БЕТА-КАЗЕИН A2 И УРОВЕНЬ ГЛЮКОЗЫ В КРОВИ Российский патент 2023 года по МПК A61K35/20 A61P3/10 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к молочному белку бета-казеину А2 и регулированию уровня глюкозы в крови. В частности, настоящее изобретение относится к молоку и продуктам питания, полученным из молока. Заявитель обнаружил, что потребление молока и молочных продуктов, которые содержат высокие уровни белка бета-казеина А2, и исключение молока и молочных продуктов, содержащих бета-казеин А1, помогает регулировать или поддерживать уровень глюкозы в крови. Регулирование уровня глюкозы в крови является целесообразным для контроля целого ряда проблем со здоровьем, связанных с гипергликемией, в том числе симптомов диабета I типа и II типа. Следует отметить, что положительный эффект является немедленным (острым) и дополнительно способствует (после воздействия бета-казеина А1) регуляции или поддержанию уровня глюкозы в крови.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Уровень глюкозы в крови, который часто называют уровнем или концентрацией сахара в крови, относится к количеству глюкозы в крови человека или животного. Уровень глюкозы в крови колеблется в течение дня, являясь самым низким утром, перед едой, возрастая в течение часа или двух после каждого приема пищи. Основная функция глюкозы состоит в том, что она является источником энергии. Глюкоза из пищи поступает в кровь из кишечника и становится доступной для поглощения клетками с помощью инсулина. Глюкоза может также вырабатываться эндогенно из углеводов или из R-групп боковых цепей аминокислот-субстратов, посредством глюконеогенеза, когда доступно достаточное количество пищевой глюкозы.

Уровень глюкозы в крови строго регулируется в организме млекопитающего метаболическими процессами. Организм человека поддерживает уровень глюкозы на близком к постоянному уровне на протяжении большей части дня. Сигнальный путь инсулина заставляет клетки организма поглощать глюкозу для их собственных нужд. Если уровень глюкозы в клетках является высоким, некоторое количество глюкозы будет превращено в нерастворимый гликоген, чтобы предотвратить негативное воздействие растворимой глюкозы на клеточный метаболизм. Это снижает уровень глюкозы в крови и помогает предотвратить гипергликемию. Дефицит инсулина или нарушение способности реагировать на инсулин, приводит к диабету. Гликоген накапливается как энергетический резерв в печени и в мышечной ткани. Если хранилища гликогена человека заполнены, избыток глюкозы будет превращаться в жир и откладываться.

Гипергликемия относится к состоянию постоянно высокого уровня глюкозы в крови. Сахарный диабет является наиболее известным заболеванием, являющимся результатом выхода из строя регуляции уровня сахара в крови. Классические симптомы высокого уровня сахара в крови включают частое мочеиспускание (полиурия), повышенную жажду (полидипсию) и усиление чувства голода (полифагию). Долгосрочные осложнения, напрямую связанные с гипергликемией, включают сердечнососудистые заболевания, хроническую почечную недостаточность и диабетическую ретинопатию.

Диабет I типа является результатом неспособности организма вырабатывать инсулин, и его иногда называют инсулинозависимым или ювенильным (юношеским) диабетом. Субъекты, страдающие диабетом I типа, как правило, контролируют уровень инсулина, а, следовательно, уровень глюкозы в крови, с помощью инъекций инсулина. Диабет II типа является результатом устойчивости к инсулину, при которой клетки не используют или не реагируют на инсулин должным образом, и его иногда называют диабетом взрослых. Диабет I типа и диабет II типа являются хроническими заболеваниями, которые не лечатся. Поэтому медицинское вмешательство нацелено на предотвращение гипергликемии, а также устранение симптомов после того, как гипергликемия была диагностирована.

Молоко, главным образом коровье молоко, потребляемое населением по всему миру, является основным источником белка в рационе человека. Коровье молоко как правило содержит около 30 г белка на литр. Наибольшую часть (80%) этих белков составляют казенны, бета-казенны составляют примерно 37% казеинов. В последние два десятилетия растет число доказательств причастности белков казеинов, в частности бета-казеинов к ряду расстройств здоровья.

Бета-казенны можно подразделить на бета-казеин А1 и бета-казеин А2. Эти два белка являются преобладающими бета-казеинами в молоке, потребляемом большинством населения. Бета-казеин А1 отличается от бета-казеина А2 одной аминокислотой. Аминокислота гистидин расположена в 67 позиции 209-аминокислотной последовательности бета-казеина А1, в то время как в той же позиции у бета-казеина А2 расположен пролин. Однако, указанное различие в одной аминокислоте критически важно для ферментативного расщепления бета-казеинов в кишечнике. Наличие гистидина в позиции 67 позволяет белковому фрагменту, содержащему 7 аминокислот, известному как бета-казоморфин-7 (БКМ-7), образовываться при ферментативном расщеплении. Таким образом, БКМ-7 представляет собой продукт расщепления бета-казеина А1. В случае бета-казеина А2, позицию 67 занимает пролин, который препятствует расщеплению аминокислотной связи в этом положении. Таким образом, БКМ-7 не представляет собой продукт расщепления бета-казеина А2.

