали метаболиты штамма B. subtilis ВКМ В-3536D. Процесс глубинного культивирования вели в ферментере Р1000 фирмы Bioengineering (Швейцария) объемом 1000 дм³ с коэффициентом заполнения 0,6. В процессе культивирования поддерживали температуру 37±1°С. Скорость перемешивания составляля 250 об/мин. Начальная скорость аэрации составляла 0,2 об/об/мин, через 16 часов роста скорость изменяли до значения 0,5 об/об/мин. Процесс глубинного культивирования вели в течение 32 часов.

[0087] Приблизительно 30 л культуральной суспензии B. subtilis ВКМ В-3536D подвергали центрифугированию на проточной суперцентрифуге Sharpless AS-26 до получения приблизительно 20 л прозрачного супернатанта. При этом супернатант представлял собой культуральную жидкость, а осадок преимущественно включал в себя вегетативные клетки и споры B. subtilis.

[0088] Полученную культуральную жидкость лиофилизировали с добавлением 2,5% мас. мальтодекстрина в качестве носителя. В результате получали 560 г порошка, представляющего собой лиофилизированную культуральную жидкость.

[0089] Осадок, включающий вегетативные клетки и споры, инкубировали при температуре 118°С в течение 40 минут. Таким образом инактивировали вегетативные клетки и споры B. subtilis. Затем инактивированные вегетативные клетки и споры подвергали лиофилизации с добавлением 2,5% мас. мальтодекстрина в качестве носителя.

[0090] Смешивали лиофилизированную культуральную жидкость с лиофилизированными инактивированными вегетативными клетками и спорами B. subtilis. В результате получали весь комплекс метаболитов, присутствовавший в культуральной суспензии B. subtilis.

Пример 2. Изучение воздействия культуральной суспензии B. subtilis на ингибирование роста патогенной и условно-патогенной микрофлоры

[0091] В данном примере методом перпендикулярных штрихов изучали антагонистическую активность культуральной суспензии пробиотического штамма B. subtilis. В качестве пробиотического штамма использовали штамм B. subtilis ВКМ В-3536D. На поверхность агаризованной среды Луриа-Бертани в чашке Петри наносили штрихи культуральной суспензии штамма B. subtilis ВКМ В-3536D. Затем указанную чашку Петри на сутки помещали в термостат при температуре 37°С. После диффузии метаболитов B. subtilis в агаризованную среду, перпендикулярно к выросшему штриху подсевали штрихами тест-культуры, начиная от краев чашки Петри. Затем указанную чашку Петри на 48 часов помещали в термостат при температуре 37°С.. Наличие антагонистической активности фиксировали, измеряя зоны задержки роста тест-культур.

[0092]

Таблица 1. Результаты исследования антагонистической активности культуральной суспензии B. subtilis Объект исследования Зона задержки роста, мм Staphylococcus aureus Listeria monocytogenes Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa Salmonella typhimurium B. subtilis 10 17 25 30 28

[0093] В результате исследования было установлена выраженная способность культуральной суспензии пробиотического штамма B. subtilis к подавлению роста патогенных и условно-патогенных микроорганизмов.

Пример 3. Исследование состава культуральной жидкости B. subtilis

[0094] В данном примере количественно исследовали состав культуральной жидкости пробиотического штамма B. subtilis ВКМ В-3536D. Исследование было выполнено в Федеральном государственном унитарном предприятии «Научно-исследовательский институт гигиены, профпатологии и экологии человека» федерального медико-биологического агентства (ФГУП «НИИ ГПЭЧ» ФМБА РОССИИ).

[0095] Образец культуральной жидкости после перемешивания был разделен на пробы, которые хранились до анализа в замороженном виде при -18°С. В дальнейшем пробы были разделены на аликвоты, в которых было проведено измерение массовых концентраций аминокислот, витаминов, свободных и этерифицированных жирных кислот. Определены содержания макро/микро элементов, а также тяжелых металлов. Результаты исследования представлены в Таблицах 2-5.

[0096]

Таблица 2. Содержание аминокислот в культуральной жидкости пробиотического штамма B. subtilis Название аминокислоты Концентрация аминокислоты, нг/мл Проба 1 Проба 2 Среднее Аланин 84,4 88,6 86,5 Аргинин 13,1 13,2 13,2 Аспарагин 1,7 1,7 1,7 Аспаргиновая кислота 8,5 7,1 7,8 Валин 67,9 68,8 68,4 Гидроксипролин 44,8 46,2 45,5 Гистидин 2,3 2,6 2,5 Глицин 70,9 69,9 70,4 Глутамин 0,0 0,0 0,0 Глутаминовая кислота 25,3 23,2 24,3 Изолейцин 46,8 47,0 46,9 Лизин 266,8 273,5 270,2 Метионин 3,9 3,9 3,9 Лейцин 50,5 50,0 50,2 Орнитин 1,5 1,6 1,5 Пролин 5,5 5,5 5,5 Серин 18,2 18,3 18,2 Тирозин 7,1 7,4 7,2 Треонин 32,4 33,7 33,1 Триптофан - 2,2 2,2 Фенилаланин 60,6 63,1 61,9 Цистин 0,7 0,5 0,6 Цитрулин 0,7 0,7 0,7

[0097]

Таблица 3. Содержание витаминов в культуральной жидкости пробиотического штамма B. subtilis Название витамина Концентрация витамина, мкг/мл B5 14,5 PP 0,4 B2 0,4 B1 0,05 C 0,025 B6 0,05

[0098]

