Показать метаданные Скрыть метаданные

(19)

(11)

2 802 825

(13)

(51)

МПК

C07K14/08(2006-01-01)

C07K14/705(2006-01-01)

A61K39/12(2006-01-01)

C12N15/62(2006-01-01)

C12N15/63(2006-01-01)

C12N7/01(2006-01-01)

A61P31/14(2006-01-01)

(21) (22)

Заявка

2021139955, 2021-12-30

(24)

Дата начала отсчета патента

2021-12-30

(22)

дата подачи заявки

2021-12-30

(45)

опубликовано

2023-09-04

(72)

авторы

Исаев Артур АлександровичКудрявцев Александр ВикторовичФролова Мария ЕвгеньевнаВахрушева Анна ВладимировнаИванов Александр ВикторовичДжонович МиланаИванишин Тарас ВладимировичКрасильников Игорь Викторович

(73)

патентообладатели

Общество С Ограниченной Ответственностью

(56)

Документы, цитированные в отчете о поиске

ZEZHONG LIU et alHAITAO LIU et al

Генная конструкция для экспрессии рекомбинантных белков на основе участка S-белка SARS-CoV-2, включающего RBD и SD1, слитого с Fc фрагментом IgG, способ получения рекомбинантных белков, антигены и антигенные композиции для индукции длительного антительного и клеточного иммунитета против вируса SARS-CoV-2 Российский патент 2023 года по МПК C07K14/08 C07K14/705 A61K39/12 C12N15/62 C12N15/63 C12N7/01 A61P31/14

Описание патента на изобретение RU2802825C2

Область техники, к которой относится изобретение.

Изобретение относится к биотехнологии, иммунологии вирусологии и касается создания генной конструкции, включающей варианты экспрессионных кассет, кодирующих рекомбинантные белки на основе участка S-белка SARS-CoV-2, включающего RBD и SD1, слитого с Fc фрагментом IgG, которые в сочетании с бетулином могут быть использованы как активная субстанция, вызывающая выработку антител против вируса SARS-CoV-2.

Уровень техники

Вакцинация рассматривается в современных условиях как одно из наиболее эффективных средств борьбы с инфекцией. Таким образом, многие страны и фармацевтические компании включились в разработку вакцин и лекарственных препаратов против SARS-CoV-2, нового РНК-содержащего вируса, относящегося к семейству Coronaviridae к линии Beta-CoV.

При традиционной технологии создания вакцин на основе использования полноразмерного патогена резко возрастает сложность производства, обусловленная опасностью работы и необходимостью строгого контроля за полнотой инактивации возбудителя, что делает данный вариант менее экономически выгодным. В связи с этим, проверенная временем технология получения вакцин на основе субъединицы вируса имеет определенные преимущества, такие как безопасность и возможность повторного введения. Однако, отдельные вирусные субъединицы имеют низкую иммуногенность, вследствие чего необходимо использование адъювантов.

Вакцины на основе целых инактивированных вирусов, в целом, широко используются в иммунизации, однако имеют серьезные недостатки - от технологических, связанных с трудностью получения быстро больших количеств препарата в сжатые сроки, до проблем, связанных с эффективностью - нежелательные побочные эффекты и проблемы с таргетностью вырабатываемых антител на необходимый эпитоп белков вирусной оболочки.

Вакцины на основе нуклеиновых кислот основаны на принципе введения в клетки генетической информации, с которой продуцируются белки патогена, вызывающие иммунную реакцию. На данный момент, к слову, ни одна из ДНК или РНК вакцин не утверждена для профилактики инфекционных заболеваний человека. Из недостатков следует отметить низкую иммуногенность. В случае использования для доставки вирусных векторов существует опасность интеграции чужеродной ДНК в геном клетки, возможное развитие аутоиммунных реакций против клеток, экспрессирующих антигенный протеин, или реакция на чужеродную ДНК. Помимо этого, существуют трудности с доставкой таких препаратов. Стоит отметить, что РНК и ДНК вакцины, а также вакцины на основе аденовирусных векторов вызывают определенную осторожность в использовании, так как неизвестны долговременные последствия их применения. Помимо этого, аденовирусные вакцины могут вызвать иммунную реакцию на сам аденовирус, а также их невозможно будет использовать без внесения модификаций повторно.

Субъединичные вакцины представлены, прежде всего, рекомбинантными препаратами, на основе очищенных белков. При создании таких типов вакцин важной частью является поиск новых подходящих адъювантов. Их использование позволяет уменьшить дозу антигена, снизить стоимость конечного препарата, повысить иммуногенность «слабых» или малых антигенов, на которые чрезвычайно сложно выработать иммунитет и получить вакцину к данному классу антигенов. Это позволяет предотвратить конкуренцию антигенов в комбинированных вакцинах, увеличить скорость развития и продолжительность иммунного ответа у привитых, индуцировать защитные свойства слизистых оболочек, а также увеличить силу иммунного ответа. В настоящее время признано невозможным создание эффективных и безопасных вакцин без применения адъювантов.

За функцию проникновения коронавируса в клетки хозяина отвечает RBD (рецептор-связывающий домен) S-белка, а также отдельные его эпитопы. В экспериментальных исследованиях установлено, что большинство антител, обладающих вируснейтрализующей активностью в отношении вида коронавирусов (например, MERS или SARS), специфически связываются с различными эпитопами RBD. RBD образует сайт связывания с рецептором АСЕ2, поэтому антитела способные связываться с RBD доменом могут блокировать контакт с рецептором и, как следствие, препятствовать проникновению вируса в клетки, что в случае SARS-CoV-2 установлено. На основании этого, в качестве последовательности для создания антигена была выбрана именно последовательность RBD. Стоит отметить, что выбор целого S-белка мог бы привести к выработке не только нейтрализующих антител, но и маскирующих, повышая развитие антитело-зависимого усиления инфекции.

Домен S1 состоит из субдомена NTD (N-концевой домен), RBD (остатки 319-527), и субдоменов SD1 и SD2, которые наиболее близки к домену S2. Таким образом, важнейшей задачей вакцинации является не просто выработка антител к S-белку, а именно нейтрализующих антител к RBD. Однако, простое использование RBD в качестве антигена вакцины не представляется возможным, так как масса белка довольно мала (менее 40 кДа), а также он быстро выводится из организма, поэтому кандидатом в антигены стал RBD, конъюгированный с Fc фрагментом IgG.