Другие варианты бета-казеинов, такие как бета-казеины В и С, также содержат гистидин в 67 позиции, а другие варианты, такие как A3, D и Е, содержат пролин в 67 позиции. Однако указанные варианты найдены только в очень низких содержаниях или вообще не найдены в молоке коров европейского происхождения. Таким образом, в контексте настоящего изобретения, термин бета-казеин А1 относится к любому бета-казеину, содержащему гистидин в 67 позиции, а термин бета-казеин А2 относится к любому бета-казеину, содержащему пролин в 67 позиции.

БКМ-7 представляет собой опиоидный пептид и потенциально может активировать опиоидные рецепторы по всему телу. БКМ-7 имеет способность проникать через стенку желудочно-кишечного тракта и попадать в кровоток, что позволяет ему оказывать влияние на системную и клеточную активность с помощью опиоидных рецепторов. Ранее заявитель и другие установили связь между потреблением бета-казеина А1 в молоке и молочных продуктах и случаями определенных состояний здоровья, включая диабет I типа (WO 1996/014577), ишемическую болезнь сердца (WO 1996/036239) и неврологические нарушения (WO 2002/019832). WO 1996/014577 описывает инициирование диабета I типа у человека при потреблении в пищу молока и молочных продуктов, содержащих бета-казеин А1. Считается, что бета-казеин А1 стимулирует диабетогенную активность, т.е. может вызвать развитие диабета у человека.

Заявитель теперь нашел убедительные научные доказательства прямой связи между потреблением бета-казеина А1 и уровнем глюкозы в крови, а также между потреблением бета-казеина А1 и развитием устойчивости к инсулину. Так как повышение уровня глюкозы в крови наблюдается в ряде неблагоприятных состояний здоровья, включая диабет I типа и диабет II типа, а также заболеваний, связанных с избыточным весом, таких как метаболический синдром (синдром X) и ожирение, заявитель нашел новый способ лечения этих состояний или контроля симптомов этих состояний. Важно отметить, что заявитель обнаружил доказательства не только острой и нежелательной реакции на потребление бета-казеина А1, но также продолжительной (после воздействия бета-казеина А1 или БКМ-7) реакции на потребление бета-казеина А1, и наступающая в результате выработка БКМ-7, может индуцировать генетические изменения у животного, что приводит к повышению уровня глюкозы в крови и, следовательно, возрастанию вероятности возникновения симптомов, связанных с высоким уровнем глюкозы в крови.

Поэтому, задачей настоящего изобретения является обеспечение способа контроля уровня глюкозы в крови, или по меньшей мере обеспечение полезной альтернативы существующим методам.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Согласно первому аспекту настоящего изобретения предложено применение композиции для регулирования уровня глюкозы в крови животного, в котором композиция содержит бета-казеин, и в котором бета-казеин содержит по меньшей мере 75% по массе бета-казеина А2.

Согласно второму аспекту настоящего изобретения предложена композиция для регулирования уровня глюкозы в крови животного, в которой композиция содержит бета-казеин и в которой бета-казеин содержит по меньшей мере 75% по массе бета-казеина А2.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложено применение молока для получения композиции для регулирования уровня глюкозы в крови животного, в котором молоко содержит бета-казеин и где бета-казеин содержит по меньшей мере 75% по массе бета-казеина А2.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложено применение бета-казеина А2 в изготовлении композиции для регулирования уровня глюкозы в крови животного, в котором композиция содержит по меньшей мере 75% по массе бета-казеина А2. Бета-казеин А2, предпочтительно, представляет собой компонент молока. Молоко, предпочтительно, является коровьим молоком.

Согласно дополнительному аспекту настоящего изобретения предложен способ регулирования уровня глюкозы в крови животного, включающий потребление животным композиции, содержащей бета-казеин, или обеспечение животного композицией для употребления, в которой бета-казеин содержит по меньшей мере 75% по массе бета-казеина А2.

Количество бета-казеина А2 может составлять любое количество в диапазоне от 75% до 100% по массе бета-казеина, например, по меньшей мере 90% или даже 100%.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, композиция представляет собой молоко или молочный продукт. Молоко может быть сухим молоком или жидким молоком. Молочный продукт может быть сливками, йогуртом, творогом, сыром, маслом, мороженым или любым другим молочным продуктом.

Уровень глюкозы в крови можно регулировать с одной или несколькими целями, включая устранение или уменьшение симптомов диабета, предотвращение состояний, связанных с диабетом, в том числе сердечно-сосудистых заболеваний, хронической почечной недостаточности и диабетической ретинопатии, и заболеваний, связанных с избыточным весом, в частности, для предотвращения или лечения ожирения.

Реакция на потребление композиции животным может представлять собой острую реакцию и может дополнительно вызывать предрасположенность у животного к повышению уровня глюкозы в крови животного.

Согласно большинству вариантов реализации настоящего изобретения, животное представляет собой человека. Тем не менее, согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения, животным может быть собака, кошка или любое другое домашнее животное, корм которого содержит молоко.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На Фиг. 1 показана активность ДПП-4 в тощей кишке крыс при краткосрочном (остром) и долгосрочном (хроническом) кормлении, получавших корм по рациону Примера 1.

На Фиг. 2 показана активность ДПП-4 в толстой кишке крыс при краткосрочном и долгосрочном кормлении, получавших корм по рациону Примера 1.