Таблица 4. Содержание свободных и связанных (этерифицированных) жирных кислот в культуральной жидкости пробиотического штамма B. subtilis, определенное методом хроматомасс-спектрометрии. в образцах культуральных жидкостей Наименование жирной кислоты Свободные жирные кислоты, нг/мл Этерифицированные жирные кислоты, нг/мл Каприловая, C8:0 406 10 Каприновая, C10:0 980 37 Ундециловая, C11:0 570 58 Лауриновая, C12:0 1361 1621 Тридекановая, C13:0 485 61 Миристолеиновая, C14:1 695 444 Миристиновая, C14:0 3355 1342 цис-10-Пентадеценовая, C15:1 НО^* НО^* Пентадекановая, C15:0 5907 1041 Пальмитолеиновая, C16:1n-7 5842 2365 Пальмитиновая, C16:0 41442 10350 цис-10-Гептадеценовая, C17:1 НО^* НО^* Маргариновая, C17:0 1220 294 γ-Линоленовая, C18:3n6 НО^* НО^* Линолевая, C18:2n6c НО^* НО^* Олеиновая, C18:1n9c 202 93 Линоэлаидиновая, C18:2t НО^* НО^* Линоленовая, C18:3n3 НО^* НО^* Элаидиновая, C18:1n9t 15 59 Стеариновая, C18:0 6459 773 Арахидоновая, C20:4n6 НО^* НО^* цис-5,8,11,14,17-Эйкозапентаеновая, C20:5 НО^* НО^* цис-8,11,14-Эйкозатриеновая, C20:3n8 НО^* НО цис-11,14-Эйкозадиеновая, C20:2 НО^* НО^* цис-11-эйкозеновая, C20:1 НО^* НО^* цис-11,14,17-Эйкозатриеновая, C20:3n11 НО^* НО^* Арахиновая, C20:0 188 11 Генэйкозановая, C21:0 17 НО^* цис-4,7,10,13,16,19-Докозагексаеновая, C22:6n3 НО^* НО^* цис-13,16-Докозадиеновая, C22:2 НО^* НО^* Эруковая, C22:1n9 НО^* НО^* Бегеновая, C22:0 66 НО^* Трикозановая, C23:0 6 НО^* Нервоновая, C24:1n9 НО^* НО^* Лигноцериновая, C24:0 185 НО^* НО* - не определяется

[0099]

Таблица 5. Содержание микроэлементов и тяжелых металлов в культуральной жидкости пробиотического штамма B. subtilis, определенное методом ICP-MS анализа Элемент / m/z Содержание в пробе, ppb (мкг/кг) без гелия Na / 23 705050 Mg / 24 10647 Al / 27 112,1 K / 39 4228 Ca / 43 38987 Ca / 44 41447 V / 51 4,58 Cr / 52 23,0 Mn / 55 9976 Fe / 56 687 Co / 59 49,2 Ni / 60 69,9 Cu / 63 1050 Zn / 66 1186 As / 75 1,17 Se / 82 7,75 Mo / 95 32,4 Ag / 107 0,26 Cd / 111 0,41 Sb / 121 0,55 Ba / 137 4,59 Pb / 206 78,2

[00100] Также был проведен общий скрининг с целью идентификации априори не предсказанных соединений в культуральной жидкости пробиотического штамма B.subtilis. Общий скрининг выполнялся методом газовой хроматомасс-спектрометрии с использованием баз данных масс-спектров и индексов удерживания в режиме автоматической интерпретации хроматомасс-спектрометрических данных. Группы органических соединений, идентифицированных при проведении хроматомасс-спектрометрическом скрининге образцов, представлены в таблицах 6-10.

[00101]

Таблица 6. Количественная оценка содержания низкомолекулярных органических кислот (кроме жирных) и неорганических кислот в культуральной жидкости пробиотического штамма B. subtilis RT, мин RI (эксп) RI (лит) Идентифицированное соединение Содержание в пробе, нг/мл 6,220 987 978 Метилбутановая кислота или
Пентановая кислота 241,8 7,726 1083 1066 Молочная кислота 244,0 8,598 1140 1252 Гидроксиизокапроновая кислота 202,9 8,702 1147 1139 Щавелевая кислота 287,4 10,813 1294 1286 Фосфорная кислота 1490,7 11,011 1308 1298 Фенилуксусная кислота - 12,624 1427 1414 Гидрокоричная кислота +
Метакрилоил глицин 2191,6 14,291 1560 1610 3-Фенилмолочная кислота 1326,9 14,511 1578 1610 3-Фенилмолочная кислота изомер 568,8 14,567 1582 1563 Гидроксифенилуксусная кислота - 17,881 1885 1935 4-Гидроксифенилмолочная кислота 936,3 18,047 1902 1935 Гидроксифенилмолочная кислота изомер 545,8 18,655 1962 - 2-Гидроксисебациновая кислота Х 18,917 1987 1981 3-Индолуксусная кислота* Х RT - Время удерживания, RI - индекс удерживания, эксп. - в эксперименте, лит. - по литературным данным

[00102]

Таблица 7. Количественная оценка содержания соединений фенольного ряда, идентифицированных в культуральной жидкости пробиотического штамма B. subtilis RT, мин RI (эксп) RI (лит) Идентифицированное соединение Cодержание в пробе, нг/мл 7,664 1079 1056 Фенол 22584,4 11,355 1333 1330 Катехол (1,2-дигидроксибензол, пирокатехин) 2382,3 12,185 1393 1410 Гидрохинон 704,5 12,332 1403 1399 3-Метилкатехол 368,7 12,442 1412 1410 Гидрохинон изомер + неидентифицированное соединение 759,3 RT - Время удерживания, RI - индекс удерживания, эксп. - в эксперименте, лит. - по литературным данным;
х - количественная оценка содержания идентифицированного соединения невозможна

[00103]

Таблица 8. Количественная оценка содержания спиртов и гликолей, идентифицированных в культуральной жидкости пробиотического штамма B. subtilis RT, мин RI (эксп) RI (лит) Идентифицированное соединение Содержание в пробе, нг/мл 6,220 991 990 Этиленгликоль 1620,2 6,764 1022 1011 Пропиленгликоль 970,3 8,114 1108 - Метионол* - 8,977 1165 1153 Бензиловый спирт 1799,4 9,279 1185 - Неидентифицированное соединение 607,0 20,650 2181 2165 1-Октадеканол Х 24,021 2563 2532 Гептаэтиленгликоль 1489,3 32,278 >3000 3052 Нонаэтиленгликоль 229,5 41,630 >3000 3316 Декаэтиленгликоль 386,7 RT - Время удерживания, RI - индекс удерживания, эксп. - в эксперименте, лит. - по литературным данным;
х - количественная оценка содержания идентифицированного соединения невозможна

[00104]

Таблица 9. Количественная оценка содержания азотсодержаших соединений, идентифицированных в культуральной жидкости пробиотического штамма B. subtilis RT, мин RI (эксп) RI (лит) Идентифицированное соединение Содержание в пробе, нг/мл 8,814 1155 1143 2-Пирролидинон (2-пирролидон) Х 10,483 1271 1266 Капролактам 218,2 11,629 1353 1332 Урацил* - 13,609 1504 1488 Дигидроурацил - 12,985 1455 - Индол** 12419,9 12,483 1415 1412 Тимин*** - 15,285 1644 1636 Фенилаланин - 15,354 1650 1653 Тирамин**** - 16,754 1776 1809 5-Гидрокси-1Н-индол 1269,4 17,265 1825 1812 9H-Пурин-6-ол - 18,230 1920 - Триптофол***** Х 26,604 2754 2625 13-Докозенамид (Амид эруковой кислоты) 344,0 RT - Время удерживания, RI - индекс удерживания, эксп. - в эксперименте, лит. - по литературным данным;
х - количественная оценка содержания идентифицированного соединения невозможна