Добавление адъюванта позволит снизить количество белка на дозу, себестоимость вакцины и позволит увеличить иммунный ответ на антиген. В настоящее время в экспериментальных и клинических исследованиях применяют: минеральные (гидроксид или фосфат алюминия), растительные (сапонины - QuilA, QS21), микробные (убитые бактерии, липополисахарид, и его производные, CpG-мотивы ДНК) и другие виды адъювантов. Вследствие токсичности или недостаточной эффективности большинства адъювантов для общего использования разрешены только соли алюминия и водно-масляные эмульсии MF-59, AS03, QS 21, VLP (virus-tike particles) и ИСКОМы (ImmunoStimulating COMplex). Наиболее перспективными являются корпускулярные адъюванты - сферические аморфные наночастицы (САНЧ). Одна из причин использования - их эффективное поглощение антиген-представляющими клетками иммунной системы, что приводит к усилению иммунного ответа. К таким адъювантам можно отнести бетулиновые адъюванты на основе тритерпеноидов из экстракта бересты (патент RU 2,545,714). Бетулиновые частицы, кроме выраженного спектра биологической активности (противомикробное, противогрибковое, противовирусное действия, гепатопротективное, противовоспалительное, противораковое, противоаллергическое, мембранстабилизирующее, иммуномодулирующее, антиоксидантное), обладают и адъювантными свойствами.

Техническое решение согласно патенту RU 2,749,193 выбрано авторами заявляемого изобретения за прототип. Из данного патента известны варианты использования антигенов, включающие RBD для индукции специфического иммунитета против вируса SARS-CoV-2 в качестве антигенного компонента, вместе с бетулиновыми сферическим аморфными наночастицами (САНЧ) размера 80-160 нм в качестве адъюванта. Сферические частицы на основе тритерпенидов из бересты - бетулина (бетуленол, бетулинол, лупендиол) охарактеризованы на фиг. 1 и фиг. 2. Данный адъювант производится в промышленных масштабах в соответствии с требованиями опытно-промышленного регламента, а также был протестирован ранее в доклинических исследованиях гриппозных вакцин, где показал хорошие иммуногенные свойства и безопасность использования.

Раскрытие сущности изобретения

Существенный недостаток известных вакцин против SARS-CoV-2, состоит в сложности их производства, недостаточной иммунногенной активности, нежелательных побочных явлениях, и проблемах с таргетностью вырабатываемых антител к необходимому эпитопу белка вирусной оболочки. Техническая задача настоящего изобретения заключается в создании антигенной композиции, позволяющей вызвать индукцию специфического гуморального и клеточного иммунного ответа к необходимому эпитопу белка вирусной оболочки SARS-CoV-2. Техническим результатом раскрываемого изобретения является создание антигенной композиции с бетулином в качестве адъюванта и рекомбинантным белком в качестве активного компонента. Технический результат достигается за счет создания генетической конструкции, включающей экспрессионную кассету, организованную в формате модульной конструкции, позволяющей осуществлять замены участков, кодирующих сигнальный пептид, целевой рекомбинантный белок-антиген RBD-SD1 SARS-CoV-2 слитый с Fc-фрагментом иммуноглобулина через линкер.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1. Охарактеризованные состоящие из бетулина сферические частицы, а) формула бетулина, б) электронные фотографии бетулиновых сферических частиц, в) размер бетулиновых корпускулярных частиц около 120-160 нм.

Фиг. 2. Изображение адъюванта в виде бетулина в сочетании с антигеном после обработки ультразвуком, полученное методом трансмиссионной электронной микроскопии.

Фиг. 3. Рекомбинантные нанесенные на бетулиновые сферические наночастицы RBD-SD1-Fc белки, а) схематическое изображение комплекса бетулин/RBD-SD1-Fc, б) типичное изображение вириона SARS-CoV-2, в) хроматографический пик RBD-SD1-Fc перед нанесением на бетулиновые частицы, г) хроматограммы супернатанта после нанесения белка на частицы, подтверждающие абсорбцию антигена из раствора.

Фиг. 4. Схема S-белка SARS-CoV-2 и рекомбинантного белка на основе RBD-SD1-Fc. а) схема S-белка на поверхности SARS-CoV-2, б) схема структуры рекомбинантного RBD-SD1-Fc антигена, в) схема S-белка SARS-CoV-2, с указанной RBD-SD1 частью, взятой за основу рекомбинантных белков.

Фиг. 5. Экспрессионные кассеты четырех генных конструкций, кодирующих рекомбинантные белки на основе участка S-белка SARS-CoV-2, включающего RBD и SD1, слитых с Fc фрагментом IgG.

Фиг. 6. Линеаризованный pcDNA3.4 вектор для ТОРО® ТА клонирования продуктов ПЦР и для высокого уровня экспрессии.

Фиг. 7. Схема получения генных конструкция для экспрессии рекомбинантных белков RBD-SD1-Fc.

Фиг. 8. Карта генной конструкции 83/1, содержащей сигнальный пептид S-белка, участок RBD (Ухань), и Fc фрагмент.

Фиг. 9. Карта генной конструкции 86/12, содержащей сигнальный пептид антитела F10, RBD-SD1 участок (Wuhan), и Fc фрагмент IgG.

Фиг. 10. Карта генной конструкции 78/9, содержащей сигнальный пептид S-белка, RBD-SD1 участок (Beta), и Fc фрагмент IgG.

Фиг. 11. Карта генной конструкции 85/1, содержащей сигнальный пептид антитела F10, RBD-SD1 участок (Beta), и Fc фрагмент IgG.

Фиг. 12. Общая схема экспрессионной кассеты, включающей последовательность сигнального пептида, RBD-SD1 участка SARS-CoV-2, линкерную последовательность, и Fc фрагмент IgG, организованной в формате модульной конструкции, позволяющей осуществлять модификации или замены участков согласно сайтам рестрикции.

Фиг. 13. Электрофореграмма разделения образцов рекомбинантных белков RBD-SD1-Fc штаммов Wuhan и Beta в 10% ПААГ в восстанавливающих (+БМЭ) и невосстанавливающих условиях (-БМЭ). М - маркер молекулярных масс (15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 85, 100, 120, 150, 200 кДа).

Фиг. 14. Схема эксперимента по двукратной иммунизации BALB/C мышей с периодом в 2 недели.

Фиг. 15. Уровень специфических антител к белку mutant RBD-Fc в сыворотках иммунизированных мышей линии BALB/c после двукратной иммунизации вакцинными препаратами в дозе 5 мкг и 20 мкг. Отдельные символы демонстрируют индивидуальное значение титра для каждого животного, горизонтальная черта - средне-геометрический титр для группы.

Фиг. 16. Уровень вирус-нейтрализующих антител к коронавирусу SARS-CoV-2 в сыворотках вакцинированных мышей BALB/c линии.

Отдельные символы демонстрируют индивидуальное значение титра для каждого животного, горизонтальная черта - средне-геометрический титр для группы.

Фиг. 17. Результаты изучения клеточного иммунного ответа - специфических ответов CD4+ и CD8+ Tem после иммунизации, (а) относительное присутствие вирус-специфичных CD4+ и CD8+ Tem среди CD4+/CD8+ CD44+ CD62L- спленоцитов, (б) относительная частота вирус-специфических цитокинов, продуцирующих CD4+ и CD8+ Tem.*р<0,05.

