БЕТА-КАЗЕИН И КОГНИТИВНАЯ ФУНКЦИЯ Российский патент 2022 года по МПК A61K35/20 A61P25/28 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Изобретение относится к белку молока бета-казеину и улучшению когнитивной функции у животных. В частности, в настоящем изобретении предложено молоко и полученные из молока пищевые продукты, в составе которых бета-казеины преимущественно представляют собой бета-казеин А2 или близкие варианты бета-казеина. Заявитель обнаружил, что употребление молока, содержащего вариант бета-казеина А1, связано с пониженной скоростью и точностью когнитивных процессов, тогда как употребление молока, содержащего только вариант бета-казеина А2, связано с повышенной скоростью и точностью.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Молоко, главным образом коровье молоко, которое потребляют популяции по всему миру, является важным источником белка в рационе человека. Обычно коровье молоко содержит приблизительно 30 грамм белка на литр. Казеины составляют самую большую часть (80%) от указанного количества белка, а бета-казеины составляют приблизительно 37% казеинов. За два последних десятилетия возрос объем данных, указывающих на участие казеиновых белков, особенно бета-казеинов, в различных нежелательных физиологических или биологических процессах, а также в нарушениях здоровья.

Бета-казеины могут быть классифицированы на бета-казеин А1 и бета-казеин А2. Указанные два белка являются преобладающими бета-казеинами в коровьем молоке, потребляемом в большинстве популяций человека. Бета-казеин А1 отличается от бета-казеина А2 одной аминокислотой. В положении 67 в последовательности из 209 аминокислот бета-казеина А1 расположена аминокислота гистидин, а в бета-казеине в том же положении находится пролин. Однако указанная одна различающаяся аминокислота является критически важной для обеспечения ферментативного расщепления бета-казеинов в кишечнике. Присутствие гистидина в положении 67 обеспечивает образование при ферментативном расщеплении фрагмента белка, известного как бета-казоморфин-7 (БКМ-7), который содержит семь аминокислот. Таким образом, БКМ-7 является продуктом расщепления бета-казеина А1. В случае бета-казеина А2 в положении 67 находится пролин, который мешает расщеплению аминокислотной связи в этом месте. Таким образом, БКМ-7 не является продуктом расщепления бета-казеина А2.

В других вариантах бета-казеина, таких как варианты В, С, F, G и H1, в положении 67 также находится гистидин, тогда как вариантах, которые являются дополнительными вариантами А2, таких как варианты A3, D, Е, Н2 и I, в положении 67 находится пролин. Однако, указанные варианты обнаружены только в очень низких концентрациях или вообще не обнаружены в молоке коров европейского происхождения. Таким образом, в контексте настоящего изобретения термин «бета-казеин А1» может относиться к любому бета-казеину с гистидином в положении 67, а термин «бета-казеин А2» может относиться к любому бета-казеину, имеющему пролин в положении 67.

БКМ-7 представляет собой опиоидный пептид и может связываться с опиоидными рецепторами и активировать указанные рецепторы во всем организме. БКМ-7 обладает способностью проходить через стенку желудочно-кишечного тракта и поступать в кровоток, что дает ему возможность влиять на системные и клеточные функции посредством опиоидных рецепторов. Заявитель и другие ранее установили нежелательную связь между потреблением бета-казеина А1, находящегося в молоке или молочных продуктах, и диабетом I типа, ишемической болезнью сердца^1,2 неврологическими расстройствами,³ воспалением кишечника,⁴ симптомами непереносимости лактозы⁵ и регуляцией концентраций глюкозы в крови.⁶ Рост числа научных данных, связывающих варианты бета-казеина с этими заболеваниями и нарушениями здоровья, побудил заявителя исследовать ряд физиологических и поведенческих последствий потребления бета-казеина.

Существуют данные о том, что потребление молока, содержащего вариант бета-казеина, у которого в положении 67 находится гистидин, а не пролин, вызывает высвобождение опиоидного пептида или экзорфина, который может вызывать или усугублять неврологические расстройства, такие как аутизм или синдром Аспергера.⁷ Данный опиоид был идентифицирован как БКМ-7. В нескольких исследованиях сообщалось о связи между казеином и расстройствами аутического спектра, включая повышенную секрецию пептидов в моче и экзорфина, а также наличие антител к казеину и БКМ-7 у лиц с аутизмом.^8-13 Существуют также данные о связи между казеином, особенно антителами к казеину, и шизофренией.^14-18 Поскольку БКМ-7 взаимодействует с опиоидными и серотониновыми рецепторами, которые участвуют в процессах синаптогенеза и центральной передачи сигналов, длительное воздействие БКМ-7 может оказывать нежелательное влияние на развитие и функционирование мозга, что ведет к проявлению неврологических заболеваний или состояний.¹²

Существуют данные, о том, что БКМ-7 достоверно понижает нормальные поведенческие реакции у крыс, такие как вскармливание потомства, ходьба и груминг, и усиливает аномальные реакции, такие как резко повышенная двигательная активность, движение по кругу и снижение социального взаимодействия.¹⁹ Было установлено, что такие эффекты, оказываемые БКМ-7 в отношении поведения, обусловлены его взаимодействием с опиоидными рецепторами, поскольку эффекты пропадали при воздействии специфического антагониста опиоидных рецепторов налоксона. БКМ-7 также вызывал fos-подобную иммунореактивность в зонах мозга, связанных с шизофренией, в частности в префронтальной коре, прилежащем ядре, ядре ложа терминальной полоски и дорсальном стриатуме.²⁰

БКМ-7 может также влиять на другие неврологические функции, включая психомоторное развитие.²¹ Иммунореактивность к БКМ-7 человека и коровы обнаружили у младенцев, питавшихся грудным молоком и детскими смесями, соответственно, в течение первых трех месяцев жизни.²² Представляет интерес, что повышенная иммунореактивность по отношению к БКМ-7 коровы была связана с задержкой психомоторного развития и аномально высоким мышечным тонусом.