На Фиг. 3 показана активность ДПП-4 в тощей кишке крыс, получавших корм с различными соотношениями бета-казеина А1 и бета-казеина А2.

На Фиг. 4 показаны изменения метилирования ДНК в генах соответствующих ферментам, отвечающим за метаболизм и гомеостаз глюкозы.

На Фиг. 5 показаны изменения метилирования ДНК в генах соответствующих ферментам, отвечающим за инсулиновый рецептор (INSR) и субстраты инсулинового рецептора (IRS1, ISR4).

На Фиг. 6 показан сигнальный путь инсулина и гены этого пути, имеющие измененный эпигенетический статус.

На Фиг. 7 показаны уровни мРНК инсулинового рецептора (INSR) и субстрата инсулинового рецептора (IRS1), экспрессирующегося в поджелудочной железе у NOD мышей.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к композиции, содержащей белок бета-казеин, и ее применению для регулирования уровня глюкозы в крови у животного, особенно у человека. Важно отметить, что бета-казеин представляет собой А2 вариант бета-казеина. Бета-казеин в композиции на 100% является бета-казеином А2, или составляет по меньшей мере 75% по массе от общего количества вариантов бета-казеина, присутствующих в композиции. Важность преобладания А2 варианта в композиции связана с тем, что Заявитель показал, что существует прямая связь между А1 вариантом и высоким уровнем активности DPPIV в тощей кишке у животного. Высокие уровни активности ДПП-4 непосредственно связаны с высоким уровнем глюкозы в крови. Таким образом, воздействие высоких уровней глюкозы в крови человека на потребление бета-казеина А1 имеет научную основу. Заявитель также обнаружил, что потребление молока, содержащего только бета-казеин А2 или преимущественно бета-казеин А2 приводит к повышению экспрессии генов инсулинового рецептора и субстрата инсулинового рецептора. Это улучшает способность управлять гомеостазом глюкозы, уменьшает симптомы и осложнения, связанные с повышением уровня глюкозы в крови, а также снижает риск развития диабета II типа. Повышенный уровень глюкозы связан с симптомами, включающими одно или более из следующего: полиурия, полидипсия и полифагия.

В настоящей заявке термин "острый" относится, если не указано иное, к периоду времени с момента потребления бета-казеина А1 до выхода бета-казеина А1 или БКМ-7 из кишечника (обычно 8-20 часов после потребления).

Поскольку основным, если не единственным источником бета-казеина в пищевом рационе большинства населения является молоко или продукты, полученные из молока, и поскольку большинство потребляемого молока содержит смесь только А1 и А2 вариантов бета-казеина, потребление молока (или продуктов, изготовленных из такого молока), имеющих высокое содержание А2 варианта, будет обязательно означать, что потребление А1 варианта является низким. Исходя из этого, если единственный пищевой источник бета-казеина содержит только А2 вариант, и никакого другого варианта, то потребление с пищей А1 варианта исключено, и можно ожидать, что неблагоприятные симптомы, связанные с высоким уровнем глюкозы в крови, также будут устранены.

Соответственно, изобретение согласно настоящей заявке основано на снижении содержания бета-казеина А1 или исключении его из рациона, и увеличении содержанияя бета-казеина А2, и этого достигают за счет того, что бета-казеин в пищевых композициях, включающих бета-казеин, особенно в молоке и молочных продуктах, представляет собой преимущественно, или даже исключительно, бета-казеин А2.

В идеале, 100% бета-казеина в композиции представляет собой бета-казеин А2. Таким образом полное исключение бета-казеина А1, максимально увеличивает потенциал поддержания нормального уровня глюкозы в крови и, таким образом, избегания неблагоприятных симптомов, связанных с высоким уровнем глюкозы в крови, в частности в случае диабета. Тем не менее, симптомы могут быть уменьшены в любой композиции, где бета-казеин преимущественно является бета-казеином А2, например, составляет любое количество между 75% по массе до 100%, в том числе, но не ограничиваясь 80%, 90%, 95%, 98% и 99% по массе.

Композиция согласно настоящему изобретению, обычно представляет собой молоко, но может быть любым продуктом, полученным из молока, таким как сливки, йогурт, творог, сыр, масло или мороженое. Композиция также может представлять собой немолочный продукт, содержащий бета-казеин, полученный из молока. Композиция может представлять собой сам бета-казеин, или быть получена из бета-казеина, где бета-казеин может быть в твердой форме, такой как порошок, гранулы или в форме твердого осадка.

В то время как молоко может быть получено от любого млекопитающего, включая людей, коз, свиней и буйволов, согласно предпочтительным вариантам реализации настоящего изобретения, молоко представляет собой коровье молоко.

Молоко может быть в виде свежего молока, сухого молока, жидкого молока, восстановленного из сухого, обезжиренного молока, гомогенизированного молока, сгущенного молока, концентрированного молока, пастеризованного молока или непастеризованного молока, или любого другого вида молока.

Композиция настоящего изобретения пригодна для потребления в первую очередь человеком, но следует понимать, что польза для здоровья также актуальна и для некоторых других животных, таких как кошки, собаки и другие домашние животные.

Обоснование настоящего изобретения приведено в экспериментах, описанных в Примерах.