Осуществление изобретения

Дизайн RBD-SD1-Fc экспрессионных кассет

На первом этапе работы создана генная конструкция на основе вектора pcDNA3.4 (SEQ ID NO: 2), содержащего следующие участки: CMV промотор/энхансер, Start-End (сайт клонирования для клонирования продуктов ПЦР), WPRE (посттранскрипционный регуляторный элемент сурка), NeoR/KanR (ген устойчивости к неомицину/канамицину), HSV ТК poly(A) signal (сигнал полиаденилирования тимидинкиназы (ТК) вируса простого герпеса), f1 ori (сайт начала репликации), SV40 промотор и SV40 ori, SV40 poly(A) signal (сигнал раннего полиаденилирования SV40), AmpR, AmpR promoter (ген устойчивости к ампициллину (bla) (β-лактамаза) и его промотор), сайты рестрикции, обозначены соответствующими им наименованиями. Экспрессионные кассеты клонируются в Start-End положение.

Генная конструкция S-RBD-SD1(Wuhan)-Fc (SEQ ID NO: 1) включала экспрессионную кассету, кодирующую рекомбинантный белок (SEQ ID NO: 3) на основе участка S-белка штамма Wuhan-Hu-1 SARS-CoV-2 (далее по тексту: Wuhan), включающего RBD и SD1, слитого с Fc фрагментом IgG (фиг. 4б). Участок S-белка (аминокислоты 302-638), включающий RBD и SD1 представлен на фиг. 4в как «RBD-SD1 антиген». Таким образом, экспрессионная кассета включала три конструктивные последовательности:

(а) сигнальный пептид S-белка SARS CoV-2 (SEQ ID NO: 4),

(б) участок S-белка штамма Wuhan (SEQ ID NO: 5),

(в) Fc фрагмент IgG (SEQ ID NO: 6).

Дополнительно, в данном изобретении на основе полученной выше генной конструкции S-RBD-SD1 (Wuhan)-Fc создан вариант экспрессионной кассеты, где участок S-белка штамма Wuhan, включающий RBD и SD1, заменен на участок с мутациями (K417N, E484K, N501Y, D614G) штамма Beta, В1.351 SARS-CoV-2 (далее по тексту: Beta). В результате, создана генная конструкция S-RBD-SD1(Beta)-Fc (SEQ ID NO: 7), экспрессирующая рекомбинантный белок (SEQ ID NO: 8) на основе такого же участка S-белка штамма Beta (аминокислоты 302-638), включающего RBD и SD1, слитого с Fc фрагментом IgG. Таким образом, генная конструкция включала три конструктивные последовательности:

(а) сигнальный пептид S-белка SARS CoV-2 (SEQ ID NO: 4),

(б) участок S-белка штамма Beta (SEQ ID NO: 9),

(в) Fc фрагмент IgG (SEQ ID NO: 6).

Сигнальные пептиды представляют собой последовательности, которые играют центральную роль в нацеливании и транслокации почти всех секретируемых белков и многих интегральных мембранных белков как у прокариот, так и у эукариот. От выбора сигнального пептида напрямую зависит секреция рекомбинантного белка. Для того, чтобы обеспечить высокие уровни продукции белка в культуральную среду, в данном изобретении использована последовательность сигнального пептида S-белка SARS-CoV-2 по причине наличия участка S-белка SARS-CoV-2 в рекомбинантном белке. Также, по причине наличия Fc фрагмента IgG в рекомбинантном белке, последовательность сигнального пептида S-белка в двух ранее описанных генетических конструкциях S-RBD-SD1 (Wuhan)-Fc и S-RBD-SDl(Beta)-Fc, экспрессирующих участок S-белка штаммов Wuhan и Beta, заменена на сигнальный пептид антитела F10 (SEQ ID NO: 10). Таким образом, созданы генетические конструкции F10-RBD-SD1(Wuhan)-Fc (SEQ ID NO: 11) и F10-RBD-SD1-Fc (SEQ ID NO: 12), экспрессирующие рекомбинантные белки на основе участка S-белка штаммов Wuhan и Beta SARS-CoV-2, включающего RBD и SD1, слитых с Fc фрагментом IgG.

Fc фрагмент - кристаллизующийся фрагмент иммуноглобулина, часть молекулы иммуноглобулина, которая взаимодействует с Fc рецепторами на поверхности клетки и с некоторыми белками системы комплемента. Fc фрагмент димеризуется друг с другом посредством дисульфидных связей, образуя димер из идентичных половин, формируя Y-образную структуру. Связь с Fc фрагментом антигенных фрагментов имитирует таким образом комплекс антиген-антитело, увеличивающий иммунный ответ, корректируя его в сторону специфического иммунного ответа и предотвращая IgE-связанную аллергенность. Также, связь с Fc фрагментом позволяет обеспечить аффинную очистку путем хроматографии через сорбент сефарозу с белком А в качестве лиганда, что обеспечивает высокую чистоту конечного продукта после очистки.

Таким образом, с учетом использованных вариантов последовательностей сигнальных пептидов, S-белка SARS-CoV-2, и последовательности Fc фрагмента IgG, в конечном итоге были сконструированы четыре экспрессионные кассеты (табл. 1), экспрессирующие два рекомбинантных белка на основе участка S-белка штаммов Wuhan и Beta, которые схематично представлены на фиг. 5.

Способ получения рекомбинантных белков RBD-SD1-Fc

Разработанный способ получения рекомбинантных белков RBD-SD1-Fc включает следующие этапы:

1) Наработку последовательностей сигнального пептида и Fc фрагмента IgG,

2) Получение pAL2-T генных конструкций, включающих последовательности сигнального пептида и Fc фрагмента IgG,

3) Лигирование фрагментов (последовательностей) сигнального пептида, Fc фрагмента IgG, и участка S-белка SARS-CoV-2 в pcDNA3.4 генную конструкцию,

4) Культивирование клеток для получения рекомбинантного белка на основе RBD-SD1-Fc,

5) Отбор культуральной среды,

6) Хроматографическую очистку рекомбинантного белка на основе RBD-SD1-Fc,

7) Подтверждение подлинности полученного рекомбинантного белка на основе RBD-SD1-Fc.

На первом этапе работы методом ПНР синтезировали последовательности сигнального пептида S-белка и Fc фрагмента IgG. Последовательность сигнального пептида S-белка синтезировали с помощью праймеров LSpF1-LSpR1 (SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14) и LSpF2-LSpR2 (SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16). Последовательность Fc фрагмента синтезировали с помощью праймеров FclinkerF (SEQ NO ID: 17) и pcDNA3.4-R (SEQ NO ID: 18) на основе плазмиды, содержащей ген Hc моноклонального антитела трастузумаб в качестве матрицы.