Все указанные данные относятся к влиянию БКМ-7 или вариантов бета-казеина, которые при расщеплении дают БКМ-7, на поведенческие характеристики людей, страдающих клинически диагностированными заболеваниями или состояниями. Указанные данные не касаются здоровых людей. Кроме того, хорошо известно, что результаты исследований, основанных на экспериментах с клеточными культурами, нельзя однозначно экстраполировать на условия in vivo или на эффекты в клинической практике, поскольку существует множество переменных, относящихся к образованию, транспорту и метаболизму БКМ-7, которые влияют на воздействие на ткани и, следовательно, на биологический ответ. Например, известно, что для обеспечения клеточного ответа важны концентрации опиоидов и их аффинность к опиоидным рецепторам.

Заявитель в ходе своих продолжающихся исследований взаимосвязей между вариантами бета-казеина и биологическим ответом у людей обнаружил нежелательную связь между бета-казеином А1 (и другими вариантами бета-казеина, которые обеспечивают образование БКМ-7) и двумя специфическими аспектами или показателями когнитивной функции у здоровых людей. Специалистам в области психологии и смежных дисциплин хорошо известно, что поведение отличается от когнитивного процесса. Поведение рассматривают как следствие стимулов внешней среды, тогда как когнитивный процесс относится к обработке информации, который влияет на то, как люди воспринимают, помнят и понимают мир вокруг них. Факторы, которые влияют на поведение, обычно не влияют на когнитивную функцию, и от них не ожидают влияния на когнитивную функцию. В исследовании заявителя представлено первое убедительное научное доказательство прямой связи между потреблением вариантов бета-казеина и когнитивной функцией.

Следовательно, объектом настоящего изобретения является обеспечение способа улучшения когнитивной функции у человека и других животных, или по меньшей мере обеспечение практически применимой альтернативы существующим способам.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Согласно первому аспекту настоящего изобретения предложен способ улучшения когнитивной функции животного путем приема внутрь композиции, содержащей бета-казеин, или путем обеспечения животного композицией, содержащей бета-казеин, где по меньшей мере 75% по массе бета-казеина представляет собой вариант бета-казеина, который не приводит к образованию БКМ-7 при расщеплении в кишечнике животного.

В определенных вариантах реализации настоящего изобретения вариант бета-казеина представляет собой бета-казеин А2, бета-казеин A3, бета-казеин D, бета-казеин Е, бета-казеин Н2 или бета-казеин I. В предпочтительных вариантах реализации вариант бета-казеина представляет собой бета-казеин А2. Количество бета-казеина А2 может представлять собой любое количество в диапазоне от 75% до 100% по массе бета-казеина, например, по меньшей мере 90% или даже 100%.

В определенных вариантах реализации настоящего изобретения улучшение когнитивной функции оценивают с использованием любого одного или более из Теста слабого когнитивного нарушения (SCIT), Автоматизированного когнитивного теста (ACT), Автоматизированных метрик нейропсихологической оценки (ANAM), Компьютеризированной системы оценки деменции с медикаментозным исследованием когнитивных процессов (COGDRAS-D), Совместного скринингового инструмента для деменции (CSI-D), Компьютеризированного нейропсихологического скрининга умеренного когнитивного нарушения (CANS-MCI), Компьютеризированной оценки умеренного когнитивного нарушения (САМО), Компьютеризированного самостоятельного тестирования (CST), Флоридской краткой шкалы памяти (FBMS), Умеренного когнитивного нарушения (MCI), Нейропсихологической батареи тестов (NTB), Краткой оценки когнитивных процессов при шизофрении (BACS), Кембриджского обследования ментальных расстройств у пожилых - Пересмотренный (CAMDEX-R), Кембриджской батареи автоматизированных нейропсихологических тестов (CANTAB), Компьютеризированной мультифазной интерактивной двухдисплейной системы (CMINDS), Батареи компьютеризированных нейропсихологических тестов (CNTB), Теста возможностей памяти (МСТ), Батареи нейропсихологической оценки (NAB), Совместного исследования болезни Альцгеймера (ADCS), Батареи исполнительных, лингвистических, пространственных функций и функции памяти (ELSMEM), Мини-определения ментального состояния (MMSE) и Когнитивного теста Гамильтона D (HAM-D).

В определенных вариантах реализации настоящего изобретения композиция представляет собой молоко или молочный продукт. Молоко может представлять собой свежее молоко, сухое молоко, жидкое молоко, восстановленное из порошка, обезжиренное молоко, гомогенизированное молоко, концентрированное молоко, сгущенное молоко, пастеризованное молоко или не пастеризованное молоко. Молочный продукт может представлять собой детскую смесь, сливки, йогурт, творог, сыр, масло, мороженое или любой другой молочный продукт.

Согласно второму аспекту настоящего изобретения предложена композиция для улучшения когнитивной функции у животного, при этом указанная композиция содержит бета-казеин, где по меньшей мере 75% по массе бета-казеина представляет собой вариант бета-казеина, который не приводит к образованию БКМ-7 при расщеплении в кишечнике животного.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложено применение молока при получении композиции для улучшения когнитивной функции у животного, при этом молоко содержит бета-казеин, и где по меньшей мере 75% по массе бета-казеина представляет собой вариант бета-казеина, который не приводит к образованию БКМ-7 при расщеплении в кишечнике животного.

Согласно дополнительному аспекту настоящего изобретения предложен способ профилактики или лечения когнитивного нарушения у животного, включающий прием внутрь указанным животным композиции, содержащей бета-казеин, или обеспечение животного композицией, содержащей бета-казеин, где по меньшей мере 75% по массе бета-казеина представляет собой вариант бета-казеина, который не приводит к образованию БКМ-7 при расщеплении в кишечнике животного.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

На Фигуре 1 показано время реакции SCIT в фазе 1 экспериментального потребления в исследовании с участием взрослых людей.