Пример 1 описывает метод кормления крыс в исследованиях Примера 2. Рационы кормления показаны в Таблице 1. Рацион на А1 молоке основан на рецептуре, где все бета-казенны в рационе являются бета-казеинами А1. Рацион на А2 молоке основан на рецептуре, где все бета-казенны в рационе являются бета-казеинами А2. Контрольный рацион основан на рецептуре, где источником белка является яичный белок.

Пример 2 описывает воздействие рационов, основанных на бета-казеине А1 и бета-казеине А2 на активность дипептидил пептидазы 4 (ДПП-4) в тощей кишке и ободочной кишке крыс. ДПП-4 представляет собой протеазу, которая, как известно, играет важную роль в метаболизме глюкозы. ДПП-4 инактивирует инкретины, представляющие собой гормоны, которые вызывают увеличение секреции инсулина и соответствующее уменьшение секреции глюкагона, а также замедляют скорость всасывания питательных веществ (в том числе глюкозы и ее полисахаридных предшественников) в кровоток за счет снижения скорости опорожнения желудка. Основными инкретинами являются глюкагоно-подобный пептид-1 (GLP-1, ГПП-1) и желудочный ингибирующий пептид (GIP, ГИП). Увеличение активности ДПП-4 означает, что уровни инкретинов снизятся. Поскольку инкретины вызывают высвобождение инсулина, уровень инсулина снизится и, следовательно, уровень глюкозы в крови будет увеличиваться. Кроме того, более низкие уровни инкретинов приводят к возрастанию скорости опорожнения желудка и, следовательно, к повышению уровня глюкозы в крови. Другими словами, снижение активности ДПП-4 должно привести к снижению уровня глюкозы в крови.

Результаты Примера 2 показывают, что рацион, содержащий бета-казеин А1 приводит к увеличению активности ДПП-4 в тощей кишке. Этот эффект не наблюдался в толстой кишке, по-видимому, потому, что поглощение глюкозы происходит в основном в тонком кишечнике, а не в толстой кишке. Таблица 2 и Фиг. 1, показывают, что по сравнению с животными, получавшими корм по рациону на А2 молоке, животные, получавшие корм по рациону на А1 молоке, демонстрировали увеличение активности ДПП-4 в ткани тощей кишки, и эта активность была постоянной как при остром, так и при хроническом воздействии бета-казеина А1 (или его пептидных метаболитов). Эффект был необратимым, или не изменялся при введении налоксона. Таблица 3 и Фиг. 2 показывают отсутствие различий в активности ДПП-4 в ткани толстой кишки у животных, получавших корм по рациону на А1 молоке и у животных получавших корм по рациону на А2 молоке, в условиях как краткосрочного, так и долгосрочного кормления. При исследовании различных соотношений бета-казеина А1 и бета-казеина А2 в рационах, и, как показано в Таблице 4 и на Фигуре 3, животные, получавшие корм, содержащий бета-казеин, 100% которого представляет собой бета-казеин А1, показали значительное увеличение активности ДПП-4 в тощей кишке. Этот рост также наблюдался у животных, получавших корм по рациону 75% А1: 25% А2. По мере увеличения доли бета-казеина А2 в рационе, то есть от 50% А1: 50% А2 до 25% А1: 75% А2 до 100% А2, уровень активности ДПП-4 снижался.

Таким образом, Пример 2 ясно показывает, что потребление бета-казеина А2, вместо бета-казеина А1, приводит к снижению уровня активности ДПП-4 в тощей кишке, и, следовательно, должно приводить к снижению уровня глюкозы в крови.

Пример 3 показывает изменения метилирования ДНК в генах, ответственных за синтез и метаболизм глюкозы (Фиг. 4) в клетках человека, обработанных БКМ-7 в течение 4-х часов. Дополнительно, этот Пример также показывает изменения метилирования ДНК в генах, ответственных за гомеостаз глюкозы (Таблица 5). И, наконец, Пример 3 показывает, что гены, имеющие значение для сигнального пути инсулина и чувствительности к инсулину, имеют измененный эпигенетический статус.

Ферменты/белки, кодируемые этими генами, опосредуют чувствительность к глюкозе и гомеостаз глюкозы под действием активации инсулина и инсулинового рецептора. Как показано на Фиг 5, гены, кодирующие инсулиновый рецептор (INSR) и субстраты инсулиновых рецепторов (IRS1, IRS4) изменены на эпигенетическом уровне. Это прямо коррелирует с уменьшением формирования инсулиновых рецепторов и снижением чувствительности к инсулину, что наблюдается при сахарном диабете II типа.

Выработка инсулина регулируется с помощью обратной связи в зависимости от уровня глюкозы в крови. Тем не менее, из-за подавления экспрессии гена инсулинового рецептора, снижается чувствительность к инсулину и нарушается метаболизм глюкозы, приводящий к нарушению гомеостаза глюкозы. Так как эти изменения происходят на эпигенетическом уровне, они потенциально имеют пожизненный эффект, а в некоторых случаях даже могут передаваться следующим поколениям. Таким образом, бета-казеин А1 (и БКМ-7) воздействует на чувствительность к инсулину на клеточном уровне вследствие изменения эпигенетического статуса генов, ответственных за гомеостаз глюкозы и сигнальный путь инсулина.