[00105]

Таблица 10. Количественная оценка содержания пептидов, идентифицированных в культуральной жидкости пробиотического штамма B. subtilis RT, мин RI (эксп) RI (лит) Идентифицированное соединение Содержание в пробе, нг/мл 16,392 1743 - DL-Аланил-L-лейцин* 1063,4 17,371 1835 1908 Неидентифицированный циклический дипептид.
Цикло(лейцилпролил) (L-Phe-D-Pro лактам) ** 456,9 17,614 1859 1908 Неидентифицированный циклический дипептид.
Цикло(лейцилпролил)** 793,1*** 18,550 1951 1908 Неидентифицированный циклический дипептид.
Цикло(лейцилпролил) (L-Phe-D-Pro лактам) ** 1236,8 18,714 1968 - Тетрадециловый эфир N-валерил-L-пролина Х 20,650 2181 - Неидентифицированный циклический дипептид.
3-Метил-6-(фенилметил)-2,5-пиперазиндион (Цикло(Ala-Phe)) ** Х 22,322 2369 - Неидентифицированный циклический дипептид.
3-Бензиогексагидропирроло[1,2-a]пиразин-1,4-дион (Цикло(D-фенилаланин-L-пролил))** 786,7 22,682 2409 - Неидентифицированный циклический дипептид.
3-Бензиогексагидропирроло[1,2-a]пиразин-1,4-дион (Цикло(D-фенилаланин-L-пролил))** 744,5 RT - Время удерживания, RI - индекс удерживания, эксп. - в эксперименте, лит. - по литературным данным;
х - количественная оценка содержания идентифицированного соединения невозможна

[00106] Также проводили скрининг с использованием высокоэффективной жидкостной хроматомасс-спектрометрии высокого разрешения (ВЭЖХ-МС ВР). В результате скрининга методом ВЭЖХ-МС ВР были идентифицированы соединения, представленные в Таблице 11. Отличие теоретической массой от практической составляет 0,7 ppm, таким образом, можно утверждать о достоверной идентификации.

[00107]

Таблица 11. Соединения в культуральной жидкости пробиотического штамма B. subtilis, идентифицированные методом ВЭЖХ-МС ВР Идентифицированные соединения Химическая формула M+H M+2H RT Проба, мкг/мл Тирамин (Фенилэтаноламин) C₈H₁₁NO 138,091 6,95 15,315 Фенилэтиламин C₈H₁₁N 122,096 8,03 12,727 Урацил C₄H₄N₂O₂ 113,0345 5,5 11,563 Дигидроурацил C₄H₆N₂O₂ 115,0502 5,42 0,793 Тимин C₅H₆N₂O₂ 126,1133 7,73 4,049 Амикумацин B C₂₀H₂₈O₈N₂ 425,1918 8,75 133,463 Амикумацин A C₂₀H₂₉N₃O₇ 424,2078 8,65 0,509 Фенгицин A C15-ЖК C₇₁H₁₀₈N₁₂O₂₀ 1449,788 725,3977 10,75 0,000 Фенгицин A C16-ЖК C₇₂H₁₁₀N₁₂O₂₀ 1463,803 732,405 11,55 0,000 Фенгицин A C17-ЖК C₇₃H₁₁₂N₁₂O₂₀ 1477,819 739,413 12,74 0,000 Фенгицин n B C16-ЖК C₇₄H₁₁₄N₁₂O₂₀ 1491,835 749,42 13,11 0,000 Фенгицин B C17-ЖК C₇₅H₁₁₆N₁₂O₂₀ 1505,85 753,428 13,62 0,000 Фенгицин B C18-ЖК C₇₆H₁₁₈N₁₂O₂₀ 1519,866 760,436 15,12 0,000 RT - Время удерживания, ЖК - жирная кислота

Пример 4. Изучение воздействия метаболитов B. subtilis на ингибирование роста патогенной и условно-патогенной микрофлоры

[00108] В данном примере изучали способность метаболитов пробиотического штамма B. subtilis ВКМ В-3536D с молекулярным весом более 5 кДа подавлять рост индикаторных культур. Исследование проводили с использованием адаптированного метода стандартных дисков для определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам. Использованные в данном примере индикаторные культуры представлены патогенными и условно-патогенными для человека микроорганизмами. Для реализации метода индикаторные культуры помещали на поверхность агаризованной питательной среды Луриа-Бертани в чашке Петри в количестве 10⁷ КОЕ. После застывания чашки Петри подсушивали в течение 15 минут при 37°С. Затем на поверхность питательной среды с индикаторными культурами в виде капель диаметром 5±1 мм наносили по 10 мкл растворов, включающих метаболиты B. subtilis с молекулярным весом более 5 кДа. Указанные растворы были получены методом тангенциальной ультрафтльтрации. При этом раствор №1 включал метаболиты с молекулярным весом более 100 кДа, а раствор №2 включал метаболиты с молекулярным весом 5-100 кДа.

[00109] Чашки Петри с нанесенными растворами оставляли при комнатной температуре до полного впитывания капель и затем инкубировали при 37°С в течение 24-48 часов. Детекцию результатов проводили путем измерения зоны задержки роста индикаторных культур вокруг области нанесения растворов, включающих метаболиты B. subtilis. Появление зон, свободных от индикаторных культур, вокруг области нанесения указанных растворов свидетельствуют об антагонистической активности метаболитов B. subtilis в отношении индикаторных культур, указанных в Таблице 2. Величина зон, свободных от индикаторных культур, указывает на эффективность антагонистического действия метаболитов B. subtilis.