На Фигуре 2 показано время реакции SCIT в фазе 2 экспериментального потребления в исследовании с участием взрослых людей.

На Фигуре 3 показана частота ошибок SCIT в фазе 1 экспериментального потребления в исследовании с участием детей дошкольного возраста.

На Фигуре 4 показана частота ошибок SCIT в фазе 2 экспериментального потребления в исследовании с участием детей дошкольного возраста.

На Фигуре 5 показана частота ошибок SCIT при "головной" и "хвостовой" продолжительностях экспозиции.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем изобретении предложена композиция, содержащая белок бета-казеин и его использование для улучшения когнитивной функции у животных, особенно у человека. Важно отметить, что указанный бета-казеин является вариантом А2 бета-казеина, или составляет по меньшей мере 75% по массе всех вариантов бета-казеина, присутствующих в композиции. Важность преобладания в композиции варианта А2 связана с тем фактом, что заявитель показал существование прямой связи между употреблением варианта А1 и снижением когнитивной функции у человека, в частности времени реакции и частоты ошибок в Тесте слабого когнитивного нарушения. Кроме того, заявитель показал, что существует прямая связь между употреблением варианта А2 и улучшенной когнитивной функцией, которая не зависит от эффекта отказа от потребления варианта А1.

Термин «когнитивная функция» или «когнитивный процесс» предназначен для обозначения группы ментальных процессов, которая включает внимание, память, производство и понимание речи, обучение, логическое мышление, решение задач и принятие решения.

Термин «бета-казоморфин-7» или «БКМ-7» относится к белковому фрагменту Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile, гептапепиду, полученному при ферментативном расщеплении вариантов бета-казеина коровы, у которых в положении 67 аминокислотной последовательности находится гистидин, а не пролин.

Поскольку основным, если не единственным источником бета-казеинов в рационе большинства популяций человека является молоко или продукты, полученные из молока, и поскольку большая часть потребляемого молока содержит смесь только вариантов бета-казеина А1 и А2, потребление молока (или продуктов, сделанных из такого молока) с высоким содержанием варианта А2 будет обязательно означать низкое потребление варианта А1. Таким образом, если единственный источник бета-казеина в рационе содержит только вариант А2 и не содержит других вариантов, потребление варианта А1 в рационе устраняют, и, следовательно, можно ожидать, что нежелательное влияние БКМ-7 на когнитивную функцию также будет устранено.

Соответственно, изобретение согласно настоящей заявке основано на снижении или устранении количества бета-казеина А1 в рационе и повышении количества бета-казеина А2. Это достигают путем обеспечения того, чтобы бета-казеин в пищевых композициях, содержащих бета-казеин, особенно молоке и молочных продуктах, представлял собой преимущественно или даже исключительно бета-казеин А2.

Предпочтительно, 100% бета-казеина в композиции представляет собой бета-казеин А2. Следовательно, полное устранение бета-казеина А1 снижает потенциал для когнитивного нарушения. Однако когнитивное нарушение может быть усилено любой композицией, где бета-казеин является преимущественно бета-казеином А2, например, в любом количестве от 75% по массе и до 100%, включая, но не ограничиваясь тем самым, 80%, 90%, 95%, 98% и 99% по массе.

Композиция согласно настоящему изобретению обычно представляет собой молоко, но может также представлять собой любой полученный из молока продукт, такой как сливки, йогурт, творог, сыр, масло или мороженое. Композиция может также представлять собой немолочный продукт, содержащий бета-казеин, который получен из молока. Композиция может представлять собой сам бета-казеин, или может быть изготовлена из бета-казеина, при этом бета-казеин может быть в твердой форме, такой как порошок или гранулы, или в форме твердой плитки.

Молоко может быть получено от любого млекопитающего, включая человека, коз, свиней и буйволов, но в предпочтительных вариантах реализации настоящего изобретения молоко представляет собой молоко коровы.

Молоко может быть в форме свежего молока, сухого молока, жидкого молока, восстановленного из порошка, обезжиренного молока, гомогенизированного молока, концентрированного молока, сгущенного молока, пастеризованного молока или не пастеризованного молока или любой другой форме молока.

Композицию согласно настоящему изобретению применяют в первую очередь для употребления человеком, но следует понимать, что польза для здоровья также относится к некоторым другим животным, таким как кошки, собаки и другие домашние животные.

Данные, подтверждающие возможность реализации настоящего изобретения, приведены в Примере 1, описывающем исследование, в котором взрослым пациентам назначали прием молока, содержащего бета-казеины А1 и А2 (называемого обычным молоком), и молока, содержащего бета-казеины А2, но не содержавшего других вариантов бета-казеина (называемого молоком только с бета-казеином А2). Когнитивную функцию оценивали с применением Теста слабого когнитивного нарушения (SCIT), который является компьютерным тестом, измеряющим скорость и эффективность обработки информации. Анализ SCIT показал, что потребление обычного молока было связано со статистически высоко достоверным увеличением времени реакции и количества ошибок. Увеличение времени реакции обнаруживали преимущественно при большей продолжительности стимула («хвостовая часть»), в то время как увеличение частоты ошибок было ограничено главным образом меньшей продолжительностью стимула («головная часть»). Это подтверждает, что потребление обычного молока связано со снижением эффективности подсознательной автоматической обработки, но контролируемый процесс при большей продолжительности стимула помогает сократить дефицит эффективности обработки за счет скорости обработки. Такое незначительное нарушение когнитивной функции может оказывать заметное влияние на ситуации, в которых необходимы быстрое распознавание стимулов и/или быстрое принятие решения. Эти данные демонстрируют, что потребление молока, содержащего бета-казеин А1, оказывает влияние на когнитивную функцию.