Отжиг праймеров осуществляли при 58°С, количество циклов амплификации устанавливали равным 15. Фрагменты разделяли методом ДНК электрофореза в 1% агарозном геле, выделяли фрагменты размером 78 и 850 п.о., и клонировали отдельно в Т-вектор pAL2-T. В результате работы получили две pAL2-T генные конструкции, включающие последовательности сигнального белка S-белка, и полиглицин-серинового линкера (SEQ ID NO: 19), слитого с Fc фрагментом IgG, соответственно. Полученные последовательности подтверждали методом секвенирования по Сэнгеру.

Отобранные pAL2-T генные конструкции (SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21), несущие последовательность сигнального пептида S-белка и последовательность полиглицин-серинового линкера, слитого с Fc фрагментом IgG, соответственно, обрабатывали эндонуклеазами рестрикции NheI, XhoI, HinDIII, выделяли фрагменты, и в ходе трехкомпонентного лигирования клонировали в pcDNA3.4 (фиг. 6) по сайтам узнавания эндонуклеаз рестрикции NheI, XhoI.

Генную конструкцию, включающую нуклеотидную последовательность участка S-белка штамма Wuhan (Wuhan-1, GenBankID:NC_045512 302:638) обрабатывали эндонуклеазами рестрикции BamHI и HinDIII, разделяли продукты реакции в 1% агарозном геле в ходе электрофореза, и выделяли фрагмент размером 1080 п.о. Выделенные фрагменты клонировали по сайтам BamHI и HinDIII в предварительно подготовленную pcDNA3.4 генную конструкцию, несущую нуклеотидные последовательности, кодирующие сигнальный пептид S-белка и Fc фрагмент IgG. Таким образом, получена pcDNA3.4 S-RBD-SD1(Wuhan)-Fc генная конструкция (SEQ ID NO: 1), содержащая экспрессионную кассету, кодирующую сигнальный пептид S-белка, участок S-белка штамма Wuhan, и Fc фрагмент IgG, которая может быть затем использована для продукции RBD-SD1(Wuhan)-Fc рекомбинантного (SEQ ID NO: 3).

Для получения RBD-SD1-Fc рекомбинантного белка, содержащего участок S-белка штамма Beta (SEQ ID NO: 8), получали экспрессионную кассету, где участок, кодирующий S-белок, включающий RBD и SD1, заменен на участок с мутациями (K417N, E484K, N501Y, D614G). Генную конструкцию, содержащую нуклеотидную последовательность участка S-белка штамма Beta (SEQ ID NO: 9) обрабатывали эндонуклеазами рестрикции BamHI и HinDIII, разделяли продукты реакции в 1% агарозном геле в ходе электрофореза и выделяли фрагмент размером 1080 п.о. Выделенные фрагменты клонировали по сайтам BamHI и HinDIII в предварительно подготовленную pcDNA3.4 генную конструкцию, несущую нуклеотидные последовательности, кодирующие сигнальный пептид S-белка, и Fc-фрагмент IgG. Таким образом получена pcDNA3.4 S-RBD-SD1 (Beta)-Fc генная конструкция (SEQ ID NO: 7), включающая сигнальный пептид S-белка, участок S-белка штамма Beta, и Fc фрагмент IgG, которая может быть затем использована для продукции RBD-SD1(Beta)-Fc рекомбинантного белка (SEQ ID NO: 8).

Для проверки работы экспрессионной кассеты при замене сигнальной последовательности, на основании ранее полученных конструкций получали экспрессионные кассеты, кодирующие рекомбинантные белки RBD-SD1(Wuhan)-Fc (SEQ ID NO: 3) и RBD-SD1(Beta)-Fc (SEQ ID NO: 8), где произведена замена последовательности сигнального пептида S-белка, на последовательность сигнального пептида F10 анти-TNF иммуноглобулина (SEQ ID NO: 10).

Последовательность сигнального пептида F10 синтезировали с помощью праймеров праймеров LidF10HF1-LidF10HR1 (SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 32) и LidF10HF2- LSpR2 (SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25). Отжиг праймеров осуществляли при 58°С, количество циклов амплификации устанавливали равным 15. Фрагменты разделяли методом ДНК электрофореза в 1% агарозном геле, выделяли фрагменты размером 84 п.о., и клонировали в Т-вектор pAL2-T. Отобранную pAL2-T генную конструкцию (SEQ ID NO: 26), несущую последовательность сигнального пептида антитела F10, и ранее полученную pAL2-T конструкцию, несущую последовательность Fc фрагмента IgG (SEQ ID NO: 21) обрабатывали эндонуклеазами рестрикции NheI, XhoI, HinDIII, выделяли фрагменты и в ходе трехкомпонентного лигирования клонировали в pcDNA3.4 по сайтам узнавания эндонуклеаз рестрикции NheI, XhoI.

Генные конструкции pcDNA3.4, включающие нуклеотидные последовательности участка S-белка штаммов Wuhan и Beta, обрабатывали эндонуклеазами рестрикции BamHI и NheI, разделяли продукты реакции в 1% агарозном геле в ходе электрофореза и выделяли фрагменты размером 1080 п.о. Выделенные фрагменты клонировали по сайтам BamHI и HinDIII в предварительно подготовленные pcDNA3.4 генные конструкции, несущие последовательности, кодирующие сигнальный пептид F10 и Fc-фрагмент IgG. Таким образом получены генные конструкции pcDNA3.4 F10-RBD-SD1(Wuhan)-Fc (SEQ ID NO: 11) и F10-RBD-SD1(Beta)-Fc (SEQ ID NO: 12), которые могут быть затем использованы для продукции RBD-SD1(Wuhan)-Fc или RBD-SD1(Beta)-Fc рекомбинантных белков. Схема получения генной конструкции с вариантами экспрессионных кассет, кодирующих рекомбинантные белки на основе RBD-SD1-Fc представлена на фиг. 7. В результате работы получены генные конструкции 83/1 (фиг. 8), 86/12 (фиг. 9), 78/9 (фиг. 10), и 85/1 (фиг. 11). Данные генные конструкции включали следующие экспрессионные кассеты: S-RBD-SD1(Wuhan)-Fc (SEQ ID NO: 27), F10-RBD-SD1(Wuhan)-Fc (SEQ ID NO: 28), S-RBD-SD1(Beta)-Fc (SEQ ID NO: 29), F10-RBD-SD1(Beta)-Fc (SEQ ID NO: 30). Экспрессионные кассеты кодировали следующие рекомбинантные белки (с сигнальными последовательностями): SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34. Общая схема экспрессионных кассет для продукции RBD-SD1-Fc рекомбинантных белков представлена на фиг. 12.