[00110]

Таблица 12. Задержка роста индикаторных культур при воздействии метаболитов B. subtilis Индикаторная культура Зона задержки роста за пределами капли раствора, включающего метаболиты B. Subtilis Раствор №1
(>100 кДа) Раствор №2
(5-100 кДа) Escherichia coli DH5α 1 мм* - Staphylococcus aureus 3.2 2 мм 2 мм Staphylococcus aureus 4.1 3 мм 2 мм Staphylococcus epidermidis 3.1 4 мм 4 мм Streptococcus agalactiae 42 1 мм 2 мм Streptococcus agalactiae 30 1 мм 1 мм Streptococcus agalactiae 9177 1 мм 1 мм Enterococcus faecium 24 1 мм 2 мм Enterococcus faecalis 4387 1 мм 1 мм Enterococcus faecalis 4661 1 мм 1 мм Streptococcuss salivarius 1453 0,5мм* 0,5мм* Streptococcus gordonii 221 - - Streptococcus mitis cl.is. 1 1 мм* 1 мм* * - бактериостатическое действие
«-» - задержка роста не наблюдалась

[00111] Из Таблицы 12 видно, что способностью к подавлению роста обладают как высокомолекулярные метаболиты весом более 100кДа (раствор №1), так и метаболиты весом 5-100кДа (раствор №2). При этом в воздействии этих двух вариантов метаболитов есть существенная разница: высокомолекулярные метаболиты весом >100 кДа вызывают задержку роста E. coli, а метаболиты весом 5-100 кДа не вызывают. При этом культуральная суспензия штамма B. subtilis ВКМ В-3536D, включающая все метаболиты, также вызывала значительную задержку роста E. coli (Пример 2). Стоит отметить, что E. coli является одним из условно-патогенных микроорганизмов, часто обнаруживаемых в мочевыводящей системе при развитии воспалительных заболеваний. Таким образом, использование всего спектра метаболитов B. subtilis обеспечивает эффективность заявленной композиции в отношении максимально широкого спектра патогенных и условно-патогенных микроорганизмов.

Пример 5. Исследование цитотоксичности метаболитов B. subtilis в отношении клеток млекопитающих

[00112] В данном примере исследовали потенциальную цитотоксичность метаболитов пробиотического штамма B. subtilis. Цитотоксичность оценивали согласно рекомендациям Европейского Агентства по безопасности пищевых продуктов (EFSA) для характеризации микроорганизмов используемых в качестве кормовых добавок или штаммов-продуцентов (Rychen et al., 2018). Штамм B. subtilis ВКМ В-3536D выращивали в сердечно-мозговом бульоне при 30°С в течение 6 ч. Клетки отделяли от культуральной жидкости центрифугированием.

[00113] Анализ цитотоксичности на клетках Vero (клеточная линия почечного эпителия зеленой мартышки) проводили по методу (Roberts et al., 2001) с модификациями. Клетки Vero инкубировали с культуральной жидкостью. Степень поврежденности клеток Vero оценивали по выделению клетками фермента лактат-дегидрогеназы. Цитотоксичность выражали в процентах от токсичности детергента Triton-X100, вызывающего выход из клеток лактат-дегидрогеназы за счет перфорации клеточных мембран. В качестве контрольных штаммов использовали цитотоксичный и нецитотоксичный штаммы рода Bacillus. В Таблице 13 представлены средние значения для штамма ВКМ В-3536D и двух контрольных штаммов. Каждый эксперимент проводился в двух повторах.

[00114]

Таблица 13. Цитотоксичность метаболитов B. subtilis в отношении клеток Vero Штамм Цитотоксичность, %* Токсичность ** B. subtilis ВКМ В-3536D 4,6 Не токсичен Нетоксичный штамм Bacillus 2,0 Не токсичен Токсичный штамм Bacillus 84,1 Токсичен * % цитотоксичности вычисляли, принимая за 100% количество лактат-дегидрогеназы, выделяемой клетками, обработанными Triton-X100.
** Интерпретация результатов: 0-20% - не токсичный, 20-100% - токсичный.

[00115] Из представленных результатов видно, что цитотоксичность культуральной жидкости штамма B. subtilis ВКМ В-3536D не превышает границы в 20%. Таким образом, метаболиты штамма B. subtilis ВКМ В-3536D, содержащиеся в исследованной культуральной жидкости, не являются токсичными в отношении клеток Vero, и могут считаться безопасными для клеток млекопитающих.

Пример 6. Исследование эффективности композиции в подавлении шигеллезной инфекции

[00116] В данном примере исследовали защитную эффективность заявленной композиции и ее отдельных компонентов на примере экспериментальной шигеллезной инфекции у мышей. Бактерии рода Shigella и вида E. coli относятся к одному семейству Enterobacteriaceae, и имеют настолько близкое филогенетическое родство, что виды Shigella некоторыми исследователями причисляются к виду E. coli (Devanga Ragupathi et al., 2017). Ввиду яркости проявления, шигеллезные инфекции являются удобной моделью для патогенеза близкородственных им видов бактерий, таких как E. coli, которые являются наиболее частыми возбудителями инфекционных заболеваний мочевыводящих путей.

[00117] Для инфицирования использовали возбудитель дизентерии - штамм Shigella sonnei II. Штамм был получен из рабочей коллекции микроорганизмов НИИЦ (МБЗ) ГНИИИ ВМ МО РФ (Санкт-Петербург). Моделирование экспериментальной шигеллезной инфекции in vivo осуществляли на белых беспородных мышах-самцах массой 18,0-20,0 г путем внутрибрюшинного заражения взвесью спор штамма S. sonnei II в объеме 0,5 мл. В предварительных исследованиях было показано, что 1 ЛД₅₀ (половинная летальная доза) возбудителя составила 5×10³ КОЕ/мл. Заражающая доза биоагента составила 10 ЛД₅₀. Наблюдение за инфицированными животными осуществляли в течение 10 сут, ежедневно регистрируя число живых и умерших в опытных и контрольных группах. Специфичность гибели животных подтверждали бактериологически - посевом селезенки павших животных на специальную питательную среду. Эффективность заявленной композиции и ее отдельных компонентов определяли по сопоставлению величин показателей выживаемости животных в подопытной группе, где животные получали заявленную композицию или ее отдельные компоненты, и контрольных группах. Было сформировано две контрольных группы: контроль заражения - группа, где животных инфицировали патогеном, но не давали заявленную композицию или ее отдельных компонентов, и группа здоровья - группа, в которой животных не заражали патогеном. Процент выживших животных в подопытной и контрольных группах определяли по таблицам В.С. Генеса (Генес, 1964).

[00118] При оценке эффективности отдельных компонентов композиции использовали следующие однократные дозы компонентов:

- D-манноза - 0,5 мг/особь;

- клюква - 0,1 мг/особь;

- комплекс метаболитов B. subtilis ВКМ В-3536D - 0,002 мг/особь.