Транскрипты и функциональную онтологию каждого гена анализировали с использованием приложения программного обеспечения DAVID™ и Киотской Энциклопедии генов и геномов (KEGG), чтобы наблюдать взаимодействие генов, измененных в сигнальном пути инсулина. Гены, которые были эпигенетически модифицированы под воздействием БКМ-7 через 4 часа, показаны на Фиг. 6 (обозначены звездочкой). Несмотря на то, что Фиг. 6 является суммарным представлением и не распространяется на все обнаруженные эпигенетически-измененные гены, Фиг. 6 показывает, что БКМ-7 воздействует на чувствительность к инсулину на уровне рецепторов через ферменты, метаболизирующие глюкозу.

Пример 4 показывает изменения в экспрессии генов ключевых рецепторов, вовлеченных в сигнальный путь инсулина. В частности, этот пример рассматривает сам инсулиновый рецептор. NOD (non-obese diabetic, не страдающие ожирением диабетические) мыши получали корм по рациону А1 или по рациону А2 в течение 10 недель с последующим выделением их поджелудочных желез. Была проведена количественная оценка уровней мРНК инсулинового рецептора (INSR) и субстрата инсулинового рецептора 1 (IRS1). Как показано на Фигуре 7, уровни мРНК INSR и IRS1 были ниже в поджелудочной железе NOD мышей (n=5), получавших корм по рациону А1 по сравнению с NOD мышами, получавшими корм по рациону А2. Это указывает на то, что рацион А1 приводит к снижению уровней мРНК инсулинового рецептора. Это совпадает с изменением эпигенетического статуса INSR и IRS1, индуцированного БКМ-7 в клетках. Следовательно, бета-казеин А1 уменьшает чувствительность к инсулину, что приводит к изменению метаболизма и гомеостаза глюкозы.

Эти исследования представляют собой первое четкое научное доказательство связи между потреблением бета-казеина А1 и высоким уровнем глюкозы в крови. На основе выводов, сделанных заявителем, предложено альтернативное потенциальное решение проблем, которыми страдают диабетики, а именно, избегание в рационе бета-казеина А1. Контроль уровня глюкозы в крови требует ежедневно, даже ежечасно, внимания диабетиков. Уровень глюкозы контролируется инъекциями инсулина и строгим регулированием потребления пищи. Поскольку настоящее изобретение, в целом, приводит к снижению уровня глюкозы в крови, в частности, путем замены продуктов питания, содержащих бета-казеин А1, продуктами питания, содержащими бета-казеин А2, оно представляет собой способ контроля гомеостаза глюкозы крови, снижения устойчивости к инсулину и, возможно, уменьшения частоты инъекций инсулина, необходимых диабетикам и уменьшения количества инсулина, которое необходимо ввести.

Хорошо известно, что чрезмерное количество углеводов, особенно простых Сахаров, в рационе человека увеличивает риск развития устойчивости к инсулину, которое в дальнейшем приводит к уменьшению симптомов состояний, таких как диабет II типа и метаболический синдром. Так как бета-казеин А1 в рационе увеличивает активность ДПП-4 и подавляет экспрессию генов INSR и IRS1 и IRS4, по сравнению с бета-казеином А2, и, следовательно, приводит к высокому уровню глюкозы в крови, рацион, содержащий в небольшом количестве или не содержащий совсем бета-казеин А1, является полезным для здоровья.

С практической точки зрения, преимущества настоящего изобретения могут быть распространены на большие группы населения путем снабжения их молоком, содержащим бета-казеин, который преимущественно является бета-казеином А2, путем производства продуктов, полученных из этого молока, и обеспечения доступности этого молока и этих продуктов с целью регулирования уровня глюкозы в крови и контроля симптомов диабета и других состояний, при которых проявляется гипергликемия.

Коровье молоко может быть проверено на относительные доли бета-казеина А1 и бета-казеина А2. В качестве альтернативы, коровы могут быть генетически протестированы на их способность производить молоко, содержащее бета-казеин А1 или бета-казеин А2 или комбинацию обоих. Эти методы хорошо известны.

Настоящее изобретение предлагает решение, которое сравнительно легко осуществить, т.е. избегание молока или молочных продуктов, содержащих бета-казеин А1 и обеспечение того, чтобы молоко и молочные продукты в рационе содержали бета-казеин, который представляет собой преимущественно бета-казеин А2, предпочтительно 100% которого представляет собой бета-казеин А2.

Любую ссылку на документы предшествующего уровня техники в данном описании не следует рассматривать как признание того, что такой предшествующий уровень техники широко известен или образует часть общеизвестных знаний в данной области.

В данном описании слова "содержит", "содержащий", и подобные слова не следует интерпретировать в исключительном или исчерпывающем смысле. Другими словами, они предназначены для обозначения "в том числе", но не ограничиваются ими.

Далее настоящее изобретение описано со ссылками на следующие Примеры. Следует иметь в виду, что Примеры являются чисто иллюстративными и не ограничивают настоящее изобретение каким-либо образом.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Метод кормления

Были использованы семьдесят два отлученных от матери (четырехнедельных) самца крыс линии Вистар (Wistar). После 7-дневного периода акклиматизации на контрольном рационе, крыс кормили в течение 12 или 60 часов в соответствии с одним из трех рационов: 100% А1 рацион, 100% А2 рацион, контрольный рацион (n=6 на кормление). Белковые компоненты рационов были получены из обезжиренного молока (для А1 и А2 рационов) и яичного белка (для немолочного белкового контрольного рациона), и были сбалансированы по энергетической ценности и композиции макроэлементов (Таблица 1). За пятнадцать минут до окончания периода кормления, крысы получали либо налоксон либо физиологический раствор (контроль) путем внутрибрюшинной инъекции, а затем перорально, через желудочный зонд получали неусваиваемый индикатор, диоксид титана. Образцы кала и мочи отбирали в 7 временных точках в течение следующих 24 часов, и хранили при -20°С (кал) или при -80°С (моча) до момента анализа.