Данная модульная конструкция позволяет согласно принципу "LEGO Genetics" легко получать новые варианты рекомбинантных белков - антигенов против SARS-CoV-2 и его мутантных штаммов, а также повышать продуктивность экпрессионной системы и заменять в экспрессионной кассете помимо вышеперечисленных модификаций в общем виде также следующие:

1) Заменять участок, кодирующий S-белок SARS-CoV-2, включающий RBD и SD1, на альтернативные, в т.ч. мутантные и/или гомологичные, например против других вирусов с помощью обработки эндонуклеазами BamHI и HinDIII и последующего лигирования.

2) Менять сигнальные последовательности для экспрессии рекомбинантного белка на альтернативные, в т.ч. с целью повышения продуктивности системы экспрессии или внесения дополнительных пост-трансляционных модификаций, с помощью обработки исходной экспрессионной кассеты эндонуклеазами NheI и HindIII и последующего лигирования.

3) Менять Fc фрагмент и линкер на альтернативные, например на Fc фрагменты других иммуноглобулинов, в т.ч. для изменения фармакокинетических характеристик получаемого антигена, с помощью обработки эндонуклеазами BamHI и XhoI и последующего лигирования.

4) Клонирования и вырезания генетической конструкции сигнальный пептид-RBD-SD1-Fc целиком, в т.ч. для замены промотора с помощью обработки исходной экспрессионной кассеты эндонуклеазами XhoI и NheI и последующего клонирования в другой вектор.

При этом, замены в экспрессионной кассете не должны быть менее 85%.

Клеточная культура для наработки рекомбинантных белков RBD-SD1-Fc.

Полученные генные конструкции (83/1, 86/12, 78/9, 85/1) затем нарабатывали в препаративных количествах и очищали при помощи коммерческого набора Plasmid Midiprep 2.0 (Евроген, кат. № ВС 124). Рекомбинантные белки RBD-SD1-Fc были получены на основе клеточной линии CHO-S и разработанных выше генных конструкций. Это коммерческая клеточная линия на основе клеток яичника китайского хомячка СНО, адаптированная к культивированию в плотной суспензии в специальной культуральной среде для повышенной экспрессии белка.

Клетки CHO-S культивировали в шейкер-инкубаторе при 5% содержания CO2, 80%-ной влажности и скорости качания 120 об/мин в питательной среде HyClone HyCell TransFx-С transfection media (GE Healthcare, США) с добавлением 8 мМ глутамина (ПанЭко, Россия), до достижения плотности 2*106 кл/мл 1 литр суспензии. Далее полученную суспензию трансфицировали плазмидными векторами 83/1, 86/12, 78/9, и 85/1 при помощи 1 мг/мл реагента Potyethylenimine (Polyscience, США), согласно инструкции производителя. В клетках СНО в режиме транзиентной экспрессии осуществлен биосинтез рекомбинантных белков RBD-SD1-Fc. Затем в течение 2 недель проводили селекцию трансфицированных клеток на антибиотике гигромицин Б. Данный антибиотик был выбран, поскольку плазмидные векторы содержат ген устойчивости к антибиотику Hygromycin В. Продукция указанного белка составляла от 5 мг/л до 10 мг/л.

Выделение рекомбинантных белков RBD-SD1-Fc осуществляли из культуральной жидкости, по окончанию культивирования клеток СНО. Клетки осаждали центрифугированием в течение 5 мин при 1000 об/мин, супернатант переносили в чистые пробирки и осаждали центрифугированием в течение 30 мин при 4000 об/мин. Супернатант снова переносили в чистые пробирки, добавляли 1/10 объема 10-кратного буфера Трис-HCl (20 мМ Трис-HCl, 150 мМ NaCl рН 7,2 1x буфер) и наносили на предварительно уравновешенную 1 мл колонку с носителем HiTrap MabSelect SuRe (Cytiva, США). Выделение белковых препаратов осуществляли на хроматографе Acta Pure (GE Healthcare, США) при скорости потока жидкости 2-4 мл/мин и давлении не более 0,5 Мпа. После нанесения колонку промывали 10 объемами колонки буфера Трис-HCl. Рекомбинантный белок RBD-SD1-Fc элюировали цитратным буфером (20 мМ лимонная кислота-NaOH, 200 мМ NaCl, рН 3,0), детекцию белков осуществляли в режиме реального времени по оптическому поглощению при 280 нм. Фракцию, содержащую искомый продукт, нейтрализовали добавлением 1/10 от объема фракции буфера для нейтрализации (1М Tris-HCl рН 8,0). Элюат диализовали против двух смен фосфатного буфера (10 mM NaH2PO4, 1.7 mM K2HP04, 137 mM NaCl, KCl 2.7 mM рН=7.4) стерилизовали фильтрацией и хранили на +4°С для кратковременного хранения (не более месяца) и -20°С для долговременного хранения.

Подтверждение подлинности

По результатам электрофореграммы подвижность рекомбинантного белка RBD-SD1-Fc в восстанавливающих условиях (+БМЭ) соответствовала ≈60 кДа, что обусловлено его гликозилированием (масса аминокислотной последовательности без учета гликозилирования составляет около 64.5 кДа). При невосстанавливающих условиях (-БМЭ) молекулярная масса получаемого белка составила ≈120-130 кДа, что соответствует димерному состоянию RBD-SD1-Fc. Таким образом, при первичном анализе препарата были подтверждена его ожидаемая молекулярная масса как в мономерном, так и в димерном состоянии. Результаты электрофореграммы представлены на фиг. 13.

Подготовка бетулина в качестве адъюванта и буферных растворов.

Для приготовления адъюванта использовали раствор бетулина в тетрагидрофуране (TGF) (ООО «Березовый мир», Россия). На первом этапе стерилизующая фильтрация проводилась через нейлоновую мембрану (NRG Pall N66+) с диаметром пор 0,22 мкм. Для получения однородной дисперсии адъюванта и снижения концентрации TGF 1% раствор бетулина смешивали с 25-кратным объемом стерильного 0,05М раствора Трис буфера (рН 7,0-9,0). Суспензию обрабатывали ультразвуком (35-40 кГц) в течение 10 мин.

Подготовка антигенных композиций на основе рекомбинантного белка RBD-SD1-Fc и бетулина в буферном растворе.

Рекомбинантный белок RBD-SD1-Fc и предварительно приготовленный адъювант в 0,05М буферном растворе Трис-HCl с добавлением 0,15М NaCl (рН 7,5) смешивали так, чтобы конечная концентрация антигена составлял 40 мкг/мл или 10 мкг/мл, а адъювант - 400 мкг/мл. Компоненты тщательно перемешали и поместили в шейкер в холодильник на 3 часа. Затем флаконы с RBD-SD1-Fc и адъювантом хранили в холодильнике при 2-8°С.

Изучение иммуногенных свойств (титра антител) разработанных антигенных композиций на основе рекомбинантного белка RBD-SD1-Fc в различные сроки после иммунизации.