Хотя эксперименты проводили с применением SCIT, специалистам в данной области техники будет понятно, что можно применять любой другой подходящий тест когнитивной функции. Примеры включают Тест слабого когнитивного нарушения (SCIT), Автоматизированный когнитивный тест (ACT), Автоматизированные метрики нейропсихологической оценки (ANAM), Компьютеризированную систему оценки деменции с медикаментозным исследованием когнитивных процессов (COGDRAS-D), Совместный скрининговый инструмент для деменции (CSI-D), Компьютеризированный нейропсихологический скрининг умеренного когнитивного нарушения (CANS-MCI), Компьютеризированную оценку умеренного когнитивного нарушения (CAMCI), Компьютеризированное самостоятельное тестирования (CST), Флоридскую краткую шкалу памяти (FBMS), Умеренное когнитивное нарушение (MCI), Нейропсихологическую батарею тестов (NTB), Краткую оценку когнитивных процессов при шизофрении (BACS), Кембриджское обследование ментальных расстройств у пожилых - Пересмотренное (CAMDEX-R), Кембриджскую батарею автоматизированных нейропсихологических тестов (CANTAB), Компьютеризированную мультифазную интерактивную двухдисплейную систему (CMINDS), Батарею компьютеризированных нейропсихологических тестов (CNTB), Тест возможностей памяти (МСТ), Батарею нейропсихологической оценки (NAB), Совместное исследование болезни Альцгеймера (ADCS), Батарею исполнительных, лингвистических, пространственных функций и функции памяти (ELSMEM), Мини-определение ментального состояния (MMSE) и Когнитивный тест Гамильтона D (HAM-D).

Как отмечалось выше, в нескольких исследованиях были показаны связи между бета-казеином А1/БКМ-7 и клинически диагностированными неврологическими заболеваниями, такими как аутизм и шизофрения. Есть также данные, что повышенная иммунореактивность БКМ-7 связана с задержкой психомоторного развития у младенцев. Данные Примера 1 подтверждают, что бета-казеин А1 и полученные из него пептиды также влияют на обработку информации в мозгу у здоровых испытуемых. Обработка информации в мозге здоровых испытуемых не связана с последствиями диагностированных неврологических заболеваний. Таким образом, считается, что нельзя прогнозировать связь между белком (или любым другим веществом) и обработкой информации в мозге здоровых испытуемых на основании связи между тем же белком (или другим веществом) и неврологическим заболеванием.

Сводные статистические данные относительно времени реакции SCIT при каждой продолжительности экспозиции показаны в Таблице 2 в зависимости от фазы исследования и продукта. На Фигурах 1 и 2 показано время реакции при каждой продолжительности экспозиции (16, 32, 48, 64, 80, 96, 112 и 128 мс) в зависимости от продукта в интервенционных фазах 1 и 2, соответственно.

Результаты дисперсионного анализа (ANOVA) смешанного влияния (Таблица 3) показывают, что влияние продукта как на время реакции (p=0,0013), так и на частоту ошибок (p=0,0004) было статистически достоверным при каждой продолжительности экспозиции. Статистически достоверное влияние продукта также обнаружили в при «хвостовом» среднем значении времени реакции (p=0,027) и при «головном» среднем значении частоты ошибок (p=0,020). Исходные уровни всех переменных SCIT были статистически достоверными ковариатами уровней после экспериментального потребления продукта.

В Таблице 4 показаны результаты сравнительного тестирования двух исследуемых продуктов. У испытуемых, принимавших обычное молоко, время реакции было в среднем на 8,6 мс дольше (p=0,0013), а частота ошибок на 1,76% больше (p=0,0004) по сравнению с испытуемыми, принимавшими молоко только с бета-казеином А2. «Хвостовое» среднее значение времени реакции (при продолжительности экспозиции 80-128 мс) было на 14,7 мс дольше (p=0,020), а «головное» среднее значение частоты ошибок (при продолжительности экспозиции 16-64 мс) было на 2,76% выше (p=0,027) при потреблении обычного молока, чем при потреблении молока только с бета-казеином А2, в то же время при сравнении двух продуктов статистически достоверной разницы между «головным» средним значением времени реакции и «хвостовым» средним значением частоты ошибок не наблюдали.

Пример 2 представляет собой исследование, в котором участвовали дети дошкольного возраста. Результаты показаны на Фигурах 3-5. Статистически достоверные данные как по «головным», так и по «хвостовым» частотам ошибок наблюдали во всех трех массивах основных результатов эксперимента.

1. Основное влияние на состояние указывает на то, существует ли какое-либо влияние потребления молока на прохождение SCIT без учета различий между типами молока.

2. Взаимосвязь между типом молока и состоянием указывает на то, существует ли различие между типами молока в отношении прохождения SCIT до и после потребления молока.

3. Взаимосвязь между фазой, типом молока и состоянием указывает на то, оказывает ли порядок, в котором участники получали типы молока, какое-либо влияние на прохождение теста до и после потребления молока, будучи функцией от типа молока.