Пример 2: активность ДПП-4

Активность дипептидил пептидазы IV (DPP IV, ДПП-4) в тканях тощей и толстой кишки крыс, получавших корм в соответствии с Примером 1, количественно определяли с использованием коммерческого набора (Kit BML-AK498, ENZO Life Sciences, USA). Образцы ткани (50 мг) гомогенизировали в Трис (100 мМ, рН 8) и количественно оценивали путем добавления Gly-Pro-4-нитроанилида (Sigma)>Дипептидил Пептидазы>Gly-Pro+ р-нитроанилина инкубировали в Трис (100 мМ, рН 8) в течение 15 мин при температуре 37°С. Реакцию останавливали ацетатным буфером (1 М, рН 4,2) и поглощение измеряли в планшете-ридере при 405 нм, и сравнивали с эталонной стандартной кривой (Sigma), чтобы вычислить активность. Одна единица производит 1,0 мМ 4-Нитроанилина из Gly-Pro-4-нитроанилина в минуту в 0,1 М Трис/HCl при рН 8,0 при 37°С. Результаты, приведенные в Таблицах 2-4 и на Фигурах с 1-3, ясно показывают, что бета-казеин А1 увеличивает активность ДПП-4 в тощей кишке. Активность ДПП-4 выражена в единицах нмоль/мин/мкг белка. Обратите внимание, что крысы, используемые для исследования различных соотношений бета-казеина А1 и бета-казеина А2 (таблица 4) содержались по-разному (очищенный крысиный рацион AIN-76A).

Пример 3: Влияние БКМ-7 на уровни метилирования ДНК

Изменения в глобальных картинах метилирования ДНК, индуцированные БКМ-7, были исследованы путем секвенирования генома, обогащенного белком с метил-CpG-связывающим доменом (MBD, methyl-CpG binding domain), (MBD-секвенирования), как описано ранее (Trivedi М., et al., Mol. Pharm. 2014), в то же время данные микроматричного анализа трансляции мРНК были получены с использованием микрочипов Agilent V3, на необработанных контрольных клетках SH-SY5Y, и клетках, обработанных в течение 4 часов 1 мкМ БКМ-7.

Геномную ДНК экстрагировали из образцов набором Easy DNA kit (Invitrogen K1800-01) с использованием соответствующего протокола для клеточных линий. Фрагментацию ДНК выполняли на приборе Covaris S2 со следующими настройками: рабочий цикл 10%, интенсивность 5, 200 циклов на разрыв в течение 200 сек. Были получены фрагменты, имеющие среднюю длину 200 п.о. Режим питания представлял собой режим качания частоты, температура 6-8°С, уровень воды 12. Максимум 5 мкг было добавлено к 130 мкл Трис-ЭДТА в микропробирку с AFA (Adaptive Focused Acoustics) усилителем. Для образцов с введением меньшего количества ДНК (до 500 нг), ДНК разводили в соотношении 1:5 в Трис-ЭДТА. ДНК с введением 5-3 мкг анализировали на биоанализаторе Agilent 2100 с использованием набора для анализа ДНК DNA 1000 Kit. ДНК с введением ниже 3 мкг концентрировали в роторном испарителе до 25 мкл и проверяли распределение фрагментов на ДНК-чипе с высокой чувствительностью. Захват метилированной ДНК осуществляли с использованием набора MethylCap (Diagenode, Belgium). Выход был обычно между 0,5 и 8 нг от общей захваченной ДНК. Фрагменты были последовательно секвенированы с помощью секвенатора Illumina Genome Analyzer II. Концентрации фрагментированной и захваченной ДНК были определены на ридере для считывания многолуночных планшетов Fluostar Optima с набором для количественного определения двухцепочечной ДНК Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit (Invitrogen P7589) при длине волны 480/520 нм.

Для приготовления библиотеки ДНК, был использован набор DNA Sample Prep Master Mix Set 1 (NEB E6040) в комбинации с набором Multiplexing Sample Preparation Oligo Kit (96 образцов, Illumina PE-400-1001). Вся фрагментированная ДНК была использована в соответствии с протоколами NEB (New England Biolabs) с использованием адаптеров для мультиплексирования образцов, предусмотренных в наборе Multiplexing Sample Preparation Oligo Kit. Отбор фрагментов нужного размера из библиотеки проводили в 2% агарозном геле (Low Range Ultra Agarose, Biorad 161-3107). Использовали маркер размеров 1 Кб Plus ladder (Invitrogen 10787-018), и проводили электрофорез при 120 В в течение 2 часов. Фрагменты размером 300 п.о. +/- 50 п.о. вырезали и элюировали на колонке из набора Qiagen Gel Extraction Kit (Qiagen 28704) и элюировали в 23 мкл ЕВ.