[00119] Также проводили оценку эффективности различных вариантов композиции и комбинации ее отдельных компонентов:

- D-манноза и клюква;

- D-манноза и комплекс метаболитов;

- клюква и комплекс метаболитов;

- D-манноза, клюква и комплекс метаболитов

[00120] Компоненты композиции и комбинации компонентов разводили до необходимой концентрации физиологическим раствором и вводили перорально животному в объеме 0,5 мл, самостоятельно (группа здоровья) или одновременно с заражением биопатогеном. Результаты проведенных исследований представлены в Таблице 14.

[00121]

Таблица 14. Защитная эффективность D-маннозы, клюквы и комплекса метаболитов B. subtilis в отношении экспериментальной инфекции, вызванной Sh. sonnei II Компонент Доза
Sh. sonnei II, ЛД₅₀ Выживаемость, %,
Х; (X-tm÷X+t) Защита, %, - 10 0 (0-31) - D-манноза - 100 (69-100) - 10 30 (7-65) 30 Клюква - 100 (69-100) - 10 0 (0-31) 0 Комплекс метаболитов - 100 (69-100) - 10 40 (12-72) 40 D-манноза + клюква - 100 (69-100) - 10 30 (7-65) 30 D-манноза + комплекс метаболитов - 100 (69-100) - 10 70 (35-97)* 70* Клюква + комплекс метаболитов - 100 (69-100) - 10 40 (12-72) 40 D-манноза + клюква + комплекс метаболитов - 100 (69-100) - 10 80 (44-88)* 80* Животных в каждой группе n=10; * - различия с контролем заражения достоверны при p<0,05.

[00122] В группе здоровья, где заражения патогеном не производили, выживаемость животных составляла около 100% при введении отдельных компонентов и их комбинаций. Это говорит о том, что компоненты композиции, как по отдельности, так и комбинированно, безопасны для мышей в течение выбранного периода наблюдения. При этом в группе заражения шигеллезная инфекция приводила к 100% смертности подопытных животных (выживаемость 0%). Применение D-маннозы и метаболитов B. subtilis по отдельности обеспечивало, соответственно, выживаемость 30% и 40% инфицированных мышей по сравнению с контролем. Хотя эти различия не были достоверны, прослеживалась четкая положительная тенденция. На этом фоне клюква сама по себе не оказывала защитного эффекта.

[00123] В комбинациях D-манноза+клюква и клюква+комплекс метаболитов эффективность была такая же, как у D-маннозы и комплекса метаболитов по отдельности, т.е. синергический эффект с клюквой отсутствовал. Однако, в комбинации D-манноза+комплекс метаболитов выживаемость возрастала до 70%, а в комбинации D-манноза+клюква+комплекс метаболитов - до 80%, в обоих случаях статистически отличаясь от контроля. Это свидетельствует о синергическом эффекте между компонентами в данных комбинациях. В комбинации D-манноза+клюква+комплекс метаболитов эффективность была выше, чем в комбинации D-манноза+комплекс метаболитов, означая, что клюква, хотя и не обладает самостоятельным эффектом, усиливает эффект комбинации D-манноза+комплекс метаболитов. Результаты исследования показывают, что заявленная композиция обладает противоинфекционной активностью за счет синергетического действия компонентов.

Пример 7. Оценка иммуномодулирующих свойств метаболитов B. subtilis

[00124] В данном примере исследовали иммуномодулирующие свойства комплекса метаболитов, включающего инактивированные вегетативные клетки и споры пробиотического штамма B. subtilis ВКМ В-3536D, а также вещества из культуральной жидкости с молекулярным весом более 5 кДа. Указанные вещества с молекулярным весом более 5 кДа были получены методом тангенциальной ультрафильтрации культуральной жидкости пробиотического штамма B. subtilis ВКМ В-3536D, смешаны с инактивированными клетками и спорами, а затем лиофилизированы на мальтодекстрине в качестве носителя. Указанный комплекс метаболитов добавляли в культуру клеток моноцитов человека ТНР-1. Сравнивали эффект добавления метаболитов по отношению к контролю без метаболитов 1) на стадии дифференцировки моноцитов в макрофаги с помощью форбол-миристат-ацетата и 2) на стадии поляризации ранее дифференцированных моноцитов. Эффект оценивали методом обратной транскрипции (RT-PCR), по экспрессии мРНК маркерных генов, кодирующих интерлейкины и другие факторы: IL1b, IL6, IL10, TGFb, TNFa и CD64.

[00125] На Фиг. 1 показаны значения экспрессии указанных маркерных генов при добавлении метаболитов, нормализованные к контролю без добавления метаболитов. Указаны средние значения двух экспериментов, по три повтора в каждом эксперименте. Статистически значимые (р≤0,05) количественные изменения (не менее чем в два раза по сравнению с контролем) в обоих экспериментах отмечены звездочкой (*). Светло-серые столбцы отражают уровень экспрессии соответствующего гена на стадии дифференцировки, темно-серые столбцы отражают уровень экспрессии на стадии поляризации.

[00126] Видно, что на стадии дифференцировки исследованные метаболиты значительно усиливали экспрессию гена TNFa, и в то же время значительно снижали экспрессию гена CD64. Это указывает на усиление процесса дифференцировки моноцитов в макрофаги. Также значительно снижалась экспрессия цитокина IL1b, что указывает на противовоспалительный эффект. На стадии поляризации исследуемые метаболиты значительно повышали экспрессию цитокинов IL6 и IL10. IL10 - классический противовоспалительный цитокин, и повышение его экспрессии свидетельствует об активации противовоспалительной поляризации макрофагов. IL6 - важный регуляторный цитокин, высокие концентрации которого также ассоциированы с противовоспалительным эффектом. При этом метаболиты не оказывали достоверно значимого эффекта на экспрессию противовоспалительного цитокина TGFb, что указывает на избирательность их действия.

[00127] Полученные данные указывают на то, что исследованные метаболиты обладают иммуномодулирующими свойствами. Они могут способствовать дифференцировке моноцитов в макрофаги, а также способствовать противовоспалительной поляризации макрофагов, которая необходима для окончания воспаления и регенерации тканей.

[00128] В настоящих материалах заявки представлено предпочтительное раскрытие осуществления заявленного технического решения, которое не должно использоваться как ограничивающее иные, частные воплощения его реализации, которые не выходят за рамки испрашиваемого объема правовой охраны и являются очевидными для специалистов в соответствующей области техники.