Наблюдали статистически достоверное общее улучшение результатов при прохождении теста между значениями на исходном уровне и после потребления молока. Однако это было обусловлено в первую очередь большим улучшением по частоте ошибок после потребления молока только с бета-казеином А2 при наличии заметного повышения частоты ошибок после потребления обычного молока. Это наблюдение подтверждает существование статистически достоверной взаимосвязи между типом молока и состоянием. Существует также статистически достоверная взаимосвязь между фазой, типом молока и состоянием. Это лучше всего иллюстрирует Фигура 3, где показаны данные по «головным» и «хвостовым» частотам ошибок в группе участников, которые потребляли обычное молоко в фазе 1 и молоко только с бета-казеином А2 в фазе 2 (группа 1) по сравнению с группой участников, которые потребляли А2 бета-казеин только молоко в фазе 1 и обычное молоко в фазе 2 (группа 2). В группе 1 потребление обычного молока не оказывало влияния на частоту ошибок, но потребление молока только с бета-казеином А2 приводило к большому и достоверному снижению частоты ошибок. В группе 2 потребление молока только с бета-казеином А2 в фазе 1 приводило к большому и достоверному снижению частоты ошибок после потребления молока только с бета-казеином А2. Однако в этой группе наблюдали также большое и достоверное увеличение ошибок после последующего потребления обычного молока в фазе 2. Такой результат дает повышение к фазе × Тип молока × Состояние, но не отражает истинного эффекта обычного молока. Скорее у участников группы 2 наблюдали продолжающийся эффект потребления в первой фазе молока только с бета-казеином А2. Улучшение по частоте ошибок после потребления молока только с бета-казеином А2 продолжалось после периода «отмывки» при отсутствии молока только с бета-казеином А2. После введения обычного молока результаты участников вернулись к значениям, эквивалентным исходным значениям при отсутствии потребления молока. Таким образом, паттерны результатов, показанные на графиках для группы 1 для «головных» и «хвостовых» частот ошибок, лучше отображают влияние потребления обычного молока по сравнению с молоком только с бета-казеином А2, при этом потребление обычного молока не оказывает никакого влияния на прохождение теста, тогда как потребление молока только с бета-казеином А2 улучшало точность ответов при прохождении SCIT по сравнению с прохождением теста на исходном уровне. Кроме того, улучшенную точность ответов при прохождении теста после потребления молока только с бета-казеином А2 продолжали наблюдать и в отсутствие молока только с бета-казеином А2 в течение по меньшей мере 10 дней периода «отмывки» и, возможно, дольше.

Эти исследования представляют первые четкие научные данные о связи между потреблением бета-казеина А1 и сниженной когнитивной функцией. На основании данных заявителя понятно, что следует избегать потребления бета-казеинов, обеспечивающих образование БКМ-7 при расщеплении. Кроме того, эти исследования представляют первое четкое научное доказательство связи между потреблением бета-казеина А2 и улучшенной когнитивной функцией независимо от эффектов избегания потребления бета-казеина А1 и последующего образования БКМ-7. Более того то, что улучшение точности ответов при прохождении теста продолжает наблюдаться и после потребления молока только с бета-казеином А2 является однозначным свидетельством благотворного эффекта от потребления бета-казеина А2, продолжающегося в течение по меньшей мере двух недель после потребления. Таким образом, преимущество от потребления бета-казеина, который не обеспечивает образование БКМ-7 при расщеплении, длится достоверно дольше времени, необходимого для потребления и расщепления.

В практическом отношении преимуществ настоящего изобретения можно достичь в больших популяциях, поставляя молоко с содержанием бета-казеина, который преимущественно представляет собой бета-казеин А2, и производя продукты, полученные из этого молока, и обеспечивая доступность такого молока и таких продуктов в целях улучшения, усиления или поддержания когнитивной функции.

В молоке коров можно проверять соотношение бета-казеина А1 и бета-казеина А2. В качестве альтернативы, можно проводить генетическое тестирование коров по их способности давать молоко, содержащее бета-казеин А1 (или другие варианты, способные образовывать БКМ-7), или проверять их способность давать молоко, содержащее бета-казеин А2 (или другие варианты, не способные образовывать БКМ-7), или их комбинацию. Эти методики хорошо известны.

Согласно настоящему изобретению предложено решение, которое сравнительно легко реализовать, а именно, избегать молока или молочных продуктов, которые содержат бета-казеин А1, и обеспечивать наличие в рационе молока и молочных продуктов, содержащих бета-казеин, который представляет собой преимущественно бета-казеин А2, предпочтительно 100% бета-казеин А2.

Любая ссылка на документы из уровня техники в описании настоящего изобретения не считается признанием того, что такой уровень техники широко известен или является частью общедоступных знаний в этой области.

При использовании в этой заявке слова «содержит», «содержащий» и подобных терминов, их не следует интерпретировать в исключительном или исчерпывающем смысле. Другими словами, они предназначены для выражения значения «включая, но не ограничиваясь перечисленным».

Далее настоящее изобретение описано со ссылкой на следующие примеры. Должно быть понятно, что заявленное изобретение никоим образом не следует ограничивать указанными примерами.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Исследование употребления молока и анализ SCIT с участием взрослых

Схема исследования

Исследование проведено в соответствии с Хельсинкской декларацией с поправками, внесенными в Сеуле в 2008 г., и одобрено комитетом по этике Общества питания Шанхая (номер разрешения: SNSIRB № 2014 [002]). Исследование зарегистрировано на ClinicalTrials.gov (идентификатор: NCT02406469). Все испытуемые перед включением в исследование предоставили письменное информированное согласие. Исследование представляло собой одностороннее, двойное слепое, рандомизированное, контролируемое, 2×2 перекрестное исследование, предназначенное для оценки влияния молока, содержащего только бета-казеин типа А2, по сравнению с молоком, содержащим бета-казеина типов А1 и А2, на уровни маркеров иммунного ответа в сыворотке крови в корреляции с симптомами непереносимости. После скринингового визита, на котором испытуемых подвергли полному клиническому обследованию и провели качественные анализы на галактозу в моче, отвечающие требованиям испытуемые начали 2-недельный период «отмывки». Затем испытуемые на 2 недели участвовали в экспериментальном периоде 1, в котором они получали молоко, содержащее только вариант бета-казеина А2 (молоко только с бета-казеином А2) или молоко, содержащее варианты как бета-казеина А1, так и А2 (обычное молоко) согласно схеме рандомизации. После второго 2-недельного периода «отмывки» испытуемые участвовали в экспериментальном периоде 2, в котором они получали другой молочный продукт. Визиты были запланированы в начале каждого экспериментального периода и на Дни 7 и 14 каждого экспериментального периода. В течение каждого периода «отмывки» с испытуемыми контактировали по телефону. Исследование проводили на кафедре гастроэнтерологии, в госпитале Синь Хуа при медицинском факультете Шанхайского университета Цзяо Тонг (Шанхай, Китай).