В исследовании были использованы самки линии BALB/c (Филиал "Столбовая" ФГБУН НЦБМТ ФМБА России). Количество животных, использованных в исследовании, являлось достаточным для того, чтобы оценить иммуногенность исследуемых объектов, а также позволило подвергнуть результаты исследования статистической обработке. Одновременно количество животных было минимальным с точки зрения этических принципов. Животных содержали в стандартных условиях (табл. 2), в соответствии с Директивой 2010/63/EU Европейского парламента и совета Европейского Союза от 22 сентября 2010 г. по охране животных, используемых в научных целях и в соответствии с санитарно-эпидемиологическими правилами СП 2.2.1.3218-14 "Санитарно-эпидемиологические требования к устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)" (утв. постановлением Главного государственного санитарного врача РФ от 29 августа 20)4 г. №51).

В табл. 3 приведены препараты на основе рекомбинантных белков RBD-SD1-Fc для иммунизации животных и дизайн исследования. В качестве препарата плацебо использовали физиологический раствор (0,9% NaCl) (Медполимер, Россия).

Мышам линии BALB/c массой 18-20 г препараты вводили внутрибрюшинно по 0,5 мл шприцем вместимостью 1 мл, двукратно, 1-й и 14-й день, согласно дизайну исследования (фиг. 14). Перед каждым заполнением шприца препарат перемешивали 5-6 раз. Контрольной группе мышей той же партии вводили раствор 0,9% натрия хлорида.

Через 28 дней после первой иммунизации у мышей осуществляли забор крови из нижнечелюстной вены. Образцы крови отстаивали при комнатной температуре в течение 2-х часов, центрифугировали 10 мин при 5000 об/мин и отбирали образовавшуюся цельную сыворотку. До момента использования сыворотки хранили при температуре - 20°С. Полученные из крови мышей сыворотки (индивидуально от каждого животного) контролировали на наличие антител методом иммуноферментного анализа (ИФА) и РМН.

Статистический анализ первичных данных проводили в GraphPad Prism v9. Для представления данных использовали следующие статистические показатели: среднее геометрическое, стандартное отклонение, среднее арифметическое, ошибка среднего. Для определения значимости различий между групповыми средними использовали однофакторный дисперсионный анализ ANOVA, затем критерий Тьюки для апостериорных попарных сравнений групп между собой. Групповой уровень значимости принимали равным α=0,05. Различия считали достоверными при р<α.

Иммуноферментный анализ

Наличие специфических иммуноглобулинов класса G (IgG) определяли в образцах сывороток мышей после двукратной иммунизации. В качестве антигена использовали белок (SARS-CoV-2; mutant RBD-Fc Lot:2452-139-066 2.95mg/ml (0.22 mkm Filt) Gly/TRIS/HCl pH 7.4), предоставленный для исследования. Сорбцию антигена, разведенного в стерильном DPBS до концентрации 1,0 мкг/мл проводили в течение ночи при +4°С в 96-луночных планшетах Maxisorp (Nunc) (по 100 мкл/лунку). Затем планшеты дважды отмывали раствором 0,1% TWEEN20 (Serva) в PBS с использованием автоматического промывателя ELx50 (BioTek) по 500 мкл/лунку. После отмывки планшеты инкубировали с блокирующим буфером (PBS-T, содержащий 5% сухое молоко, «ТФ Дитол»), в течение 2-х часов при комнатной температуре и повторно отмывали. После чего на планшет вносили серии двукратных разведений сывороток, начиная с разведения 1:400 для групп животных, получивших вакцинные препараты и с разведения 1:50 для группы плацебо. Планшеты с мышиными сыворотками инкубировали 1 ч при комнатной температуре, затем три раза отмывали. В качестве вторичных антител использовали меченые пероксидазой хрена Goat anti mouse IgG (H+L) HRP (Abcam) в разведении 1:7500 no 100 мкл/лунку. После инкубации со вторичными антителами планшеты четыре раза отмывали. В качестве цветного субстрата использовали раствор ТМВ (ООО «Имтек», Россия) по 100 мкл/лунку в течение 10 мин при комнатной температуре, затем реакцию останавливали добавлением 1N H2SO4 («Вектон», Россия). Оптическую плотность (ОП) при длине волны 450 нм измеряли на мультипланшетном ридере с LVF монохроматорами CLARIOstar (BMG LABTECH).

Для четырех вакцинных препаратов после двукратной иммунизации в дозе 5 мкг и 20 мкг было проведено определение уровня специфических антител к белку mutant RBD-Fc IgG в сыворотках иммунизированных животных с помощью непрямого варианта ИФА с использованием экспериментальной тест системы. Результаты определения уровня специфических антител представлены на фиг. 15. Статистический анализ был выполнен при помощи однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим попарным сравнением групп при помощи критерия Тьюки.

В ходе исследования показано формирование выраженного уровня сывороточных антител, специфических к белку mutant RBD-Fc после двукратной иммунизации обоими вакцинными препаратами в обоих использованных дозах.

Реакция микронейтрализации.

Для проведения реакции нейтрализации сыворотки мышей разводили стерильным DPBS в соотношении 1:4 и прогревали 30 мин при 56°С. Затем готовили разведения сывороток на среде МЕМ+2% FBS в объеме 50 мкл, начиная с 1:10 (в пересчете на цельную сыворотку). К разведениям сывороток добавляли эквивалентный объем вируса SARS-CoV-2 (заражающая доза 25 ТЦИД50) и инкубировали 1 час при 37°С. Затем разведения переносили на клетки Vero в 96-луночных планшетах. Планшеты инкубировали в течение 4 суток при 37°С, после чего проверяли на наличие ЦПД. Нейтрализующим титром считали наибольшее разведение сыворотки, при котором наблюдается отсутствие ЦПД. Все исследования с инфекционным коронавирусом проводили в лаборатории иммунологии и профилактики вирусных инфекций ФГБНУ «ИЭМ» (Санитарно-эпидемиологическое заключение Роспотребнадзора по Санкт-Петербургу №77.ПЧ.01.000.М.000053.08.20 от 05.08.2020 для проведения работ с ПБА II-IV группы патогенности).

Результаты определения уровня нейтрализующих антител против коронавируса SARS-CoV-2 в сыворотках крови мышей после двукратной иммунизации показали, что вирус-нейтрализующие антитела в количестве, достоверно отличающимся от группы плацебо, формируются только в группе животных, получивших антигенную композицию, содержащую рекомбинантный белок RBD-SD1-Fc штамма Ухань в дозе 20 мкг. Уровень вирус-нейтрализующих антител, сформировавшихся в других экспериментальных группах, достоверно не отличался от такового в группы плацебо. Результаты представлены на фиг. 16. Статистический анализ был выполнен при помощи однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим попарным сравнением групп при помощи критерия Тьюки.