Литература

Алексеенко Е.В., Азарова М.М. Ягоды клюквы - перспективный источник биоактивных антоциановых красителей. Пищевая промышленность 9/2018.

Бондаренко В.М., Грачева Н.М., Мацулевич Т.В. «Дисбактериозы кишечника у взрослых» // М.: КМК. - 2003. - 224 с.

Бухарин О.В. «Персистенция патогенных бактерий» // М.: Медицина - 1999. - 364 с.

ГОСТ Р 52349-2005 «Продукты пищевые. Продукты пищевые функциональные. Термины и определения» (с Изменением N 1) // ГОСТ Р от 31 мая 2005 г. № 52349-2005.

Генес, В.С. Таблицы достоверных различий между группами наблюдений по качественным показателям: пособие по статистической обработке результатов наблюдений и опытов в медицине и биологии / В.С. Генес. - Москва : Медицина, 1964. - 80 с.

Ленцнер А.А., Ленцнер Х.П., Микельсаар М.Э. и др. «Лактофлора и колонизационная резистентность» // Антибиотики и мед. биотехнология. - 1987. - №3. - С. 173-179.

Минушкин О.Н., Ардатская М.Д., Бабин В.Н., Домарадский И.В., Дубинин А.В. «Дисбактериоз кишечника» // Рос. мед. журнал. - 1999. - №3. - С. 40-45.

Петровская В.Г. «Общие закономерности взаимодействия в системе паразит-хозяин и проблема смешанных инфекций» // Журн. микробиол. - 1982. - №8. - С. 24-31.

Тарантула В.З. «Словарь биотехнологических терминов» // Москва: Роспатент, 2005.

Технический регламент Таможенного союза TP ТС 021/2011 «О безопасности пищевой продукции».

Фирсов Н.Н., «Микробиология: словарь терминов» // М: Дрофа, 2006.

Хурса Р.В., Месникова И.Л., Микша Я.С. «Кишечная микрофлора: роль в поддержании здоровья и развитии патологии, возможности коррекции» // Минск БГМУ, 2017.

Шендеров Б.А., Ткаченко Е.И., Лазебник Л.Б., Ардатская М.Д., Синица А.В., Захарченко М.М. «Метабиотики - новая технология профилактики и лечения заболеваний, связанных с микроэкологическими нарушениями в организме человека» // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. 2018; 151(3): 83-92.

Шендеров Б.А. «Медицинская микробная экология и функциональное питание: в 3 т. / Т. 1: Микрофлора человека и животных и ее функции» // М.: ГРАНТЪ, 1998. - 288 с.

Юшков В.В. и др. «Иммунокорректоры: Руководство для врачей и провизоров» // Екатеринбург: ООО «ИРА УТК», 2002. - 255 с.

Bae YS, Rhee MS. Short-Term Antifungal Treatments of Caprylic Acid with Carvacrol or Thymol Induce Synergistic 6-Log Reduction of Pathogenic Candida albicans by Cell Membrane Disruption and Efflux Pump Inhibition. Cell Physiol Biochem. 2019; 53(2):285-300. doi: 10.33594/000000139.

Barbosa-Cesnik C, Brown MB, Buxton M, Zhang L, DeBusscher J, Foxman B. Cranberry Juice Fails to Prevent Recurrent Urinary Tract Infection: Results From a Randomized Placebo-Controlled Trial, Clinical Infectious Diseases, 2011, Volume 52, Issue 1, 23-30, https://doi.org/10.1093/cid/ciq073

Devanga Ragupathi NK, Muthuirulandi Sethuvel DP, Inbanathan FY, Veeraraghavan B. Accurate differentiation of Escherichia coli and Shigella serogroups: challenges and strategies. New Microbes New Infect. 2017 Sep 23;21:58-62. doi: 10.1016/j.nmni.2017.09.003.

Domenici L, Monti M, Bracchi C, Giorgini M, Colagiovanni V, Muzii L, Benedetti Panici P. D-mannose: a promising support for acute urinary tract infections in women. A pilot study. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2016 Jul;20(13):2920-5.

Gibson, G., Hutkins, R., Sanders, M. et al. «Expert consensus document: The International Scientific Association for Probiotics and Prebiotics (ISAPP) consensus statement on the definition and scope of prebiotics» // Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 2017, 14, 491-502. https://doi.org/10.1038/nrgastro.2017.75.

Guimarães A, Venancio A, Abrunhosa L. Antifungal effect of organic acids from lactic acid bacteria on Penicillium nordicum. Food Addit Contam Part A Chem Anal Control Expo Risk Assess. 2018 Sep;35(9):1803-1818. doi: 10.1080/19440049.2018.1500718.

Hamdache A., Lamarti A.; Aleu J.; Collado I.G. Non-peptide metabolites from the genus Bacillus // J. Nat. Prod. 2011. V. 74, P. 893-899.

He W, Hu S, Du X, Wen Q, Zhong XP, Zhou X, Zhou C, Xiong W, Gao Y, Zhang S, Wang R, Yang J, Ma L. Vitamin B5 Reduces Bacterial Growth via Regulating Innate Immunity and Adaptive Immunity in Mice Infected with Mycobacterium tuberculosis. Front Immunol. 2018 Feb 26;9:365. doi: 10.3389/fimmu.2018.00365.

Huang CB, Alimova Y, Myers TM, Ebersole JL. Short- and medium-chain fatty acids exhibit antimicrobial activity for oral microorganisms. Arch Oral Biol. 2011 Jul;56(7):650-4. doi: 10.1016/j.archoralbio.2011.01.011.

Jepson RG, Williams G, Craig JC. Cranberries for preventing urinary tract infections. Cochrane Database of Systematic Reviews 2012, Issue 10. Art. No.: CD001321. DOI: 10.1002/14651858.CD001321.

Jung SW, Lee SW. The antibacterial effect of fatty acids on Helicobacter pylori infection. Korean J Intern Med. 2016 Jan;31(1):30-5. doi: 10.3904/kjim.2016.31.1.30. Epub 2015 Dec 28. PMID: 26767854; PMCID: PMC4712431.

Kaspar F, Neubauer P, Gimpel M. Bioactive Secondary Metabolites from Bacillus subtilis: A Comprehensive Review. J Nat Prod. 2019, Jul 26; 82(7):2038-2053. doi: 10.1021/acs.jnatprod.9b00110.