Эксперименты

Молоко только с бета-казеином А2 и обычное молоко предоставила компания «А2 инфант нутришн лимитед» (А2 Infant Nutrition Limited) (Окленд, Новая Зеландия), а в исследовательский центр их доставил китайский филиал фирмы SPRIM (SPRIM China). Персонал китайского филиала фирмы SPRIM переупаковал и нанес маркировку на все продукты, чтобы гарантировать незнание исследователями и испытуемыми того, какой продукт они получали в каждый экспериментальный период. В каждом экспериментальном периоде испытуемые получили инструкции потреблять 250 мл молока после 2 приемов пищи в день в течение 14 дней. Испытуемые вели дневник, где фиксировали потребление молока и соблюдение указаний в каждом эксперименте. Использованные и неиспользованные упаковки собирали на каждом визите, чтобы оценить соответствие требованиям эксперимента и подтвердить, что незнание сохранено. Испытуемых рандомизировали со стратификацией по полу в последовательность 1 (обычное молоко → молоко только с бета-казеином А2) или последовательность 2 (молоко только с бета-казеином А2 → обычное молоко) в соответствии с присвоенным номером, вложенным в запечатанный конверт. Номер присваивали на основании сгенерированного компьютером списка, подготовленного китайским филиалом фирмы SPRIM.

Молоко только с бета-казеином А2 содержало (на 100 мл) 271 кДж энергии, 3,1 г белка, 3,6 г жира, 5,0 г углеводов, 48 мг натрия, 150 мг калия и 117 мг кальция. Соотношение бета-казеина А1 к бета-казеину А2 составляло приблизительно 40:60 в продукте А1/А2, что было подтверждено высокоэффективной жидкостной хроматографией и масс-спектроскопией. Оба продукта были идентичны и содержали одинаковое количество белка.

Употребление молочных продуктов, отличающихся от предоставленных, во время исследования было запрещено. Во время каждого периода «отмывки» испытуемым разрешали потреблять продукты из искусственного молока, но не коровье молоко.

Испытуемые

Критерии включения были следующими: мужчина или женщина; возраст 25-68 лет; нерегулярное потребление молока (задокументированное с применением опросника о частоте потребления пищи); по словам испытуемого, непереносимость коммерчески доступного молока; по словам испытуемого, связанный с пищеварением дискомфорт после потребления молока; и нормальные показания электрокардиограммы (ЭЭГ) и артериального давления во время спокойного дыхания. Испытуемые входили в исследование, если они: согласились не принимать никаких лекарственных средств, пищевых добавок или других молочных продуктов, включая ацидофильное молоко, во время исследования; были готовы выполнить все требования и процедуры; предоставили подписанное информированное согласие; согласились не участвовать в других интервенционных клинических исследованиях в ходе настоящего исследования; не соответствовали ни одному из критериев исключения; и полностью понимали природу, цель, преимущество и потенциальные риски и побочные эффекты исследования. Испытуемых набирали по объявлениям, размещенным на досках объявлений в общественных больницах. Сводные статистические данные приведены в Таблице 1.

Тест слабого когнитивного нарушения (SCIT)

SCIT является компьютерным тестом, который измеряет скорость и эффективность обработки информации. Испытываемые указывали на то, какая из двух параллельных вертикальных линий в целевом стимуле короче, нажимая левую или правую кнопку мыши. Визуально маскированный целевой стимул был случайным образом представлен при продолжительности экспозиции 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112 и 128 мс; по 12 попыток при каждой продолжительности, в общей сложности 96 попыток. Время реакции и частоту ошибок испытуемого фиксировали для каждой продолжительности экспозиции стимула. Данные четырех наиболее коротких продолжительностей экспозиции (16-64 мс) были объединены для обеспечения двух шкал от «головной» части соответствующих кривых реакции ответа (бессознательная автоматическая обработка): времени реакции (SCIT-RT_H) и частоты ошибок (SCIT-E_H). Данные четырех наиболее длинных продолжительностей показа (83-133 мс) были объединены для обеспечения двух шкал у «хвостовой» части соответствующих кривых реакции ответа (сознательная обработка): времени реакции (SCIT-RT_T) и частоты ошибок (SCIT-E_T). SCIT имеет высокую вероятность совпадений при повторном тестировании и внутренних совпадений, и умеренно высокую содержательную валидность.²⁰

Статистический анализ

Для оценки нормальности непрерывных переменных использовали тест Колмогорова-Смирнова. Переменные, не имевшие нормального распределения, подвергали квадратичному или логарифмическому преобразованию, чтобы аппроксимировать нормальное распределение. Параметры на исходном уровне представлены описательно как среднее ± стандартное отклонение (СО) или число (в процентах) испытуемых. Переменные SCIT анализировали с применением дисперсионного анализа смешанных эффектов, в котором выбранный эксперимент и экспериментальный период включали как фиксированные влияния, а субъект был включен как случайное влияние внутри последовательности исследования (то есть последовательность 1, обычное молоко → молоко только с бета-казеином А2, последовательность 2, молоко только с бета-казеином А2 → обычное молоко). Чтобы исследовать, существовали ли различия между двумя экспериментами по средним значениям для каждой конечной точки, и менялись ли средние значения во время периодов исследования, применяли тесты типа III с фиксированными влияниями, чтобы проверить влияние экспериментов и периодов исследования. Дополнительно, провели контрастные тесты, чтобы сравнить средние значения для каждого продукта. Наличие перекрестного влияния оценивали с использованием взаимодействия Эксперимент × Период. Если это взаимодействие не было статистически достоверным, оценивали данные по обоим периодам. Если взаимодействие было статистически достоверным, использовали только данные экспериментального периода 1.

Пример 2: Исследование молока и анализ SCIT у детей дошкольного возраста

Это исследование провели в соответствии с той же методологией, что и в Примере 1 выше, за исключением того, что испытуемые были детьми дошкольного возраста. Исследование начали с 80 испытуемых, но поскольку 5 детей вышли из исследования, это число снизилось до 75.