В ходе исследования показано, что двукратная иммунизация приводила к формированию вирус-нейтрализующих антител в количестве достоверно отличающемся от группы плацебо только в группе животных, получивших антигенную композицию, содержащую рекомбинантный белок RBD-SD1-Fc штамма Ухань в дозе 20 мкг.

Изучение иммуногенных свойств (оценки клеточного иммунного ответа) разработанных антигенных композиций на основе рекомбинантного белка RBD-SD1-Fc в различные сроки после иммунизации.

Для оценки Т-клеточного иммунного ответа, мышам линии C57/black SPF (n=5 на группу) препарат RBD1 вводили внутрибрюшинно по 5 или 20 мкг, двукратно, 1-й и 22-й день. Селезенки были собраны через 28 дней после второй иммунизации. Невакцинированная группа (n=3) служила контролем. Дизайн исследования представлен в табл. 4.

Гомогенаты селезенки фильтровали (поры 70 мкм), промывали DPBS, содержащим 2,5% FCS (Gibco), лишали красных кровяных телец буфером для лизиса RBC (BioLegend), промывали DPBS (2,5% FCS). Клетки селезенки высевали на 96-луночные планшеты с плоским дном при плотности 2×106 клеток и стимулировали пулом пептида S-белка SARS-CoV-2 (PepTivator® SARS-CoV-2 Prot S) в течение 6 часов в присутствии анти-CD28 (BioLegend) и Брефельдина A (BD Biosciences). Фенотип клеток изучали с с помощью проточной цитометрии и CD8-PE / Су7, CD4-PerCP / Су5.5, CD44-BV510, CD62L-APC / Су7, IFNγ-BV780, TNFα-BV421, IL2-PE (BioLegend). Мертвые клетки обнаруживали с помощью Zombie Red (BioLegend). True Stain, содержащий анти-CD16/CD32 (Bio-Legend), использовали для блокирования неспецифического связывания. Окрашивание клеток проводили с помощью Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences) в соответствии с инструкциями.

Определяли относительное соотношение CD8+ и CD4+ Т-лимфоцитов с фенотипом эффекторных клеток памяти (CD44+ CD62L-). Значительное увеличение S-белок специфических CD4+ и CD8+ Tem клеток было измерено после двух иммунизаций по 20 мкг, тогда как иммунизация в количестве 5 мкг антигена привела к статистически значимому увеличению только CD4+ Tem (р<0,05). Наблюдалась тенденция к дозозависимому росту клеток, продуцирующих Th1-цитокин (IFNγ, IL-2, TNFα), среди обеих популяций Tem. Эффект достиг значимости для Tem, продуцирующего IL-2 (IFNγ-IL-2+TNFα-), и для многофункциональных CD8+ Т-клеток (IFNγ+IL-2+TNFα+) в обеих группах дозирования. В группе с высокими дозами рост IL-2, продуцируемого CD8+ Tem, также был значительным (фиг. 17).

--->

SEQUENCE LISTING

<110> Betuvaks LLC

<120> Генная конструкция для экспрессии рекомбинантных белков на основе

участка S-белка SARS-CoV-2, включающего RBD и SD1, слитого с Fc

фрагментом IgG, способ получения рекомбинантных белков, антигены

и антигенные композиции для индукции длительного антительного и

клеточного иммунитета против вируса SARS-CoV-2

<130> Antigene Compositions

<160> 34

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 7826

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pcDNA3.4 S-RBD(Wuhan)-Fc

<400> 1

aagggttcga tccctaccgg ttagtaatga gtttgatatc tcgacaatca acctctggat 60

tacaaaattt gtgaaagatt gactggtatt cttaactatg ttgctccttt tacgctatgt 120

ggatacgctg ctttaatgcc tttgtatcat gctattgctt cccgtatggc tttcattttc 180

tcctccttgt ataaatcctg gttgctgtct ctttatgagg agttgtggcc cgttgtcagg 240

caacgtggcg tggtgtgcac tgtgtttgct gacgcaaccc ccactggttg gggcattgcc 300

accacctgtc agctcctttc cgggactttc gctttccccc tccctattgc cacggcggaa 360

ctcatcgccg cctgccttgc ccgctgctgg acaggggctc ggctgttggg cactgacaat 420

tccgtggtgt tgtcggggaa gctgacgtcc tttccatggc tgctcgcctg tgttgccacc 480

tggattctgc gcgggacgtc cttctgctac gtcccttcgg ccctcaatcc agcggacctt 540

ccttcccgcg gcctgctgcc ggctctgcgg cctcttccgc gtcttcgcct tcgccctcag 600

acgagtcgga tctccctttg ggccgcctcc ccgcctggaa acgggggagg ctaactgaaa 660

cacggaagga gacaataccg gaaggaaccc gcgctatgac ggcaataaaa agacagaata 720

aaacgcacgg gtgttgggtc gtttgttcat aaacgcgggg ttcggtccca gggctggcac 780

tctgtcgata ccccaccgag accccattgg ggccaatacg cccgcgtttc ttccttttcc 840

ccaccccacc ccccaagttc gggtgaaggc ccagggctcg cagccaacgt cggggcggca 900

ggccctgcca tagcagatct gcgcagctgg ggctctaggg ggtatcccca cgcgccctgt 960

agcggcgcat taagcgcggc gggtgtggtg gttacgcgca gcgtgaccgc tacacttgcc 1020

agcgccctag cgcccgctcc tttcgctttc ttcccttcct ttctcgccac gttcgccggc 1080

tttccccgtc aagctctaaa tcggggcatc cctttagggt tccgatttag tgctttacgg 1140

cacctcgacc ccaaaaaact tgattagggt gatggttcac gtagtgggcc atcgccctga 1200

tagacggttt ttcgcccttt gacgttggag tccacgttct ttaatagtgg actcttgttc 1260

caaactggaa caacactcaa ccctatctcg gtctattctt ttgatttata agggattttg 1320

gggatttcgg cctattggtt aaaaaatgag ctgatttaac aaaaatttaa cgcgaattaa 1380

ttctgtggaa tgtgtgtcag ttagggtgtg gaaagtcccc aggctcccca gcaggcagaa 1440

gtatgcaaag catgcatctc aattagtcag caaccaggtg tggaaagtcc ccaggctccc 1500

cagcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc tcaattagtc agcaaccata gtcccgcccc 1560