Levine M, Lohinai ZM. Resolving the Contradictory Functions of Lysine Decarboxylase and Butyrate in Periodontal and Intestinal Diseases. Journal of Clinical Medicine. 2021; 10(11):2360. https://doi.org/10.3390/jcm10112360.

Lin R, Liu W, Piao M, Zhu H. A review of the relationship between the gut microbiota and amino acid metabolism. Amino Acids. 2017 Dec;49(12):2083-2090. doi: 10.1007/s00726-017-2493-3.

Liu F, Sun Z, Wang F, Liu Y, Zhu Y, Du L, Wang D, Xu W. Inhibition of biofilm formation and exopolysaccharide synthesis of Enterococcus faecalis by phenyllactic acid. Food Microbiol. 2020 Apr;86:103344. doi: 10.1016/j.fm.2019.103344.

Machate DJ, Figueiredo PS, Marcelino G, Guimarães RCA, Hiane PA, Bogo D, Pinheiro VAZ, Oliveira LCS, Pott A. Fatty Acid Diets: Regulation of Gut Microbiota Composition and Obesity and Its Related Metabolic Dysbiosis. Int J Mol Sci. 2020 Jun 8;21(11):4093. doi: 10.3390/ijms21114093.

Maksimova EM, Vinogradova DS, Osterman IA, Kasatsky PS, Nikonov OS, Milón P, Dontsova OA, Sergiev PV, Paleskava A and Konevega AL. Multifaceted Mechanism of Amicoumacin A Inhibition of Bacterial Translation // Front. Microbiol. 2021 12:618857. doi: 10.3389/fmicb.2021.618857

Narayana KJ, Prabhakar P, Vijayalakshmi M, Venkateswarlu Y, Krishna PS. Biological activity of phenylpropionic acid isolated from a terrestrial Streptomycetes. Pol J Microbiol. 2007;56(3):191-7.

Ning Y, Fu Y, Hou L, Ma M, Wang Z, Li X, Jia Y. iTRAQ-based quantitative proteomic analysis of synergistic antibacterial mechanism of phenyllactic acid and lactic acid against Bacillus cereus. Food Res Int. 2021 Jan; 139:109562. doi: 10.1016/j.foodres.2020.109562. Epub 2020 Nov 1. PMID: 33509445.

Ning Y, Yan A, Yang K, Wang Z, Li X, Jia Y. Antibacterial activity of phenyllactic acid against Listeria monocytogenes and Escherichia coli by dual mechanisms. Food Chem. 2017 Aug 1;228:533-540. doi: 10.1016/j.foodchem.2017.01.112. Epub 2017 Jan 25. PMID: 28317760.

O'Connor K, Morrissette M, Strandwitz P, Ghiglieri M, Caboni M, Liu H, Khoo C, D'Onofrio A, Lewis K. Cranberry extracts promote growth of Bacteroidaceae and decrease abundance of Enterobacteriaceae in a human gut simulator model. PLoS One. 2019 Nov 12; 14(11):e0224836. doi: 10.1371/journal.pone.0224836.

Omura Y, O'Young B, Jones M, Pallos A, Duvvi H, Shimotsuura Y. Caprylic acid in the effective treatment of intractable medical problems of frequent urination, incontinence, chronic upper respiratory infection, root canalled tooth infection, ALS, etc., caused by asbestos & mixed infections of Candida albicans, Helicobacter pylori & cytomegalovirus with or without other microorganisms & mercury. Acupunct Electrother Res. 2011; 36(1-2):19-64. doi: 10.3727/036012911803860886.

Park H. B., Perez C. E., Perry E. K. and Crawford J. M. Activating and Attenuating the Amicoumacin Antibiotics.// Molecules.2016. 21(7).

Prokhorova IV, Akulich KA, Makeeva DS, Osterman IA, Skvortsov DA, Sergiev PV, Dontsova OA, Yusupova G, Yusupov MM, Dmitriev SE. Amicoumacin A induces cancer cell death by targeting the eukaryotic ribosome. Sci Rep. 2016 Jun 14;6:27720. doi: 10.1038/srep27720.

Qi Q, Chu V, Yu X, Xie Y, Li Y, Du Y, Liu X, Zhang Z, Shi J & Yan N. «Anthocyanins and Proanthocyanidins: Chemical Structures, Food Sources, Bioactivities, and Product Development» // Food Reviews International, 2022, pp. 1-29. https://doi.org/10.1080/87559129.2022.2029479.

Read SA, Obeid S, Ahlenstiel C, Ahlenstiel G. The Role of Zinc in Antiviral Immunity. Adv Nutr. 2019 Jul 1;10(4):696-710. doi: 10.1093/advances/nmz013.

Roberts PH, Davis KC, Garstka W, Bhunia AK, «Lactate dehydrogenase release assay from Vero cells to distinguish verotoxin producing Escherichia coli from non-verotoxin producing strains» // Journal of Microbiological, 2001, Methods, 43: 171-181.

Rychen G, Aquilina G, Azimonti G, Bampidis V, Bastos ML, Bories G, Chesson A, Cocconcelli PS, Flachowsky G, Gropp J, Kolar B, Kouba M, Lopez-Alonso M, Lopez Puente S, Mantovani A, Mayo B, Ramos F, Saarela M, Villa RE, Wallace RJ, Wester P, Glandorf B, Herman L, Kärenlampi S, Aguilera J, Anguita M, Brozzi R, Galobart J «EFSA FEEDAP Panel (EFSA Panel on Additives and Products or Substances used in Animal Feed): Guidance on the characterisation of microorganisms used as feed additives or as production organisms» // EFSA Journal, 2018, 16(3), 5206, 24 pp. https://doi.org/10.2903/j.efsa.2018.5206.

Sakko M, Tjäderhane L, Sorsa T, Hietala P, Järvinen A, Bowyer P, Rautemaa R. 2-Hydroxyisocaproic acid (HICA): a new potential topical antibacterial agent. Int J Antimicrob Agents. 2012 Jun; 39(6):539-40. doi: 10.1016/j.ijantimicag.2012.02.006.

Shah T., Baloch Z., Shah Z., Cui X., Xia X. «The Intestinal Microbiota: Impacts of Antibiotics Therapy, Colonization Resistance and Diseases» // Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 6597. https://doi.org/10.3390/ijms22126597.