Все анализы проводили с помощью линейной смешанной модели анализа для перекрестного дизайна. В основных анализах есть три фактора.

1. Фаза (фаза 1 и фаза 2 перекрестного дизайна).

2. Тип молока (смешанное и только с бета-казеином А2).

3. Состояние (исходный уровень и прием молока), т.е. результаты до и после потребления молока.

Четыре значения SCIT использовали в качестве «головного» и «хвостового» времени реакции, а также «головной» и «хвостовой» частоты ошибок. «Головной» и «хвостовой» соответственно относятся к ответам на стимулы, представленные при продолжительности экспозиции 16-64 мс («головной») и 80-128 мс («хвостовой»). Это разделение соответствует продолжительности экспозиции, при которой доступны только автоматические процессы для обработки стимулов («головной»), и продолжительности экспозиции, при которой также доступны контролируемые (привлекающие внимание) процессы («хвостовой»). Для каждого из четырех значений SCIT анализы проводили раздельно. Результаты показаны на Фигурах 3-5.

Хотя настоящее изобретение описано с помощью примеров, следует принимать во внимание, что вариации и модификации могут быть сделаны без отхода от объема изобретения, определенного в формуле изобретения. Кроме того, если существуют известные эквиваленты с определенными свойствами, такие эквиваленты включены в заявку так же, как если бы на них особо ссылались в описании изобретения.

Источники информации

1. WO 1996/014577.

2. WO 1996/036239.

3. WO 2002/019832.

4. WO 2014/193248.

5. WO 2015/005804.

6. WO 2015/026245.

7. WO 2002/019832.

8. Cade R, Privette М, Fregly М, Rowland N, Sun Z, Zele V, et al. Autism and schizophrenia: intestinal disorders. Nutr Neurosci. 2000; 3: 57-72.

9. Reichelt KL, Ekrem J, Scott H. Gluten, milk proteins and autism: dietary intervention effects on behavior and peptide secretion. J Appl Nutr. 1990; 42: 1-11.

10. Reichelt KL, Knivsberg AM. Can the pathophysiology of autism be explained by the nature of the discovered urine peptides? Nutr Neurosci. 2003; 6(1): 19-28.

11. Kawashti MI, Amin OR, Rowehy NG. Possible immunological disorders in autism: concomitant autoimmunity and immune tolerance. Egypt J Immunol. 2006; 13(1): 99-104.

12. Sokolov O, Kost N, Andreeva O, Korneeva E, Meshavkin V, Tarakanova Y, et al. Autistic children display elevated urine levels of bovine casomorphin-7 immunoreactivity. Peptides. 2014; 56: 68-71.

13. Tveiten D, Finvold A, Andersson M, Reichelt KL. Peptides and exorphins in the autism spectrum. Open J Psychiatry. 2014; 3(3): 275-87.

14. Dohan FC. Genetic hypothesis of idiopathic schizophrenia: its exorphin connection. Schizophr Bull. 1988; 14(4): 489-94.

15. Niebuhr DW, Li Y, Cowan DN, Weber NS, Fisher JA, Ford GM, et al. Association between bovine casein antibody and new onset schizophrenia among US military personnel. Schizophr Res. 2011; 128(1-3): 51-5.

16. Reichelt KL, Landmark J. Specific IgA antibody increases in schizophrenia. Biol Psychiatry. 1995; 37(6): 410-3.

17. Severance EG, Dickerson FB, Hailing M, Krivogorsky B, Haile L, Yang S, et al. Subunit and whole molecule specificity of the anti-bovine casein immune response in recent onset psychosis and schizophrenia. Schizophr Res. 2010; 118(1-3): 240-7.

18. Severance EG, Lin J, Sampson HA, Gimenez G, Dickerson FB, Hailing M, et al. Dietary antigens, epitope recognition, and immune complex formation in recent onset psychosis and long-term schizophrenia. Schizophr Res. 2011; 126(1-3): 43-50.

19. Sun Z, Cade RJ. A peptide found in schizophrenia and autism causes behavioral changes in rats. Autism. 1999; 3(1): 85-95.

20. Sun Z, Cade RJ, Fregly MJ, Privette RM. b-casomorphin induces Fos-like immunoreactivity in discrete brain regions relevant to schizophrenia and autism. Autism. 1999; 3(67-83).

21. Kost NV, Sokolov OY, Kurasova OB, Dmitriev AD, Tarakanova JN, Gabaeva MV, et al. Beta-casomorphins-7 in infants on different type of feeding and different levels of psychomotor development. Peptides. 2009; 30(10): 1854-60.

22. Bruce, KM, Robinson, SR, Smith, JA and Yelland, GW Validity of a screening tool for detecting subtle cognitive impairment in the middle-aged and elderly. Clinical Interventions in Aging. 2014, 9, 2165-2176.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к применению молока или молочных продуктов с повышенным содержанием варианта бета-казеина, который не приводит к образованию бета-казоморфина-7 (БКМ-7) при расщеплении в кишечнике указанного человека, для улучшения когнитивной функции и для профилактики когнитивных нарушений у здорового человека. Вариант бета-казеина, который не приводит к образованию БКМ-7, при расщеплении в кишечнике человека представляет собой вариант бета-казеина, у которого присутствует пролин в положении 67 в последовательности аминокислот. Группа изобретений обеспечивает снижение содержания бета-казеина A1 в рационе, что позволяет устранить неблагоприятное влияние бета-казоморфина-7 (БКМ-7) на когнитивные функции. 4 н. и 7 з.п. ф-лы, 5 ил., 4 табл., 2 пр.