taactccgcc catcccgccc ctaactccgc ccagttccgc ccattctccg ccccatggct 1620

gactaatttt ttttatttat gcagaggccg aggccgcctc tgcctctgag ctattccaga 1680

agtagtgagg aggctttttt ggaggcctag gcttttgcaa aaagctcccg ggagcttgta 1740

tatccatttt cggatctgat caagagacag gatgaggatc gtttcgcatg attgaacaag 1800

atggattgca cgcaggttct ccggccgctt gggtggagag gctattcggc tatgactggg 1860

cacaacagac aatcggctgc tctgatgccg ccgtgttccg gctgtcagcg caggggcgcc 1920

cggttctttt tgtcaagacc gacctgtccg gtgccctgaa tgaactgcag gacgaggcag 1980

cgcggctatc gtggctggcc acgacgggcg ttccttgcgc agctgtgctc gacgttgtca 2040

ctgaagcggg aagggactgg ctgctattgg gcgaagtgcc ggggcaggat ctcctgtcat 2100

ctcaccttgc tcctgccgag aaagtatcca tcatggctga tgcaatgcgg cggctgcata 2160

cgcttgatcc ggctacctgc ccattcgacc accaagcgaa acatcgcatc gagcgagcac 2220

gtactcggat ggaagccggt cttgtcgatc aggatgatct ggacgaagag catcaggggc 2280

tcgcgccagc cgaactgttc gccaggctca aggcgcgcat gcccgacggc gaggatctcg 2340

tcgtgaccca tggcgatgcc tgcttgccga atatcatggt ggaaaatggc cgcttttctg 2400

gattcatcga ctgtggccgg ctgggtgtgg cggaccgcta tcaggacata gcgttggcta 2460

cccgtgatat tgctgaagag cttggcggcg aatgggctga ccgcttcctc gtgctttacg 2520

gtatcgccgc tcccgattcg cagcgcatcg ccttctatcg ccttcttgac gagttcttct 2580

gagcgggact ctggggttcg cgaaatgacc gaccaagcga cgcccaacct gccatcacga 2640

gatttcgatt ccaccgccgc cttctatgaa aggttgggct tcggaatcgt tttccgggac 2700

gccggctgga tgatcctcca gcgcggggat ctcatgctgg agttcttcgc ccaccccaac 2760

ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa tttcacaaat 2820

aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa tgtatcttat 2880

catgtctgta taccgtcgac ctctagctag agcttggcgt aatcatggtc atagctgttt 2940

cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg aagcataaag 3000

tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc taactcacat taattgcgtt gcgctcactg 3060

cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg 3120

gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc 3180

tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc 3240

acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg 3300

aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat 3360

cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag 3420

gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga 3480

tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcaatgctc acgctgtagg 3540

tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt 3600

cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac 3660

gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc 3720

ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag gacagtattt 3780

ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc 3840

ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc 3900

agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg 3960

aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag 4020

atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg 4080

tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt 4140

tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga gggcttacca 4200

tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct caccggctcc agatttatca 4260

gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc 4320

tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt 4380

ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg 4440

gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc 4500

aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg 4560

ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga 4620

tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga 4680

ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg cgccacatag cagaacttta 4740

aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg 4800

ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact gatcttcagc atcttttact 4860

ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata 4920

agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt 4980

tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa 5040

ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg acgtcgacgg atcgggagat 5100

ctcccgatcc cctatggtcg actctcagta caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc 5160

agtatctgct ccctgcttgt gtgttggagg tcgctgagta gtgcgcgagc aaaatttaag 5220

ctacaacaag gcaaggcttg accgacaatt gcatgaagaa tctgcttagg gttaggcgtt 5280

ttgcgctgct tcgcgatgta cgggccagat atacgcgttg acattgatta ttgactagtt 5340

attaatagta atcaattacg gggtcattag ttcatagccc atatatggag ttccgcgtta 5400

cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa cgacccccgc ccattgacgt 5460

caataatgac gtatgttccc atagtaacgc caatagggac tttccattga cgtcaatggg 5520

tggagtattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca agtgtatcat atgccaagta 5580

cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg gcattatgcc cagtacatga 5640

ccttatggga ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg 5700

tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc gtggatagcg gtttgactca cggggatttc 5760

caagtctcca ccccattgac gtcaatggga gtttgttttg gcaccaaaat caacgggact 5820

ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat tgacgcaaat gggcggtagg cgtgtacggt 5880

gggaggtcta tataagcaga gctcgtttag tgaaccgtca gatcgcctgg agacgccatc 5940

cacgctgttt tgacctccat agaagacacc gggaccgatc cagcctccgg actctagagg 6000

atcgaaccct tgctagcgcc accatgttcg tgttcctggt gctgctgccc ctggtgtcct 6060

cccagtgcgg cgacgagatg ggcaccaccc tgaaaagctt caccgtggaa aagggcatct 6120

accagaccag caacttccgg gtgcagccca ccgaatccat cgtgcggttc cccaatatca 6180

ccaatctgtg ccccttcggc gaggtgttca atgccaccag attcgcctct gtgtacgcct 6240

ggaaccggaa gcggatcagc aattgcgtgg ccgactactc cgtgctgtac aactccgcca 6300

gcttcagcac cttcaagtgc tacggcgtgt cccctaccaa gctgaacgac ctgtgcttca 6360

caaacgtgta cgccgacagc ttcgtgatcc ggggagatga agtgcggcag attgcccctg 6420

gacagacagg caagatcgcc gactacaact acaagctgcc cgacgacttc accggctgtg 6480

tgattgcctg gaacagcaac aacctggact ccaaagtcgg cggcaactac aattacctgt 6540

accggctgtt ccggaagtcc aatctgaagc ccttcgagcg ggacatctcc accgagatct 6600

atcaggccgg cagcacccct tgtaacggcg tggaaggctt caactgctac ttcccactgc 6660

agtcctacgg ctttcagccc acaaatggcg tgggctatca gccctacaga gtggtggtgc 6720

tgagcttcga actgctgcat gcccctgcca cagtgtgcgg ccctaagaaa agcaccaatc 6780

tcgtgaagaa caaatgcgtg aacttcaact tcaacggcct gaccggcacc ggcgtgctga 6840

cagagagcaa caagaagttc ctgccattcc agcagtttgg ccgggatatc gccgatacca 6900

cagacgccgt tagagatccc cagacactgg aaatcctgga catcacccct tgcagcttcg 6960

gcggagtgtc tgtgatcacc cctggcacca acaccagcaa tcaggtggca gtgctgtacc 7020

aggacgtgaa ctgtaccgaa gtgcccgtgg ccattcacgc cgatcagctg acacctacat 7080

ggcgggtgta ctccaccgga tccggcggcg gcggcgacgg cggcggcggc tctggcgaca 7140

aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg tcagtcttcc 7200

tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag gtcacatgcg 7260

tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac gtggacggcg 7320

tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc acgtaccgtg 7380

tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag tacaagtgca 7440

aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa gccaaagggc 7500

agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggaggagctg accaagaacc 7560

aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc gtggagtggg 7620

agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg gactccgacg 7680

gctccttctt cctctatagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag caggggaacg 7740

tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag aagagcctct 7800

ccctgtcccc gggttcctga ctcgag 7826

<210> 2

<211> 6023

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pcDNA3.4

<400> 2