Протокол амплификации библиотеки одновременно с ее индексированием для платформы Illumina был использован со следующими изменениями: использовали 22 мкл ДНК и осуществляли 21 цикл. Образец очищали на колонке для очистки продуктов ПЦР Qiaquick PCR Purification column (Qiagen 28101) и элюировали в 50 мкл ЕВ, разводили в соотношении 1: 5, концентрировали в роторном испарителе до 10 мкл. 1 мкл наносили на высокочувствительный ДНК-чип от Agilent 2100 и концентрацию определяли путем анализа мазка на Agilent 2100. Образцы разбавляли до концентрации 10 нМ. После денатурации с NaOH образцы разбавляли до концентрации 16 пМ. Подготовку ячейки для парно-концевых (Paired-End) прочтений осуществляли в соответствии с руководством пользователя для Cluster Station. Секвенирование проводили в соответствии с руководством пользователя для секвенатора HiSeq (проведение мультиплексного парно-концевого прочтения) с 2×51 циклов для парно-концевых прочтений.

Полногеномное секвенирование ДНК методом MBD-seq выявило транскрипты с дифференциально метилированными промоторами (ДМТ), которые были определены методом оценки доли ложноположительных результатов (FDR, false discovery rate) <0.1 и ANOVA с последующим апостериорным t-критерием Стьюдента (р<0.05). Транскрипты включают оба гена и некодирующие РНК, которые были дифференциально метилированы/транскрибированы. Эпигенетические изменения, а также изменения транскрипции, вызванные БКМ-7 в конкретных биологических или функционально соответствующих путях, были оценены с помощью анализа Ingenuity Pathway Analysis (IPA) и были определены пути, оказывающие наибольшее действие. Результаты показаны в Таблице 5. Согласно данным, изменения в эпигенетическом статусе генов, ответственных за метаболизм, синтез и гомеостаз глюкозы также происходят под действием БКМ-7, как показано на Фигурах 5 и 6.

Пример 4: Воздействие бета-казеинов на инсулиновый рецептор.

NOD мышей (самцов и самок) с момента отлучения от матери переводили на рацион, обогащенный бета-казеином А1 или молочным белком А2. Эти рационы были разработаны компанией Specialty Feeds Pty. Ltd. (Australia) для обеспечения адекватного состава и питательности. Когорты мышей (n=10) из каждого пола и рациона были умерщвлены в 10 недель или в 20 недель. Во время вскрытия, отбирали различные образцы и хранили их при -80°С. 40 NOD мышей были включены в это исследование: по 10 в группе (самец/самка: А1/А2). 10 были умерщвлены в 10 недель и в 20 недель. Поджелудочные железы были собраны и заморожены в растворе для стабилизации РНК RNAlater™.

Для анализа транскрипции РНК, из тканей выделяли РНК с использованием набора RNAqueous®-4PCR от Ambion (Austin, ТХ). Процедура была аналогичной описанной в протоколе производителя. Чтобы очистить РНК выделенную РНК обрабатывали ДНКазой, затем определяли концентрацию РНК с помощью спектрофотометра ND-1000 NanoDrop.Далее синтезировали кДНК, как описано ранее с использованием набора first-strand cDNA synthesis от компании Roche (Indianapolis, IN). Добавляли РНК (1 мг), смесь дНТФ (1 мМ), случайные гексамерные праймеры (60 мм), сверхчистую H2O класса для молекулярной биологии до конечного объема пробы 13 мл. Затем, образцы денатурировали при 65°С в течение 5 минут, и затем помещали на лед. Добавляли Transcriptor РТ (20 единиц/мл) (Roche), ингибитор широкого спектра РНКаз Protector RNase inhibitor (40 ед/мл) (Roche), буфер 5 Transcriptor Reverse Transcriptase Reaction Buffer (Roche), и сверхчистую H2O класса для молекулярной биологии и конечный объем доводили до 7 мл во второй части реакции и конечный объем доводили до 20 мл. Затем инкубировали в машине РТС Thermocycler (MJ Research, St. Bruno, QC, Canada) при 25°C в течение 10 минут и заканчивали инкубацией при 55°С в течение 30 минут. Наконец, ингибировали фермент обратную транскриптазу путем инкубации при 85°С в течение 5 минут.

Далее, количественную ПЦР в реальном времени (qRT-PCR) проводили на трех образцах с использованием qRT-PCR анализатора LightCycler 480 компании Roche (Trivedi et al., Mol. Pharmcol., 2014). qRT-PCR проводили с использованием 5 мл кДНК-матрицы, 10 мМ прямого и обратного праймеров, 10 мл смеси для проведения ПЦР SYBR Green I Master от Roche, а также dH2O, в конечном объеме 20 мл. Перечень праймеров, использованных для этой цели, приведен в Таблице 6. ПЦР проводили по следующей программе: инкубирование в течение 5 минут при 95°С, а затем 45 циклов 95°С - 10 секунд, 60°С - 20 секунд и 72°С - 30 секунд, а затем один цикл 95°С - 5 секунд, при 65°С - 1 минута и 97°С для кривой плавления с последующим охлаждением при температуре 40°С в течение 90 секунд. Использовали контроли без кДНК-матрицы, и получали кривые диссоциации для определения неспецифических продуктов, и это нормализовалось, чтобы избежать неспецифической амплификации. Данные анализировали с использованием количественного метода ddCt (Roche) и нормализовали на уровни бета-актина.