1. Способ улучшения когнитивной функции у здорового человека путем приема внутрь композиции, содержащей бета-казеин, или путем обеспечения указанного человека композицией, содержащей бета-казеин, где указанная композиция представляет собой молоко или молочный продукт, причём указанное молоко или молочный продукт имеет по сравнению с обычным молоком или молочным продуктом из обычного молока повышенное содержание варианта бета-казеина, который не приводит к образованию бета-казоморфина-7 (БКМ-7) при расщеплении в кишечнике указанного человека, где указанный вариант бета-казеина, который не приводит к образованию БКМ-7, при расщеплении в кишечнике человека представляет собой вариант бета-казеина, у которого присутствует пролин в положении 67 в последовательности аминокислот, и при этом указанный вариант бета-казеина, который не приводит к образованию БКМ-7 при расщеплении в кишечнике человека, присутствует в указанной композиции в количестве, которое эффективно для улучшения когнитивной функции у здорового человека.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что вариант бета-казеина представляет собой бета-казеин A2, бета-казеин A3, бета-казеин D, бета-казеин E, бета-казеин H2 или бета-казеин I.

3. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что вариант бета-казеина представляет собой бета-казеин A2.

4. Способ по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что бета-казеин содержит по меньшей мере 90% по массе бета-казеина А2.

5. Способ по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что бета-казеин содержит 100% бета-казеина А2.

6. Способ по любому из пп. 1-5, отличающийся тем, что когнитивную функцию оценивают с использованием любого одного или более из Теста слабого когнитивного нарушения (SCIT), Автоматизированного когнитивного теста (ACT), Автоматизированных метрик нейропсихологической оценки (ANAM), Компьютеризированной системы оценки деменции с медикаментозным исследованием когнитивных процессов (COGDRAS-D), Cовместного скринингового инструмента для деменции (CSI-D), Компьютеризированного нейропсихологического скрининга умеренного когнитивного нарушения (CANS-MCI), Компьютеризированной оценки умеренного когнитивного нарушения (CAMCI), Компьютеризированного самостоятельного тестирования (CST), Флоридской краткой шкалы памяти (FBMS), Умеренного когнитивного нарушения (MCI), Нейропсихологической батареи тестов (NTB), Краткой оценки когнитивных процессов при шизофрении (BACS), Кембриджского обследования ментальных расстройств у пожилых – Пересмотренный (CAMDEX-R), Кембриджской батареи автоматизированных нейропсихологических тестов (CANTAB), Компьютеризированной мультифазной интерактивной двухдисплейной системы (CMINDS), Батареи компьютеризированных нейропсихологических тестов (CNTB), Теста возможностей памяти (MCT), Батареи нейропсихологической оценки (NAB), Совместного исследования болезни Альцгеймера (ADCS), Батареи исполнительных, лингвистических, пространственных функций и функции памяти (ELSMEM), Мини-определения ментального состояния (MMSE) и Когнитивного теста Гамильтона D (HAM-D).

7. Способ по любому из пп. 1-5, отличающийся тем, что указанное молоко представляет собой свежее молоко, сухое молоко, жидкое молоко, восстановленное из порошка, обезжиренное молоко, гомогенизированное молоко, концентрированное молоко, сгущенное молоко, пастеризованное молоко или не пастеризованное молоко.

8. Способ по любому из пп. 1-5, отличающийся тем, что указанный молочный продукт представляет собой сливки, йогурт, творог, сыр, масло или мороженое.

9. Применение композиции для улучшения когнитивной функции у здорового человека, где указанная композиция представляет собой молоко или молочный продукт, причём указанное молоко или молочный продукт имеет по сравнению с обычным молоком или молочным продуктом из обычного молока повышенное содержание варианта бета-казеина, который не приводит к образованию бета-казоморфина-7 (БКМ-7), при расщеплении в кишечнике указанного человека, где указанный вариант бета-казеина, который не приводит к образованию БКМ-7 при расщеплении в кишечнике человека, представляет собой вариант бета-казеина, у которого присутствует пролин в положении 67 в последовательности аминокислот, и при этом указанный вариант бета-казеина, который не приводит к образованию БКМ-7 при расщеплении в кишечнике человека, присутствует в указанной композиции в количестве, которое эффективно для улучшения когнитивной функции у здорового человека.

10. Применение молока при получении композиции для улучшения когнитивной функции у здорового человека, где указанная композиция представляет собой молоко или молочный продукт, при этом указанное молоко или молочный продукт имеют по сравнению с обычным молоком или молочным продуктом из обычного молока повышенное содержание варианта бета-казеина, который не приводит к образованию бета-казоморфина-7 (БКМ-7) при расщеплении в кишечнике человека, где указанный вариант бета-казеина, который не приводит к образованию БКМ-7, при расщеплении в кишечнике указанного человека представляет собой вариант бета-казеина, у которого присутствует пролин в положении 67 в последовательности аминокислот, и при этом указанный вариант бета-казеина, который не приводит к образованию БКМ-7 при расщеплении в кишечнике человека, присутствует в указанной композиции в количестве, которое эффективно для улучшения когнитивной функции у здорового человека.

11. Способ профилактики когнитивного нарушения у здорового человека, включающий прием внутрь указанным человеком композиции, содержащей бета-казеин, или обеспечение указанного человека композицией, которая содержит бета-казеин, где указанная композиция представляет собой молоко или молочный продукт, причём указанное молоко или молочный продукт имеет по сравнению с обычным молоком или молочным продуктом из обычного молока повышенное содержание варианта бета-казеина, который не приводит к образованию бета-казоморфина-7 (БКМ-7), при расщеплении в кишечнике указанного человека, где указанный вариант бета-казеина, который не приводит к образованию БКМ-7, при расщеплении в кишечнике человека представляет собой вариант бета-казеина, у которого присутствует пролин в положении 67 в последовательности аминокислот, и при этом указанный вариант бета-казеина, который не приводит к образованию БКМ-7 при расщеплении в кишечнике человека, присутствует в указанной композиции в количестве, которое эффективно для улучшения когнитивной функции у здорового человека.