Sun S, Li H, Chen J, Qian Q. Lactic Acid: No Longer an Inert and End-Product of Glycolysis. Physiology (Bethesda). 2017 Nov; 32(6):453-463. doi: 10.1152/physiol.00016.2017.

Tosco A., Chobelet A., Bathany K., Schmitter J.-M, Urdaci M. C., Buré C. Characterization by Tandem Mass Spectrometry of Biologically Active Compounds Produced by Bacillus Strains //journal of Applied bioanalysis. 2015. Jan., P. 19-25.

Venn-Watson, S., Lumpkin, R. & Dennis, E.A. Efficacy of dietary odd-chain saturated fatty acid pentadecanoic acid parallels broad associated health benefits in humans: could it be essential?. Sci Rep 10, 8161, 2020. https://doi.org/10.1038/s41598-020-64960-y.

Wang F, Wu H, Jin P, Sun Z, Liu F, Du L, Wang D, Xu W. Antimicrobial Activity of Phenyllactic Acid Against Enterococcus faecalis and Its Effect on Cell Membrane. Foodborne Pathog Dis. 2018 Oct; 15(10):645-652. doi: 10.1089/fpd.2018.2470.

Zhang, L.S., Davies, S.S. Microbial metabolism of dietary components to bioactive metabolites: opportunities for new therapeutic interventions. Genome Med 8, 46, 2016. https://doi.org/10.1186/s13073-016-0296-x.

Zhao K, Xing R, Yan X. Cyclic dipeptides: Biological activities and self-assembled materials. Peptide Science, 2020, https://doi.org/10.1002/pep2.24202.

Zheng R, Zhao T, Hung YC, Adhikari K. Evaluation of Bactericidal Effects of Phenyllactic Acid on Escherichia coli O157:H7 and Salmonella Typhimurium on Beef Meat. J Food Prot. 2019 Dec; 82(12):2016-2022. doi: 10.4315/0362-028X.JFP-19-217.

Изобретения относятся к биотехнологии и медицине. Предложены метабиотическая композиция для лечения и профилактики инфекционных заболеваний мочевыводящих путей и способ ее получения. Композиция содержит 0,1-7,0 мас.% комплекса метаболитов Bacillus subtilis ВКМ В-3536D или Bacillus subtilis ВКПМ В-2335 и 93,0-99,9 мас.% D-маннозы, клюквы или их смеси. Комплекс метаболитов представляет собой вещества, содержащиеся в смеси культуральной жидкости, вегетативных клеток и спор указанного пробиотического штамма Bacillus subtilis. Композиция совместима с приемом антибиотиков, способствует выведению патогенных микроорганизмов из мочевыводящих путей, обладает широким антагонистическим действием в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, стимулирующим действием в отношении нормальной микробиоты кишечника, иммуномодулирующим потенциалом. 2 н. и 19 з.п. ф-лы, 1 ил., 14 табл., 6 пр.

1. Метабиотическая композиция для лечения и профилактики инфекционных заболеваний мочевыводящих путей, которая включает биологически активные вещества, включающие комплекс метаболитов Bacillus subtilis и изолятор патогенов, при этом соотношение биологически активных веществ, мас. %:

комплекс метаболитов Bacillus subtilis 0,1-7,0 изолятор патогенов 93,0-99,9,

где комплекс метаболитов представляет собой вещества, содержащиеся в смеси культуральной жидкости, вегетативных клеток и спор пробиотического штамма Bacillus subtilis, выбранного из Bacillus subtilis ВКМ В-3536D или Bacillus subtilis ВКПМ В-2335,

а изолятор патогенов представляет собой D-маннозу, клюкву или их смесь.

2. Метабиотическая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что культуральная жидкость имеет влажность не более чем 6% мас.

3. Метабиотическая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что вегетативные клетки и споры пробиотического штамма Bacillus subtilis используются в неживом состоянии.

4. Метабиотическая композиция по п. 3, отличающаяся тем, что вегетативные клетки и споры пробиотического штамма Bacillus subtilis имеют влажность не более чем 6% мас.

5. Метабиотическая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что клюква представляет собой порошок, полученный из цельных ягод.

6. Метабиотическая композиция по п. 1, дополнительно включающая соль цинка.

7. Метабиотическая композиция по п. 6, отличающаяся тем, что соль цинка представляет собой цитрат цинка.

8. Способ получения композиции по п. 1, включающий следующие этапы:

а) выращивают Bacillus subtilis в жидкой питательной среде;

б) центрифугируют культуральную суспензию на проточной центрифуге с получением культуральной жидкости и осадка, включающего вегетативные клетки и споры Bacillus subtilis;

в) высушивают полученную культуральную жидкость;

г) инактивируют вегетативные клетки и споры Bacillus subtilis;

д) смешивают высушенную культуральную жидкость и инактивированные вегетативные клетки и споры с получением комплекса метаболитов Bacillus subtilis;

е) добавляют изолятор патогенов к полученному комплексу метаболитов, где изолятор патогенов представляет собой D-маннозу, клюкву или их смесь.

9. Способ по п. 8, в котором выращивание Bacillus subtilis проводят глубинным способом.

10. Способ по п. 9, в котором выращивание проводят в ферментере с коэффициентом заполнения 60-70%.

11. Способ по п. 9, в котором выращивание проводят при температуре 36-38°С.

12. Способ по п. 10, в котором выращивание проводят при постоянном перемешивании и аэрации.

13. Способ по п. 8, в котором используют питательную среду с исходным рН = 6,8-7,2.

14. Способ по п. 13, в котором выращивание Bacillus subtilis проводят до достижения жидкой питательной средой рН = 8,5-8,9.

15. Способ по п. 8, в котором культуральную жидкость высушивают до такого состояния, что влажность составляет не более 6% мас.

16. Способ по п. 15, в котором культуральную жидкость высушивают путем лиофилизации.

17. Способ по п. 8, в котором вегетативные клетки и споры инактивируют путем инкубации осадка, полученного на этапе центрифугирования, при температуре 60-140°С.

18. Способ по п. 17, в котором осадок инкубируют в течение 5-120 минут.

19. Способ по п. 8, по которому после инактивации вегетативные клетки и споры Bacillus subtilis дополнительно высушивают так, что влажность составляет не более 6% мас.

20. Способ по п. 19, где инактивированные клетки и споры высушивают путем лиофилизации.

21. Способ по п. 8, дополнительно включающий добавление соли цинка к смеси комплекса метаболитов с изолятором патогенов.