Несмотря на то, что изобретение было описано в виде примера, следует понимать, что варианты и модификации могут быть сделаны без отступления от сущности и объема изобретения, как определено в формуле изобретения. Кроме того, если существуют известные эквиваленты специфических особенностей, такие эквиваленты включены, как если бы конкретно упоминались в данном описании.

Группа изобретений относится к области медицины. Предложен способ снижения риска появления у животного предрасположенности к развитию повышенного уровня глюкозы в крови путем предотвращения или минимизирования эпигенетических изменений в одном или более генах, ответственных за гомеостаз глюкозы и сигнальный путь инсулина у животного, где указанный способ включает потребление животным композиции или включает обеспечение животного композицией для потребления, при этом указанная композиция включает бета-казеин, содержащий по меньшей мере 75 мас.% вариантов бета-казеина, содержащих пролин в положении 67 аминокислотной последовательности бета-казеина. Также предложено применение молока, содержащего бета-казеин, включающий по меньшей мере 75 мас.% вариантов бета-казеина, содержащих пролин в положении 67 аминокислотной последовательности бета-казеина, для изготовления композиции для снижения риска появления у животного предрасположенности к развитию повышенного уровня глюкозы в крови указанного животного. Изобретение обеспечивает снижение риска появления предрасположенности к развитию повышенного уровня глюкозы в крови. 2 н. и 13 з.п. ф-лы, 7 ил., 6 табл., 4 пр.

1. Способ снижения риска появления у животного предрасположенности к развитию повышенного уровня глюкозы в крови указанного животного путем предотвращения или минимизирования эпигенетических изменений в одном или более генах, ответственных за гомеостаз глюкозы и сигнальный путь инсулина у животного, где указанный способ включает потребление животным композиции или включает обеспечение животного композицией для потребления, при этом указанная композиция содержит бета-казеин, причем бета-казеин содержит по меньшей мере 75 мас.% вариантов бета-казеина, содержащих пролин в положении 67 аминокислотной последовательности бета-казеина.

2. Способ по п. 1, в котором бета-казеин содержит по меньшей мере 75 мас.% бета-казеина А2.

3. Способ по п. 1, в котором бета-казеин содержит менее 25 мас.% вариантов бета-казеина, которые способны обеспечивать образование бета-казоморфина-7 в результате ферментативного расщепления в желудочно-кишечном тракте животного.

4. Способ по любому из пп. 1-3, в котором повышенный уровень глюкозы связан с симптомами, включающими одно или более из следующего: полиурия, полидипсия и полифагия.

5. Способ по любому из пп. 1-4, в котором один или более генов выбраны из группы, включающей CREM, AKR1A1, AKT1, SLC2A9, SORBS1, PGM1, SORD, EDNRA, CACNA1E, PCK1, SSTR5, ADRA1B, TCF7L2, SLC5A1, RPH3AL, EDN1, INS, GCKR, PLSCR3, ALDH5A1, IGF2, ALMS1, STAT3, PPARD, CPT1A, HK2, G6PC, CYB5R4, PGM2L1, PDK1, PDK2, FOXO3, SLC37A4, IRS1, STXBP4, GCK, CACNA1C, CAV3, YES1, MLXIPL, SLC2A3, PPARG, INSR, SERPINE1, PFKM, KLF15, CACNA1A, SLC30A8, PTPN11, ADIPOQ, GAPDHS, PGM5, HNF1A, WFS1, SLC2A5, PTCH1, WDTC1, PDK3, H6PD и DBH.

6. Способ по любому из пп. 1-5, в котором бета-казеин содержит по меньшей мере 90 мас.% бета-казеина A2.

7. Способ по п. 6, в котором бета-казеин содержит по меньшей мере 99 мас.% бета-казеина A2.

8. Способ по любому из пп. 1-7, в котором бета-казеин содержит менее 25 мас.% бета-казеина A1.

9. Способ по п. 8, в котором бета-казеин содержит менее 10 мас.% бета-казеина A1.

10. Способ по п. 9, в котором бета-казеин содержит менее 1 мас.% бета-казеина A1.

11. Способ по любому из пп. 1-10, в котором композиция представляет собой молоко или молочный продукт.

12. Способ по п. 11, в котором молоко представляет собой свежее молоко; сухое молоко; жидкое молоко, восстановленное из сухого; обезжиренное молоко; гомогенизированное молоко; сгущенное молоко; концентрированное молоко; пастеризованное молоко или непастеризованное молоко.

13. Способ по п. 11, в котором молочный продукт представляет собой сливки, йогурт, творог, сыр, масло или мороженое.

14. Способ по любому из пп. 1-13, в котором животное представляет собой человека, собаку или кошку.

15. Применение молока для изготовления композиции для снижения риска появления у животного предрасположенности к развитию повышенного уровня глюкозы в крови указанного животного путем предотвращения или минимизирования эпигенетических изменений в одном или более генах, ответственных за гомеостаз глюкозы и сигнальный путь инсулина у животного, при этом молоко содержит бета-казеин, причем бета-казеин содержит по меньшей мере 75 мас.% вариантов бета-казеина, содержащих пролин в положении 67 аминокислотной последовательности бета-казеина.